Download - Cotinus coggygria
ALMA MATER STUDIORUM – UNIVERSITA' DI BOLOGNAALMA MATER STUDIORUM – UNIVERSITA' DI BOLOGNALEOPOLD-FRANZENS UNIVERSITÄT INNSBRUCKLEOPOLD-FRANZENS UNIVERSITÄT INNSBRUCK
Facoltà di FarmaciaFacoltà di FarmaciaCorso di Laurea in Chimica e Tecnologia FarmaceuticheCorso di Laurea in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche
Phytochemical characterization of Phytochemical characterization of the ethyl acetate soluble fraction of the ethyl acetate soluble fraction of
wood extract of wood extract of
Cotinus coggygriaCotinus coggygria
Relatore: Dr.ssa Ester SperoniRelatore: Dr.ssa Ester Speroni
Co-Relatore: Univ. Prof. Dr. Hermann StuppnerCo-Relatore: Univ. Prof. Dr. Hermann Stuppner
Presentata da: Valentina MasiPresentata da: Valentina Masi
Matricola: 0000254734Matricola: 0000254734
Cotinus coggygriaCotinus coggygria
Anacardiaceae, chiamato anche Sommacco selvatico, Scotano, Albero della nebbiaMorfologia: Arbusto caducifoglio, globoso, alto 0,3-4 m, con odore resinoso; radici molto robuste e capaci di insinuarsi profondamente tra rocce; rami prostrato-ascendenti, sottili; rametti dell'anno dapprima verdi-lucidi, poi rossastri-bruni; corteccia scabra, sottilmente screpolata, color terra con macchie chiare; legno verde chiaro con midollo scuro e con odore di trementina al taglio; gemme subsessili, piccole, appuntite, scure.
Foglie semplici alterne, ovali-ellittiche o subrotonde, ottuse, glabre, a margine intero, con picciolo, glauche ed opache su ambedue le pagine, colore virante al giallo-arancio fno al rosso-carminio.
Fiori giallo-verdastri in pannocchie lasse ed irregolari terminali (10-20 cm), molto piccoli, su peduncoli gracili e piumosi (ad antesi conclusa) per peli rosei, in gran parte sterili.
Frutti drupacei secchi, a forma di cuore (o di pera), rugosi, radi, di 3-4 mm.
DistribuzioneDistribuzione
Ampia distribuzione nelle zone più meridionali del Mediterraneo, penisola balcanica e nelle regioni del Centro e del Sud-Ovest asiatico.
In Italia cresce spontaneamente nel centro-nord (eccetto Val d'Aosta), con esclusione di tutto il meridione e le isole.
Preferenza per zone asciutte e calcaree, fno ad un'altitudine di 900 m.
Spesso coltivato nei giardini per l'efetto decorativo di foglie e infruttescenze.
Importanza e utilizzoImportanza e utilizzoFoglie, inforescenze, frutti e tronco rientrano per secoli nelle preparazioni della medicina tradizionale (in particolare bulgara e cinese) per la cura di:
Ferite dalla guarigione difcile
Lesioni dei tessuti delle mucose
Alterazioni del sistema epatobiliare
Ulcera gastrica e duodenale
Diarrea
Infammazioni
Paradontite
Emorroidi
Estratto attivo contro:
Infezioni da E. coli, Staphylococcus aureus and S. cerevisiae
Cancro
Proflo Fitochimico Proflo Fitochimico Classifcazione dei metaboliti secondari presenti nel legno del Cotinus c. fno ad ora conosciuti:
Flavonoidi e derivatiFlavonoidi e derivati
Flavoni
Isofavoni
Auroni
Calconi
Acido gallico eAcido gallico e
derivatiderivati
Proflo FitochimicoProflo FitochimicoFlavonoidi e derivatiFlavonoidi e derivati
• 7,3',4'-triidrossi-diidrofavone
• 5,7,4'-triidrossi-diidrofavone
• 3,7,3',4'-tetraidrossi-diidrofavone
• 3,5,7,3',4'-pentaidrossi-diidrofavone
• Isoliquiritigenina (4,2',4'-triidrossicalcone)
• Fisetina (3,7,3',4'-tetraidrossifavone)
• C-3/C-3'' dimero della butina (3',4',7-triidrossifavanone)
• Catechina
• Fisetinidol-(4α→8)-(+)-catechina
• Epifsetinidol-(4β→8)-(+)-catechina
• Fustina
• Diidroquercetagetina
• Butina
• Eriodictiolo
• Fisetina
• Quercetina
• Buteina
• Disulfuretina {2,2'-[1,2-bis(3,4-diidrossifenil)-1, 2-etanedilidene]bis-[6-idrossi-3(2H)-benzofuranone]}
• Sulfuretina (6,3',4'-triidrossiaurone)
• Sulfureina
