UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ

VICTOR LEÃO HITZSCHKY MADEIRA

Criopreservação do sêmen canino com um diluidor à base

de água de coco na forma de pó (ACP - 106®): efeito do

tempo de equilíbrio e da taxa de descongelação

FORTALEZA, CEARÁ

Dezembro, 2007

ii

VICTOR LEÃO HITZSCHKY MADEIRA

Criopreservação do sêmen canino com um diluidor à base

de água de coco na forma de pó (ACP - 106®): efeito do

tempo de equilíbrio e da taxa de descongelação

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Veterinárias da

Faculdade de Veterinária da Universidade

Estadual do Ceará, como requisito parcial

para a obtenção do grau de mestre em

Ciências Veterinárias

Área de Concentração: Reprodução e

Sanidade Animal

Orientadora: Profa. Dra. Lúcia Daniel

Machado da Silva

Co-orientador: Dr. Airton Alencar de

Araújo

FORTALEZA, CEARÁ

Dezembro, 2007

iii

Universidade Estadual do Ceará

Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias

Título do Trabalho: Criopreservação do sêmen canino com um diluidor à base de água de

coco na forma de pó (ACP - 106®): efeito do tempo de equilíbrio e da taxa de descongelação

Autora: Victor Leão Hitzschky Madeira

Defesa em: 20/ 12 / 2007 Conceito obtido: ________

Nota obtida: ___________

Banca Examinadora

______________________________________

Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva

Universidade Estadual do Ceará

Orientadora

______________________________________

Prof. Dr. Airton Alencar de Araújo

Universidade Estadual do Ceará

Co-Orientador

______________________________________

Prof. Dr. Alexandre Rodrigues Silva

Universidade Federal Rural do Semi-Árido

Examinador

iv

DEDICATÓRIA

Dedico a minha namorada Cynthia Levi

Baratta pelo apoio incondicional durante as

minhas atividades do mestrado e em todos os

outros momentos desde que tive a sorte de tê-la

novamente ao meu lado.

v

HOMENAGEM

Aos meus pais, Germano Hitzschky Madeira e

Maria Ângela Leão Hitzschky Madeira, por me

reservarem credibilidade e incentivo, nunca

pondo barreiras frente ao meu crescimento

intelectual.

vi

AGRADECIMENTOS

A Deus pelo privilégio de sempre ter tido condições de enfrentar os desafios e

conseguir crescer a cada dia, pois a mim nunca faltaram saúde, alimento, moradia e o amor de

meus familiares.

Aos meus pais pelo amor incondicional e pelo esforço constante de oferecer aos

filhos o que tem de melhor.

Aos meus irmãos, Daniel Leão e Germano Leão, pela amizade e companheirismo.

A minha namorada Cynthia Levi Baratta por todo o bem que tem me feito, sempre

presente na minha vida, seja me ajudando nas madrugadas estressantes do experimento ou nas

madrugadas sorridentes escutando Chico Buarque ao lado das minhas cadelas Alcione e Iara e

da minha gata Rainha.

À minha orientadora, Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva, pela paciência,

pelos ensinamentos e por acreditar em mim, sempre dando oportunidade de me tornar um

profissional e uma pessoa melhor. Jamais esquecerei sua inestimável colaboração na minha

formação profissional e pessoal.

Ao Prof. Dr. Airton Alencar de Araújo, pela importantíssima ajuda na análise

estatísca dos resultados e ao Prof. Dr. Alexandre Rodrigues Silva que sempre foi muito

prestativo.

A todos os que fazem o Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias.

Ao Laboratórios de Tecnologia do Sêmen Caprino e Ovino por permitir o uso de

equipamentos necessários para que fosse realizado a análise do sêmen auxiliada por

computador.

vii

À ACP Biotecnologia na pessoa da Dra. Cristiane Clemente de Mello Salgueiro

pelo fornecimento do diluente ACP® 106, objeto de estudo deste trabalho.

A Funcap, pelo apoio financeiro indispensável ao desenvolvimento das atividades

relacionadas ao mestrado.

A todos os colegas do laboratório de reprodução de carnívoros domésticos por

tudo que me ensinaram e pela excelente convivência.

Aos estagiários do laboratório de reprodução de carnívoros domésticos Ricardo

Parente Jucá, Ângela Cristina de Oliveira e Áurea Helena Rocha Lima pela solicitude durante

a execução dos experimentos.

A companheira de trabalho e amiga Claudia da Cunha Barbosa que sempre esteve

disposta a me ajudar e com certeza foi uma pessoa fundamental para realização dos meus

experimentos e dessa dissertação.

À minha grande amiga Iracelma Julião de Arruda por sua amizade e por sempre

está do meu lado quando preciso.

Ao colega doutorando Daniel Couto Uchoa e ao handler profissional Oiran Filho

pela concessão dos animais para a realização dos experimentos.

A todos os animais que fizeram parte do experiemento, pois eles são sem dúvida

alguma as figuras mais importantes de toda essa dissertação.

As minhas cadelas Alcione e Iara e a minha gata Rainha pelo amor desinteressado

e pela maravilhosa companhia em todos os momentos.

Um agradecimento especial ao meu inesquecível cão Lambão in memorian

responsável pelo rumo que optei traçar na minha vida, pois há dez anos atrás lambão precisou

fazer uma ultra-sonografia com a Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva e desde então resolvi

que faria parte do laboratório de reprodução de carnívoros domésticos.

viii

A todos os animais agradeço e dedico!

ix

RESUMO

Devido ao crescente interesse de criadores de cães em resguardar o potencial genético daqueles animais de alto valor zootécnico e afetivo, vários pesquisadores têm se dedicado ao estudo de técnicas que viabilizem a conservação de sêmen por longos períodos sem comprometer, no entanto, a sua capacidade de fertilização.Dessa forma, esse este trabalho foi dividido em dois experimentos que tiveram como objetivo geral aperfeiçoar o protocolo de congelação do sêmen canino utilizando-se um diluidor à base de água de coco em pó (ACP-106®) e mais especificamente, no 1° experimento testou-se diferentes taxas de descongelação e, no 2° verificou-se o efeito do tempo de equilíbrio a 4°C após a glicerolização.Para tanto, 20 ejaculados de 15 cães foram processados, sendo 10 para cada experimento. A fração espermática foi diluída em ACP-106® contendo 20% de gema de ovo e submetida ao resfriamento a 15°C/40min e 4°C/30 min. Posteriormente, o ACP-106® acrescido de gema de ovo e glicerol foi adicionado ao sêmen diluído (glicerolização). No experimento 1, a primeira alíquota foi descongelada a 37°C/1min, a segunda a 75°C/8s e a terceira a 55°C/5s. No experimento 2, após a glicerolização, a primeira alíquota não foi equilibrada(G0h), a segunda o foi por 1h (G1h) e a terceira por 2h(G2h) para só então serem congelados. Foram avaliados os seguintes parâmetros: volume, concentração, motilidade, vigor, pH, morfologia, integridade acrossomal e teste hipoosmótico e no caso do experimento 2 foi realizado a CASA.Pela análise dos resultados do sêmen a fresco, observou-se que em ambos os experimentos os parâmetros avaliados apresentavam-se dentro da normalidade para a espécie canina. Com relação ao experimento 1 a motilidade pós-descongelação demonstrou uma diferença entres as três taxas de descongelação, sendo que a taxa de descongelação de 55°C/5s apresentou os melhores resultados por até 30min após a descongelação. Com relação ao vigor as taxas de descongelação 55°C/5s e 37°C/60s foram as que apresentaram os melhores resultados. No tocante as alterações morfológicas, acrossomas intactos, membranas funcionais e pH não houve diferenças entre os tratamentos. Para o experimento 2, após a descongelação, a motilidade total e progressiva e espermatozóides com velocidade média de G2h foram superiores ao G0h, enquanto que o G1h não diferiu nem de G0h, nem de G2h. Na VAP médio e espermatozóides com velocidade rápida, o G2h foi superior ao G0h com 30min após a descongelação. O VAP rápido, bem como as alterações morfológicas, acrossomas intactos e pH não diferiram entre os grupos. Na termoresistência, houve uma queda a partir dos 30min para a maioria dos parâmetros. No teste hipoosmótico, o G2h foi melhor que o G0h e G1h não diferiu de nenhum dos dois. Em vista disso conclui-se que a melhor taxa de descongelação é a de 55°C/5s e que para a congelação do sêmen canino, utilizando-se ACP-106®, deve-se incluir um tempo de equilíbrio de 2h após a glicerolização a 4°C Palavras-chave: sêmen, cão, criopreservação, tempo de equilíbrio, descongelação, ACP-106®.

x

ABSTRACT

Due to the increasing interest of dog raisers to guard the genetic potential of animals with high breeding and emotional values, several researchers have been dedicated to develop techniques which enables the semen conservation for long periods, without compromising its fertilization capacity. The present study was divided in two experiments, aiming to improve the canine semen freezing protocol, using an extender powder coconut water diluter (ACP-106®). The first experiment tested different thawing rates and the second one verified the effect of equilibration times at 4° C after glycerol addition. Being thus, twenty ejaculates from fifteen dogs were processed (ten of each experiment). The sperm rich fraction was extended in ACP-106® with 20% egg yolk, and frozen at 15°C/40min and 4°C/30 min. Then, the extender with glycerol was added. In Experiment 1, the first rate was thawed at 37°C/1min, the second at 75°C/8s and the third at 55°C/5s. In Experiment 2, after the addition of glycerol, the first rate was immediately frozen (G0h) while the second (G1h) and the third (G2h) ones were balanced for 1h and 2h, respectively, before the cryopreservation process. The parameter volume, concentration, motility, vigor, pH, morphology, acrossomic integrity and hyposmotic test were evaluated. In Experiment 2, CASA was also used. To analyze the results regarding to fresh semen, it was observed that, in both experiments, the evaluated parameter were inside the normality values limits to the canine species. In the Experiment 1, the three thawing rates motility presented differences, being the 55°C/5s rate the one which presented better results until 30min after thawing. Regarding to vigor, the thawing rates 55°C/5s and 37°C/60s presented the best results. There were no differences between groups for the parameters morphologic alterations, intact acrosome, functional membranes and pH. In Experiment 2, after thawing, the total and progressive motility and sperm with an average speed of G2h were higher than G0h, while G1h did not differ neither from G0h nor G2h. The average VAP and sperm with fast speed, the G2h was superior to G0h 30min after thawing. The fast VAP, as well as the morphological alterations, acrossomic integrity and pH did not differ between groups. In thermoresistance test, there was a fall starting at 30min for most parameters. In the hyposmotic test, G2h was better than G0h and G1h did not differ from any of the other two groups. In summary, the better thawing rate was at 5°C/5s. For canine semen freezing, using ACP-106 ®, balance period of 2h after glycerol addition at 4ºC must be included. Keywords: semen, dog, cryopreservation , tempo de equilíbrio, , equilibration time, thawing, ACP-106®.

xi

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

% : Porcentagem

µm/s : Micrômeros por segundo

< : Menor

> : Maior

± : Mais ou menos

≤ : Menor ou igual

≥ : Maior ou igual

°C : Graus Celsius

µm : Micrômeros

ACP - 106® : Diluente à base de água de coco em pó formulado para a espécie canina

ACP®

ALH

: Água de coco em pó

: Amplitude do deslocamento lateral da cabeça

ANOVA : Análise de variância

BCF

BHT

BSA

BSP

: Freqüência de batimento da cauda

: Hidroxitolueno butirado

: Albumina sérica bovina

: Proteínas obrigatórias dos lipídios

CAPES : Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

CASA : Análise de sêmen auxiliada por computador

CLONE : Cryogenics Laboratory of New England

cm : Centímetro

CNPq

DMSO

: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico

: Dimetilsulfoxido

FAVET : Faculdade de Veterinária

FUNCAP : Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico

g

h

IA

HOST

: Gramas

: Horas

: Inseminação artificial

: Teste hiposmótico

L : Litro

xii

LDL : Lipoproteína de baixa densidade

LRC

min

: Laboratório de Reprodução de Carnívoros

: Minutos

mL : Mililitros

mOsmol : Miliosmol

MP : Motilidade progressiva

MT : Motilidade total

Ph

s

: Potencial hidrogeniônico

: Segundos

SCA

SMI

SQA

: Sperm Class Analyser

: Indice de motilidade espermática

: Sperm Quality Analizer

sptz : Espermatozóide

sptz/mL

STR

TES

TTR

: Espermatozóides por mililitro

: Retilinearidade

: N-tris-metil2ácido sulfônico aminometano

: Teste de termo resistência

TRIS : Tris-hidroximetil-aminometano

UECE : Universidade Estadual do Ceará

v/v : Volume a volume

VAP : Velocidade média da trajetória

VCL : Velocidade curvilinear

VSL : Velocidade linear

µL : Microlitro

xiii

LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO 1 Página

Figura 1. Porcentagem média ± DP de células com acrossoma intacto do sêmen a fresco e descongelado a 37°C/60s, 55°C/5s e 75°C/8s.

38

Figura 2. Porcentagem média ± DP de células com cauda enrolada do sêmen a fresco e descongelado a 37°C/60s, 55°C/5s e 75°C/8s.

39

Figura 3. Média ± DP do pH de amostras do sêmen a fresco e descongelado a 37°C/60s, 55°C/5s e 75°C/8s.

39

CAPÍTULO 2

Figura 1. Porcentagem média ± DP de células com acrossoma normal do sêmen a fresco e descongelado a diferentes tempo de equilíbrio ( 0h / 1h / 2h)

58

Figura 2. Média ± DP do pH de amostras do sêmen a fresco e descongelado a diferentes tempos de equilíbrio (0h, 1h, 2h).

59

Figura 3. Porcentagem média ± DP de células com cauda enrolada de amostras do sêmen a fresco e descongelado a diferentes tempos de equilíbrio (0h, 1h, 2h).

59

xiv

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 1

Página

Tabela 1. Média ± desvio padrão do pH, volume, da concentração, motilidade, vigor, morfologia e acrossomas intactos do sêmen a fresco (n = 10 ejaculados).

35

Tabela 2. Média ± desvio padrão da motilidade espermática pós-descongelação em três diferentes taxas de descongelação (37ºC / 60 s, 55ºC / 5 s e 75ºC / 8 s) nos tempos 0, 30, 60, 90, 120min após a descongelação.

36

Tabela 3. Média ± desvio padrão do vigor espermático entre três diferentes taxas de descongelação (37ºC / 60 s, 55ºC / 5 s e 75ºC / 8 s) nos tempos 0, 30, 60, 90, 120min após a descongelação.

37

Tabela 4. Média ± desvio padrão das alterações morfológicas primárias e secundárias da cabeça, peça intermediária e cauda e do total de espermatozóides normais em relação ao sêmen fresco e aos tratamentos 37°C/60s, 55°C/5s e 75°C/8s.

38

CAPÍTULO 2

Tabela 1. Média ± desvio padrão da concentração, motilidade, vigor, espermatozóides normais, alterações morfológicas e acrossomas intactos do sêmen a fresco (n = 10 ejaculados).

54

Tabela 2. Média ± desvio padrão da motilidade espermática pós-descongelação em três diferentes tempos de equilíbrio (0h / 1h / 2h) nos tempos 0, 30, 60, 90, 120min após a descongelação.

55

Tabela 3. Média ± desvio padrão da motilidade espermática pós-descongelação em três diferentes tempos de equilíbrio (0h / 1h / 2h) nos tempos 0, 30, 60, 90, 120min após a descongelação.

55

Tabela 4. Média ± desvio padrão da % de SPTZ com velocidade rápida pós-descongelação em três diferentes tempos de equilíbrio (0h / 1h / 2h) nos tempos 0, 30, 60, 90, 120min após a descongelação

56

Tabela 5. Média ± desvio padrão da % de SPTZ com velocidade média pós-descongelação em três diferentes tempos de equilíbrio (0h / 1h / 2h) nos tempos 0, 30, 60, 90, 120min após a descongelação

56

Tabela 6. Média ± desvio padrão da VAP dos SPTZ com velocidade rápida pós-descongelação em três diferentes tempos de equilíbrio (0h / 1h / 2h) nos tempos 0,

57

xv

30, 60, 90, 120min após a descongelação

Tabela 7. Média ± desvio da VAP dos SPTZ com velocidade média pós-descongelação em três diferentes tempos de equilíbrio (0h / 1h / 2h) nos tempos 0, 30, 60, 90, 120min após a descongelação

57

Tabela 8. Média ± desvio padrão das alterações morfológicas primárias e secundárias da cabeça. Peça intermediária e cauda e do total de espermatozóides normais em ralação ao sêmen fresco e aos tratamentos 0h, 1h e 2h.

