cotinus coggygria

ALMA MATER STUDIORUM – UNIVERSITA' DI BOLOGNAALMA MATER STUDIORUM – UNIVERSITA' DI BOLOGNALEOPOLD-FRANZENS UNIVERSITÄT INNSBRUCKLEOPOLD-FRANZENS UNIVERSITÄT INNSBRUCK

Facoltà di FarmaciaFacoltà di FarmaciaCorso di Laurea in Chimica e Tecnologia FarmaceuticheCorso di Laurea in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche

Phytochemical characterization of Phytochemical characterization of the ethyl acetate soluble fraction of the ethyl acetate soluble fraction of

wood extract of wood extract of

Cotinus coggygriaCotinus coggygria

Relatore: Dr.ssa Ester SperoniRelatore: Dr.ssa Ester Speroni

Co-Relatore: Univ. Prof. Dr. Hermann StuppnerCo-Relatore: Univ. Prof. Dr. Hermann Stuppner

Presentata da: Valentina MasiPresentata da: Valentina Masi

Matricola: 0000254734Matricola: 0000254734

Cotinus coggygriaCotinus coggygria

Anacardiaceae, chiamato anche Sommacco selvatico, Scotano, Albero della nebbiaMorfologia: Arbusto caducifoglio, globoso, alto 0,3-4 m, con odore resinoso; radici molto robuste e capaci di insinuarsi profondamente tra rocce; rami prostrato-ascendenti, sottili; rametti dell'anno dapprima verdi-lucidi, poi rossastri-bruni; corteccia scabra, sottilmente screpolata, color terra con macchie chiare; legno verde chiaro con midollo scuro e con odore di trementina al taglio; gemme subsessili, piccole, appuntite, scure.

Foglie semplici alterne, ovali-ellittiche o subrotonde, ottuse, glabre, a margine intero, con picciolo, glauche ed opache su ambedue le pagine, colore virante al giallo-arancio fno al rosso-carminio.

Fiori giallo-verdastri in pannocchie lasse ed irregolari terminali (10-20 cm), molto piccoli, su peduncoli gracili e piumosi (ad antesi conclusa) per peli rosei, in gran parte sterili.

Frutti drupacei secchi, a forma di cuore (o di pera), rugosi, radi, di 3-4 mm.

DistribuzioneDistribuzione

Ampia distribuzione nelle zone più meridionali del Mediterraneo, penisola balcanica e nelle regioni del Centro e del Sud-Ovest asiatico.

In Italia cresce spontaneamente nel centro-nord (eccetto Val d'Aosta), con esclusione di tutto il meridione e le isole.

Preferenza per zone asciutte e calcaree, fno ad un'altitudine di 900 m.

Spesso coltivato nei giardini per l'efetto decorativo di foglie e infruttescenze.

Importanza e utilizzoImportanza e utilizzoFoglie, inforescenze, frutti e tronco rientrano per secoli nelle preparazioni della medicina tradizionale (in particolare bulgara e cinese) per la cura di:

Ferite dalla guarigione difcile

Lesioni dei tessuti delle mucose

Alterazioni del sistema epatobiliare

Ulcera gastrica e duodenale

Diarrea

Infammazioni

Paradontite

Emorroidi

Estratto attivo contro:

Infezioni da E. coli, Staphylococcus aureus and S. cerevisiae

Cancro

Proflo Fitochimico Proflo Fitochimico Classifcazione dei metaboliti secondari presenti nel legno del Cotinus c. fno ad ora conosciuti:

Flavonoidi e derivatiFlavonoidi e derivati

Flavoni

Isofavoni

Auroni

Calconi

Acido gallico eAcido gallico e

derivatiderivati

Proflo FitochimicoProflo FitochimicoFlavonoidi e derivatiFlavonoidi e derivati

• 7,3',4'-triidrossi-diidrofavone

• 5,7,4'-triidrossi-diidrofavone

• 3,7,3',4'-tetraidrossi-diidrofavone

• 3,5,7,3',4'-pentaidrossi-diidrofavone

• Isoliquiritigenina (4,2',4'-triidrossicalcone)