Acido gallico e derivatiAcido gallico e derivati
• Acido gallico
• Metil gallato
• Penta- galloil glucosio
Attività antinfammatoria Attività antinfammatoria
Legno del fusto di Cotinus coggygria
↓
Estratto metanolico
Attività antinfammatoria Attività antinfammatoria
Legno del fusto di Cotinus coggygria
↓
Estratto metanolico
↓
Frazione di etilacetato
Attività antinfammatoria Attività antinfammatoria
Legno del fusto di Cotinus coggygria
↓
Estratto metanolico
↓
Frazione di etilacetato
↓
Saggio per via orale dell'edema di zampa di ratto
Attività antinfammatoria Attività antinfammatoria
Legno del fusto di Cotinus coggygria
↓
Estratto metanolico
↓
Frazione di etilacetato
↓
Saggio per via orale dell'edema di zampa di ratto
↓
Inibizione dell'edema del 34 - 57 %Inibizione dell'edema del 34 - 57 %
Attività antinfammatoria Attività antinfammatoria
Legno del fusto di Cotinus coggygria
↓
Estratto metanolico
↓
Frazione di etilacetato
↓
Saggio per via orale dell'edema di zampa di ratto
↓
Inibizione dell'edema del 34 - 57 %Inibizione dell'edema del 34 - 57 %
Ethyl acetate fraction
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.00.00
0.25
0.50
0.75CTRL; n=18100 mg/kg; n=3200 mg/kg; n=3
time [h]
diff
eren
ce v
olum
e [m
L]
Attività antinfammatoria Attività antinfammatoria
Sulfuretina e Fustina (sostanze pure)
↓
Saggio per via orale dell'edema di zampa di ratto
Attività antinfammatoria Attività antinfammatoria
Sulfuretina e Fustina (sostanze pure)
↓
Saggio per via orale dell'edema di zampa di ratto
↓
Inibizione dell'edema non signifcativa (16 – 23 %)Inibizione dell'edema non signifcativa (16 – 23 %)
Pure substances
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.00.00
0.25
0.50
0.75CTRL; n=18Sulfuretin 200 mg/kg; n=3Fustin 100 mg/kg; n=3
time [h]
diff
eren
ce v
olum
e [m
L]
Scopo dello studio
Sviluppare l'indagine ftochimica sulla frazione di Sviluppare l'indagine ftochimica sulla frazione di etilacetato per identifcare i composti responsabili etilacetato per identifcare i composti responsabili
dell'attività farmacologicadell'attività farmacologica
Scopo dello studio
Sviluppare l'indagine ftochimica sulla frazione di Sviluppare l'indagine ftochimica sulla frazione di etilacetato per identifcare i composti responsabili etilacetato per identifcare i composti responsabili
dell'attività farmacologicadell'attività farmacologica
IdentifcazioneIdentifcazione
Isolamento e delucidazione strutturale
Scopo dello studio
Sviluppare l'indagine ftochimica sulla frazione di Sviluppare l'indagine ftochimica sulla frazione di etilacetato per identifcare i composti responsabili etilacetato per identifcare i composti responsabili
dell'attività farmacologicadell'attività farmacologica
IdentifcazioneIdentifcazione
Isolamento e Confronto con delucidazione strutturale composti di riferimento
Composti isolati
D4 – D9 – D11D4 – D9 – D11(Sephadex con MeOH puro → HSCCC)
Fustina SFustina Sulfuretina-6-ulfuretina-6-OO-β-D-glucoside (Sulfureina)-β-D-glucoside (Sulfureina)
Eriodictiol-7-Eriodictiol-7-OO-β-D-glucoside-β-D-glucoside
Composti isolati
F5 - S9F5 - S9(F5: Sephadex MeOH puro → Sephadex MeOH/H₂O → HSCCC;
S9: Sephadex MeOH puro → Sephadex MeOH puro → LOBAR)
1,2,3,6-tetragalloil-1,2,3,6-tetragalloil-OO-β-D-glucosio-β-D-glucosio
Composti isolati
I2I2(Sephadex con MeOH puro → HSCCC → Sephadex con MeOH puro)
Basso rendimentoBasso rendimento
Campione contentente troppe impuritàCampione contentente troppe impurità
↓↓
Struttura assegnata tramite confronto di spettri UV e MSStruttura assegnata tramite confronto di spettri UV e MS
↓↓
TTrigalloilrigalloil-O-O-β-D-β-D-glucosio-glucosio
Fraction Combined tubes Yield (mg)
I1 1-20 28.20
I2 21-27 11.0911.09
I3 Washing 24.30
Composti isolati
N4N4(Sephadex con MeOH puro → HSCCC → Sephadex con MeOH puro)