58

xvi

SUMÁRIO

RESUMO........................................................................................................................ ix

ABSTRACT.................................................................................................................... x

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS............................................................... xi

LISTA DE FIGURAS..................................................................................................... xiii

LISTA DE TABELAS.................................................................................................... xiv

1. INTRODUÇÃO........................................................................................................... 1

2. REVISÃO DE LITERATURA................................................................................... 3

2.1. Criopreservação do sêmen............................................................................... 3

2.2. Métodos de avaliação seminal......................................................................... 5

2.2.1 Motilidade e vigor................................................................................ 5

2.2.2 Morfologia espermática....................................................................... 6

2.2.3 Integridade acrossomal........................................................................ 7

2.2.4. Teste hipoosmótico............................................................................. 8

2.2.5 Teste de termoresistência..................................................................... 9

2.2.6 Sistema de análise seminal auxiliada por computador....................... 10

2.3. O diluente água de coco.................................................................................. 14

2.4. A gema de ovo................................................................................................ 16

2.5. O glicerol........................................................................................................ 18

2.6. Tempo de equilíbrio........................................................................................ 21

2.7. Taxa de descongelação.................................................................................... 22

3. JUSTIFICATIVA....................................................................................................... 25

4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS...................................................................................... 26

5. OBJETIVOS................................................................................................................ 27

5.1. Objetivo Geral................................................................................................. 27

5.2. Objetivos Específicos...................................................................................... 27

6. CAPÍTULO 1. Efeito da taxa de descongelação sobre o sêmen canino

criopreservado em um diluidor à base água de coco em pó (ACP-106®)......................

28

7. CAPÍTULO 2. Efeito do tempo de equilíbrio sobre a qualidade do sêmen canino

diluído em ACP - 106® e criopreservado a – 196°C.......................................................

46

8. CONCLUSÕES........................................................................................................... 67

9. PERSPECTIVAS........................................................................................................ 68

10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................... 69

xvii

11. ANEXOS................................................................................................................... 89

1

1. INTRODUÇÃO

O processo de conservação de sêmen ocasiona danos espermáticos, tais como:

redução da motilidade e do vigor, aumento das alterações morfológicas, entre outros que

implicam na redução da qualidade do sêmen preservado. A fim de minimizar esses danos,

foram identificadas substâncias de vital importância na tecnologia do sêmen designados de

diluidores (RODRIGUES, 1997).

Alguns pesquisadores têm tentado desenvolver diluidores alternativos que sejam

atóxicos, isotônicos, tenham atividade tamponante, sejam de baixo custo, práticos e eficientes.

Já há alguns anos, têm sido observados bons resultados na criopreservação do sêmen canino

utilizando-se, diluidores à base de água de coco in natura (CARDOSO et al., 2003). No

entanto, o uso desses diluidores apresenta desvantagens, como a baixa disponibilidade dos

frutos com características ideais para a sua fabricação e a impossibilidade de conservação por

longo período da água de coco em sua forma in natura. Ademais, a constituição bioquímica

de um fruto costuma ser bastante diferente dos demais, o que pode diretamente influenciar a

criopreservação da água de coco. Diante dessa problemática, novas pesquisas foram

conduzidas no intuito de se desenvolver a água de coco sob a forma de pó (ACP®). A forma

em pó apresenta os mesmos constituintes bioquímicos da forma in natura, porém é

padronizada e mais fácil de ser conservada, o que facilita sua comercialização para regiões

onde o fruto não existe.

Resultados iniciais comparando a água de coco na forma in natura e em pó

mostraram que ambas são similarmente eficientes na criopreservação de sêmen canino

(CARDOSO et al., 2004). Entretanto, esses resultados podem ainda ser melhorados, haja vista

que o protocolo de conservação no uso do diluidor ACP® precisa ainda ser aprimorado.

Diversos fatores podem interferir no sucesso da congelação de sêmen. Dentre

estes, destaca-se o tempo de equilíbrio. Segundo WATSON (1979), o tempo de equilíbrio

seria importante, tanto para permitir a entrada do glicerol na célula espermática, como para

permitir que as membranas espermáticas se acomodem ou que influxos iônicos ocorram em

maior grau. Para a congelação do sêmen canino com o diluidor ACP®, os poucos trabalhos

acerca do assunto não fazem uso de um tempo de equilíbrio e preconizam a exposição do

sêmen aos vapores de nitrogênio, imediatamente após a glicerolização. Desse modo, é

2

possível que a alteração do protocolo, através da inclusão de um tempo de equilíbrio após a

glicerolização possa incrementar os resultados pós-descongelação.

Outra fase crítica da criopreservação de espermatzóides é a metodologia aplicada

na descongelação, pois sabe-se que essa fase é responsável por vários danos às células.

Atualmente, existem vários protocolos preconizando diferentes temperaturas de

descongelação para o sêmen canino, as quais variam desde 37ºC por um minuto (SILVA et

al., 1998) a 98ºC por 6,5 segundos (NOTHLING et al., 2007). Convencionalmente, o

protocolo de congelação de sêmen canino com o ACP® preconiza a descongelação a 37ºC

(CARDOSO et al., 2004) por 1 minuto. Porém, não existem informações acerca da aplicação

de outras temperaturas de descongelação no uso deste diluidor para o sêmen de cães.

3

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Criopreservação do sêmen

A criopreservação do sêmen é uma biotecnologia de extrema utilidade para

criadores de cães. Dentre as principais vantagens dessa biotécnica pode-se destacar o fato de

que é possível armazenar o material genético de animais de alto valor zootécnico por um

período ilimitado, transmitindo as características desses animais por várias gerações mesmo

após a morte do animal. Além disso, a inseminação artificial (IA) com sêmen congelado

elimina os riscos de transmissão de algumas doenças sexuais, evita o estresse do animal com

o transporte e permite o aproveitamento de machos velhos ou cães que apresentam doenças

adquiridas que não estejam aptos a realizar a monta natural (STOCKNER, 1995).

ROWSON em 1954 foi quem primeiro obteve sucesso na criopreservação do

sêmen de cães, contudo o relato de nascimento de filhotes da espécie canina utilizando sêmen

congelado só foi notificado quinze anos mais tarde (SEAGER, 1969). No Brasil, a primeira

notificação de sucesso em inseminação artificial (IA) com sêmen canino congelado foi

realizada a pouco mais de 20 anos, tendo sido obtida uma ninhada de seis cães normais da

raça Boxer (VASKE et al., 1981).

A -196°C (temperatura do nitrogênio líquido) não existe água na forma líquida, de

tal forma que o ambiente celular é altamente viscoso e a difusão é insignificante, sendo assim

reações químicas não podem ocorrer (MAZUR, 1984). Diante disso, a criopreservação de

células vivas se fundamenta no fato de que, teoricamente, após o resfriamento e permanência

a temperaturas extremamente baixas, estas células entram em um estado de quiescência,

reduzindo o metabolismo e proporcionando uma diminuição nos gastos energéticos e na

produção de catabólitos tóxicos, contribuindo para a preservação celular e, dessa forma,

podem ser mantidas viáveis por longos períodos, de modo que após a descongelação

voltariam a desenvolver suas atividades normais (BATEMAN, 2001).

Infelizmente, ainda existem muitos fatores que influenciam na sobrevivência e

funcionalidade dos espermatozóides criopreservados. A maioria das alterações causadas pelo

estresse térmico se inicia na membrana espermática (JASKO, 1994; HOLT, 2000). A

alteração da temperatura, assim como alterações de osmolaridade, pressão ou pH podem

4

determinar mudanças na estrutura e organização da bicamada de fosfolipídios (GENNIS,

1989). A redução de temperatura de 37ºC a valores próximos de 4-5ºC pode levar ao rearranjo

inadequado de alguns fosfolipídios da membrana plasmática. Com este rearranjo, as

propriedades básicas da membrana biológica, como permeabilidade seletiva e difusão lateral

de proteínas não são mantidas, alterando a funcionalidade da membrana em questão

(WATSON, 1981; GENNIS, 1989; PARKS E GRAHAM, 1992; AMANN E GRAHAM,

1993; JASKO, 1994; WATSON, 1995; HOLT, 2000; WATSON, 2000). Segundo a revisão

de WATSON (2000), existem ainda alguns elementos do citoesqueleto espermático sensíveis

a alterações de temperatura, como é o caso dos filamentos de actina. O mesmo autor relatou

que a despolimerização da F-actina é uma das etapas necessárias para permitir a aproximação

da membrana plasmática e da membrana acrossomal externa, promovendo a exocitose

acrossomal e que, talvez, esta possa ser uma das explicações para a fusão desorganizada das

membranas após o resfriamento e a criopreservação dos espermatozóides.

Com o declínio constante da temperatura, as células estarão expostas à temperatura

de congelação (abaixo de 0ºC), e com isto, as células espermáticas serão expostas a alterações

de osmolaridade do meio que as circunda. A água presente no meio extracelular encontra-se

sob a forma de solução e com a congelação de parte desta água, a saturação de solutos

aumenta, tornando hipertônico o meio externo. Neste momento, para que um equilíbrio

osmótico seja atingido, ocorre um efluxo de água da célula a ser congelada para o meio

externo. Esta tentativa da célula em equilibrar o meio que a circunda pode levá-la a sofrer um

efeito deletério devido a grande desidratação e a exposição a um meio extremamente

saturado. Este efeito é chamado de Efeito de Solução e é considerado um dos pontos críticos

no processo de congelação das células espermáticas (MAZUR et al, 1972; WATSON, 1981;

WATSON, 1995; HOLT, 2000).

No que diz respeito à metodologia de congelação observa-se que existe uma ampla

variedade de protocolos. Em todas as metodologias busca-se minimizar o dano causado ao

espermatozóide pelo processamento, visando recuperar um máximo possível de

espermatozóides viáveis (STROM et al., 1997). O método de criopreservação de sêmen

canino mais usual é aquele descrito por ANDERSEN (1975). Neste método, foi realizada a

diluição do sêmen a 37ºC em Tris acrescido de gema de ovo e glicerol. Em seguida, foi

procedido um período de equilíbrio de três horas, seguido do envase em palhetas plásticas e a

exposição aos vapores de nitrogênio para só então mergulhar as palhetas em nitrogênio

5

líquido. Segundo HAMMERSTEDT et al. (1990) o processo de criopreservação do sêmen

ocorre em 5 fases : 1) diluição e resfriamento; 2) adição do crioprotetor; 3) congelação em

nitrogênio líquido; 4) armazenamento e 5) descongelação. Para esse pesquisador os métodos

para cada uma destas etapas devem ser desenvolvidos de acordo com a espécie, porque cada

etapa impacta de forma decisiva no sucesso da criopreservação.

2.2. Métodos de avaliação seminal

2.2.1. Motilidade e vigor

A motilidade espermática é definida como sendo a porcentagem de

espermatozóides móveis. Atualmente a maioria dos pesquisadores ainda utiliza a motilidade

como principal parâmetro para a avaliação da qualidade seminal. NOTHLINGH et al. (1997)

observaram que a taxa de gestação em cadelas inseminadas com sêmen congelado estaria

relacionada principalmente com o número de espermatozóides móveis após a descongelação,

contudo o sêmen que apresenta uma boa motilidade após a congelação pode apresentar

espermatozóides incapazes de realizar a fecundação em função de danos acrossomais

(PURSEL et al., 1972). NOTHLINGH et al. (1997) complementam que, além da qualidade

seminal, a detecção do momento ideal para a realização da inseminação é de fundamental

importância para o sucesso da inseminação artificial com o uso de sêmen congelado-

descongelado.

Este parâmetro deve ser avaliado depositando-se uma gota do sêmen entre lâmina

e lamínulas previamente aquecidas a 37°C ( SANTOS & VANNUCCHI, 1997). A amostra é

então avaliada em microscópio, no aumento de 100 ou 400x e, de forma subjetiva, será

avaliada a porcentagem de espermatozóides móveis. Uma amostra de sêmen normal deve

possuir motilidade superior a 70% e, no caso do sêmen congelado-descongelado,

CONCANNON & BATTISTA (1989) sugerem, para a espécie canina, uma motilidade acima

de 50% como ideal e, acima de 30% como aceitável para se proceder uma inseminação

artificial.

Outro parâmetro importante para avaliação da qualidade espermática e que deve

ser avaliado conjuntamente à motilidade é o vigor. Este parâmetro é definido como sendo a

velocidade de progressão do espermatozóide onde é atribuído uma nota que varia de 0 a 5

6

(DOBRINSKY et al., 1993). A presença de vigor 0 indica que o espermatozóide está imóvel,

e o vigor 5 indica que o espermatozóide apresenta um movimento flechante e retilíneo. Cães

normais devem apresentar vigor espermático superior a três (progressão moderada pra frente)

(DOBRINSKY et al., 1993).

2.2.2. Morfologia espermática

Um parâmetro de fundamental importância para avaliação da qualidade

espermática é a análise da morfologia das células, uma vez que, espermatozóides com

alterações morfológicas comprometem de forma significativa a fertilidade de machos tanto da

espécie canina como de outras espécies animais (OETTLÉ, 1993). Alguns estudos

correlacionam porcentagem de defeitos espermáticos e infertilidade no cão sendo reconhecido

que 80% ou mais dos espermatozóides no ejaculado devem ser livres de alterações estruturais

(ROOT E JHONSTON, 1994). OETTLÉ (1993) relatou que, na espécie canina, à medida que

se aumenta o percentual de espermatozóides anormais, a fertilidade é reduzida, sendo

observado que, quando a proporção de espermatozóides morfologicamente normais estava

abaixo de 60%, a fertilidade foi adversamente afetada.

Para a análise das alterações morfológicas existem dois principais métodos de

classificação. Um deles divide as alterações morfológicas em primárias e secundárias

(JOHNSTON et al., 2001). Segundo SEAGER (1986) as alterações morfológicas primárias

são aquelas relacionadas com problemas oriundos da espermatogênese, já as secundárias estão

relacionadas a problemas oriundos da maturação espermática no epidídimo ou durante as

fases de manipulação do sêmen, como colheita, diluição, resfriamento, congelação,

descongelação ou ainda após febre, trauma, processo infeccioso e administração de

glicocorticóides. O outro método de análise das alterações morfológicas classifica os

espermatozóides como apresentando defeitos maiores ou menores (OETTLÉ, 1993). Os

defeitos maiores são aqueles que comprometem gravemente a fertilidade, enquanto que os

menores são considerados defeitos de menor gravidade (OETTLÉ & SOLEY, 1988). Tanto

um método quanto o outro podem analisar as alterações de acordo com a sua localização, ou

seja, cabeça, peça intermediária e cauda (SEAGER, 1986; OETTLÉ, 1993).

Para a visualização da morfologia espermática existem vários métodos

disponíveis. Um deles é a realização de esfregaços de sêmen fixados com glutaraldeído ou

7

tampão salina formolizada para manter as características celulares e permitir uma observação

futura sendo então examinados por microscopia de contraste de fase (CBRA, 1998). A

morfologia também pode ser avaliada microscopicamente, após o uso de corantes Wright,

Rosa de Bengala, Diff-Quik, Spermac_ (PURSWELl et al., 1992; OETTLÉ & SOLEY, 1985;

STRÖM et al., 1997), Giemsa (CARDOSO et al., 2003), Hematoxilina-eosina (SILVA et al.,

2003) e eosina-nigrosina (PEÑA, 2000).

2.2.3. Integridade Acrossomal

De nada adianta uma amostra de sêmen que apresente uma porcentagem alta de

espermatozóides morfologicamente normais e excelentes motilidade e vigor se os acrossomas

encontram-se com algum tipo de alteração que comprometa sua funcionalidade, pois para a

ocorrência da fecundação é indispensável que esta estrutura seja capaz de realizar a reação

acrossômica.

O acrossoma é uma vesícula contendo várias enzimas hidrolíticas, incluindo pró-

acrosina, hialuronidase, esterases e hidrolases ácidas, envolvidas no processo de fecundação

(GARNER & HAFEZ, 1995), desempenhando um papel crucial na função espermática

(CARDOSO et al., 2005).

O armazenamento do sêmen a baixas temperaturas acarreta variadas alterações

nas membranas dos espermatozóides, principalmente no acrossoma. Por esse motivo a

observação da integridade do acrossoma é fundamental quando se faz necessária a

conservação do sêmen. Em sêmen de coelho foi encontrado correlação significativa entre

integridade acrossomal e os resultados de fertilização, mas a correlação não foi significativa

entre fertilização e motilidade espermática (HELLEMANN, 1976; WEITZE, 1977). No cão

foi encontrada relação entre motilidade espermática e integridade acrossomal no sêmen fresco

não diluído, o que não foi observado em amostras de sêmen diluído e congelado

(OETTLE,1986). PACE et al. (1981), estudando sêmen bovino, observaram correlação

positiva entre fertilidade e atividade da acrosina e foi observada em sêmen canino fresco,

diluído e congelado a correlação positiva entre fertilidade e integridade acrossomal

(FROMAN et al., 1984).

8

2.2.4. Teste hipoosmótico (HOST)

O HOST baseia-se na observação de que um espermatozóide, com uma membrana

celular íntegra, se colocado em solução hipoosmótica, permite a passagem da água pela

membrana celular até o restabelecimento do equilíbrio osmótico entre os fluidos extra e

intracelulares (SANTOS et al., 2001). Com o influxo da água para o interior da célula, há um

aumento do volume celular (edema), com posterior enrolamento da cauda (JEYENDRAN et

al., 1984).

VON KOLLIKER (1856) apud PINTO & KOZINK (2007), estudando a fisiologia

do sêmen de diversas espécies de mamíferos, relatou primeiramente que os epermatózoides

expostos à água tornam-se imóveis e edemaciados, um fenômeno que poderia ser invertido

colocando os espermatozóides imóveis em soluções capazes de repor a isotonicidade

(soluções salinas, plasma seminal ou soro). DREVIUS (1963) relatou que as caudas de

espermatozóides de touros enrolavam quando estes eram expostos a soluções hipotônicas, um

fenômeno documentado também para o sêmen de coelho e do ser humano (DREVIUS &

ERIKSSON, 1966). Segundo estes autores, o aumento no volume sofrido pelo

espermatozóide exposto a condições hipoosmóticas ocorre com um mínimo de aumento na

sua área superficial. Assim, após a expansão da membrana plasmática da sua cauda, os

filamentos axiais flexíveis iniciam um processo de enrolamento, conferindo uma aparência

mais esférica a célula espermática.