• Fisetina (3,7,3',4'-tetraidrossifavone)

• C-3/C-3'' dimero della butina (3',4',7-triidrossifavanone)

• Catechina

• Fisetinidol-(4α→8)-(+)-catechina

• Epifsetinidol-(4β→8)-(+)-catechina

• Fustina

• Diidroquercetagetina

• Butina

• Eriodictiolo

• Fisetina

• Quercetina

• Buteina

• Disulfuretina {2,2'-[1,2-bis(3,4-diidrossifenil)-1, 2-etanedilidene]bis-[6-idrossi-3(2H)-benzofuranone]}

• Sulfuretina (6,3',4'-triidrossiaurone)

• Sulfureina

Acido gallico e derivatiAcido gallico e derivati

• Acido gallico

• Metil gallato

• Penta- galloil glucosio

Attività antinfammatoria Attività antinfammatoria

Legno del fusto di Cotinus coggygria



↓

Estratto metanolico



↓

Estratto metanolico

↓

Frazione di etilacetato



↓

Estratto metanolico

↓


↓

Saggio per via orale dell'edema di zampa di ratto



↓

Estratto metanolico

↓


↓


↓

Inibizione dell'edema del 34 - 57 %Inibizione dell'edema del 34 - 57 %



↓

Estratto metanolico

↓


↓


↓

Inibizione dell'edema del 34 - 57 %Inibizione dell'edema del 34 - 57 %

Ethyl acetate fraction

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.00.00

0.25

0.50

0.75CTRL; n=18100 mg/kg; n=3200 mg/kg; n=3

time [h]

diff

eren

ce v

olum

e [m

L]


Sulfuretina e Fustina (sostanze pure)



↓




↓


↓

Inibizione dell'edema non signifcativa (16 – 23 %)Inibizione dell'edema non signifcativa (16 – 23 %)

Pure substances

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.00.00

0.25

0.50

0.75CTRL; n=18Sulfuretin 200 mg/kg; n=3Fustin 100 mg/kg; n=3

time [h]

diff

eren

ce v

olum

e [m

L]

Scopo dello studio

Sviluppare l'indagine ftochimica sulla frazione di Sviluppare l'indagine ftochimica sulla frazione di etilacetato per identifcare i composti responsabili etilacetato per identifcare i composti responsabili

dell'attività farmacologicadell'attività farmacologica

Scopo dello studio



IdentifcazioneIdentifcazione

Isolamento e delucidazione strutturale

Scopo dello studio



IdentifcazioneIdentifcazione

Isolamento e Confronto con delucidazione strutturale composti di riferimento

IsolamentoIsolamento

Composti isolati

D4 – D9 – D11D4 – D9 – D11(Sephadex con MeOH puro → HSCCC)

Fustina SFustina Sulfuretina-6-ulfuretina-6-OO-β-D-glucoside (Sulfureina)-β-D-glucoside (Sulfureina)

Eriodictiol-7-Eriodictiol-7-OO-β-D-glucoside-β-D-glucoside

Composti isolati

D4 – D9 – D11D4 – D9 – D11

Composti isolati

F5 - S9F5 - S9(F5: Sephadex MeOH puro → Sephadex MeOH/H₂O → HSCCC;

S9: Sephadex MeOH puro → Sephadex MeOH puro → LOBAR)

1,2,3,6-tetragalloil-1,2,3,6-tetragalloil-OO-β-D-glucosio-β-D-glucosio

Composti isolati

I2I2(Sephadex con MeOH puro → HSCCC → Sephadex con MeOH puro)

Basso rendimentoBasso rendimento

Campione contentente troppe impuritàCampione contentente troppe impurità

↓↓

Struttura assegnata tramite confronto di spettri UV e MSStruttura assegnata tramite confronto di spettri UV e MS

↓↓

TTrigalloilrigalloil-O-O-β-D-β-D-glucosio-glucosio

Fraction Combined tubes Yield (mg)

