cuantificación de beta-glucanos en diferentes especies...

Cuantificación de beta-glucanos en diferentes especies de hongos: Hongo Robellón (Lactarius deliciosus), Hongo

Blanco (Boletus edulis), Champiñón (Agaricus bisporus) y Shiitake (Lentinus edodes) y cuantificación de

arabinoxilanos en malta y bagazo de cerveza Trabajo Final de Máster

Andrea Rivera [email protected]

Septiembre 2016

TRABAJO FINAL DE MÁSTER

Cuantificación de beta-glucanos en diferentes especies de hongos: Hongo Robellón (Lactarius deliciosus), Hongo Blanco

(Boletus edulis), Champiñón (Agaricus bisporus) y Shiitake (Lentinus edodes) y cuantificación de arabinoxilanos en malta y

bagazo de cerveza

Andrea Rivera Toapanta Máster en Biotecnología Alimentaria

2016

Dirigida por:

Dra. Núria Panella Riera

Tutor:

Dr. Jaume Camps Soler

Memoria presentada para optar el título de Máster por la

Universidad de Girona

PRÓLOGO

El Trabajo Final de Máster se ha realizado en el IRTA entre los meses de marzo, abril, mayo y junio del 2016 en el Programa de Calidad de Producto bajo la dirección y supervisión de la Dra Núria Panella, la Dra. Marta Gil y el Dr. Jaume Camps de la Universidad de Girona.

El Instituto de Investigación y Tecnología Agroalimentarias (IRTA) es un instituto de investigación de la Generalidad de Cataluña adscrito al Departamento de Agricultura, Ganadería, Pesca, y Alimentación. Su misión, es contribuir a la modernización, competitividad y desarrollo sostenible del sector agrario, alimentario y acuícola, el abastecimiento de alimentos sanos y de calidad para los consumidores y, en general, a la mejora del bienestar de la población

El programa de Calidad de Producto, entre los estudios que se dedican es a la evaluación de la calidad de la carne desde el punto de vista tecnológico, nutricional, sensorial y social en relación con la genética, la alimentación y el tratamiento ante y post mortem, realizan estudios de vida útil, maduración, reducción de los defectos de calidad en carne envasada, y clasificación de la carne de cerdo macho con olor sexual, y también detectan componentes bioactivos en diferentes matrices alimentarias y en sub productos que puedan ser utilizados para la innovación de las propiedades de otros alimentos.

Agradecimientos

Quiero agradecer a la Secretaría de Educación Superior, Ciencia, Tecnología e Innovación como entidad auspiciante de la beca, que permitió que realice mi posgrado de Máster en Biotecnología Alimentaria, en Girona- España.

Al Sr. Joan Tibau director del IRTA Monells, y a la Dra. María Ángels Oliver, y al excelente grupo investigador y personal colaborador del programa de Calidad de Producto, por apoyarme y acogerme en sus instalaciones.

Especialmente, quiero agradecer la Dra. Núria Panella y la Dra. Marta Gil, por su dirección excelente, dedicación y su apoyo incondicional en el desarrollo del trabajo final de Máster, gracias por compartir sus conocimientos, sus consejos sabios y la paciencia y cariño que tuvieron conmigo.

Al Dr. Jaume Camps, mi tutor académico de la Universidad de Girona, por la guía en la estructuración y revisión del trabajo.

A todo el docente investigador de la Maestría de Biotecnología Alimentaria de la UDG, especialmente a las Dras. María Pla, Ana Nadal, Elena Carretero, Dolors Parés y Elena Saguer, gracias por sus excelentes clases, por las tutorías, y consejos, y sobre todo por hacerme sentir muy bien desde el primer día de clases.

Por último, quiero agradecer a mis padres y hermano por su amor y apoyo incondicional a la distancia, para mi desarrollo personal y profesional.

“Doy gracias a Dios porque es mi roca y mi fortaleza, por las personas hermosas que puso en mi camino, y permitió que se desarrolle este trabajo con éxito”.