Até então não era atribuída nenhuma aplicabilidade do HOST para indicar a

capacidade funcional da membrana dos espermatozóides e isso só foi feito posteriormente por

JEYENDRAN et al., (1984). Nesse trabalho, o grau de resposta do espermatozóide quando

em um meio hiposmótico foi correlacionado com a habilidade da célula de penetrar oócitos de

hamsters. Em um estudo subseqüente, concliu-se que a resposta do espermatozóide a um meio

hiposmótico era um indicativo da capacidade de fertilização in vitro em seres humanos (VAN

DER VEM et al., 1986).

ENGLAND & PLUMMER (1993) foram quem primeiro realizaram o HOST em

cães e relataram o edemaciamento dos espermatozóides caninos em meio hiposmótico. Esses

pesquisadores concluíram que o HOST era um método apropriado para avaliar a integridade

da membrana podendo dessa forma ser incorporado em análises rotineiras do sêmen, contudo

demonstraram não existir correlação entre a porcentagem de espermatozóides edemaciados

9

com outros parâmetros, como motilidade, morfologia e porcentagem entre vivos e mortos. Por

outro lado recentemente PINTO & KOZINK (2007) concluíram que o HOST resultou em

uma correlação significativa com a motilidade e viabilidade do sêmen fresco e congelado-

descongelado. INAMASSU et al., (1999) demonstraram que existe correlação entre a turgidez

espermática e a morfologia espermática em resposta ao HOST.

JEYENDRAN et al. (1984), ao descreverem a utilização da técnica para avaliação

do espermatozóide humano, testaram soluções com osmolaridades que variaram de 50 a 300

mOsmol, obtendo os melhores índices de reação espermática ao teste ao utilizarem soluções a

150 mOsmol/L, ou menos. Os mesmos autores também testaram diferentes solutos (citrato de

sódio, sucrose, melitose, frutose e cloreto de sódio) e associações entre eles, e verificaram que

a taxa de reação espermática variava de acordo com a solução usada, dentro da mesma faixa

de osmolaridade. Esses pesquisadores obtiveram os melhores resultados com a utilização da

associação entre citrato de sódio (50%) e frutose (50%) a 150 mOsmol/L, incubada por 30

minutos a 37°C, razão por que escolheram esse protocolo como padrão para todos os outros

experimentos a serem realizados futuramente. Quando o edemaciamento do sêmen canino foi

avaliado pelo teste hipoosmótico, recomendou-se a incubação do sêmen em meio

hipoosmótico por 30-60 minutos (ENGLAND & PLUMMER, 1993; KUMI-DIAKA, 1993;

KUMI-DIAKA & BADTRAM, 1994; RODRIGUEZ-GIL-GIL et al., 1994), contudo em um

estudo mais recente, PINTO & KOZINK (2007), observaram que tanto faz incubar o sêmen

em meio hipoosmótico por 1min ou por 60min . INAMASSU et al., (1999), recomendaram

como protocolo pra realização do teste a mistura de 0,1 mL do sêmen em 0,9 mL da solução

hipoosmótica (150 mOsmol). HISHINUMA & SEKINE, 2003 utilizaram água destilada como

uma solução hipoosmótica e concluiram que essa solução seria adequada para realização do

teste.

2.2.5. Teste de termoresistência (TTR)

O teste de termoresistência (TTR) foi proposto por DIMITROPOULOS (1967),

para a avaliação do potencial de fertilidade do sêmen congelado de bovinos, sendo adaptado

posteriormente para outras espécies. Esse teste consiste na incubação, em banho-maria, de

uma amostra de sêmen descongelado, a uma temperatura e por um tempo pré-determinado, de

acordo com a espécie animal.

10

Geralmente a motilidade espermática e o vigor espermático são as variáveis

analisadas durante a execução do teste (BITTENCOURT, 2006), mas caso seja possível a

realização de análise computadorizada, outros parâmetros também podem ser avaliados.

O TTR obteve grande aceitação, pois submete o sêmen a condições de

temperatura semelhantes à que fica exposto no trato genital de fêmeas em estro,

demonstrando e testando a capacidade de resistência do sêmen pós-inseminação

(BITTENCOURT, 2006) e segundo DIMITROPOULOS (1967), esse teste apresentou uma

correlação positiva e altamente significativa com a fertilidade a campo em bovinos.

No tocante a realização desse teste na espécie canina, STRÖM et al. (1997)

relataram que a termorresistência pós-descongelação pode ser mais baixa para o

espermatozóide canino, do que para outras espécies. Além disso, observaram que o

espermatozóide canino mesmo com uma baixa termorresistência não tem, necessariamente,

um baixo potencial fertilizante, visto que o sêmen congelado, com o método CLONE,

apresentou uma baixa termorresistência e mostrou índices de fertilidade de 59,3% e 86,4%,

após inseminação vaginal e intra-uterina, respectivamente (GOVETTE et al., 1996). Por todos

esses motivos, OLAR (1984) sugere que a avaliação da motilidade imediatamente após a

descongelação pode ser mais importante do que a sobrevivência espermática após um longo

período de incubação.

De acordo com os resultados obtidos por esses pesquisadores percebe-se que é

duvidoso relacionar o TTR com a fertilidade do sêmen canino. O argumento de que esse teste

mimetiza o trato genital das fêmeas não é de todo verdade, visto que a única variável em

comum é a temperatura. Sendo assim é bem provável que o ambiente do trato genital da

fêmea seja incomparavelmente mais adequado para sobrevivência dos espermatozóides. Em

vista disso, fazem-se necessários mais estudos para que se possa saber até que ponto se avalia

com segurança a fertilidade do sêmen por meio desse teste.

2.2.6 Sistema de analise seminal auxiliada por computador (CASA)

Até recentemente, a microscopia óptica tem sido usada rotineiramente para avaliar

os parâmetros principais do sêmen do cão, sendo esta uma avaliação subjetiva baseada na

avaliação dos parâmetros motilidade, vigor, concentração espermática e anormalidades

11

morfológicas. Porém, este método clássico, apresenta limitações como a subjetividade e a

variabilidade (OETTLE et al., 1993, IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001a), além de ser

influenciada pela temperatura e pelas habilidades do avaliador, levando a uma elevada

variabilidade entre os laboratórios e os observadores ( IGUER-OUADA & VERSTEGEN et

al., 2001b). A qualidade da avaliação depende da qualidade do microscópio, da experiência

do observador e da técnica de fixação e coloração utilizada para análise de morfologia (PEÑA

& LINDE-FORSBERG et al.,1999; PEÑA et al., 1999 ).Uma fonte adicional da variação do

laboratório é o número relativamente baixo dos espermatozóides analisados com estas

técnicas convencionais (PEÑA et al., 1998).

As variações relatadas na estimação da motilidade espermática (MORTIMER et

al., 1986) e dos parâmetros morfológicos (BAKER et al., 1987; KRUGER et al., 1995) do

mesmo ejaculado avaliado por observadores diferentes implicam uma necessidade absoluta

para métodos objetivos e padronizados, para as finalidades clínicas e das pesquisas

reprodutivas (IGUER-OUADA & VERSTEGEN , 2001b; SMITH & ENGLAND, 2001 ).

Isto conduziu ao desenvolvimento de diversos dispositivos de medição semi-computarizado

(IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001a, ENGLAND & ALLEN, 1990; RIJSSELAERE et

al., 2002) e computarizado (IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001b; RIJSSELAERE et

al., 2003, 2004; SMITH & ENGLAND, 2001) para a avaliação da qualidade do sêmen

canino.

A análise seminal auxiliada por computador (CASA) foi primeiramente proposta

por DOTT & FOSTER há 20 anos e é usada atualmente em diversos centros andrológicos

humanos e veterinários. Sua primeira descrição para a análise seminal do cão foi relatada por

GÜNZEL-APEL et al., (1993) e atualmente tem sido utilizada por diversos pesquisadores

(RIJSSELAERE et al., 2003, SCHÄFER-SOMI & AURICH, 2006; ROTA et al., 2006;

SILVA, 2005).

AMANN & KATZ (2004) definiram a análise de sêmen assistida por computador

(CASA) como um sistema automatizado que visualiza, digitaliza e analisa imagens sucessivas

dos espermatozóides, fornecendo informação acurada e precisa que se baseia na avaliação

individual do espermatozóide, calculando, de forma rápida, diferentes parâmetros seminais,

tais como a motilidade total, motilidade progressiva, linearidade e vários parâmetros de

velocidade como: a velocidade curvilinear (VCL) que é a velocidade da trajetória real do

12

espermatozóide, velocidade média da trajetória (VAP) , que é a velocidade média da trajetória

do espermatozóide, velocidade linear (VSL), que é a velocidade em função da linha reta

estabelecida entre o primeiro e último ponto da trajetória do espermatozóide (RIJSSELAERE

et al., 2003; IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001) (figura 1), amplitude do deslocamento

lateral da cabeça (ALH) definida como o deslocamento médio da cabeça do espermatozóide

em sua trajetória real em relação à trajetória média ou linear, freqüência de batimento cruzado

(BCF) definida como freqüência que a cabeça do espermatozóide atravessa a trajetória média.

e retilinearidade (STR) definida como a relação percentual entre VSL e VAP.

Além destas avaliações, o CASA realiza a subdivisão das populações

espermáticas de acordo com a categoria de seus movimentos, em rápidos, médios, lentos e

espermatozóides estáticos (RIJSSELAERE et al., 2007), e ainda permite a avaliação da

morfologia e concentração espermática (RIJSSELAERE et al., 2005).

Durante a última década, diversos sistemas comerciais do CASA (

videomicrografia computadorizada CellSoft, analisador do movimento das células de

Strömberg-Mika, Hobson Sperm Tracker, e Hamilton-Thorne-Thorne), baseados

predominantemente na avaliação individual do espermatozóide, foram validados para o uso

nos cães (IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001a ,2001b,. SMITH & ENGLAND, 2001,

GÜNZEL-APEL, 1993, RIJSSELAERE et al., 2003). Diversos estudos encontraram

correlações elevadas entre a motilidade, a motilidade progressiva e a concentração calculada

13

com auxilio do computador e a avaliação microscópica óptica convencional (GÜNZEL-

APEL, 1993, RIJSSELAERE et al., 2003 IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001b). Os

problemas principais destes dispositivos de medição computarizados são os custos de

investimento elevados e a necessidade de padronização e validação do sistema antes que todo

o uso prático esteja possível (IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001b, RIJSSELAERE et

al., 2003, SMITH & ENGLAND, 2001). No entanto, há disponível um equipamento com um

preço mais acessível, o analisador de qualidade espermática (Sperm Quality Analyzer-SQA,

United Medical Systems Inc., Santa Ana, CA, USA), que já foi validado para a avaliação do

sêmen canino criopreservado (IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001a, 2001b). Esse

equipamento registra variações na densidade óptica, convertendo essa informação, por

cálculos matemáticos, em um índice de motilidade espermática (SMI). Tal procedimento

mostrou uma boa repetibilidade de resultados em amostras seminais de boa e ótima qualidade,

observando altas correlações entre vários parâmetros seminais (IGUER-OUADA &

VERSTEGEN, 2001).

Em cães, as alterações significativas das características da motilidade medidas por

sistemas de CASA foram descritas devido à diluição da amostra do sêmen (RIJSSELAERE et

al., 2003, SMITH & ENGLAND, 2001), do diluente usado (RIJSSELAERE et al., 2003,

SMITH & ENGLAND, 2001), da temperatura da análise (SMITH & ENGLAND, 2001) e da

câmara de contagem (IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001b). Uma vez que estes

sistemas foram padronizados, um grau elevado de repetibilidade pode ser conseguido com

coeficientes de variação inter- e intra ensaios <12% para maioria dos parâmetros (IGUER-

OUADA & VERSTEGEN, 2001b ; SMITH & ENGLAND, 2001).

RIJSSELAERE et al (2003) avaliando o emprego da análise computadorizada

para sêmen de cães afirmaram que sem a atenção aos ajustes técnicos, sobreduto da

padronização e do processamento do sêmen, os sistemas do CASA podem fornecer dados

enganadores ou errôneos. Entretanto, uma vez que o sistema é padronizado para espécie,

podem oferecer uma análise rápida e objetiva de um grande número de espermatozóides, e

podem gerar uma caracterização muito detalhada da dinâmica espermática. Além disso, este

dispositivo melhora significativamente a exatidão e a precisão de métodos subjetivos

existentes da análise do sêmen do cão e faz a comparação entre laboratórios possível.

14

SILVA (2005), verificou uma relação significativa entre padrões de motilidade

avaliados pelo CASA: VAP, VSL e freqüência de batimento cruzado (BCF), com interações

in vitro entre espermatozóides caninos congelados/descongelados e oócitos homólogos,

evidenciando assim a utilização do CASA como uma ferramenta auxiliar para avaliação

espermática canina.

2.3. O diluente água de coco

Há cerca de duas décadas, a água de coco começou a freqüentar laboratórios de

pesquisadores brasileiros interessados no potencial do produto como meio de conservação

celular. Aos poucos, percebeu-se que o produto, muito mais que uma bebida saborosa e

nutritiva, oferece uma variada possibilidade de utilização nas áreas da medicina, da

veterinária, da biologia, entre outras (GALIZA, 2007).

A água proveniente do fruto do coqueiro Cocos nucifera L. (membro da família

Palmae) é uma solução estéril, ácida que corresponde a aproximadamente 25% do peso do

fruto, possuindo um volume de aproximadamente 400 ml e sua composição básica apresenta

93% de água, 5% de açúcares, além de proteínas, vitaminas, sais minerais, fatores de

crescimento (fitormônios) e um baixo teor fosfolipídeo (LAGUNA, 1996). Com composição

química semelhante à das bebidas isotônicas, é considerada como um repositor de sais

podendo ser utilizada na forma de soro oral ou intravenoso, em casos de cólera, problemas

intestinais e estomacais (ANZALDO et al., 1985., MACIEL et al., 1992). O produto sofre

mudanças na sua composição durante o desenvolvimento do fruto. Além do grau de

maturação, outros fatores como variedade, região e época do ano também têm influência

sobre as suas características físico-químicas (JAYALEKSHMY et al., 1984., MACIEL et al.,

1992)

Dentre os componentes da água de coco têm-se os açúcares que, no início da

maturação, apresentam-se na forma de açúcares redutores (glicose e frutose), cujas

concentrações alcançam níveis máximos de 5%, próximo ao 6° e 7° mês, período em que a

quantidade de água também é maior. Com a maturação, a concentração de açúcares redutores

diminui em até 1%, porém são formados açúcares não-redutores (sacarose), sendo, ao final da

maturação, o teor de açúcares totais de, aproximadamente, 2% (CAMPOS et al., 1996,

JAYALEKSHMY et al., 1984 apud MAGALHÃES et al., 2005).

15

A água de coco contém ainda outros compostos que mostram atividades

semelhantes àquelas das citocininas e que são derivados das purinas (difeniluréia), possuindo

uma ação benéfica na motilidade espermática de espécies como caprinos ovinos e caninos

(NUNES & SALGUEIRO, 1999, UCHOA, 2002). O isolamento da citocinina na água de

coco foi realizado por LETHAM (1974 apud NUNES & COMBARNOUS, 1995). Depois de

várias pesquisas, verificou-se que a auxina principal era o ácido 3-indol-acético (LETHAM,

1974 apud NUNES &COMBARNOUS, 1995).

A água de coco in natura proveniente de frutos com idade de seis meses

(variedade verde da praia) apresenta uma osmolaridade em torno de 500 mOsmol/L e um pH

de 4,5 a 5,0 (NUNES & COMBARNOUS, 1995). Para uma perfeita compatibilização da água

de coco in natura como diluente para o sêmen canino, deve ser feita uma correção da

osmolaridade para 300-310 mOsmol/L e do pH para 6,2 a 6,6 (SILVA, 1999). Para tal

correção, após filtrar a água de coco, adiciona-se água destilada e uma solução de citrato de

sódio a 5% (NUNES, 1995).

A solução citada anteriormente já foi utilizada com eficiência na congelação de

sêmen canino (CARDOSO et al., 2003b). Testando-se alguns outros protocolos, observaram-

se melhores resultados (aproximadamente 50% de espermatozóides móveis) utilizando a

solução citada anteriormente contendo 20% de gema de ovo e 6% de glicerol.

Mesmo com os avanços do processamento da água de coco na forma líquida, a

mesma, depois de acondicionada e armazenada não pára seu metabolismo. CAMPOS et al.

1996 observaram a presença das enzimas polifenoloxidase e peroxidase na água de coco

verde. Estas enzimas apresentam o máximo de atividade em pH 6,0 e 5,5 e a temperatura de

25°C e 35°C, respectivamente. Sabe-se que estas enzimas podem estar relacionadas com as

alterações organolépticas que ocorrem após a extração da água do fruto e que catalisam

reações que estão associadas à deterioração de diversos nutrientes (GALEAZZI, 1984). Isso

levou o pesquisador José Ferreira Nunes durante as décadas de 80 e 90 à elaboração de um

produto genuinamente nordestino à base de água de coco em pó (ACP®).