Basso rendimentoBasso rendimento
Campione contenente troppe impuritàCampione contenente troppe impurità
↓↓
Analisi NMR non praticabileAnalisi NMR non praticabile
Fraction Combined tubes Yield (mg)
N1 1-13 3.42
N2 14-18 7.16
N3 19-20 7.41
N4 21-28 78.8878.88
N5 29-44 36.95
N6 Washing 4.59
Composti isolati
P2P2(Sephadex con MeOH puro → HSCCC → 2 Sephadex simultanee con MeOH puro →
2 Sephadex consecutive con MeOH puro)
Sulfuretina-6-Sulfuretina-6-OO--ββ-D-glucoside-6’’-gallato (= sulfureina-6’’-gallato)-D-glucoside-6’’-gallato (= sulfureina-6’’-gallato)
Composti isolati
Q11Q11(Sephadex con MeOH puro → HSCCC → LOBAR)
PPentagalloil-entagalloil-OO-β-D-glucosio-β-D-glucosio
Confronto con composti di Confronto con composti di riferimentoriferimento
Acido gallicoAcido gallico
nm200 250 300 350 400 450 500 550
Norm.
0
200
400
600
800
1000
1200
min5 10 15 20 25 30 35 40 45
mAU
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100
200
300
400
500
3.7
95
min5 10 15 20 25 30 35 40 45
mAU
0
100
200
300
400
500
3.7
18
168.8
246.8296.9 437.8
499.7 542.9 610.9 793.9 1031.5
1416.7
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0
2000
4000
6000
8000
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
OH
HO OH
O OH
Confronto con composti di Confronto con composti di riferimentoriferimento
(+/-) catechina (+/-) catechina
nm200 250 300 350 400 450 500 550
Norm.
0
200
400
600
800
1000
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100
200
300
400
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48
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mAU
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10
20
30
40
50
60
6.4
80
136.8182.8
288.9
356.9 402.9442.5 504.8 579.8 649.1 792.8 1475.4
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0
1
2
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200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
139.2233.6
291.1
407.3
475.3541.9 619.1 665.9
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2
4
6
4x10
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
Confronto con composti di Confronto con composti di riferimentoriferimento
Metilestere dell'acido gallicoMetilestere dell'acido gallico
OH
HO OH
O O
CH3
nm200 250 300 350 400 450 500 550
mAU
0
200
400
600
800
1000
1200
182.8
296.8 366.8
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200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
153.1
185.1
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+MS, -Spectral Bkgrnd, 6.5min #217
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0.5
1.0
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5x10
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min5 10 15 20 25 30 35 40 45
mAU
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100
200
300
400
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6.8
24
min5 10 15 20 25 30 35 40 45
mAU
0
100
200
300
400
500
6.6
59
Confronto con composti di Confronto con composti di riferimentoriferimento
Fisetinidol-(4Fisetinidol-(4αα→8)-(+)-catechina→8)-(+)-catechina
nm200 250 300 350 400 450 500 550
mAU
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
min5 10 15 20 25 30 35 40 45
mAU
0
100
200
300
400
500
10
.03
5
min5 10 15 20 25 30 35 40 45
mAU
0
10
20
30
40
50
9.9
73
302.9
561.1
-MS, -Spectral Bkgrnd, 9.2min #308
0.00
0.25
0.50
0.75
5x10
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
273.0411.1
563.1
633.0
+MS, -Spectral Bkgrnd, 9.3min #309
0
1
2
5x10
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
Confronto con composti di Confronto con composti di riferimentoriferimento
Epifsetinidol-(4Epifsetinidol-(4ββ→8)-(+)-catechina→8)-(+)-catechina
nm200 250 300 350 400 450 500 550
mAU
0
200
400
600
800
min5 10 15 20 25 30 35 40 45