A todos, muchas gracias.

i

INDICE GENERAL

INDICE DE FIGURAS ........................................................................................................... ii

INDICE DE TABLAS ............................................................................................................ iii

1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 1

1.1 Características (13, 14) , (13, 16) –β-D glucanos ......................................... 2

1.2 β- glucanos en hongos................................................................................................ 3

1.3 β-glucanos en cereals - bagazo ................................................................................... 6

1.4 Arabinoxilanos .......................................................................................................... 9

1.5 Aplicaciones de β-glucanos...................................................................................... 11

1.5.1 Fibra como ingrediente en la formulación de productos de carne ...................... 11

1.5.2 Potencial uso de β-glucanos en los productos derivados de lácteos ................... 11

2. OBJETIVOS ................................................................................................................... 14

3. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................ 15

3.1 Material biológico ................................................................................................... 15

3.2 Cuantificación de β- glucanos en hongos mediante el método enzimático: hongos y levaduras beta glucanos, (K-YBGL 09/14, Megazyme) ....................................................... 15

3.2.1 Principio: ......................................................................................................... 15

3.2.2 Materiales y reactivos ...................................................................................... 16

3.2.3 Método Determinación de Glucanos totales (incluye alfa y beta glucanos, D-glucosa presente en los oligosacáridos, sacarosa y D- glucosa libre)................................. 16

3.3 Cuantificación de β- glucanos en bagazo (K-BGLU 05/15, método 4.16.1 Megazyme) 17

3.3.1 Principio: ......................................................................................................... 17


3.3.3 Método Determinación de β – glucanos en bagazo. Método (EBC Método 4.16.1) 18

3.4 Cuantificación de arabinoxilanos en bagazo por HPLC-IR ....................................... 18

3.4.1 Principio: ......................................................................................................... 18


3.4.3 Método Determinación de arabinoxilanos en hongos, malta y bagazo. .............. 20

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN...................................................................................... 20

4.1 Cuantificación de β- glucanos en hongos K-YBGL09/14, Megazyme). .................... 20

4.2 Cuantificación de β- glucanos en bagazo (K-BGLU 05/15, Método 4.16.1 Megazyme) 24

4.2.1 Estabilización del bagazo ................................................................................. 24

4.2.2 Pruebas de distintas concentraciones durante la extracción de beta-glucanos ..... 27

ii

4.2.3 Prueba del tiempo de espera para el desarrollo del color ................................... 28

4.2.4 Resultados del análisis de contenido de beta-glucanos en malta y bagazo ......... 29

4.3 Cuantificación de arabinoxilanos en bagazo ............................................................. 33

4.3.1 Selección de la columna cromatográfica ........................................................... 33

4.3.2 Determinación de arabinoxilanos en muestras de malta y bagazo. ..................... 34

4.3.3 Rectas de calibración ....................................................................................... 34

4.3.4 Resultados y cuantificación de arabinoxilanos en malta y bagazo ..................... 41

5. CONCLUSIONES .......................................................................................................... 43

6. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 44

7. ANEXOS ........................................................................................................................ 48

7.1 Características de la columna HPX-87P. .................................................................. 48

7.2 Estándares para la determinación de Arabinoxilanos. ............................................... 49

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Instalaciones del IRTA y laboratorio donde se desarrolló la investigación. ................ 1 Figura 2. Estructura química de los β-D glucanos, con un enlace 1,3, cada tres enlaces

1,4(Rivero Hernández, 2012). ....................................................................................... 2 Figura 3 Estructura de las moléculas de β-glucanos. Ejemplo de diferentes enlaces entre

unidades de glucosa, determinando su estructura bioquímica de diversos β-glucanos (Petit and Wiegertjes, 2016) ......................................................................................... 3

Figura 4. Morfología de hongos y trufas (Saritha, Prakash, Khedkar, & Reddy, 2016) .............. 4 Figura 5. Estructura de (1-3) β- glucanos y con ramificaciones β (1-6) (Laroche, 2007). .......... 4 Figura 6. Estructura química de los β-D glucanos, con un enlace 1,3, cada tres enlaces 1,4 ;

