cours fluo
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Chimie analytique instrumentale
Notions de spectrofluorimétrie
Etienne QUIVET 04 91 10 62 43
Laboratoire Chimie Provence, UMR 6264, Université de Marseille
Spectrofluorimétrie
1. Principe2. Spectres d’excitation3. Spectres d’émission4. Quantification5. Instrumentation
OOH O
COOH
Principe
Luminescence :Émission d’un rayonnement électromagnétiqueClassement en fonction du mode d’excitation
Chimi luminescence → réaction chimique
Bioluminescence → réaction enzymatique
Thermoluminescence → chaleur
Electroluminescence → champ électrique
Photoluminescence → Photons
Fluorescence
� Phosphorescence
�
Principe
Diagramme de Jablonski
Les molécules qui se trouvent au repos dans le niveau vibrationnel V0 de l’état électronique fondamental S0 se trouvent portée à un état excité S1 sous l’effet de
l’absorption d’un rayonnement lumineux (λex).
V3
V4
V1V0
V2
E
S0
S1
S0
T1
V3
V4
V1V0
V2
Absorption Fluorescence Phosphorescence
λémλex
Désactivationsnon radiatives
CroisementInter-système
Relaxation vibrationnelle
Conversioninterne
∆Eex > ∆Eém⇒⇒⇒⇒ λex < λém
Principe
Différents types de dissipation de l’énergie en excès peuvent
alors se produire. Ce sont des phénomènes de relaxation:
� Relaxation non rayonnante (non radiative)
� conversion interne
� relaxation vibrationnelle
� Relaxation rayonnante (radiative)
� Autres types de processus de fluorescence
Principe
Relaxation rayonnante :fluorescence
La fluorescence moléculairese produit par émission d’un photon (àλem) dont l’énergie correspond à la transition entre l’état électronique S1 et
l’un des niveaux vibrationnels de l’état fondamental S0. L’excès d’énergie vibrationnel par rapport à S0 est à nouveau perdu par un
processus de relaxation vibrationnelle.
C’est un phénomène rapide : il faut entre 10-9 et 10-7 seconde pour qu’une molécule retourne à l’état fondamental.
La fluorescencese traduit par des bandes de rayonnement car les molécules excitées peuvent revenir à n’importe quel niveau vibrationnel
de l’état électronique fondamental S0.
Principe
Relaxation rayonnante :fluorescence
Comme un peu d’énergie se perd durant la relaxation vibrationnelleavant que l’émission ne se produise, l’énergie émise est donc de λ plus grande
que celle de l’énergie absorbée (déplacement de Stokes). Des raies de résonancesont aussi observables.
Principe
Relaxation rayonnante :phosphorescence
La phosphorescencetraduit un type différent de retour au niveau fondamental. Après la phase d’absorption (transfert d’électron S0 → S1), si la relaxation vibrationnelleest assez lente, on assiste au retournement de spin de l’électron pour conduire à un état triplet T 1 un peu plus stable.
Le retour au niveau fondamental avec émission de photon est donc ralenti et les durées de relaxation peuvent être 108 fois plus grande que pour la
fluorescence(jusqu’à 10 secondes).
Principe
Autres types de processus de fluorescence :
� fluorescence de Stokes
� diffusion de Rayleigh
� diffusion Raman
� fluorescence de résonance
Relaxation non rayonnante :
� conversion interne
� relaxation vibrationnelle
Principe
Autres types de processus de fluorescence :fluorescence de Stokes
La fluorescence de Stokess’observe normalement en solution avec la réémission de photons ayant une longueur d’onde plus grande que
ceux observés.
Cependant, si de l’énergie thermique est ajoutée lorsque la molécule est dans un état excité, une émission à plus courte longueur d’onde
peut se produire, c’est ce qu’on appelle la fluorescence anti-Stokes. Elle s’observe généralement dans des gaz portés à très hautes
températures.
Diffusion Rayleigh(raie excitatrice)
DiffusionRaman
Fluorescence Lumière diffractée(2èmeordre du réseau)
Principe
Autres types de processus de fluorescence :diffusion de Rayleigh
La diffusion Rayleigh est la réémission, à la même longueur d’onde,d’une petite fraction de la lumière excitatrice dans toutes les directions
par le solvant dans lequel se trouve le composé.
Son intensité dépend de la polarisabilité des molécules de ce solvant.
Principe
Autres types de processus de fluorescence :diffusion Raman
La diffusion Raman, de 100 à 1000 fois plus faible que la diffusion Rayleigh, provient d’une partie de l’énergie de la lumière excitatrice
aux molécules de solvant sous forme d’énergie de vibration. Les molécules de solvant réémettent donc des photons de moindre
énergie que ceux ayant servi à les exciter.
Autres types de processus de fluorescence :fluorescence de résonance
La fluorescence de résonance, réémission de photons à la même longueur d’onde, n’est que rarement observée en solution du fait des
interactions avec le solvant, mais peut se produire dans les gaz.
Principe
Fluorophores :
� Molécules biologiques : Tryptophane (groupement aromatique), GFP (Green Fluorescent Protein) protéine verte extraite des méduses mutants…Avantage : insertion dans le génome
� Molécules organiques attachées : Très nombreuses… plus ou moins spécifiques (cystéines –SH, lysine-NH2). Liaison Biotine-avidine.
� Intercalants de l’ADN : BET, YOYO
� Indicateurs fluorescents :molécules organiques qui deviennent fluorescentes en présence d’un cofacteur Ca2+, Na+, Cl-, O2, pH…
� Nanocristaux :sondes inorganiques, spectre d’émission étroit, spectred’absorption large, photostables, visibles en microscopie électronique.