A grande vantagem da água de coco em pó deve-se ao fato de que uma vez

processada, não modifica sua composição até sua utilização, garantindo um “padrão”

confiável (GALIZA, 2007)

16

Tal produto foi registrado como ACP ® (ACP Biotecnologia ®, Fortaleza - Ceará,

Brasil). A água de coco em pó, após reconstituição, foi testada para a refrigeração do sêmen

de eqüinos (SAMPAIO-NETO et al., 2002), diluição para IA em caprinos (SALGUEIRO et

al., 2002), refrigeração do sêmen de cães (MADEIRA et al, 2004), congelação do sêmen de

cães (CARDOSO et al, 2005) mostrando bons resultados.

2.4. A gema de ovo

A gema de ovo tem sido utilizada para aumentar a habilidade de fertilização do

espermatozóide quando presente nos diluidores para o armazenamento do sêmen na

temperatura ambiente (DUNN et al., 1950; SHANNON & CURSON, 1983) e parece prevenir

danos às células espermáticas durante o resfriamento e congelação (PHILLIPS & LARDY,

1940; DE LEEUW et al., 1993). Entretanto, o mecanismo pelo qual esta proteção é fornecida

ao espermatozóide permanece desconhecida. É especulado que a fração lipoprotéica de baixa

densidade (LDL) contida na gema de ovo associa-se com a membrana do espermatozóide e

promova a proteção ao espermatozóide estabilizando a membrana, contudo alguns autores

questionam a estabilidade da associação de LDL com a membrana do espermatozóide

(WATSON, 1975; FOULKES, 1977; MACDONALD & FOULKES, 1981). Uma segunda

hipótese sugere que os fosfolipídios presentes nas LDL protegem os espermatozóides por

formar uma película protetora na superfície do espermatozóide (QUINN et al., 1980) ou por

substituição dos fosfolipideos da membrana dos espermatozóides que são perdidos ou

danificados durante o processo de criopreservação (FOULKES et al., 1980; GRAHAM &

FOOTE, 1987). Essa película protetora é formada por esferas de lipoproteínas que contem

lipídios neutros de tamanho variável, rodeado de uma capa de lipoproteína composta

principalmente de glicoproteínas e fosfolipídios, cujos grupos hidrófobos se orientam para o

interior e os grupos hidrófilos para a superfície (EVANS et al., 1973). Um estudo recente

mostrou que a fosfatidilcolina da gema de ovo associa-se com a membrana do espermatozóide

e protege o sêmen do garanhão tão eficientemente quanto a gema de ovo; entretanto, aqueles

fosfolipídios não são incorporados na membrana espermática (RICKER et al., 2006). Uma

terceira hipótese sugere que as LDLs competem com os peptídeos catiônicos do plasma

seminal prejudicial à membrana do espermatozóide e assim protegem os espermatozóides.

(VISHWANATH et al.,1992). Recentemente BERGERON & MANJUNATH (2006)

descobriram que uma família de proteínas obrigatórias dos lipídeos (proteínas de BSP)

presente no plasma seminal do touro interage com a LDL e que esta interação parece ter

17

efeitos significativos na preservação da integridade do espermatozóide (MANJUNATH et al.,

2002; BERGERON et al., 2004). Segundo FOULKES (1977), a gema de ovo previne também

a liberação da enzima hialuronidase pela célula espermática.

Para a preservação do sêmen canino, uma variedade de concentrações de gema de

ovo tem sido utilizada. Visto que a mesma também tem uma capacidade de tampão, sua

quantidade no meio varia de acordo com a capacidade tamponante dos outros componentes do

diluente (FARSTAD, 1996). As amostras de gema de ovo comumente utilizadas na

congelação de sêmen canino são em média 15 – 30% do volume total. Esta variação na

concentração é baseada nos resultados obtidos por VAN DEMARK et al., (1957), onde o

percentual de espermatozóides móveis após congelação e descongelação foi similar entre

estas concentrações. SILVA et al., (2000) constataram uma superioridade do diluidor à base

de Tris contendo 20% de gema de ovo em relação a concentração de 10% de gema de ovo

quanto aos parâmetros de vigor, alterações espermáticas totais e secundárias. DAVIES (1982)

obteve melhores taxas de sobrevivência pós-descongelação incluindo 20% de gema de ovo,

frente a 5% (v/v), no entanto, não encontrou diferenças significativas na motilidade pós-

descongelação quando comparou taxas de 10 e de 20% (v/v), se bem que, nos resultados

absolutos a motilidade pós-descongelação foi superior quando utilizava 20%. LOPES-NETO

et al., (2006) testaram diferentes concentrações de gema de ovo (5%, 10% e 20%) acrescidas

ao diluidor a base de água de coco em pó e não obtiveram diferenças em relação aos

parâmetros observados. Nesse contexto, as maiorias dos autores utilizam concentrações de

gema em torno de 20% no diluente (FARSTAD & ANDERSEN-BERG, 1989; LINDE-

FORSBERG & FORSBERG, 1989; SILVA, 2001; MARTINS, 2005).

A gema de ovo, sendo um produto de origem animal, representa um risco

potencial de contaminação do sêmen e sua composição não é uniforme. Conseqüentemente,

está aumentando o interesse de diluidores livres de produtos da origem animal para

armazenagem do sêmen (MANJUNATH et al., 2002; BERGERON et al., 2004). Por essas

razões, pesquisas visando sua substituição por outros lipídios sintéticos e purificados foram

conduzidas e observaram que os análogos do hidroxitolueno butilado (BHT) são interessantes

substitutos para a gema, por também protegerem a membrana plasmática da injúria do choque

térmico (FARSTAD, 1996). Estudos recentes mostraram ser possível a purificação das LDL,

permitindo sua utilização em substituição à gema de ovo integral (MOUSSA et al., 2002).

VARELA JR. et al. (2004) avaliaram o efeito de diferentes concentrações de LDL purificada

18

adicionada ao diluente Tris para a refrigeração do sêmen do cão a 5ºC e observaram que

concentrações entre 6 e 10% de LDL são tão eficientes quanto o uso de 20% de gema de ovo

integral. Entretanto, a literatura ainda é escassa de informações quanto ao uso das LDL na

tecnologia de sêmen de cães.

Além de sua ação em proteger a membrana espermática, a gema de ovo é também

conhecida por servir como uma fonte protéica para o diluente (SANTOS, 2004).

2.5. O glicerol

Para a criopreservação dos espermatozóides faz-se necessário a adição de

substâncias que protejam estas células contra os danos oriundos da congelação. Muitos são os

compostos de ação crioprotetora, os quais são tradicionalmente classificados como tendo ação

intra ou extracelular. Dentro do grupo de ação intracelular, se incluem os álcoois, etanol,

etilenoglicol, glicerol, metanol e polietilenoglicol (DE LEEUW et al., 1993) e também as

amidas, incluindo a acetamida, formamida, lactamida e bem como o dimetilsulfoxido

(DMSO) (JEYENDRAN & GRAHAM, 1980; ASHWOOD – SMITH, 1987; MEDEIROS et

al., 2002). Já no grupo de ação extracelular se incluem açúcares, lipoproteínas da gema do

ovo e proteínas do leite (AMANN & PICKETT, 1987) e polivinil-pirrolidona (ENGLAND,

1993).

POLGE et al., (1949), demonstraram a eficácia do glicerol como crioprotetor

universal e desde então essa substância vem sendo amplamente utilizada. PARKS &

GRAHAM (1992) sugeriram que o glicerol penetra a célula através da difusão passiva,

permanecendo tanto na membrana quanto no citoplasma. GRAHAM (1996) verificou que a

difusão do glicerol é de 30 a 60 vezes mais lenta que a da água. A primeira conseqüência da

adição do glicerol em um meio isotônico é uma alteração de volume celular devido a uma

rápida saída de água intracelular (enrugamento celular), seguido por um lento retorno ao

volume original à medida que o crioprotetor penetra na célula (HAMMERSTED &

GRAHAM, 1990; PEÑA, 1997). O modo pelo qual o glicerol atua não se encontra totalmente

elucidado. Acredita-se que a ação protetora deste crioprotetor é atribuída a suas propriedades

coligativas e ligantes com a água, diminuindo o ponto de congelação da solução, o qual é

determinado como a temperatura onde ocorre a formação dos primeiros cristais de gelo.

Numa solução contendo glicerol, no momento em que ocorrer a congelação restará mais água

19

descongelada do que numa solução sem glicerol, havendo com isso, um aumento do volume

dos canais de solvente não congelado e uma menor concentração de sais nesses canais

(KEITH, 1998) o que reduz com isso os danos do efeito de solução (PEÑA, 1997; HOLT,

2000).

Apesar de imprescindíveis para a sobrevivência dos espermatozóides no processo

de congelação, o glicerol apresenta efeitos tóxicos para estas células (HOLT, 2000a). Por

promover a remoção da água intracelular o glicerol acarreta o encolhimento celular e o

influxo de íons, no entanto, a descongelação proporciona o efeito inverso, consequentemente,

há o influxo de água podendo ocasionar a ruptura da membrana (HOLT, 2000b). O

espermatozóide dos mamíferos comporta-se como um osmômetro linear, ocorrendo morte

celular caso haja intumescimento ou encolhimento do mesmo quando submetido a níveis

superiores da tolerância osmótica espécie específica. As lesões da membrana plasmática

podem também estar relacionadas de maneira secundária ao rápido movimento da água

através desta (BALL & VO, 2001). Sua toxicidade pode resultar também na inibição da

atividade enzimática (FAHY, 1986), na desnaturação de proteínas e as alterações das

interações da actina (FAHY, 1990) e originar danos acrossomais (HOLT, 2000). Segundo

HAMMERSTEDT & GRAHAM (1992) o glicerol induz a mudanças nos eventos

citoplasmáticos por aumentar a viscosidade ao penetrar a célula espermática, causando

alterações na polimerização da tubulina, na associação dos microtúbulos, no balanço

bioenergético, além de atuar diretamente de modo prejudicial na membrana plasmática, no

glicocálix e nas proteínas de superfície celular. A fusogenicidade da membrana e o padrão de

respostas induzidas por sinais extracelulares podem ser alterados devido a estas mudanças

causadas pela inclusão do glicerol à membrana espermática, podendo este fato contribuir para

a diminuição da sobrevivência espermática posterior ao processo de

congelação/descongelação e acelerar a capacitação espermática (WATSON, 1995).

No intuito de se conseguir o máximo efeito crioprotetor com o mínimo de efeitos

tóxicos, vários pesquisadores vêm testando diferentes concentrações de glicerol no diluidor a

fim de determinar a concentração ideal. Segundo ENGLAND (1992) a concentração de

glicerol para a congelação do sêmen de cão varia de 4 a 11%. Para OLAR et al., (1989) e

ROTA et al., (1998) os melhores resultados foram obtidos com concentrações variando entre

2 e 8% no volume de sêmen diluído. PEÑA et al., (1998) compararam concentrações de 2, 4,

6 e 8% de glicerol para congelação do sêmen canino, e concluíram que a glicerolização na

20

proporção de 8% proporcionou os melhores índices de motilidade, viabilidade e morfologia

espermática na pós-descongelação. SILVA et al., (2002d) testaram as concentrações de 4, 6 e

8% de glicerol para a congelação do sêmen canino e verificaram que a morfologia

espermática era melhor preservada, quando utilizada a concentração de 6%. SANTOS et al.,

(2003) compararam as concentrações de 4, 6, 8 e 10% de glicerol e concluíram que a

crioproteção do glicerol, na concentração de 8% em associação ao diluente a base de Tris-

gema preservou melhor as características morfofisiológicas do espermatozóide canino.

CARDOSO et al (2003a) testaram as concentrações de 4,6 e 8% de glicerol no diluidor a base

de água de coco não observando diferenças em relação aos parâmetros avaliados.

O efeito da temperatura de adição de glicerol tem sido investigado em estudos de

criopreservação do sêmen canino. Os agentes crioprotetores penetrantes, particularmente o

glicerol, protegem a célula da crioinjúria durante a fase de cristalização que ocorre entre -6° e

-10°C. Dessa forma, não pareceria ser lógico adicionar o glicerol a temperaturas superiores a

30°C (COLAS, 1975). No entanto, ANDERSEN (1975) realizou a adição de um diluente

glicerolizado ao sêmen a 37°C e obteve bons resultados após inseminação artificial. Já PEÑA

et al., (1998) não encontraram diferenças entre a adição de glicerol ao sêmen a 37° ou a 4°C.

FONTBONNE & BADINAND (1993b) não verificaram diferenças na qualidade do sêmen

canino após a descongelação entre a adição do glicerol à temperatura ambiente (25°C) e a

5°C. Em um estudo mais recente JUCÁ et al., (2007) também não observaram diferenças

entre a glicerolização a temperatura ambiente em relação a 4°C utilizando um diluidor a base

água de coco em pó. Diante disso pode-se concluir que não há problema em promover a

glicerolização a temperatura ambiente.

No que diz respeito à forma de adição do glicerol (simples ou fracionada),

FONTBONNE & BADINAND (1993b) não verificaram diferenças na qualidade do sêmen

canino após a descongelação. SILVA et al., (2003) compararam a adição única e fracionada

do glicerol ao sêmen, na temperatura de 4ºC e não observaram diferenças entre as mesmas.

Da mesma forma LIMA et al., (2007) ao comparar as duas formas de glicerolização em um

diluidor à base de água e coco em pó também não encontraram diferenças.

21

2.6. Tempo de equilíbrio

O tempo de equilíbrio é considerado o tempo total em que os espermatozóides são

mantidos em contato com o glicerol e todos os demais componentes do diluidor, previamente

à congelação (BITTENCOURT et al., 2006). Durante esse período, ocorre o equilíbrio

osmótico entre o meio intracelular espermático e extracelular, formado por todos os

componentes osmoticamente ativos presentes no meio diluidor (SALAMON & MAXWELL,

2000). WATSON (1979) sugeriu que este tempo não é só importante para permitir a entrada

do glicerol como se acreditava anteriormente, mas também permite que as membranas

espermáticas se acomodem ou que influxos iônicos ocorram.

Outro ponto importante atribuído ao tempo de equilíbrio é que a permanência do

sêmen a uma baixa temperatura permite uma melhor adaptabilidade dos espermatozóides a

essa temperatura, reduzindo com isso, o efeito negativo do choque térmico já que as

alterações físicas e químicas na membrana celular causadas pelo resfriamento podem ser

irreversíveis (SANTOS et al., 2003). ENGLAND (1992) sugeriu que o sêmen de várias

espécies animais necessita de uma pausa de algumas horas antes da congelação para que

desenvolva uma máxima resistência aos efeitos da congelação e concluiu, ainda, que o tempo

de equilíbrio pode ser extremamente variável de acordo com o protocolo de

congelação/descongelação e, ainda, de acordo com a espécie em questão. Segundo OETTLÉ

(1986), um apropriado período de equilíbrio, assim como adequadas taxas de diluição e

resfriamento celular, são fatores fundamentais para a prevenção do surgimento de alterações

espermáticas durante o processo de criopreservação espermática.

Tempos distintos de resfriamento e equilíbrio, variando de 45 minutos a 5 h,

foram relatados para cães (FARSTAD & ANDERSEN BERG, 1989; FERGUSON et al.,

1989; FONTBONNE & BADINMD, 1993; NOTHLING et al., 1995; SILVA et al., 1996).

OLAR et al., (1989) constataram que a melhor motilidade pós descongelação foi alcançada

com o sêmen de cão refrigerado de 37°C a 5°C por 1 h e equilibrado a 5°C por 1 h ou

resfriado por 2h e equilibrado a 5°C por mais 2h usando o diluidor Tris-gema contendo 3-4%

de glicerol. ENGLAND (1992) encontrou que um tempo de equilíbrio de 4 h a 5°C resultou

em melhor motilidade pós descongelação e porcentagem de espermatozóides vivos quando

comparada a tempos de equilíbrio de 2 e 6h usando o diluidor Tris/Tes-gema de ovo com

6,5% de glicerol. ROTA (1997) obteve bons resultados equilibrando o sêmen canino a 4ºC

22

durante 60 minutos, sendo que a temperatura de 4ºC era atingida após 45 minutos de

resfriamento. SANTOS et al., (2003) observou que os melhores resultados de motilidade,

vigor, retenção acrossômica e termoresistência foram obtidos com 1 h de equilíbrio a 4°C e

concluiu que a estabilização do sêmen com o meio diluidor é de fundamental importância

para manter a integridade da membrana do espermatozóide durante o processo de congelação.

Por outro lado, HAY (1996) observou que após resfriamento rápido para O°C durante 40 min,

com equilíbrio maior que 2 horas, houve uma diminuição na motilidade espermática e na

porcentagem de espermatozóides com acrossomas intactos.

Como pode ser constatado, ainda existem algumas divergências entres os

pesquisadores quanto ao melhor tempo de equilíbrio para o sêmen de cães.

Consequentemente, faz-se necessário mais estudos a fim de elucidar algumas dúvidas que

ainda restam sobre esse assunto.