Rivero, 2011-2012). ...................................................................................................... 6 Figura 7. Interior del grano de cebada (Rivero, 2011-2012). .................................................... 6 Figura 8. Esquema de un proceso de producción de la cerveza. Fuente Enciclopedia Británica,

Inc. 2009. https://global.britannica.com/topic/malting .................................................. 8 Figura 9. Representación esquemática del proceso de obtención del bagazo de cebada

(Mussatto, Dragone, & Roberto, 2006). ........................................................................ 8 Figura 10. Estructura química de los arabinoxilanos. Fuente:

http://www.scientificpsychic.com/fitness/carbohidratos2.html ....................................... 9 Figura 11. a) Robellón (Lactarius deliciosus), b) Shiitake (Lentinus edodes), c) Hongo Blanco

(Boletus edulis), d) Champiñón (Agaricus bisporus), e) Malta y f) Bagazo. ................. 15 Figura 12. Porcentaje de β-glucanos en diferentes especies de hongos, determinadas con el

método enzimático específico para hongos y levaduras (Megazyme K-YBGL09/14). Resultado representa el promedio obtenido de dos determinaciones (duplicado). El control contiene 49 % (1-3-) (1-6)-β-glucanos de levadura. ........................................ 23

Figura 13. Porcentaje de humedad y peso seco de los champiñones frescos, obtenidos sometiendo 5 g de champiñones frescos a 102 º C durante 48 horas (hasta peso constante). .................................................................................................................. 24

Figura 14.Determinación del porcentaje humedad perdida en bagazo seco a 40 ° C y a 50 ° C. ................................................................................................................................... 25

Figura 15.Porcentaje de β-glucanos en bagazo, secado en estufa a 40 °C y a 50 °C. Todas las muestras se analizaron por duplicado. ........................................................................ 26

iii

Figura 16. Determinación de absorbancia de muestras de bagazo secadas a 40°C con diferentes volúmenes de dilución (20 y 30 mL). A y B: dilución a 20 mL; C y D: dilución a 30 mL. Todas las muestras se analizaron por duplicado. .......................................... 27

Figura 17. Porcentaje de β-glucanos de muestras de bagazo secas a 40°C con diferentes volúmenes de dilución (20 y 30 mL). A y B: dilución a 20 mL; C y D: dilución a 30 mL. Todas las muestras se analizaron por duplicado. ........................................................ 28

Figura 18. Desarrollo de color durante el análisis de beta-glucanos en muestras de bagazo y muestras control, considerando tres tiempos de medida: 15,30 y 45 minutos. Todas las muestras se analizaron por duplicado. ........................................................................ 29

Figura 19. Determinación del % β-glucanos en el control harina de cebada, malta y bagazo. . 30 Figura 20. Contenido del % β-glucanos en harina de cebada, malta y bagazo (Marconi et al.,

2014) .......................................................................................................................... 31 Figura 21. Prueba preliminar para la determinación de arabinoxilanos con la columna HPX-

87C ............................................................................................................................ 33 Figura 22.Cromatogramas de los estándares de glucosa (a), xilosa (b), galactosa(c),

arabinosa(d) (continua) .............................................................................................. 35 Figura 23. Cromatogramas obtenidos para el mix de azúcares de Glucosa, Xilosa, Galactosa,

Arabinosa y Manosa a distintas concentraciones: a) 50 ppm, b) 100 ppm, c) 200 ppm, d) 500 ppm, e) 1000 ppm, f) 1500 ppm y g) 2000 ppm. (continua) .............................. 37

Figura 24. Curvas calibración de la glucosa, xilosa, galactosa y arabinosa. ........................... 39 Figura 24 (Continuación). Curva calibración de la manosa .................................................... 40 Figura 25. Cromatogramas obtenidos tras analizar por HPLC-RI el control de arabinoxilanos

(a), bagazo secado a 40°C (b), Malta (c). ................................................................... 42

