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Cromatografia edElettroforesi
Prof.ssa Flavia Frabetti
Esplorando le proteineUn passaggio indispensabile negli studi di biochimica che necessitanodi conoscere la sequenza aa di una proteina per potere spiegare la sua struttura tridimensionale e dunque il suo funzionamento è la
PURIFICAZIONE della proteina di interesse
Tre metodi chiave: cromatografiaelettroforesiultracentrifugazione
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CROMATOGRAFIA
• metodo fisico di separazione dei componenti di una miscela complessa
• può essere analitica o preparativa
• si realizza attraverso l’utilizzo di un sistema cromatografico
fase stazionaria impaccata in un letto cromatograficofase mobilesistema di distribuzione della fase mobilesistema di rilevazione
• di solito per arrivare alla purificazione completa di una sostanza sideve usare una sequenza di più metodi cromatografici
• il fondamento di tutte le tecniche cromatografiche è il coefficiente diripartizione (o coefficiente di distribuzione) Kd che descrive come ilcomposto si distribuisce tra due fasi immiscibili.
I singoli componenti di una miscela vengono separati sulla base di differenti CARATTERISTICHE FISICHE:
dimensione e forma
carica
volatilità solubilità
affinità di legame permolecole specifiche
la separazione dei singoli componenti di una miscela è resa possibile dalla diversa interazione degli stessi con la fase stazionaria
interazione forte ritardo maggioreinterazione scarsa ritardo minimo
tempi di eluizione >tempi di eluizione <
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Eluire = lavare via, staccare via, distaccare una sostanza dalla fase stazionare alla quale ha aderito per una specificaaffinità
Lessico scientifico
Fase = componente del sistema caratterizzato da unauniforme composizione chimica e proprietà fisiche(densità, struttura cristallina, ecc.)
miscela
fasestazionaria
rilevatorefase mobile
Si inietta una miscela da analizzare su una colonna
I componenti avanzanoa diverse velocità attraverso il mezzo di conduzione ovverola fase mobile, a seconda del grado di affinità per la fase stazionaria, il tempo di uscitaverrà registrato dal rilevatore
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Tipologie dei sistemi cromatografici
La classificazione può avvenire in base a:
forma del letto cromatografico
natura delle fasi mobile o stazionaria
metodo di separazione
Forma del letto cromatografico es. su strato sottile (es.carta) o su colonna
Tipologia-classificazione
raccolta dei componenti
aggiunta solvente
caricamentocampione
colonna contenente
la fasestazionaria
Cromatografia su CARTA
Cromatografia su STRATO SOTTILE
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Metodo di separazioneTipologia-classificazione
1) cromatografia di partizioneo ripartizione
• separazione sulla base della solubilità di molecole piccole• ripartizione tra due fasi liquide: acqua che permea una matricesolida inerte + fase mobile organica non polare• cromatografia a fase inversa (vedi HPLC)
matrice inerte di supporto
fase stazionarialiquida
flusso della fase mobile
molecole non polariche si sciolgono nella fase
stazionaria
molecole polari che passano velocemente attraverso la colonna
Metodo di separazione2) cromatografia per gel permeazione(o esclusione molecolare)
• separazione sulla base della dimensione• fase stazionaria = granuli porosi di un polimeroinsolubile ma molto idratato
flusso della fase mobile
fase stazionaria gelmicroporoso
molecole piccole che hannoaccesso all’intera matrice molecole medie che hanno
accesso solo ai pori più larghi
molecole grandi che sono totalmenteescluse dai pori e passano rapidamente attraverso la colonna
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Metodo di separazione 3) cromatografia a scambio ionico
• separazione sulla base della carica• fase stazionaria = colonne con resine: cariche + (es.dietilamminoetil-cellulosa o DEAE-cellulosa) oppurecariche - (es.carbossimetil-cellulosa o CM-cellulosa)
flusso della fase mobile
cationi (+) del campioneche vengono trattenuti dalla
colonna+
+
+
__ _
_
_
_
_
_ _
++
--- --
fase stazionariaresina a scambiocationico
Separazione di aa in una colonna a scambio cationico
Asp Ser Lys
Colonnaa scambiocationico
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Metodo di separazione 4) cromatografia per affinità
• separazione sulla base ad una affinità chimica di legame• fase stazionaria = colonne dove viene immobilizzatoun ligando specifico per una certa molecola che ha una struttura complementare che specificamente riconosce quel ligando
flusso della fase mobile
fase stazionaria:matrice solida disupportotratto spaziatoreligando
tutti gli altri soluti vengono eluiti
molecola complementarelegata da interazioni specifiche
al ligando
Tipologia-classificazioneNatura delle fasi mobile o stazionaria
fase stazionaria: solido/gel o liquido
fase mobile: liquido o gas
liquidasolidaCromatografia aScambio ionico (IEC)
liquidasolidaCromatografia sustrato sottile (TLC)
liquidasolidaCromatografialiquida (LC)
gasSolida oliquida
Gascromatografia
Fasemobile
Fasestazionaria
Tipo es.