2.7. Taxa de descongelação

Um ponto de extrema importância para a melhoria dos resultados na

criopreservação do sêmen é a metodologia empregada na descongelação. Investigações

recentes tem levado a hipótese de que os espermatozóides criopreservados são danificados

principalmente durante a descongelação (HOLT et al.,1992; GAO et a.l, 1992; CURRY &

WATSON, 1994; HOLT & NORTH, 1994; ROTA et al.,1998) e, isso estaria relacionado às

mudanças das condições hipertônicas durante a congelação para condições isosmóticas

durante a descongelação. Segundo HOLT (2000b), pelo fato do crioprotetor promover a

remoção da água intracelular, ele provoca o encolhimento celular e o influxo de íons. No

entanto, a descongelação proporciona o efeito inverso, consequentemente, há o influxo de

água podendo ocasionar a ruptura da membrana. Outro problema crítico da descongelação é a

formação de cristais de gelo intracelulares (na maioria das vezes pequenos) que apresentam

uma tendência a se agregarem para formação de cristais de gelo maiores (recristalização)

(FAHY, 1986). As células devem então ser descongeladas de uma maneira capaz de prevenir

a recristalização e as conseqüentes alterações de membrana e impedir o influxo exagerado de

água que poderia causar alteração nas acomodações das membranas celulares.

Existem várias taxas de descongelação, as quais podem ser classificadas como

rápidas ou lentas. Nas taxas de descongelação rápidas, usam-se temperaturas mais elevadas e,

23

de forma inversa, as taxas de descongelação lenta usam temperaturas medianas. Uma taxa de

descongelação excessivamente lenta pode resultar em recristalização dos cristais de gelo

intracelular resultando em uma redução na sobrevivência celular. Por outro lado, uma

descongelação excessivamente rápida não permite que o crioprotetor penetrante saia

suficientemente rápido quebrando assim o equilíbrio osmótico e causando inchaço do

espermatozóide devido ao influxo de água (GRIFFTHS et al., 1979).

Por razões práticas, o sêmen canino diluído em TRIS é frequentemente

descongelado a 37ºC, embora vários pesquisadores tenham encontrado que a descongelação a

taxas maiores melhore a viabilidade dos espermatozóides (DAVES,1982; ENGLAND, 1992;

ROTA et al.,1998 apud PEÑA & LINDE-FORSBERG, 2000). IVANOVA-KICHEVA et al.,

(1995), comparando os processos de descongelação a 37°C por 8s e 55 °C por 5s, observaram

que a motilidade espermática, termoresistência, morfologia espermática e reservas energéticas

foram mais bem preservadas a 55 °C, segundo esses autores, ao descongelar o sêmen em

temperaturas mais altas, os efeitos destrutivos dos processos osmóticos nas estruturas dos

espermatozóides são reduzidos. Além disso, o aumento rápido da temperatura de - 196°C a

55°C por 5s impede provavelmente a cristalização intracelular. Por outro lado SILVA et al.,

(1998) sugerem que a temperatura de 37ºC por 60s promove uma menor porcentagem de

alterações morfológicas espermáticas do que a de 50ºC por 30s. BADINAND et al., (1993)

descongelaram amostras de sêmen a 37°C por 45 segundos e consideraram este método

moderado mais seguro e argumentou que o tempo de permanência em temperaturas altas é

sempre crítico e de influência letal sobre a viabilidade dos espermatozóide. Já MINTER &

DeLIBERTO (2005), em um estudo com sêmen de coiote, ao comparar a taxa de

descongelação de 37° por 120s com 60° por 30s e 70° por 8s, concluiu que o sêmen

descongelado a 37°C ou 60°C resultou em uma maior motilidade e viabilidade pós

descongelamento com menos anormalidades morfológicas e acrossomais.

Outros pesquisadores defendem o uso de taxas de descongelação a temperaturas

mais elevadas. NOTHLING & SHUTTLEWORTH (2005) relacionaram o tamanho da palheta

com a taxa de descongelação e observaram que as amostras congeladas em palhetas de 0,5ml

e descongeladas a 70°C por 8s foram as que apresentaram os melhores resultados. PEÑA &

LINDE-FORSBERG (2000) observaram que todos os parâmetros avaliados foram

significativamente melhores quando os espermatozóides foram descongelados a 70ºC por 8 s

quando comparados com 37ºC por 15s. CHIRINÉA (2004) e MARTINS (2005) utilizaram

24

um método de descongelação a 75ºC por 8s para o sêmen de cães e obtiveram excelente

qualidade espermática pós-descongelação. Para PEÑA & LINDE – FORSBERG (2000)

existem evidencias que mudanças na fluidez da membrana espermática ocorrem durante o

resfriamento, congelação e descongelação, e que algumas dessas mudanças são irreversíveis,

provocando um aumento da permeabilidade da membrana, permitindo um influxo de cálcio

descontrolado. Esse influxo de cálcio poderia ocasionar hiperatividade das células. Nesse

estudo desenvolvido por PEÑA & LINDE – FORSBERG (2000) foram testadas duas taxas de

descongelação (37ºC/15s e 70ºC/8s) sendo que a taxa de descongelação de 37ºC/15s

proporcionou uma maior entrada de cálcio intracelular. O autor acredita que isso se deve ao

fato de que as membranas espermáticas expostas a variações de temperaturas sofrem uma

reorganização da membrana lipidica e/ou modificação de proteínas e que essas mudanças são

mais severas com taxas de descongelação mais lentas.

O fato é que existem muitas controvérsias quanto ao melhor protocolo de

descongelação, de modo que, se fazem necessários mais estudos nesse sentido.

25

3. JUSTIFICATIVA

O primeiro sucesso na criopreservação do sêmen de cães foi obtido por ROWSON

em 1954, contudo o nascimento de filhotes da espécie canina utilizando sêmen congelado só

foi relatado quinze anos mais tarde (SEAGER, 1969). Estudos sucessivos foram realizados

promovendo a evolução desta biotécnica e, atualmente ela representa uma ferramenta

importante no manejo reprodutivo de cães de alto valor zootécnico, de modo que a

inseminação artificial das cadelas com sêmen congelado-descongelado é oferecida como um

serviço clínico rotineiro por muitos veterinários, inclusive muitos criadores anunciam em sites

a disponibilidade do envio de sêmen congelado com teste de congelabilidade aprovado para o

uso em cadelas. Apesar de todos esses avanços, a inseminação artificial com sêmen

congelado-descongelado costuma resultar em taxas de gestação e tamanho das ninhadas

menores quando comparado ao uso do sêmen fresco (LINDE-FORSBERG & FORSBERG,

1993). Nesse sentido, inúmeros pesquisadores têm buscado estabelecer um padrão de

resfriamento, congelação e descongelação ideal, associado a um diluidor que seja eficiente, de

fácil preparo e de baixo custo.

Desse modo, justifica-se a utilização do diluidor à base de água de coco para a

congelação do sêmen de cães, haja vista a abundância de matéria prima para o mesmo na

região nordeste do Brasil. Entretanto, existem ainda poucos trabalhos acerca desse assunto,

sendo necessário um aprimoramento do protocolo de uso do diluidor ACP®. Assim, é possível

que sejam obtidos resultados superiores aos atualmente descritos na literatura através do

emprego de uma adequada taxa de descongelação e de um tempo de equilíbrio ideal para a

congelação do sêmen de cães. A verificação dessas variáveis será um passo importante

visando o aperfeiçoamento do ACP® como diluidor para o sêmen de cães, no sentido de uma

futura aplicação comercial e uso em larga escala.

26

4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS

• O tempo de equilíbrio de 1h a uma temperatura de 4°C após a glicerolização

favorecerá a obtenção de melhores resultados.

• A descongelação do sêmen por meio de temperaturas mais altas e por um curto

período melhorará a qualidade espermática pós-descongelação.

27

5. OBJETIVOS

5.1. Objetivo Geral

� Avaliar a eficiência de um diluidor à base de água de coco na forma de pó (ACP-

106®) na qualidade do sêmen canino após congelação.

5.2. Objetivos Específicos

� Avaliar o efeito de protocolos preconizando a administração de um tempo de

equilíbrio a 4°C após a glicerolização, bem como a ausência desse tempo de

equilíbrio, sobre a qualidade do espermatozóide canino após descongelação.

� Testar diferentes taxas de descongelação para o sêmen canino.

28

6. CAPÍTULO 1

Artigo 1

Efeito da taxa de descongelação sobre o sêmen canino criopreservado em um diluidor à

base água de coco em pó (ACP-106®)

Victor Leão Hitzschky Madeira, Cynthia Levi Baratta Monteiro, Claudia da Cunha Barbosa,

Ricardo Parente Jucá, Ângela Cristina de Oliveira, Daniel Couto Uchoa, Lúcia Daniel

Machado da Silva

Artigo submetido em 22 de novembro de 2007 ao periódico “Ciência Animal Brasileira”,

classificada como QUALIS A nacional.

29

Efeito da taxa de descongelação sobre o sêmen canino criopreservado em um diluidor à

base água de coco em pó (ACP-106®)

Effect of different thawing rates on canine semen cryopreserved using a powdered coconut

water extender (ACP-106®)

RESUMO

Sabe-se que a temperatura, bem como a velocidade de descongelação do sêmen pode

afetar a qualidade do mesmo. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi testar diferentes taxas

de descongelação para o sêmen canino diluído em ACP-106® e criopreservado. Para tanto,

foram coletados 10 ejaculados oriundos de oito cães. A fração espermática foi avaliada quanto

ao volume, concentração, motilidade, vigor, pH, morfologia, integridade acrossomal e teste

hipoosmótico. O sêmen foi diluído em ACP-106®, contendo 20% de gema de ovo e 6% de

glicerol, e congelado em palhetas de 0,25 ml. Depois de uma semana, a primeira palheta foi

descongelada a uma temperatura de 37°C/1 min, a segunda a 55°C/5 s e a terceira a 75°C/8 s

e foram reavaliados os parâmetros seminais. Os tratamentos apresentaram resultados

semelhantes para quase todos os parâmetros avaliados com exceção da motilidade

espermática, que foi melhor preservada na descongelação a 55°C/5s por até 30min, seguida da

taxa de 37°C/60s e por último a taxa de 75°C/8s. Conclui-se que a melhor taxa de

descongelação para o sêmen de cães utilizando como diluidor o ACP-106® é 55°C/5s já que a

mesma foi quem proporcionou uma melhor motilidade por até 30min após a descongelação.

Palavras-chaves: criopreservação, descongelação, sêmen, cão, ACP-106®.

ABSTRACT

It is known that temperature and thawing velocity can affect sperm quality during

freeze-thawing procedures. Thus, the aim of this research was to compare different thawing

rates for canine semen extended in ACP®-106 extender and cryopreserved. Ten ejaculates

were collected from eight dogs and sperm rich fraction was evaluated regarding to volume,

concentration, motility, vigor, pH, morphology, acrosomal integrity and hyposmotic swelling

test. Then, semen was extended in ACP®-106 with 20% egg yolk and 6% glycerol, and frozen

in 0.25 mL straws. After one week, one straw was thawed at 37°C/1 min, another one at

30

55°C/5 s and a third one at 75°C/8 and seminal characteristics were reevaluated. Similar

results were observed for all the groups, except for sperm motility which was better preserved

by using 55°C/5s for up 30min than by 37°C/60s and 75°C/8s. From these results, it is

concluded that canine semen extended in ACP® -106 is better thawed by using 55°C/5s.

Key Words: cryopreservation, thawing, semen, dog, ACP-106®

INTRODUÇÃO

Atualmente o interesse por parte dos criadores de cães em usufruir dos benefícios das

biotecnologias aplicadas à reprodução tem aumentado consideravelmente. No caso particular

da criopreservação do sêmen, podem ser destacadas como principais vantagens dessa

biotecnologia o fato de que é possível armazenar o material genético de animais de alto valor

zootécnico por um período ilimitado, transmitindo as características desses animais por várias

gerações mesmo após a morte do animal (STOCKNER, 1995). Apesar dessas vantagens,

permanecem muitos pontos não identificados que aparentemente influenciam na

sobrevivência e funcionalidade dos espermatozóides criopreservados, o que resulta em taxas

de gestação altamente variáveis e geralmente mais baixas do que aquelas obtidas com sêmen

fresco (LINDE-FORSBERG & FORSBERG, 1993).

A fim de melhorar esses resultados, vários pesquisadores vêm somando esforços no

intuito de aperfeiçoar os protocolos de congelação do sêmen canino. Um exemplo disso é o

desenvolvimento de diluidores alternativos que sejam atóxicos, isotônicos, tenham atividade

tamponante, sejam de baixo custo, práticos e eficientes. O diluidor à base de água de coco tem

em sua composição básica açúcares, proteínas, vitaminas, sais minerais, fatores de

crescimento (fitormônios) e um baixo teor de fosfolipídeo (LAGUNA, 1996). A sua

formulação em pó (ACP_106®) foi testada para a refrigeração de sêmen eqüino (SAMPAIO-

NETO et al., 2002), diluição para inseminação artificial em caprinos (SALGUEIRO et al.,

2002), refrigeração (MADEIRA et al., 2003) e congelação de sêmen canino (CARDOSO et

al., 2005), apresentando bons resultados.

Outro ponto de extrema importância para a melhoria dos resultados na congelação do

sêmen é a metodologia empregada na descongelação. Investigações recentes têm levado à

hipótese de que os espermatozóides criopreservados são danificados, principalmente durante a

descongelação (GAO et al., 1992; HOLT et al.,1992; CURRY & WATSON, 1994; HOLT &

NORTH, 1994; ROTA et al.,1998). Por razões práticas, o sêmen canino é freqüentemente

31

descongelado a 37ºC/1-3 minutos, embora vários pesquisadores tenham encontrado que a

descongelação a taxas maiores melhore a viabilidade dos espermatozóides (DAVIES, 1982;

ENGLAND & ALLEN, 1992; ROTA et al.,1998). IVANOVA-KICHEVA et al. (1995),

comparando os processos de descongelação a 37°C por 8s e 55°C por 5s, observaram que a

motilidade espermática, termorresitência, morfologia espermática e reservas energéticas

foram melhor preservadas a 55°C. Por outro lado SILVA et al. (1998) sugerem que a

temperatura de 37°C por 60s promove uma menor porcentagem de alterações morfológicas

espermáticas do que a de 50°C por 30s. NÖTHLING & SHUTTLEWORTH (2005)

relacionaram o tamanho da palheta com a taxa de descongelação e observaram que as

amostras congeladas em palhetas de 0,5 ml e descongeladas a 70°C por 8s foram as que

apresentaram os melhores resultados. PEÑA & LINDE-FORSBERG (2000) observaram que

todos os parâmetros avaliados foram significativamente melhores quando os espermatozóides

foram descongelados a 70ºC por 8 s quando comparados com 37ºC por 15s. NÖTHLING et

al. (2007) constataram que a descongelação do sêmen a 98°C não traz benefícios, quando

comparado à descongelação a 70°C. MINTER & DeLIBERTO (2005) ao compararem a taxa

de descongelação de 37° por 120s com 60°C por 30s e 70°C por 8s concluíram que o sêmen

descongelado a 37°C ou 60°C resultou em uma maior motilidade e viabilidade pós-

descongelação com menos anormalidades morfológicas e acrossomais. Além disso,

CHIRINÉA (2004) e MARTINS (2005) utilizaram um método de descongelação a 75ºC por

8s para o sêmen de cães e obtiveram excelente qualidade espermática pós-descongelação.

Diante do exposto percebe-se que ainda existem muitas variações no que diz respeito à

melhor taxa de descongelação, além disso, nenhum trabalho propôs a melhor taxa de

descongelação quando se usa ACP-106® como diluidor. Sendo assim, o objetivo deste

trabalho foi avaliar o efeito de diferentes taxas de descongelação sobre a qualidade do sêmen

canino criopreservado com um diluidor à base de água de coco na forma de pó (ACP-106®).

MATERIAL E MÉTODOS

Local de Execução

O experimento foi realizado no Laboratório de Reprodução de Carnívoros do

Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Universidade Estadual do Ceará,

localizado na cidade de Fortaleza.

32

Animais experimentais

Foram utilizados oito cães, oriundos de canis particulares, sendo dois da raça Boxer,

um da raça Labrador, um da raça Rottweiler, um da raça Cane Corso, um da raça Bullmastif,

um da raça American Pit Bull Terrier e um da raça Whippet com idades entre 2 e 9 anos. Os

cães, mantidos em canis individuais, receberam alimentação à base de ração comercial

peletizada uma vez por dia e tiveram acesso à água ad libitum.

Coleta do sêmen

O sêmen foi coletado por meio da técnica de manipulação digital do bulbo peniano

(CHRISTIANSEN, 1988) com o auxílio de um funil de plástico e tubos de vidro graduados.

Como no cão a ejaculação ocorre de forma fracionada (FELDMAN & NELSON, 1996), fez-

se a separação do sêmen em suas três frações distintas, sendo a primeira e a terceira de origem

prostática; e a segunda, denominada fração espermática, de origem testicular e rica em

espermatozóides retida para fins de avaliação e posterior criopreservação. No total, foram

coletados e processados 10 ejaculados.

Avaliação do sêmen

A segunda fração do sêmen coletado foi avaliada macro e microscopicamente. As

avaliações macroscópicas incluíram: cor, volume e pH. Já as microscópicas incluíram:

motilidade (porcentagem de espermatozóides móveis), vigor (qualidade da motilidade) que foi

avaliado em uma escala variando de 0 (sem movimento) a 5 (movimento retilíneo

progressivo), concentração e morfologia espermáticas, bem como e integridade acrossomal

(PLATZ & SEAGER, 1977).

Os parâmetros macroscópicos (cor, volume e pH) foram avaliados no sêmen a fresco

(fração espermática), sendo o pH também avaliado após a descongelação. A morfologia

espermática e integridade do acrossoma foram avaliadas no sêmen a fresco e

congelado/descongelado.