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Composición nutricional general de hongos (Saritha et al., 2016) ............................... 5 Tabla 2. Composición del bagazo de cerveza. ......................................................................... 10 Tabla 3. Productos de carne frescos enriquecidos con fibra diaria y materiales enriquecidos

con fibra. .................................................................................................................... 12 Tabla 4. Aplicaciones industriales de β-glucanos. ................................................................... 13 Tabla 5. Contenido de glucanos totales, alfa y beta de distintas especies de hongos

determinadas con el método enzimático específico para hongos y levaduras (Megazyme K-YBGL09/14). Resultado representa el promedio obtenido de dos determinaciones (duplicado). ................................................................................................................ 22

Tabla 6. Determinación de diferentes compuestos del bagazo, mediante método secado, para asegurar su preservación. ........................................................................................... 26

Tabla 7. Rendimiento de extracción de β-glucanos de salvado de cebada con diferentes métodos de extracción (Du et al., 2014) .................................................................................... 32

Tabla 8. Concentración de los azúcares de xilosa y arabinosa. ............................................... 41

1

1. INTRODUCCIÓN

El Programa de calidad de Producto del IRTA está desarrollando una línea de investigación que pretende identificar y estudiar componentes funcionales y bioactivos, para revalorizar componentes de recursos naturales y residuos industriales; por ello en este estudio se cuantificó β- glucanos y arabinoxilanos en hongos, malta y en bagazo de cerveza, aplicando técnicas enzimáticas y HPLC-RI.

Figura 1. Instalaciones del IRTA y laboratorio donde se desarrolló la investigación.

En los siguientes apartados se contextualizan los objetivos trabajados en el proyecto de inicio de investigación.

Los β-glucanos son un componente importante de la fibra alimenticia soluble, con influencia en los valores nutricionales y propiedades funcionales en los alimentos. En ese sentido, numerosos estudios han revelado que los β-glucanos están relacionados con las propiedades hipocolesterolémicas de la avena y la cebada, y de los alimentos que contienen estos granos, a través de la disminución de la absorción intestinal de colesterol y ácido bílico por su interacción con los glucanos; la actuación en el hígado, que pasa de sintetizar colesterol a producir ácido bílico; y la fermentación por las bacterias intestinales a ácidos grasos de cadena corta que son absorbidos e inhiben la síntesis de colesterol hepático(Rivero, 2011-2012).

También, uno de los principales componentes activos de los hongos fue recientemente identificado como β- glucanos (Zhu, Du, Bian, & Xu, 2015). Los hongos son también reconocidos como alimentos funcionales por este componente bioactivo que ofrece diversos impactos beneficiosos en la salud humana. La mayoría de β- glucanos se obtienen del cuerpo fructífero de los hongos. Los β- glucanos contienen enlaces (13) (16) (Laroche, 2007)

Los β- glucanos de hongos posee un esqueleto de residuos de glucosa unidos por enlaces β-(13) glucosídicos con unión de enlaces ramificados β - (16), lo que se ha mostrado eficacia como defensa anti tumor y como un sistema de refuerzo inmunológico (Zeković, Kwiatkowski, Vrvić, Jakovljević, & Moran, 2005)

2

Los arabinoxilanos ofrecen beneficios nutricionales de fibra soluble e insoluble, y por la presencia de restos fenólicos en sus estructuras moleculares, pueden presentar algunas propiedades antioxidantes (Izydorczyk & Dexter, 2008). De la importancia de estos componentes bioactivos en la salud humana deriva el interés científico en obtener y estudiar sus características. En este trabajo se ha determinado el contenido de β- glucanos en malta y bagazo de cerveza (subproducto de la fabricación de la cerveza) y en diversas especies de hongos; también se determinó el contenido de arabinoxilanos en malta y bagazo. El método de determinación aplicado según el origen de estos compuestos es distinto dado que las características químicas, así como las funcionales, son diferentes en ambos tipos de matriz