I1 1-20 28.20

I2 21-27 11.0911.09

I3 Washing 24.30

Composti isolati

N4N4(Sephadex con MeOH puro → HSCCC → Sephadex con MeOH puro)

Basso rendimentoBasso rendimento

Campione contenente troppe impuritàCampione contenente troppe impurità

↓↓

Analisi NMR non praticabileAnalisi NMR non praticabile

Fraction Combined tubes Yield (mg)

N1 1-13 3.42

N2 14-18 7.16

N3 19-20 7.41

N4 21-28 78.8878.88

N5 29-44 36.95

N6 Washing 4.59

Composti isolati

P2P2(Sephadex con MeOH puro → HSCCC → 2 Sephadex simultanee con MeOH puro →

2 Sephadex consecutive con MeOH puro)

Sulfuretina-6-Sulfuretina-6-OO--ββ-D-glucoside-6’’-gallato (= sulfureina-6’’-gallato)-D-glucoside-6’’-gallato (= sulfureina-6’’-gallato)

Composti isolati

Q11Q11(Sephadex con MeOH puro → HSCCC → LOBAR)

PPentagalloil-entagalloil-OO-β-D-glucosio-β-D-glucosio

Confronto con composti di Confronto con composti di riferimentoriferimento

Acido gallicoAcido gallico

nm200 250 300 350 400 450 500 550

Norm.

0

200

400

600

800

1000

1200

min5 10 15 20 25 30 35 40 45

mAU

0

100

200

300

400

500

3.7

95

min5 10 15 20 25 30 35 40 45

mAU

0

100

200

300

400

500

3.7

18

168.8

246.8296.9 437.8

499.7 542.9 610.9 793.9 1031.5

1416.7

-MS, -Spectral Bkgrnd, 3.7min #124

0

2000

4000

6000

8000

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

OH

HO OH

O OH


(+/-) catechina (+/-) catechina

nm200 250 300 350 400 450 500 550

Norm.