Spectres d’excitation et d’émission
Chaque molécule fluorescente présente deux spectrescaractéristiques :
� un spectre d’excitationqui permet de déterminer l’efficacitérelative des différentes longueurs d’onde
des rayonnements incidents sur la fluorescence
� un spectre d’émissionqui montre l’intensité
relative des rayonnements émis à
différentes longueurs d’onde
Spectres d’excitation
Le spectre d’excitation(obtenu avec un fluorimètre) n’est pas toujours identique au spectre d’absorption(obtenu avec un spectrophotomètre) de
la molécule → artefacts instrumentaux
Exemple :complexe alizarine - aluminium
480 nm470 nm
350 nm430 nm
270 nm350 nm
Spectre d’absorptionSpectre d’excitationParamètres différentsentre les appareils: largeur de bande du
monochromateur, intensitéde la source lumineuse,
largeur de fente…
Le spectre d’absorption→ bonne approximation de λext
En général, on choisit la valeur de la longueur d’onde la plus grande dans le spectre d’excitation pour exciter la molécule
Spectres d’émission
Chaque bande observée dans lespectre d’excitationaura une bande d’émission(ou de fluorescence) correspondante. Ces
deux bandes seront approximativement des images miroirs l’une de l’autre. Cependant, plus le composé est complexe, plus la
bande de fluorescence est large et moins la symétrie des spectres sera avérée.
Exemple :Iso-thiocyanate de fluorescéine
Spectres d’émission
Exemple :mélange anthracène - quinine
Bandes d’excitation superposées
La quinine peut être mesurée à 350 nm et l’anthracène à
300 nm environ
Réciproquement, si deux composés émettent une fluorescence à la même longueur d’onde, ils peuvent
toujours être mesurés ensemble dans la solution s’ils ont des pics d’excitation différenciés.
N
N
OCH3 OH
CH2
☺☺☺☺ Avantage majeur de la fluorimétrie par rapport à la spectrophotométrie
Quantification
Il y a simultanément absorption partielle de l’intensité de la radiation
lumineuse excitatrice(bleu) et absorption partielle de la lumière de fluorescence(rose) avant d’atteindre la sortie. Ce phénomène appeléfiltre
interne rend difficile le calcul de l’intensité de fluorescence.
Suivant l’endroit de la solution où la fluorescence est émise, une intensité lumineuse variable atteint le détecteur.
L’intensité de fluorescence If est la somme des fluorescences individuelles (If1, If2…) des molécules présentes dans le volume délimité
par les fenêtres d’entrée et de sortie.
I 0
I f1 I f2 I f3 I f4
I f(vers détecteur)
Quantification
Pour les solutions, on définit le rendement quantique(ou rendement de fluorescence) Φ
Φ représente le rapport entre le nombre de photons émis (If) sur le nombre de photons absorbés (Ia).
Φ est indépendant de l’intensité lumineuse.
Plus la valeur de Φ est élevée, plus le composé est fluorescent.
Φ = I f / Ia
Quantification
Quantification → rendement quantique Φ ne sert pas directement
ΦΦΦΦ = I f / Ia
I a = I0 - I t
I0 →→→→ intensité de la lumière incidenteI t →→→→ intensité de la lumière transmise
I f = ΦΦΦΦ.(I0 – I t) = ΦΦΦΦ.I0.(1 – (It /I 0))
log (I0 / I t) = A ⇒⇒⇒⇒ I t / I0 = 10-A
I f = ΦΦΦΦ.I0.(1 – 10-A)I f = ΦΦΦΦ.(I0 – I t) = ΦΦΦΦ.I0.(1 – (It /I 0))
Quantification
Si la solution est diluée, l’absorbance (A = ε.l.C) est faible.
I f = ΦΦΦΦ.I0.A = ΦΦΦΦ.I0.ε.l.C
I f = ΦΦΦΦ.I0.(1 – 10-A)
A = ε.l.C
Pour les mesures faites dans les mêmes conditions, ΦΦΦΦ.ε.l peut êtredans un même facteur K .
I f = K.I 0.C
Si l'absorbance est trop importante, il y a une perte de la linéarité liée à la forme de l'équation ci-dessus en 10-A, et au "self-quenching", phénomène dans lequel les molécules absorbent la radiation de
fluorescence émise par d'autres molécules.
Instrumentation
Différents éléments d’un spectrofluorimètre :
� une source lumineuse (génération d’une large bande de radiation)
� un porte échantillon (ou porte cuve)
� deux unités de dispersion (monochromateurs)
� un détecteur (mesure de l’intensité de la radiation)
� divers composants optiques (lentilles, miroirs, filtres…)
Instrumentation
Source lumineuse:
L’intensité de fluorescence semble proportionnelle à l’intensitélumineuse excitatrice incidente (If = K.I0.C). Cependant, une
source trop intense peut provoquer une photodécomposition de l’échantillon (→ effet inverse de celui recherché !).
Les lampes au xénonet au mercure ainsi que des lasers pulséssont couramment employées
Deux unités de dispersion (monochromateurs):
A l’inverse d’un spectrophotomètre, il y a deux monochromateurs: un pour l’excitation, un pour l’émission.
Instrumentation
Source lumineuse:
Lampe à vapeur de mercure (Hg) Lampe à vapeur de xénon (Xe)
Instrumentation
Détecteur:
La majorité des spectrofluorimètres place le photodétecteurperpendiculairementau faisceau d’excitation. Cet arrangement permet de diminuer les contributions de diffusion Rayleigh et
Ramandans le signal détecté.
On peut également mesurer la fluorescence suivant d’autres angles (22,5° ou 37° notamment) et plus récemment des appareillages permettant de mesurer une fluorescence à angle variable ont été
développés.
Instrumentation