1.1 Características (13, 14) , (13, 16) –β-D glucanos

Los β-D glucanos son polisacáridos no amiláceos compuestos de enlaces (13) y (14) de glucosa (Figura 2). Están localizados mayoritariamente en las paredes celulares del endospermo y en la capa de aleurona de los diferentes granos de cereales, especialmente cebada y avena. Están formados por cadenas de unidades de D-glucosa con enlaces glucosídicos tipo beta. Estos anillos D-glucosa de seis átomos pueden conectarse unos a otros, en una variedad de posiciones en la estructura del anillo de D-glucosa. Algunos compuestos de β-D glucanos, se repiten continuamente debido a la unión de D-glucosa en posiciones específicas (Figura 3). La forma más activa de los β-glucanos son los que integran unidades de D-glucosa unidas en la posición (13) (Rivero, 2011-2012)

Figura 2. Estructura química de los β-D glucanos, con un enlace 1,3, cada tres enlaces 1,4(Rivero Hernández, 2012).

Los β (13), (14) glucanos también se extraen de algunos tipos de algas y varias especies de hongos. Su tamaño molecular y su concentración, así como sus características moleculares, son variables importantes en la determinación de las propiedades físicas de los polímeros resultantes, tales como solubilidad, viscosidad y

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capacidad de formación de gel (Skendi, Biliaderis, Lazaridou, & Izydorczyk, 2003). La eficacia de la extracción de β- glucanos está relacionada con procedimientos de extracción, el peso molecular, estructura y características reológicas de las propiedades de los β-glucanos.

Figura 3 Estructura de las moléculas de β-glucanos. Ejemplo de diferentes enlaces entre

unidades de glucosa, determinando su estructura bioquímica de diversos β-glucanos (Petit and Wiegertjes, 2016)

El rango de contenido (13, 14) –β- glucanos en cereales es de 1% en granos de trigo, de 3-7% en avena, y 5-11% en cebada (Skendi et al., 2003). Así, los granos de cebada pueden ser un rico recurso de (13, 14) –β- glucanos, localizados en el endospermo del grano (Rivero, 2011-2012).

La importancia de los β-glucanos de la cebada, viene relacionada por sus efectos beneficiosos para la salud, como corroboran la FDA (Food and Drug Administration, USA), y la EFSA (European Food Safety Authority) y varios estudios científicos(Rivero, 2011-2012). Se ha demostrado que la fibra soluble como (13, 14) –β-D glucanos (Figura 3), tiene efectos relacionados con: la glicemia, la concentración de colesterol en la sangre, el incremento de la sensación de saciedad que conlleva una reducción en la ingesta de energía, una reducción de las respuestas glucémicas postprandiales, y una mejora de la función digestiva (EFSA NDA Panel (EFSA Panel on Dietetic Products, 2011) (European Food Safety Authority (EFSA), 2011). Por ello, los β- glucanos deberían ser considerados como ingredientes funcionales para la industria alimentaria de cereal (C. S. Brennan & Cleary, 2005).

1.2 β- glucanos en hongos

Los hongos contienen 83-90% agua y 10 - 16,5 % materia seca, el contenido de proteína varía entre el 27 y 48%, los carbohidratos son inferiores al 60% y lípidos entre el 2-8%.

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En promedio, un hongo contiene aproximadamente un 16,5% de materia seca del cual 7,4% es fibra cruda, 14,6% es proteína cruda y 4,48% es grasa y aceite (Tabla 1).

Los β-glucanos son componentes de la pared de miceto (Figura 4). Estructuralmente los β-glucanos de hongos consisten en enlaces lineales β-(1-3)-glucanos unidos con β-(1-6)- glucanos en sitios de la cadena de longitud variada y distribución que puede formar complejas estructuras terciarias estabilizadas por enlaces hidrogeno (Brown & Gordon, 2005)

Figura 4. Morfología de hongos y trufas (Saritha, Prakash, Khedkar, & Reddy, 2016)

El contenido de β-glucanos depende de muchos factores, tal como la especie, condiciones de crecimiento de los hongos, el grado de madurez del cuerpo fructífero y el contenido de fibra total (Kyanko, Canel, Ludemann, Pose, & Wagner, 2013).

Figura 5. Estructura de (1-3) β- glucanos y con ramificaciones β (1-6) (Laroche, 2007).