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Tipologia-classificazioneNatura delle fasi mobile o stazionaria
cromatografia liquida-liquida: HPLC cromatografia ad alta performanceo cromatografia liquida ad alta pressione
esempi:
cromatografia gas -liquida: gas-cromatografia
fase stazionaria: solido/gel o liquido
fase mobile: liquido o gas
carrier gas
pompa colonna
rilevatore
Fase stazionariasolida
Esempio di un cromatogramma
Deve avere una buona risoluzione
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inizio
t’R2
t’R1 ΔttM
picco di un solutonon trattenuto
tR = tempo di ritenzionetM = tempo di ritardo della fase mobile
t’R1= tR-tMΔt = distanza tra i 2 picchi
R�ISOLUZIONE R= Δt Wb1+Wb2
2se R = 1.5 separazione completa
Wb1 Wb2
ELETTORFORESI
• metodo fisico di separazione che sfrutta la mobilità elettroforetica di molecole cariche, sottoposte ad un campo elettrico
• si realizza attraverso l’utilizzo di un sistema elettroforetico
matrice di gelcella elettroforeticaalimentatore (in cui applicare voltaggio o intensità di corrente costante)tamponi salini
si possono studiare sia gliacidi nucleici (DNA e RNA) sia le proteine
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Matrice di gel serve da “setaccio” molecolare e consentela separazione
può essere fatto di polimeriagarosio o poliacrilamide
Gel di agarosio: pesare l’agarosio misurare il buffer (TBE/TAE) bollire l’agarosio in buffer versare il gel nella vaschetta allestita
Gel di acrilamide:miscelando acrilamide e bis-acrilamide che formano un polimero complesso a maglia*
Come si forma il gel?
Gel di acrilamide
• utili soprattutto per la separazione e caratterizzazione di proteine• di solito in sistemi verticali• la velocità di migrazione elettroforetica attraverso i gel dipende principalmente da 4 parametri
taglia molecolare del peptideconcentrazione di acrilamideconformazione della molecola (denaturata o meno)voltaggio
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pozzetticon i campioni
campione
anodo
catodo
supportodiplastica
tampone
tampone
PAGE = Poli-Acrilamide Gel Elettroforesi delle proteineè di norma realizzata facendo polimerizzare la poliacrilamide tra due vetri piatti e la corsa viene eseguita in un sistemaverticaleSDS = detergente(sodio-dodecil-solfato)carico
-
Spesso si procede in condizioni denaturanti - SDS PAGE
proteina tetramerica proteina monomerica
bollitura
bollitura
peptidi connessi daponti disolfuro
peptidi separati
DENATURAZIONE DELLE PROTEINE
SDS = Sodio Dodecil-Solfato (detergente anionico)BME = β- mercaptoetanolo (riducente)
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Acrilamide(%) Intervallo di separazione dei peptidi(in kilodalton)
8 200 - 25
10 100 - 15
12.5 70 - 10
15 60 - 6
20 40 - 4
Scelta della % di acrilamide in rapporto alla taglia molecolare delle proteine
Dal Chieffiriquadro 2.2 pag:44-48
ELETTROFORESI BIDIMENSIONALESU GEL o ISOELECTROFOCUSINGpunto isoelettrico (pI): il pH al quale la carica nettadi una proteina è nulla per un bilancio tra + e -, quiLa proteina non sarà più soggetta a migrazione elettroforetica
pH acido
pH basico
I fase:sep. x carica
II fase: separazione dimensionale
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Rivelazione della separazione elettroforetica:
• tramite colorazione aspecifica di tutte le proteine della miscela(es. con comassie blue o silver-stain)
• trasferimento, anche qui elettroforetico, su opportune matrici attraverso la tecnica del Western Blotting per analisi più fini, specifiche
1- riconoscimento mediante autoradiografia di proteine marcate con radioisotopi2- riconoscimento immuno-enzimatico utilizzando anticorpi specifici
2- riconoscimento immuno-enzimatico utilizzando anticorpi specifici
consente di riconoscere una specifica proteina di interesse
consta di diverse fasi schematizzabili in:a) elettrotrasferimento dal gel ad una membrana di nitrocellulosab) rivelazione con l’anticorpo (colorazione immuno-enzimatica)
1- riconoscimento mediante autoradiografia di proteine marcate con radioisotopi
consente di evidenziare proteine neo-sintetizzate ed analizzare ilturn-over proteico. L’isotopo radioattivo più usato è lo zolfo 35S
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a) elettrotrasferimento dal gel ad una membrana di nitrocellulosa
trasferimentodelle proteine
proteina di interesse
carta imbevutadi tampone
carta imbevutadi tampone
b) rivelazione con l’anticorpo (colorazione immuno-enzimatica) -fasi procedurali
anticorpi Ilegano l’antigene
anticorpi IIlegano gli anticorpi I
la membrana viene saturata daproteine inerti
sviluppo della colorazione enzimatica
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Acrilamide(%) Intervallo di separazione dei peptidi(in kilodalton)
8 200 - 25
10 100 - 15
12.5 70 - 10
15 60 - 6
20 40 - 4
Stima della dimensione di una molecola in rapporto alla mobilità elettroforeticadi std di dimensione nota (questo vale anche per le proteine)
Scelta della % di acrilamide in rapporto alla taglia molecolare delle proteine