0

200

400

600

800

1000

min5 10 15 20 25 30 35 40 45

mAU

0

100

200

300

400

500

6.5

48

min5 10 15 20 25 30 35 40 45

mAU

0

10

20

30

40

50

60

6.4

80

136.8182.8

288.9

356.9 402.9442.5 504.8 579.8 649.1 792.8 1475.4


0

1

2

4x10

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

139.2233.6

291.1

407.3

475.3541.9 619.1 665.9

+MS, -Spectral Bkgrnd, 6.0min #201

0

2

4

6

4x10

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z


Metilestere dell'acido gallicoMetilestere dell'acido gallico

OH

HO OH

O O

CH3

nm200 250 300 350 400 450 500 550

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

182.8

296.8 366.8


0

1

2

5x10

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

153.1

185.1

475.3534.6


0.0

0.5

1.0

1.5

5x10

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

min5 10 15 20 25 30 35 40 45

mAU

0

100

200

300

400

500

6.8

24

min5 10 15 20 25 30 35 40 45

mAU

0

100

200

300

400

500

6.6

59


Fisetinidol-(4Fisetinidol-(4αα→8)-(+)-catechina→8)-(+)-catechina

nm200 250 300 350 400 450 500 550

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

min5 10 15 20 25 30 35 40 45

mAU

0

100

200

300

400

500

10

.03

5

min5 10 15 20 25 30 35 40 45

mAU

0

10

20

30

40

50

9.9

73

302.9

561.1


0.00

0.25

0.50

0.75

5x10

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

273.0411.1

563.1

633.0


0

1

2

5x10

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z


Epifsetinidol-(4Epifsetinidol-(4ββ→8)-(+)-catechina→8)-(+)-catechina

nm200 250 300 350 400 450 500 550

mAU

0

200

400

600

800

min5 10 15 20 25 30 35 40 45

mAU

0

100

200

300

400

500

11.5

61

min5 10 15 20 25 30 35 40 45

mAU

0

10

20

30

40

50

60

70

80 11.4

65

561.1

634.9


0.0

0.5

1.0

1.5

5x10

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

273.2411.1

467.0

563.2


0

1

2

3

45x10

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z


SulfuretinaSulfuretina

nm200 250 300 350 400 450 500 550

mAU

0

100

200

300

400

500

600

700

min5 10 15 20 25 30 35 40 45

mAU

0

100

200

300

400

500

32

.274

min5 10 15 20 25 30 35 40 45

mAU

0

25

50

75

100

125

150

175 32

.25

1

268.9

336.7 382.8 538.8


0.00

0.25

0.50

0.75

5x10

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

271.0

562.9


0

1

2

5x10

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

OverviewOverview

1- acido gallico; 2- 1- acido gallico; 2- (+/-)catechina(+/-)catechina; 3- metilestere dell'acido gallico; 3- metilestere dell'acido gallico; 4- fisetinidol-(4α→8)-(+)-; 4- fisetinidol-(4α→8)-(+)-catechina; 5- epifisetinidol-(4β→8)-(+)-catechina; 6-fustina; 7- catechina; 5- epifisetinidol-(4β→8)-(+)-catechina; 6-fustina; 7- eriodictiol-7-O-β-D-glucoside; 8- eriodictiol-7-O-β-D-glucoside; 8- 1,2,3,6-t1,2,3,6-tetragalloiletragalloil-O-β-D-O-β-D-glucosio; 9--glucosio; 9- sulfuretina-6-O-β-D-glucoside (sulfureina); 10- sulfuretina-6-O-β-D-glucoside (sulfureina); 10- pentagalloilpentagalloil--O-β-D-O-β-D-glucosio; 11-glucosio; 11-sulfuretina-6-O-β-D-glucoside-6’’-gallato (sulfureina-6’’-gallato);12- sulfuretinasulfuretina-6-O-β-D-glucoside-6’’-gallato (sulfureina-6’’-gallato);12- sulfuretina

MetodiMetodi

Vacuum-liquid Chromatography

Thin Layer Chromatography (TLC)

Sephadex column chromatography

High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)

Preparative LOBAR® system

Mass spectrometry

Nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR)

High Speed Counter Current Chromatography (HSCCC)

HSCCCSpirale elicoidale in materiale inerte

Rotazione planetaria ed eccentrica

Zone di miscelazione e zone di deposito

che avanzano ad altissima velocità

↓

Eliminazione supporti solidi

↓

Recupero di campione vicino al 100%Recupero di campione vicino al 100%

Discussione

Attività plausibile dei composti isolatiAttività plausibile dei composti isolati

Fisetinidol-(4α→8)-(+)-catechina Fisetinidol-(4α→8)-(+)-catechina Procianidine dimericheProcianidine dimeriche

Inibitori del legame NF-kB al DNA

Epifsetinidol-(4β→8)-(+)-catechina Epifsetinidol-(4β→8)-(+)-catechina

Discussione

Esteri dell'acido gallicoEsteri dell'acido gallico

Inibitori dell'attivazione di NF-kB indotta da citochine

Riduttori dell'espressione delle molecole di adesione endotelio-leucociti nelle cellule in coltura

OH

HO OH

O OH

Discussione

Eriodictiol-7-Eriodictiol-7-OO-β-D-glucoside-β-D-glucoside

Inibitore della produzione di ossido nitrico (NO) e prostaglandina E2 (COX-2)

Inibitore della crescita di promastigoti di Leishmania Braziliensis e

di epimastigoti di Tripanosoma Cruzi

Discussione

Sulfuretina-6-Sulfuretina-6-OO-β-D-glucoside (sulfureina)-β-D-glucoside (sulfureina)

Attività anti-allergica tramite inibizione della produzione di istamina

ConclusioneConclusioneIsolamento, purifcazione e identifcazione della maggior parte dei costituenti

della frazione di etilacetato di Cotinus coggygria

Primo passo nella razionalizzazione delPrimo passo nella razionalizzazione del

potenziale antinfammatorio delle preparazionipotenziale antinfammatorio delle preparazioni

di di Cotinus coggygriaCotinus coggygria

Grazie per l'attenzioneGrazie per l'attenzione

cotinus coggygria

Health & Medicine