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La solubilidad de β-glucanos en agua depende sobre todo de su estructura aumenta con la temperatura, y también está asociado con su origen (Rop, Mlcek, & Jurikova, 2009; Tao, Zhang, & Cheung, 2006)

La viscosidad de β-glucanos depende del peso molecular, estructura molecular y la matriz del alimento (Bae, Lee, Kim, & Lee, 2009; Kerckhoffs & 2003). El rango del peso molecular de β-glucanos es amplio y fluctuante (dependiendo del origen) de diez a miles de kilodaltons (kDa)(Rop et al., 2009).

La gran variedad en la cantidad de β – glucanos puede observarse en el estudio de especies de hongos, cuyos rangos de concentración de beta glucanos va de 0,21 a 0,53 g/100g en base seca (Manzi & Pizzoferrato, 2000).

Shitake (Lentinus edodes) y algunos miembros del genero Oyster (Pleurotus spp.) son conocidos por ser precursores importantes de β-glucanos (Rop et al., 2009), son hongos representativos de (13) -β-glucanos con una efectiva actividad antitumor e inmunopotencialidad (Chihara, 2001).

Tabla 1. Composición nutricional general de hongos (Saritha et al., 2016)

Nutrientes Rango Energía (kcal/100g) 24-31 Humedad (g/100 g) 83-90 Proteína (g/100g) 1,94-3,00 Grasa (g/100g) 0,20-0,34 Ceniza (g/100g) 0,79-0,91 Carbohidrato (g/100g) 3,69-8,42 Fibra Dietaria (g/100g) 1,45-2,70 β- Glucanos (g/100g) 0,21 -0,79 Ergosterol (mg/100g) 37-69 Calcio (mg/100g) 1 -4 Cobre (mg/100g) 0,11-0,30 Hierro (mg/100g) 0,22-1,15 Magnesio (mg/100g) 10 - 16 Manganeso (mg/100g) 0,05- 0,10 Fosforo (mg/100g) 74 -105 Potasio (mg/100g) 204-359 Sodio (mg/100g) 1 - 15 Riboflavina (mg/100g) 0,20 - 0,33 Niacina (mg/100g) 2,80 - 7,03 Ácido Pantoténico (mg/100g) 0,27 -1,36 Vitamina B6 (mg/100g) 0,05 - 0,10 Ácido Fólico (mg/100g) 6 – 52

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Según los autores (Handayani, 2012), la dieta con β-glucanos de hongos Shiitake baja los lípidos del plasma, incrementa la viscosidad del alimento, también reduce: el peso ganado, la masa total de grasa, plasma triacilglicerol e incrementa la excreción fecal cuya dosis requerida es 1,8% p/p de beta glucanos.

1.3 β-glucanos en cereals - bagazo

La cebada se usa para fabricación de cerveza y whisky, y los β-glucanos son los principales componentes de las paredes del endospermo amiláceo de cebada ( Figura 7), los β- glucanos son moléculas lineales que están formados por el 30% de enlaces (13) y el 70% de enlaces (14) aproximadamente (Figura 6) (Bacic & Stone, 1981; Fincher, 1975; Forrest & Wainwright, 1977)

Figura 6. Estructura química de los β-D glucanos, con un enlace 1,3, cada tres enlaces 1,4 ;

Rivero, 2011-2012).

Además, las paredes del endospermo consisten en el 70% de β- glucanos y 20% de arabinoxilanos mientras que la pared de la aleurona contiene 26% de β- glucanos y 67% de arabinoxilanos, ambos tienen cantidad similar de glucomananos y celulosa (Bacic & Stone, 1981; Wood , Fulcher, & Bruce, 1983), también tiene proteína y compuestos fenólicos.

Figura 7. Interior del grano de cebada (Rivero, 2011-2012).