33

As avaliações de motilidade e vigor foram realizadas com o auxílio da microscopia

óptica (M.O.), no aumento de 100x. A concentração espermática foi verificada utilizando-se a

câmara de Neubauer (CARDOSO et al., 1997).

Para a avaliação da morfologia e integridade acrossomal, foram realizados esfregaços

de sêmen, os quais foram corados com Rosa de Bengala e, posteriormente, avaliados

utilizando-se um microscópio óptico (1000x), fazendo-se a contagem de 200 células

espermáticas. No tocante à morfologia, os espermatozóides foram classificados como normais

ou apresentando alterações morfológicas primárias ou secundárias e separadas de acordo com

a sua localização (cabeça, peça intermediária e cauda - BURKE, 1986). O acrossoma foi

classificado como normal ou danificado.

Teste hipoosmótico

O teste hipoosmótico (HOS) foi realizado após a coleta e imediatamente, após a

descongelação do sêmen, tendo como função avaliar a integridade funcional da membrana

espermática (SPITTALER & TYLER, 1985). Para isso 0,01 mL de sêmen foi diluído em 0,09

mL de água destilada e mantido em banho-maria a 38ºC. Após 45 minutos, os

espermatozóides de cada alíquota foram colocados em uma lâmina e avaliados em

microscópio óptico. Foram contadas 200 células em aumento de 400x, sendo os

espermatozóides que apresentavam sua cauda enrolada considerados como apresentando

membrana espermática funcional.

Teste de termorresistência

O teste de termorresistência foi realizado após a descongelação do sêmen, sendo este

mantido em banho-maria a 38ºC. A motilidade e o vigor espermático foram avaliados

imediatamente após a descongelação e aos 30, 60, 90 e 120 minutos.

Preparo do diluidor

Foi utilizado um diluidor à base de água de coco em pó (ACP-106®) que foi preparado

de acordo com a orientação do fabricante. O diluidor continha 20% de gema de ovo e 6% de

glicerol (concentração final no diluidor).

34

Processamento do sêmen

O volume total de diluidor foi dividido em duas partes (A e B). A parte “A” contendo

apenas o ACP-106® acrescido de gema de ovo e a Parte “B”, similar a anterior, mas contendo

12% de glicerol.

O sêmen foi diluído inicialmente com metade do volume de diluidor necessário para a

concentração final de 200 x 106 espermatozóides/mL. Nesta etapa, foi utilizada somente a

parte A do diluidor. Após esta diluição inicial em temperatura ambiente (aproximadamente

27°C), as amostras foram armazenadas em tubos de vidro e estes colocados em um recipiente

com água e acondicionados em caixa térmica com gelo reciclável (15°C) por 40 minutos.

Após este período, o sêmen foi transferido para um refrigerador até atingir 4°C (30 minutos) e

posteriormente, a parte B foi adicionada ao sêmen. O sêmen foi envasado em palhetas de 0,25

mL, estas foram dispostas horizontalmente em rampa de congelação a uma altura de 5 cm do

nível de nitrogênio líquido por cinco minutos e, finalmente, armazenadas em nitrogênio

líquido. Após uma semana, as amostras foram descongeladas em banho-maria, sendo a

primeira palheta descongelada a 37°C/60s, a segunda a 55°/5s e a terceira a 75°C por 8s e

avaliadas microscopicamente (CARDOSO et al., 2003).

Análise estatística

As características macroscópicas do sêmen fresco foram avaliadas de forma subjetiva,

exceto o volume da fração espermática que, juntamente com as características microscópicas,

foram avaliadas pela estatística descritiva e expressas na forma de média e desvio padrão. A

análise dos dados foi realizada pelo programa Systat 7.0 (SPSS Inc. 1997). Os dados

percentuais sofreram transformação angular arcoseno. Para verificar as diferenças estatísticas

entre os tratamentos com relação à motilidade, vigor, morfologia, integridade acrossomal e

porcentagem de caudas enroladas, utilizou-se ANOVA-GLM (General Linear Model) e nos

casos em que houve diferenças estatísticas as médias foram comparadas pelo teste de Tukey

para se verificar onde ocorreram as diferenças. Para todas as análises utilizou-se P < 0,05.

RESULTADOS

No tocante ao sêmen a fresco, observou-se que todos os ejaculados apresentaram-se de

cor branco opalescente e viscosidade leitosa e que os demais parâmetros (macro e

microscópicos) encontravam-se dentro da normalidade (Tabela 1).

35

A motilidade espermática do sêmen descongelado a 55°C/5s (58,50 ± 14,92%) foi

melhor do que no descongelado a 37°C/60s (46,00 ± 11,74%) que por sua vez foi melhor do

que no descongelado a 75°C/8s (19,60 ± 29,31%) nos tempos 0 e 30 min (P < 0,05 – Tabela

2). A partir de 60 minutos, não houve mais diferença entre a motilidade nas três taxas de

descongelação testadas (P > 0,05 - Tabela 2). Quando se compara a motilidade dentro de

cada taxa de descongelação ao longo do tempo, observa-se que nas taxas de 37°C/60s e

55°C/5s, a motilidade no tempo 0 min foi superior a todos os outros tempos, e no tempo de 30

min foi superior aos tempos de 60, 90 e 120min (P < 0,05) e a partir dos 60 min não houve

mais diferenças (P > 0,05). Para a taxa de 75°C/8s, a motilidade não diferiu em momento

algum (P > 0,05 - Tabela 2).

Tabela 1. Média ± desvio padrão do pH, volume, da concentração, motilidade, vigor,

morfologia e acrossomas intactos do sêmen a fresco (n = 10 ejaculados).

Parâmetros avaliados Média ± D.P.

Volume da fração espermática (µl) 785,00 ± 380,83

pH 6,40 ± 0,46

Concentração espermática (nº sptz X 106/mL) 1374,00 ± 744,80

Motilidade (%) 99,00 ± 2,11

Vigor (0 – 5) 5,00 ± 0,00

Espermatozóides normais (%) 87,90 ± 11, 24

Alterações morfológicas de cabeça

Primárias (%) 0,90 ± 1,10

Secundárias (%) 1,70 ± 3,74

Alterações morfológicas de peça intermediária

Primárias (%) 0,20 ± 0,63

Secundárias (%) 2,40 ± 5,21

Alterações morfológicas de cauda

Primárias (%) 0,10 ± 0,32

Secundárias (%) 6,70 ± 3,65

Acrossomas intactos (%) 91,30 ± 4,92

Com relação ao vigor espermático do sêmen descongelado, este não diferiu nas taxas

de 37°C/60s e 55°C/5s em todos os tempos avaliados, mas ambos apresentaram resultados

melhores que o tratamento 75°C/8s nos tempos 0 e 30 minutos (P < 0,05). No que diz respeito

36

à comparação dos tratamentos entre os tempos, o vigor se manteve inalterado até 30 minutos.

A partir de 60 minutos, houve uma redução significativa no vigor que se manteve estável até

120 minutos (Tabela 3).

Para as características morfológicas dos espermatozóides, não houve diferenças entre

as alterações primárias de cabeça, peça intermediária e de cauda e secundárias de peça

intermediária entre nenhum dos tratamentos e igualmente em relação ao sêmen fresco (P >

0,05). Já com relação às alterações secundárias de cabeça e cauda foram observadas algumas

diferenças. No caso das alterações secundárias de cabeça, os tratamentos 37°C/60s e 75°C/8s

foram semelhantes entre si ((P > 0,05), e apresentaram um aumento nas alterações

morfológicas quando comparados ao sêmen fresco (P < 0,05), enquanto que o tratamento

55°C/5s não diferiu nem do sêmen a fresco, nem dos demais tratamentos (P > 0,05). Com

relação às alterações secundárias de cauda todos os tratamentos foram semelhantes entre si e

apresentaram mais alterações que o sêmen fresco (Tabela 4).

Tabela 2. Média ± desvio padrão da motilidade espermática pós-descongelação em três

diferentes taxas de descongelação (37ºC / 60 s, 55ºC / 5 s e 75ºC / 8 s) nos tempos 0, 30, 60,

90, 120min após a descongelação.

TAXA DE MOTILIDADE

DESCON-

GELAÇÃO 0 min 30 min 60 min 90 min 120 min

37°C/60 seg 46,00 ± 11,74bA 14, 50 ± 11,41bB 2,10 ± 4,79aC 0,60 ± 1,58aC 0,10 ± 0,32aC

55°C/5 seg 58,50 ± 14,92aA 36,50 ± 17,80aB 8,80 ± 13,14aC 2,50 ± 6,35aC 1,50 ± 3,37aC

75°C/8 seg 19,60 ± 29,31cA 6,20 ± 13,41cA 4,00 ± 12,65aA 1,00 ± 3,16aA 0,50 ± 1,58aA

a,b,c Letras minúsculas diferentes indicam diferença entre linhas. A,B,C Letras maiúsculas diferentes indicam diferença entre colunas.

P < 0,05

Nesse estudo observou-se que não houve diferenças com relação à porcentagem de

acrossomas intactos entre os tratamentos, mas ambos apresentaram uma porcentagem menor

de acrossomas intactos em relação ao sêmen fresco (Figura 1).

37

Tabela 3. Média ± desvio padrão do vigor espermático entre três diferentes taxas de

descongelação (37ºC / 60 s, 55ºC / 5 s e 75ºC / 8 s) nos tempos 0, 30, 60, 90, 120min após a

descongelação.

TAXA DE VIGOR

DESCON-

GELAÇÃO 0 min 30 min 60 min 90 min 120 min

37°C/60 seg 3,40 ± 0,46aA 2,60 ± 1,02aA 0,60 ± 1,05aB 0,40 ± 0,88aB 0,20 ± 0,63aB

55°C/5 seg 3,80 ± 0,35aA 3,40 ± 0,57aA 1,30 ± 1,32aB 0,45 ± 1,12aB 0,40 ± 0,97aB

75°C/8 seg 1,60 ± 1,88bA 0,85 ± 1,41bA 0,20 ± 0,63aB 0,20 ± 0,63aB 0,10 ± 0,32aB

a,b Letras minúsculas diferentes indicam diferença entre linhas. A,B Letras maiúsculas diferentes indicam diferença entre colunas.

P < 0,05

Houve uma redução significativa no percentual de células com caudas enroladas em

todos os tratamentos com relação ao sêmen fresco, não diferindo entre os tratamentos após a

descongelação (figura 2).

Não houve alteração do pH nas taxas de 37°C/60s e 55°C/5s (P > 0,05), no entanto,

houve uma redução do pH da taxa de 75°C/8s em relação ao sêmen fresco (P < 0,05) (figura

3).

38

Tabela 4. Média ± desvio padrão das alterações morfológicas primárias e secundárias da

cabeça, peça intermediária e cauda e do total de espermatozóides normais em relação ao

sêmen fresco e aos tratamentos 37°C/60s, 55°C/5s e 75°C/8s.

ALTERAÇÕES GRUPOS

% Fresco 37°C/60 s 55°C/5 s 75°C/8 s

Cabeça

Primária 1,70 ± 3,74a 1,10 ± 2,23a 0,80 ± 0,79a 1,60 ± 3,37a

Secundária 0,90 ± 1,10a 3,10 ± 2,47b 1,20 ± 0,63ab 3,70 ± 4,37b

Peça

intermediária

Primária 0,20 ± 0,63a 0,60 ± 0,70a 0,10 ± 0,32a 0,40 ± 0,52a

Secundária 2,40 ± 5,21a 4,70 ± 7,10a 2,30 ± 3,20a 5,60 ± 6,27a

Cauda

Primária 0,10 ± 0,32a 0,00 ± 0,00a 0,00 ± 0,00a 0,00 ± 0,00a

Secundária 6,70 ± 3,65a 21,90 ± 13,67b 20,20 ± 12,41b 18,20 ± 13,89b

Total de

normais 88,00 ± 11,00a 68,60 ± 20,00b 75,40 ± 13,87b 70,50 ± 20,29b

a,b Letras minúsculas diferentes indicam diferença entre colunas.

P < 0,05

0

20

40

60

80

100

120

TAXA DE DESCONGELAÇÃO

AC

RO

S.I

NT

AC

TO

S

fresco

T 37º C / 60 seg

T 55º C / 5 seg

T 75º C / 8 seg

Figura 1. Porcentagem média ± DP de células com acrossoma intacto do sêmen a fresco e

descongelado a 37°C/60s, 55°C/5s e 75°C/8s. P < 0,05.

a

b b b

39

0

20

40

60

80

100

120

TAXA DE DESCO NGELAÇÃO

% E

NR

OL

AD

A fresco

T 37º C / 60 seg

T 55º C / 5 seg

T 75º C / 8 seg

Figura 2. Porcentagem média ± DP de células com cauda enrolada do sêmen a fresco e

descongelado a 37°C/60s, 55°C/5s e 75°C/8s. P < 0,05.

5,6

5,7

5,8

5,9

6

6,1

6,2

6,3

6,4

6,5

6,6

TAXA DE DESCONGELAÇÃO

pH

FRESCO

T 37º C / 60 seg

T 55º C / 5 seg

T 75º C / 8 seg

Figura 3. Média ± DP do pH de amostras do sêmen a fresco e descongelado a 37°C/60s,

55°C/5s e 75°C/8s. P < 0,05.

DISCUSSÃO

De acordo com a análise dos resultados do sêmen a fresco, observou-se que as

amostras estavam aptas a participarem do experimento, visto que todos os parâmetros

avaliados apresentavam-se dentro da normalidade para a espécie canina, conforme descrito

por CHRISTIANSEN (1988).

Com relação à motilidade pós-descongelação, esse estudo demonstrou que existe uma

diferença significativa entres as três taxas de descongelação, sendo que a taxa de

descongelação de 55°C/5s apresentou os melhores resultados por até 30min após a

descongelação, seguida pela taxa de descongelação de 37°C/60s e, por último, o tratamento

75°C/8s. Resultado semelhante foi obtido por IVANOVA-KICHEVA et al. (1995) em que

b b b

a

a

ab ab b

40

esses autores obtiveram uma melhor motilidade quando descongelaram o sêmen de cães a

55°C/5s em comparação com a taxa de 37°C/8s. Segundo IVANOVA-KICHEVA et al.

(1995), descongelar o sêmen em temperaturas mais altas reduz os efeitos destrutivos dos

processos osmóticos nas estruturas dos espermatozóides, além disso, o aumento rápido da

temperatura de - 196°C a 55°C por 5s impede a recristalização intracelular. Isso foi o que

provavelmente favoreceu o tratamento 55°C/5s em relação ao tratamento37°C/60s. Embora

tenha havido uma superioridade da motilidade do tratamento 55°C/5s em relação ao

37°C/60s, percebe-se que ambos os tratamentos apresentaram uma motilidade dentro da faixa

aceitável para a realização de inseminações artificiais, levando-se em consideração os dados

de CONCANNON & BATTISTA (1989), que sugerem, para a espécie canina, a motilidade

pós-descongelação acima de 50% como ideal e, acima de 30% como aceitável.

NÖTHLING & SHUTTLLEWORTH (2005) relacionaram o tamanho da palheta com

a taxa de descongelação e observaram que as amostras congeladas em palhetas de 0,5 ml e

descongeladas a 70°C por 8s foram as que apresentaram os melhores resultados. PEÑA &

LINDE-FORSBERG (2000) observaram que todos os parâmetros avaliados foram

significativamente melhores quando os espermatozóides foram descongelados a 70ºC por 8 s

quando comparados com 37ºC por 15s. CHIRINÉA (2004) e MARTINS (2005) utilizaram

um método de descongelação a 75ºC por 8s para o sêmen de cães e obtiveram excelente

qualidade espermática pós-descongelação. Percebe-se que todos esses pesquisadores

conseguiram bons resultados na descongelação do sêmen a altas temperaturas e todos eles

atribuem a esses bons resultados a mesma justificativa de IVANOVA-KICHEVA et al.

(1995), contudo nesses experimentos diferentemente do nosso, o sêmen foi envasado em

palhetas de 0,5 ml. Diante disso é possível que a influência letal das altas temperaturas sobre a

viabilidade dos espermatozóide seja maior sobre palhetas de 0,25 ml em relação a palhetas de

0,5 ml, pois o conteúdo da palheta de 0,25 ml descongelaria mais rapidamente que o conteúdo

da palheta de 0,5 ml e sendo assim o sêmen descongelado da palheta de 0,25 ml permaneceria

por mais tempo a uma temperatura elevada. Diante do exposto acreditamos que o resultado

obtido na descongelação a 75°C/8s poderia ser melhorado caso fosse usado uma palheta de

0,5ml ou então diminuído o tempo de exposição à temperatura de 75°C.

Com relação ao vigor espermático, não houve diferença entre as taxas de

descongelação 55°C/5s e 37°C/60s e novamente a pior taxa de descongelação foi a de 75°C/8s

sendo a provável causa para isso o efeito deletério da alta temperatura.

No tocante as alterações morfológicas, acrossomas intactos e caudas enroladas não

houve diferenças entre os tratamentos, sendo observado um maior percentual de alterações

41

totais e secundárias da cabeça e cauda em relação ao sêmen fresco e uma diminuição de

acrossomas intactos e caudas enroladas em relação ao sêmen fresco. Esses resultados já são

esperados em função dos danos celulares provocados pelo processo de congelação e

descongelação do sêmen.