mAU
0
100
200
300
400
500
11.5
61
min5 10 15 20 25 30 35 40 45
mAU
0
10
20
30
40
50
60
70
80 11.4
65
561.1
634.9
-MS, -Spectral Bkgrnd, 10.9min #362
0.0
0.5
1.0
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200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
273.2411.1
467.0
563.2
+MS, -Spectral Bkgrnd, 10.8min #361
0
1
2
3
45x10
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
Confronto con composti di Confronto con composti di riferimentoriferimento
SulfuretinaSulfuretina
nm200 250 300 350 400 450 500 550
mAU
0
100
200
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600
700
min5 10 15 20 25 30 35 40 45
mAU
0
100
200
300
400
500
32
.274
min5 10 15 20 25 30 35 40 45
mAU
0
25
50
75
100
125
150
175 32
.25
1
268.9
336.7 382.8 538.8
-MS, -Spectral Bkgrnd, 32.2min #1072
0.00
0.25
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5x10
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
271.0
562.9
+MS, -Spectral Bkgrnd, 32.2min #1071
0
1
2
5x10
200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z
OverviewOverview
1- acido gallico; 2- 1- acido gallico; 2- (+/-)catechina(+/-)catechina; 3- metilestere dell'acido gallico; 3- metilestere dell'acido gallico; 4- fisetinidol-(4α→8)-(+)-; 4- fisetinidol-(4α→8)-(+)-catechina; 5- epifisetinidol-(4β→8)-(+)-catechina; 6-fustina; 7- catechina; 5- epifisetinidol-(4β→8)-(+)-catechina; 6-fustina; 7- eriodictiol-7-O-β-D-glucoside; 8- eriodictiol-7-O-β-D-glucoside; 8- 1,2,3,6-t1,2,3,6-tetragalloiletragalloil-O-β-D-O-β-D-glucosio; 9--glucosio; 9- sulfuretina-6-O-β-D-glucoside (sulfureina); 10- sulfuretina-6-O-β-D-glucoside (sulfureina); 10- pentagalloilpentagalloil--O-β-D-O-β-D-glucosio; 11-glucosio; 11-sulfuretina-6-O-β-D-glucoside-6’’-gallato (sulfureina-6’’-gallato);12- sulfuretinasulfuretina-6-O-β-D-glucoside-6’’-gallato (sulfureina-6’’-gallato);12- sulfuretina
MetodiMetodi
Vacuum-liquid Chromatography
Thin Layer Chromatography (TLC)
Sephadex column chromatography
High Pressure Liquid Chromatography (HPLC)
Preparative LOBAR® system
Mass spectrometry
Nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR)
High Speed Counter Current Chromatography (HSCCC)
HSCCCSpirale elicoidale in materiale inerte
Rotazione planetaria ed eccentrica
Zone di miscelazione e zone di deposito
che avanzano ad altissima velocità
↓
Eliminazione supporti solidi
↓
Recupero di campione vicino al 100%Recupero di campione vicino al 100%
Discussione
Attività plausibile dei composti isolatiAttività plausibile dei composti isolati
Fisetinidol-(4α→8)-(+)-catechina Fisetinidol-(4α→8)-(+)-catechina Procianidine dimericheProcianidine dimeriche
Inibitori del legame NF-kB al DNA
Epifsetinidol-(4β→8)-(+)-catechina Epifsetinidol-(4β→8)-(+)-catechina
Discussione
Esteri dell'acido gallicoEsteri dell'acido gallico
Inibitori dell'attivazione di NF-kB indotta da citochine
Riduttori dell'espressione delle molecole di adesione endotelio-leucociti nelle cellule in coltura
OH
HO OH
O OH
Discussione
Eriodictiol-7-Eriodictiol-7-OO-β-D-glucoside-β-D-glucoside
Inibitore della produzione di ossido nitrico (NO) e prostaglandina E2 (COX-2)
Inibitore della crescita di promastigoti di Leishmania Braziliensis e
di epimastigoti di Tripanosoma Cruzi
Discussione
Sulfuretina-6-Sulfuretina-6-OO-β-D-glucoside (sulfureina)-β-D-glucoside (sulfureina)
Attività anti-allergica tramite inibizione della produzione di istamina
ConclusioneConclusioneIsolamento, purifcazione e identifcazione della maggior parte dei costituenti
della frazione di etilacetato di Cotinus coggygria
Primo passo nella razionalizzazione delPrimo passo nella razionalizzazione del
potenziale antinfammatorio delle preparazionipotenziale antinfammatorio delle preparazioni
di di Cotinus coggygriaCotinus coggygria