7

El contenido total de β-glucanos en cebada normalmente va de 6 a 8% y el 66% están en forma soluble. Además, los factores genéticos y ambientales impactan sobre el (Knuckles B. E. , 1992; Savin R, 1997; Yoon S. H. , 1995) contenido de β- glucanos del grano de cebada. En general la estructura genética de la cebada, es más importante que las condiciones ambientales como un factor determinante del contenido final de β- glucanos del grano (Gill, Morgan, & Smith, 1982; Henry & Blakeney, 1986; Stuart, Loi, & Fincher, 1988).

En la elaboración de la cerveza, el contenido total de β-glucanos decrece de la germinación de la cebada a malta por la acción de β-glucanasa, en la malta se degrada un 92% de β-glucanos, dependiendo en gran parte del tiempo de germinación. La solubilidad de β-glucanos incrementa durante el malteado, donde la mayoría de β-glucanos llegan a ser solubles (Figura 8; (Marconi, Tomasi, Dionisio, Perretti, & Fantozzi, 2014).

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Figura 8. Esquema de un proceso de producción de la cerveza. Fuente Enciclopedia Británica, Inc. 2009. https://global.britannica.com/topic/malting

El bagazo (spent grain), es el residuo sólido principal de bajo valor que resulta del uso de la cebada en la elaboración de la cerveza. Representa más de un 25% (p/p) del

material de partida (malteado de la cerveza) (

Figura 9) y está constituido aproximadamente por el 80 % de materiales provenientes de la pared celular, parcialmente lignificados y ricos en polisacáridos del tipo de los arabinoxilanos.

Figura 9. Representación esquemática del proceso de obtención del bagazo de cebada (Mussatto, Dragone, & Roberto, 2006).

Según la Agencia del Medio Ambiente, estima que la industria cervecera del Reino Unido produce sobre medio millón de toneladas de bagazo anualmente, y que en Europa la estimación es de 3,5 millones de toneladas. Hasta ahora, el bagazo se ha comercializado como alimento para ganado, pero se buscan también otros usos alternativos, como suplementos de harina de horneo en productos de pan, y snacks. El potencial uso de bagazo en productos de alimentos para humanos es de interés considerable por su alto contenido de fibra y minerales. Recientes estudios demostraron

9

los efectos beneficiosos del bagazo en el tratamiento de estreñimiento y colitis ulcerativa (A. J. Jay, Parker, M. L., Faulks, R., Husband, F., Wilde, P., Smith, A. C,Waldron K. W, 2008).

Debido al alto contenido de humedad (>70%p/p) y contenido de azúcar fermentable, el bagazo se deteriora fácilmente, por ello el secado en estufa es el método de preservación más común usado en la industria, mediante el cual demuestran que por calefacción por debajo de 60 °C no se altera el contenido fenólico (Santos, Jiménez, Bartolomé, Gómez-Cordovés, & del Nozal, 2003).

Recientes estudios han focalizado un potencial uso de β- glucanos de cebada y otros cereales, como ingrediente funcional (Mälkki, 2004).A pesar de la pequeña contribución de los β- glucanos en el peso total del grano, (Skendi et al., 2003) los β- glucanos tienen un impacto desproporcionado en la utilización de la tecnología de cebada y un valor nutricional del grano.

1.4 Arabinoxilanos

Los arabinoxilanos son polímeros de xilosa conocidos como pentosanos. Es un

esqueleto lineal de beta-1-4 D-xilopiranosa con residuos de alfa-L- arabinofuranosa

(Figura 10).

Figura 10. Estructura química de los arabinoxilanos. Fuente: http://www.scientificpsychic.com/fitness/carbohidratos2.html

10

Los arabinoxilanos junto con los (1 → 3) (1 → 4)-β-D-glucanos son los polisacaridos mayormente presentes en varios tejidos de cebada. Dependiendo del genotipo u origen celular, los arabinoxilanos exhiben variaciones en sus estructuras moleculares. Las características moleculares de arabinoxilanos son determinantes importantes de las propiedades físicas como solubilidad, viscosidad y propiedades de gelificación. (Faulds et al., 2009; A. J. Jay et al., 2008) caracterizaron los carbohidratos del bagazo, en varias muestras de bagazo identificaron la presencia de varios monómeros (Tabla 2).