Com relação ao pH constatou-se que ação tamponante do diluidor foi extremamente

eficaz, já que foi capaz de manter o pH dentro da normalidade ao longo de todo experimento

(CHRISTHIANSEN 1988).

CONCLUSÃO

A partir dos resultados obtidos sugere-se que a melhor a taxa de descongelação

para o sêmen de cães utilizando como diluidor o ACP-106® é 55°C/5 s já que a mesma foi

quem proporcionou uma melhor motilidade por até 30min após a descongelação

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à CAPES, ao CNPq e à FUNCAP pelo apoio financeiro;

aos proprietários dos cães, em particular ao Daniel Couto Uchoa, por disponibilizar os

animais para o estudo e ao Prof. Dr. Airton Alencar de Araújo pela colaboração nas análises

estatísticas.

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46

7. CAPÍTULO 2

Artigo 2

Efeito do tempo de equilíbrio sobre a qualidade do sêmen canino diluído em ACP - 106®

e criopreservado a – 196°C

Victor Leão Hitzschky Madeira, Cynthia Levi Baratta Monteiro, Claudia da Cunha Barbosa,

Lúcia Daniel Machado da Silva

47

Efeito do tempo de equilíbrio sobre a qualidade do sêmen canino diluído em ACP - 106®

e criopreservado a – 196°C

Victor Leão Hitzschky Madeira, Cynthia Levi Baratta Monteiro, Claudia da Cunha Barbosa,

Lúcia Daniel Machado da Silva

Laboratório de Reprodução de Carnívoros – Faculdade de Veterinária – Programa de Pós-

Graduação em Ciências Veterinárias, UECE, Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi

CEP: 60740-903, Fortaleza, CE, Brasil

Fone: (85) 3101-9859; Fax: (85)3101-9840

RESUMO

Objetivou-se verificar o efeito do tempo de equilíbrio a 4°C após a glicerolização

na congelação do sêmen canino utilizando-se um diluidor à base de água de coco em pó

(ACP-106®). O sêmen diluído em ACP-106® com 20% de gema de ovo foi refrigerado e

acrescido do diluidor com glicerol. Após a glicerolização, a primeira alíquota foi

imediatamente congelada (G0h), a segunda foi equilibrada por 1h a 4°C (G1h) e a terceira por

2h (G2h) para então serem criopreservadas. Posteriormente a descongelação, a motilidade

total e progressiva e espermatozóides com velocidade média de G2h foram superiores ao G0h,

enquanto que o G1h não diferiu nem de G0h, nem de G2h. Na VAP média e espermatozóides

com velocidade rápida, o G2h foi superior ao G0h com 30min após a descongelação. O VAP

rápido, bem como as alterações morfológicas, acrossomas intactos e pH não diferiram entre os

grupos. Na termoresistência, houve uma queda a partir dos 30min para a maioria dos

parâmetros. No teste hipoosmótico, o G2h foi melhor que o G0h e G1h não diferiu de nenhum

dos dois. Conclui-se que para a congelação do sêmen canino, utilizando-se ACP-106®, deve-

se incluir um tempo de equilíbrio de 2h após a glicerolização a 4°C.

Palavras-chave: sêmen; cão; congelação; tempo de equilíbrio; ACP-106®.

ABSTRACT

The objective was to verify the effect of equilibration times at 4ºC after glycerol addition in

freezing canine semen using a extender powder coconut water (ACP-106®). The diluted

semen in ACP-106® with 20% from egg yolk was chilled and added the extender with

48

glycerol. After glycerol addition, the first sample was immediately frozen (G0h), the second

was balanced for 1h at 4ºC (G1h) and the third for 2h (G2h) to then be cryopreserved. After

thawing, the total and progressive motility and sperm with an average speed of G2h were

higher than G0h, while G1h did not differ from G0h or G2h. The average VAP and sperm

with fast speed, the G2h was superior to G0h 30min after thawing. The fast VAP, as well as

the morphological alterations, acrosomal integrity and pH were similar for all groups. In

thermoresistance test, there was a fall starting at 30min for most parameters. In the

hypoosmotic test, G2h was better than the G0h and G1h did not differ from each other group.

It follows that for the freezing of canine semen, using ACP-106 ®, one must include a time of

balance of 2h after glycerol addition at 4ºC.

Keywords: semen; dog; cryopreservation; equilibration time; ACP-106®

INTRODUÇÃO

Um passo importante para a obtenção de melhores resultados na criopreeservação

de sêmen é o uso de diluidores que, associados a um crioprotetor, possam fornecer aos

espermatozóides as condições necessárias para que se obtenha uma boa qualidade espermática

pós-descongelação. Na busca de um diluidor que ofereça essas condições, foi elaborado um

produto à base de água de coco em pó (ACP®). Este diluidor foi testado para a refrigeração de

sêmen eqüino (SAMPAIO-NETO et al., 2002), diluição para inseminação artificial em

caprinos (SALGUEIRO et al., 2002), refrigeração (MADEIRA et al., 2003) e congelação de

sêmen canino (CARDOSO et al., 2005), apresentando bons resultados.

Para que o diluidor e o crioprotetor ofereçam o máximo de benefícios aos

espermatozóides, alguns pesquisadores acreditam que é necessária a realização de um tempo

de equilíbrio antes da congelação, possibilitando com isso que os espermatozóides

permaneçam em contato com o crioprotetor e todos os demais componentes do diluidor

(BITTENCOURT et al., 2006) o que permitirá o equilíbrio osmótico entre o meio intracelular

espermático e extracelular, formado por todos os componentes osmoticamente ativos

presentes no meio diluidor (SALAMON & MAXWELL, 2000), além de também permitir que

as membranas espermáticas se acomodem ou que influxos iônicos ocorram (WATSON,

1979).

Tempos distintos de resfriamento e equilíbrio, variando de 45 minutos a 5 h,

foram relatados para cães (FARSTAD & ANDERSEN BERG, 1989; FERGUSON et al.,

49

1989; FONTBONNE & BADINMD, 1993; NOTHLING et al., 1995; SILVA et al., 1996).

OLAR et al. (1989) constataram que a melhor motilidade pós-descongelação foi alcançada

com o sêmen de cão refrigerado de 37°C a 5°C por 1 h e equilibrado a 5°C por 1 h ou

resfriado por 2h e equilibrado a 5°C por mais 2h usando o diluidor Tris-gema contendo 3-4%

de glicerol. ENGLAND (1992) encontrou que um tempo de equilíbrio de 4 h a 5°C resultou

em melhor motilidade pós-descongelação e maior porcentagem de espermatozóides vivos

quando comparada a tempos de equilíbrio de 2 e 6h usando o diluidor Tris/Tes-gema de ovo

com 6,5% de glicerol. ROTA (1997) obteve bons resultados equilibrando o sêmen canino a

4ºC durante 60 minutos, sendo que a temperatura de 4ºC era atingida após 45 minutos de

resfriamento. SANTOS et al., (2003) observaram que os melhores resultados de motilidade,

vigor, retenção acrossômica e termorresistência foram obtidos com 1 h de equilíbrio a 4°C e

concluíram que a estabilização do sêmen com o meio diluidor é de fundamental importância

para manter a integridade da membrana do espermatozóide durante o processo de congelação.

Por outro lado, HAY (1996) observou que após resfriamento rápido para 0°C durante 40 min

com equilíbrio maior que 2 horas, houve uma diminuição na motilidade espermática e na

porcentagem de espermatozóides com acrossomas intactos.

Como pode ser constatado, ainda existem algumas divergências entre os

pesquisadores quanto ao melhor tempo de equilíbrio para o sêmen de cães, conseqüentemente

fazem-se necessários mais estudos a fim de definir o melhor protocolo de congelação para o

sêmen canino. Em vista disso, esse trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da

administração de um tempo de equilíbrio a 4°C após a glicerolização sobre a qualidade do

espermatozóide canino diluído em ACP-106 ®, após a descongelação.

MATERIAL E MÉTODOS

Local de Execução

O experimento foi realizado no Laboratório de Reprodução de Carnívoros do

Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Universidade Estadual do Ceará,

localizado na cidade de Fortaleza.

Animais experimentais

Foram utilizados sete cães, oriundos de canis particulares, sendo dois da raça

Boxer, três da raça Rottweiler, um da raça American Pit Bull Terrier e um da raça Sharpei

50

com idades entre 2 e 9 anos. Os cães, mantidos em canis individuais, receberam alimentação à

base de ração comercial peletizada uma vez por dia e tiveram acesso à água ad libitum.

Coleta do sêmen

O sêmen foi coletado por meio da técnica de manipulação digital

(CHRISTIANSEN, 1988) com o auxílio de um funil de plástico e tubos de vidro graduados.

Como no cão a ejaculação ocorre de forma fracionada (FELDMAN & NELSON, 1996), fez-

se a separação do sêmen em suas três frações distintas, sendo a primeira e a terceira de origem

prostática; e a segunda, denominada fração espermática, de origem testicular e rica em

espermatozóides retida para fins de avaliação e posterior criopreservação. No total, foram

coletados e processados 10 ejaculados.

Avaliação do sêmen fresco

A segunda fração do sêmen coletado foi avaliada macro e microscopicamente. As

avaliações macroscópicas incluíram: cor, volume e pH aferido por meio de fitas indicadoras

(pH-Fix 0-14, Macherey-Nagel®). Já as microscópicas incluíram: motilidade (porcentagem de

espermatozóides móveis), vigor (qualidade da motilidade) que foi avaliado em uma escala

variando de 0 (sem movimento) a 5 (movimento retilíneo progressivo), concentração e

morfologia espermáticas, bem como a integridade acrossomal (PLATZ & SEAGER, 1977).

As avaliações de motilidade e vigor foram realizadas com o auxílio da

microscopia óptica (M.O.), no aumento de 100x. A concentração espermática foi verificada

utilizando-se a câmara de Neubauer (CARDOSO et al., 1997).

Para a avaliação da morfologia e integridade acrossomal, foram realizados

esfregaços de sêmen, os quais foram corados com Rosa de Bengala e, posteriormente,

avaliados utilizando-se um microscópio óptico (1000x), fazendo-se a contagem de 200 células

espermáticas. No tocante à morfologia, os espermatozóides foram classificados como normais

ou apresentando alterações morfológicas primárias ou secundárias e separadas de acordo com

a sua localização (cabeça, peça intermediária e cauda - BURKE, 1986). O acrossoma foi

classificado como normal ou danificado.

Avaliação do sêmen descongelado

Uma semana após a congelação foi realizada a descongelação em banho-maria a

uma temperatura de 55°C por 5 segundos sendo o sêmen transferido em seguida para um tubo

Eppendorf® presente em outro banho-maria a uma temperatura de 37°C. Feito isso, foi

51

mensurado o pH, realizados esfregaços de sêmen, os quais foram corados com Rosa de

Bengala para a avaliação da morfologia espermática e integridade acrossomal conforme foi

descrito para o sêmen fresco e utilizou-se o sistema de análise de sêmen auxiliada por

computador (CASA). O CASA foi utilizado também durante o teste de termorresistência nos

tempos 30, 60, 90 e 120 minutos após a descongelação a fim de se avaliar a longevidade

espermática (SILVA et al., 2003).

No tocante ao CASA, avaliaram-se os parâmetros de motilidade total (MT, %),

motilidade progressiva (MP, %), espermatozóides com velocidade rápida (%),

espermatozóides com velocidade média (%), velocidade média da trajetória (VAP, µm/s) de

sub-populações de espermatozóides com velocidade média (VAP 55 a 95 µm/s) e rápida

(VAP > 95 µm/s). Essas avaliações foram executadas com um microscópio de contraste de

fases acoplado a uma vídeo-câmara adaptada ao sistema Sperm Class Analyser® (SCA,

Microptic S.L., versão 3.2.0).

Para a realização do CASA, a amostra de sêmen descongelada foi re-diluída em

uma solução de citrato de sódio-glicose (2,37 g citrato de sódio, 0,80 g glicose, 100 mL água

destilada) na proporção de 10 µl de sêmen para 50 µl da solução de citrato de sódio-glicose a

fim de se atingir uma concentração de 20 a 50x106 de sptz/mL. Feito isso, cinco µl da amostra

re-diluída foi colocada em uma Câmara de Makler® (Sel-Medical Instruments), previamente

aquecida a 37ºC e finalmente realizada a avaliação.

Teste hipoosmótico

O teste hipoosmótico (HOS) foi realizado após a coleta, e imediatamente após a

descongelação do sêmen, tendo como função avaliar a integridade funcional da membrana

espermática (SPITTALER & TYLER, 1985). Para isso 0,01 mL de sêmen foi diluído em 0,09

mL de água destilada e mantido em banho-maria a 38ºC. Após 45 minutos, os

espermatozóides de cada alíquota foram colocados em uma lâmina e avaliados em

microscópio óptico. Foram contadas 200 células em aumento de 400x, sendo os

espermatozóides que apresentavam sua cauda enrolada considerados como apresentando

membrana espermática funcional.

52

Preparo do diluidor

Foi utilizado um diluidor à base de água de coco em pó (ACP-106®) que foi

preparado de acordo com a orientação do fabricante. O diluidor continha 20% de gema de ovo

e 6% de glicerol (concentração final no diluidor).

Processamento do sêmen

O volume total de diluidor foi dividido em duas partes (A e B). A parte “A”

contendo apenas o ACP-106® acrescido de gema de ovo e a Parte “B”, similar a anterior, mas

contendo 12% de glicerol.

O sêmen foi diluído inicialmente com metade do volume de diluidor necessário

para a concentração final de 200 x 106 espermatozóides/mL. Nesta etapa, foi utilizada

somente a parte A do diluidor. Após esta diluição inicial em temperatura ambiente

(aproximadamente 27°C), as amostras foram armazenadas em tubos de vidro e estes

colocados em um recipiente com água e acondicionados em caixa térmica com gelo reciclável

(15°C) por 40 minutos. Após este período, o sêmen foi transferido para um refrigerador até

atingir 4°C (30 minutos). Feito isso o volume da parte B foi dividido por três e cada terço foi

adicionado ao sêmen com um intervalo de cinco minutos (glicerolização fracionada). Ao

término da glicerolização o sêmen foi envasado em palhetas de 0,25 mL e estas foram

dispostas horizontalmente em rampa de congelação a uma altura de 5 cm do nível de

nitrogênio líquido por cinco minutos e armazenadas em nitrogênio líquido, sendo que na

primeira amostra a ser congelada esse procedimento foi realizado logo após a glicerolização

(G0h), na segunda amostra esse procedimento foi realizado uma hora após a glicerolização

(G1h) e na terceira amostra esse procedimento foi realizado duas horas após a glicerolização

(G2h).

Análise estatística

Os dados relativos ao volume e características microscópicas da fração

espermática foram submetidos aos testes de Shapiro-Wilk e Bartlett para verificação da

normalidade da distribuição e homocedasticidade, respectivamente. Nos casos em que não foi

observada homogeneidade de variância entre os tratamentos, foi feita transformação

logarítmica dos dados. Confirmado o atendimento das exigências para realização da análise de

variância, esta foi executada por meio do PROC GLM do programa SAS (1999) e as médias

foram comparadas através dos testes t de Student (CV>15%) ou Student-Newman-Keuls

(SNK, CV<15%) considerando-se o nível de significância de 5%. Nos casos em que persistiu

53

a condição de heterocedasticidade, mesmo após a transformação dos dados, foi aplicado o

teste não paramétrico de Kruskal-Wallis. Os resultados foram apresentados com média ±

desvio padrão.

RESULTADOS

De acordo com os resultados obtidos para o sêmen fresco, constatou-se que todos

os ejaculados apresentaram cor branco opalescente e viscosidade leitosa. Os demais

parâmetros avaliados (macro e microscópicos) referentes ao sêmen fresco encontram-se na

Tabela 1.

No que diz respeito à analise seminal auxiliada por computador (CASA), os

resultados demonstraram que na avaliação dos parâmetros motilidade total, motilidade

progressiva e percentual de espermatozóides com velocidade média realizada logo após a

descongelação houve uma superioridade do sêmen que foi equilibrado por 2h em relação ao

sêmen que não sofreu um tempo de equilíbrio, enquanto que o sêmen equilibrado por 1h não

diferiu nem de G0h, nem de G2h. Com 30min após a descongelação na avaliação desses

mesmos parâmetros, o G1h e o G2h foram superiores ao G0h. No caso da motilidade total

essa superioridade se estendeu por até 60min e no caso do percentual de espermatozóides com

velocidade média apenas o G2h foi superior ao G0h com 60 min após a descongelação

(Tabela 2, Tabela 3, Tabela 5). Para os parâmetros % de espermatozóides com velocidade

rápida e VAP médio, o G2h mostrou superioridade em relação ao G0h com 30 min após a

descongelação (Tabela 4, Tabela 7). O único parâmetro em que os grupos não diferiram foi o

VAP rápido (Tabela 6).

No tocante aos resultados da avaliação morfológica, observou-se que não houve

diferenças entre os grupos em relação à porcentagem de alterações morfológicas primárias da

cabeça, peça intermediária e cauda. No que diz respeito às alterações morfológicas

secundárias, a única diferença obtida foi na comparação dos grupos G0h, G1h e G2h com o

sêmen fresco em relação às alterações da cauda (Tabela 8). Na comparação entre o número

de espermatozóides normais e na porcentagem de acrossomas intactos, os grupos G0h, G1h e

G2h foram semelhantes entre si e inferiores ao sêmen fresco (Tabela 8, Figura 1).

Na avaliação do pH, não foram observadas diferenças entre os grupos e com

relação aos resultados da porcentagem de espermatozóides com membrana funcional

observou-se que os grupos G0h, G1h e G2h apresentaram uma menor porcentagem de

54

espermatozóides com membrana funcional em relação ao sêmen fresco e na comparação

entres os grupos G0h, G1h e G2h, observou-se que o G0h apresentou menos espermatozóides

com membrana funcional em relação ao grupo G2h (Figura 2, Figura 3).

Tabela 1: Média ± desvio padrão da concentração, motilidade, vigor, espermatozóides

normais, alterações morfológicas e acrossomas intactos do sêmen a fresco (n=10 ejaculados).

Parâmetros avaliados Média ± D.P.

Volume da fração espermática (µl) 796,00 ± 379,87

pH 6,15 ± 0,24

Concentração espermática (nº sptz X 106/mL) 1473,00 ± 735,80

Motilidade (%) 99,00 ± 3,05

Vigor (0 – 5) 5,00 ± 0,00

Espermatozóides normais (%) 91,80 ± 5,16

Alterações morfológicas de cabeça

Primárias (%) 2,00 ± 2,36

Secundárias (%) 0,90 ± 1,10

Alterações morfológicas de peça intermediária

Primárias (%) 0,10 ± 0,32

Secundárias (%) 0,40 ± 0,70

Alterações morfológicas de cauda

Primárias (%) 0,00 ± 0,00

Secundárias (%) 4,80 ± 3,49

Acrossomas intactos (%) 95,80 ± 2,30

55

Tabela 2: Média ± desvio padrão da motilidade espermática total pós-descongelação em três

diferentes tempos de equilíbrio (0h, 1h e 2h) nos tempos 0, 30, 60, 90, 120min após a

descongelação.

Termorresistência

(minutos)

MT / tempo de equilíbrio (horas)

0 1 2

0 19,5 ± 14,21 bA 33,27 ± 19,21abA 39,29 ± 19,82aA

30 5,47 ± 4,25bB 13,50 ± 8,57aB 19,49 ± 12,82aB

60 1,62 ± 2,12bC 7,40 ± 7,11aC 11.02 ± 12,08aC

90 1, 07 ± 3,28aC 2,19 ± 3,45aD 5,97 ± 8,72aCD

120 0,50 ± 1,58aC 0,47 ± 1,38aD 2,20 ± 5,29aD ab Letras minúsculas diferentes indicam diferença estatística na linha. ABCD Letras maiúsculas diferentes indicam diferença estatística na coluna.

p < 0,05

Tabela 3: Média ± desvio padrão da motilidade espermática progressiva pós-descongelação

em três diferentes tempos de equilíbrio (0h, 1h e 2h) nos tempos 0, 30, 60, 90, 120min após a

descongelação.

Termorresistência

(minutos)

MP / tempo de equilíbrio (horas)

0 1 2

0 12,81 ± 10,48bA 21,80 ± 15,17abA 26,59 ± 17,47aA

30 2,61 ± 2,34bB 5,99 ± 4,46aB 10,66 ± 7,79aB

60 0,90 ± 1,28aC 2,92 ± 3,01aC 5,14 ± 7,93aBC

90 0,61 ± 1,93aD 1,17 ± 1,84aD 3,17 ± 5,05aC

120 0,14 ± 0,44aD 0,24 ± 0,76aD 1,13 ± 2,57aC

ab Letras minúsculas diferentes indicam diferença estatística na linha. ABCD Letras maiúsculas diferentes indicam diferença estatística na coluna.

p < 0,05

56

Tabela 4: Média ± desvio padrão da percentagem de espermatozóides com velocidade rápida

pós-descongelação em três diferentes tempos de equilíbrio (0h, 1h e 2h) nos tempos 0, 30, 60,

90, 120min após a descongelação.

Termorresistência

(minutos)

% espermatozóides rápidos / tempo de equilíbrio (horas)

0 1 2

0 9,16 ± 10,58aA 16,59 ± 13,28aA 18,30 ± 15,53aA

30 1,33 ± 1,67bB 3,32 ± 2,78abB 6,03 ± 5,25aB

60 0,35 ± 0,73aC 1,13 ± 1,62aC 2,40 ± 3,75aC

90 0,18 ± 0,57aC 0,45 ± 1,14aCD 2,04 ± 3,47aC

120 0,02 ± 0,06aC 0,00 ± 0,00aD 0,36 ± 0,87aC ab Letras minúsculas diferentes indicam diferença estatística na linha. ABCD Letras maiúsculas diferentes indicam diferença estatística na coluna.

p < 0,05

Tabela 5: Média ± desvio padrão da percentagem de espermatozóides com velocidade média

pós-descongelação em três diferentes tempos de equilíbrio (0h, 1h e 2h) nos tempos 0, 30, 60,

90, 120min após a descongelação

Termorresistência

(minutos)

% espermatozóides médios / tempo de equilíbrio (horas)

0 1 2

0 4,50 ± 3,38bA 6,70 ± 4,61abA 11,24 ± 9,83aA

30 1,45 ± 1,25bB 3,17 ± 2,16aB 5,64 ± 4,55aA

60 0,57 ± 0,71bC 2,06 ± 1,83abB 3,38 ± 5,28aB

90 0,43 ± 1,36aC 0,71 ± 1,15aC 1,23 ± 1,82aB

120 0,17 ± 0,54aC 0,28 ± 0,88aC 0,82 ± 1,85aB

ab Letras minúsculas diferentes indicam diferença estatística na linha. ABCD Letras maiúsculas diferentes indicam diferença estatística na coluna.

p < 0,05

57

Tabela 6: Média ± desvio padrão da VAP dos espermatozóides rápidos espermática pós-

descongelação em três diferentes tempos de equilíbrio (0h, 1h e 2h) nos tempos 0, 30, 60, 90,

120min após a descongelação.

Termorresistência

(minutos)

VAP rápidos / tempo de equilíbrio (horas)

0 1 2

0 120,30 ± 8,24aA 120,03 ± 7,40aA 117,89 ± 6,64aA

30 83,89 ± 32,19aB 103,41± 17,82aB 105,76 ± 25,67aA

60 31,50 ± 41,80aC 52,68 ± 55,06aC 62,34 ± 59,32aB

90 14,41 ± 40,76aC 24,02 ± 47,85aCD 40,07 ± 52,66aB

120 4,14 ± 11,70aC 0,00 ± 0,00aD 22,53 ± 44,75aB ab Letras minúsculas diferentes indicam diferença estatística na linha. ABCD Letras maiúsculas diferentes indicam diferença estatística na coluna.

p < 0,05

Tabela 7: Média ± desvio da VAP dos espermatozóides com velocidade média pós-

descongelação em três diferentes tempos de equilíbrio (0h, 1h e 2h) nos tempos 0, 30, 60, 90,

120min após a descongelação.

Termorresistência

(minutos)

VAP médios / tempo de equilíbrio (horas)

0 1 2

0 73,25 ± 12,14aA 75,38 ± 10,82aA 79,03 ± 2,88aA

30 57,17 ± 21,73bAB 67,03 ± 11,98abAB 76,10 ± 6,51aA

60 34,40 ± 39,33aB 59,18 ± 24,84aB 47,29 ± 34,05aB

90 7,53 ± 23,81aC 23,12 ± 34,49aC 27,54 ± 36,80aB

120 6,69 ± 21,16aC 7,78 ± 24,60aC 15,20 ± 32,09aB ab Letras minúsculas diferentes indicam diferença estatística na linha. ABCD Letras maiúsculas diferentes indicam diferença estatística na coluna.

p < 0,05

58

Tabela 8: Média ± desvio padrão das alterações morfológicas primárias e secundárias da

cabeça. Peça intermediária e cauda e do total de espermatozóides normais em ralação ao

sêmen fresco e aos tratamentos 0h, 1h e 2h.

Grupos Alterações

(%) Fresco 0h 1h 2h

Cabeça

Primária 2,00 ± 2,36a 2,16 ± 2,91a 1,60 ± 1,95a 1,10 ± 0,99a

Secundária 0,90 ± 1,10a 0,90 ± 1,90a 0,50 ± 0,80a 0,90 ± 1,59a

Peça

intermediária

Primária 0,10 ± 0,32a 0,00 ± 0,00a 0,20 ± 0,42a 0,20 ± 0,42a

Secundária 0,40 ± 0,70a 0,40 ± 0,52a 0,80 ± 1,32a 0,30 ± 0,67a

Cauda

Primária 0,00 ± 0,00a 0,10 ± 0,32a 0,00 ± 0,00a 0,20 ± 0,63a

Secundária 4,80 ± 3,49a 20,99 ± 13,14b 19,20 ± 9,37b 21,40 ± 11,50b

Normais 91,80 ± 5,16a 75,00 ± 12,79b 77,10 ± 10,04b 75,90 ± 13,08b a,bLetras minúsculas diferentes indicam diferença entre colunas.

P < 0,05

0

20

40

60

80

100

120

TRATAMENTOS

AC

RO

SS. I

NT

AC

TO

S

fresco

0h

1h

2h

Figura 1: Porcentagem média ± DP de células com acrossoma normal do sêmen a fresco e

descongelado em diferentes tempo de equilíbrio (0h, 1h e 2h). a,bLetras minúsculas diferentes indicam diferença entre colunas

a b

b

b

b

59

5,4

5,6

5,8

6

6,2

6,4

6,6

TRATAMENTOS

pH

fresco

0h

1h

2h

Figura 2: Média ± DP do pH de amostras do sêmen a fresco e descongelado a diferentes

tempos de equilíbrio (0h, 1h e 2h).

P > 0,05

0

20

40

60

80

100

120

TRATAMENTO S

% E

NR

OL

AD

AS fresco

0h

1h

2h

Figura 3: Porcentagem média ± DP de células com cauda enrolada de amostras do sêmen a

fresco e descongelado a diferentes tempos de equilíbrio (0h, 1h e 2h). a,bLetras minúsculas diferentes indicam diferença entre colunas

DISCUSSÃO

De acordo com os resultados obtidos para o sêmen fresco, pode-se observar que

os parâmetros avaliados encontravam-se dentro da normalidade para a espécie canina

(CHRISTIANSEN, 1988) e que, portanto todos os animais utilizados estavam aptos a

participarem desse experimento.

b c bc

a

60

No que diz respeito aos parâmetros avaliados pelo CASA, os resultados revelam a

importância do tempo de equilíbrio ao se congelar o sêmen de cães quando se usa ACP-106®

como diluidor. SALAMON & MAXWELL (2000) relataram a importância desse tempo de

equilíbrio para a qualidade do sêmen canino pós-descongelação, pois segundo esses autores

durante esse período, ocorre o equilíbrio osmótico entre o meio intracelular espermático e

extracelular, formado por todos os componentes osmoticamente ativos presentes no meio

diluidor. WATSON (1979) sugeriu que este tempo não é só importante para permitir a entrada

do glicerol como se acreditava anteriormente, mas também permite que as membranas

espermáticas se acomodem ou que influxos iônicos ocorram. Outro ponto importante

atribuído ao tempo de equilíbrio é que a permanência do sêmen a uma baixa temperatura

permite uma melhor adaptabilidade dos espermatozóides a essa temperatura, reduzindo com

isso, o efeito negativo do choque térmico já que as alterações físico-químicas na membrana

celular causadas pelo resfriamento podem ser irreversíveis (SANTOS et al., 2003).

A motilidade espermática é o principal parâmetro microscópico avaliado no sêmen

descongelado, (ENGLAND, 1993). Nesse experimento, os dados referentes à motilidade total

logo após a descongelação, mostraram que o sêmen submetido a um tempo de equilíbrio de 1

e 2 horas apresentaram uma média aceitável para uma posterior inseminação artificial, visto

que no caso do sêmen congelado-dscongelado, CONCANNON & BATTISTA (1989)

sugerem, para a espécie canina, uma motilidade acima de 50% como ideal e, acima de 30%

como aceitável. O G0h foi quem mostrou os piores resultados de motilidade, contudo o

resultado desse grupo foi semelhante ao obtido por CARDOSO (2005), que utilizando o

mesmo diluidor (ACP-106® acrescido de 20% de gema de ovo) e o mesmo protocolo de

congelação do G0h obteve uma motilidade total de 23% e uma motilidade progressiva de

18%. CARDOSO (2005) foi quem primeiro analisou os dados do sêmen canino descongelado

diluído em ACP-106® utilizando o CASA e nesse trabalho foi comparado os resultados da

análise computadorizada com os da análise subjetiva havendo uma superioridade significativa

dos resultados obtidos pela análise subjetiva. Atribuímos esse resultado ao fato de que é

requerida uma re-diluição para o CASA devido à alta concentração do sêmen após a

descongelação e sabe-se que essa re-diluição do sêmen pode causar mudanças no parâmetro

motilidade e integridade de membrana (IGUER-OUADA & VERSTEGEN, 2001a; SMITH &

ENGLAND, 2001; RIJSSELAERE et al., 2003). Outro ponto importante é que segundo

SCHÄFER-SOMI & AURICH (2007), o aumento na concentração espermática melhora

significativamente a velocidade espermática, a linearidade e a motilidade. Esses autores

recomendam uma concentração de 100×106 sptz/mL para uma adequada análise. Nesse estudo

61

também foi percebido esse efeito da concentração, mas mesmo assim, uma concentração

variando de 20 a 50x106 de sptz/mL foi estabelecida previamente, baseando-se na informação

de que as colisões individuais múltiplas das células condensadas nas concentrações elevadas

podem interferir na motilidade progressiva (VANTMAN et al. 1988; RIJSSELAERE et al.

2002, 2003; HOFLACK et al. 2005). Como existe esse impasse quanto à melhor concentração

a ser utilizada para uma adequada avaliação do CASA, sugerem-se mais estudos sobre esse

assunto.

No tocante ao teste de termorresistência, pôde-se perceber uma queda significativa

a partir dos 30min para a maioria dos parâmetros avaliados, contudo esse resultado não foi

preocupante, visto que a termorresistência pós-descongelação é baixa para o espermatozóide

canino e, além disso, o espermatozóide canino mesmo com uma baixa termorresistência não

tem, necessariamente, um baixo potencial fertilizante (STRÖM et al., 1997).

Com relação às alterações morfológicas, acrossomas intactos e teste hipoosmótico

os resultados obtidos já eram esperados em função dos danos celulares provocados pelo

processo de congelação e descongelação do sêmen (WATSON, 1995). Na comparação entre

os grupos dos resultados do teste hipoosmótico, o G0h apresentou menos espermatozóides

com membrana funcional em relação ao grupo G2h e isso indica que o tempo de equilíbrio

promoveu um efeito benéfico sobre a preservação da funcionalidade da membrana.

Com relação ao pH constatou-se que ação tamponante do diluidor foi extremamente

eficaz, já que foi capaz de manter o pH dentro da normalidade ao longo de todo experimento

(CHRISTHIANSEN 1988).

CONCLUSÃO

Após a análise dos dados podemos concluir que no processo de congelação do

sêmen de cães deve-se incluir um tempo de equilíbrio de 2h após a glicerolização a 4°C.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à CAPES, ao CNPq e à FUNCAP pelo apoio financeiro;

aos proprietários dos cães, em particular ao Daniel Couto Uchoa, por disponibilizar os

animais para o estudo; ao Prof. Dr. Airton Alencar de Araújo pela colaboração nas análises

62

estatísticas e ao Laboratório de Tecnologia do Sêmen Caprino pela disponibilização de uso do

CASA

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67

8. CONCLUSÕES

1. A partir dos resultados obtidos sugere-se que a melhor a taxa de descongelação para o

sêmen de cães utilizando como diluidor o ACP-106® seja 55°C/5s já que a mesma foi quem

proporcionou uma melhor motilidade por até 30min após a descongelação.

2. Após a análise dos dados podemos concluir que no processo de congelação do sêmen de

cães deve-se incluir um tempo de equilíbrio de 2h após a glicerolização a 4°C.

68

9. PERSPECTIVAS

Após a conclusão desse trabalho foi possível demonstrar a eficiência do diluidor a

base de água de coco em pó na congelação do sêmen de cães. Além disso, aprimorou-se a

técnica de congelação até então utilizada para esse diluidor, pois foi mostrada a importância

da inclusão de um tempo de equilíbrio de 2h após a glicerolização a 4°C e de uma taxa de

descongelação de 55°C por 5 segundos. Com esse aperfeiçoamento no protocolo de uso do

diluidor ACP®-106 foi dado um passo importante visando à aplicação comercial e uso em

larga escala.

69

10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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11. ANEXOS

Anexo A. Composição do corante Rosa de Bengala para avaliação da morfologia

espermática.

20 mL de água destilada

0,58 g de citrato de sódio

0,8 mL de formaldeído

0,3 g de Rosa de Bengala

OBS.: Após a mistura dos três primeiros componentes, a solução é homogeneizada e

acrescenta-se o Rosa de Bengala.

Anexo B. Diluidor à base de água de coco em pó (ACP-106®) para criopreservação de

sêmen canino.

4,25 g ACP-106®

50 mL água destilada

OBS.: pH 7,07 e osmoraridade de 298 mOsmol.

Anexo C. Composição do meio de re-diluição (solução de citrato de glicose) para avaliação

no CASA

100 mL de água destilada

0,08 g de glicose

2,37 g de citrato de sódio

OBS.: pH 7,5 e osmolaridade de 300 mOsm.