Tabla 2. Composición del bagazo de cerveza.

Fracción Molar (%)

Rha Fruc Ara Xyl Man Gal Glu (n. Cel)

Glu (Lima, Souza, Godoy, França, & Lima)

UA Ara/Xyl

0,2 0,11 15,36 29,84 1,24 2 25,71 12,6 12,95 0,515 Tabla adaptada de Jay y col, 2008- Rha: ramnosa, Fruc: fructosa, Ara: arabinosa, Xyl: xilosa, Man: manosa, Gal: galactosa, Glu: glucosa, Cel: celulosa, UA: ácidos urónicos.

En la Tabla 2, la celulosa y los arabinoxilanos forman la mayor parte de los polisacáridos NSP (polisacáridos no almidón) del bagazo, como la arabinosa (Ar), la glucosa (Glu) y la xilosa (Xyl).

Los arabinoxilanos constituyen parte de la fibra dietética que presentan efectos positivos en el tracto gastrointestinal, tienen en su estructura química compuestos con actividad antioxidante, también están relacionados con el tratamiento y prevención de enfermedades cardiovasculares, la diabetes tipo II, el cáncer colon rectal y la obesidad. Los efectos beneficiosos para la salud se confieren a través de la modulación de la microbiota intestinal, por ello son considerados como prebióticos.

Se ha descrito que la ingesta de arabinoxilanos (AX) mejora el control de la glucemia. En un estudio con 12 participantes, la adición de 6 a 12 g de arabinoxilanos al pan resultó en un área bajo la curva de la gráfica de glucosa postprandial un 20% y 41% inferior que el grupo control a las 2 horas (Zhong X Lu, Walker, Muir, Mascara, & O'Dea, 2000).

En otro estudio con 14 participantes que consumieron 15g arabinoxilanos/día durante cinco semanas se demostró que la glucosa postpandrial y la insulina fueron menores, pero no existió diferencia en los lípidos de la sangre, el peso corporal, o presión arterial (Z. X. Lu, Walker, Muir, & O'Dea, 2004)

La adición de arabinoxilanos a los productos alimenticios pueden mejorar el control glucémico, sin embargo, los estudios son limitados por su corta duración y tamaño de muestra.

11

1.5 Aplicaciones de β-glucanos

El uso industrial de los β- glucanos se aplican a diferentes áreas :alimentos para humanos y animales, a la medicina y cosméticos (Tabla 3 y 4).

1.5.1 Fibra como ingrediente en la formulación de productos de carne

Los productos de carne enriquecida con fibra (como base potencial de alimentos funcionales), representan una oportunidad para mejorar la imagen de la carne, así como para aumentar el consumo de fibra.

La fibra de cereales, ha sido usada como aditivos en la manufactura de productos de carne esencialmente para propuestas tecnológicas, como agentes voluminosos no calóricos, como retenedor de agua y aceite, para modificar la textura, para mejorar la emulsión, o la estabilidad oxidativa o minimizar los efectos por los cambios de composición. El uso de la fibra en el procesamiento de la carne depende de los factores asociados con la naturaleza de la fibra, propiedades tecnológicas y sensoriales, y estos son muy dependientes del tipo producto cárnico de carne (Tabla 3).

1.5.2 Potencial uso de β-glucanos en los productos derivados de lácteos

El incremento del interés en el uso en alimentos no está solamente relacionado con sus propiedades nutricionales benéficas, también se debe a la optimización del procesado de los alimentos que introducen los β-glucanos. Recientes investigaciones han focalizado el uso de la fibra soluble diaria, y en particular en la adición de los β-glucanos en la elaboración de helados y yogurt (C. Brennan, Tudorica, & Kuri, 2002). Incorporando los beta-glucanos con otras fibras diarias solubles, dentro de productos de bajo contenido en grasa, pueden influir en las propiedades sensoriales, de modo que el sabor en la boca es como que se trataran de productos de alto contenido en grasa. La adición de soluciones de beta-glucanos para modificar la formación del cuajo de la leche, incluyendo la reducción del tiempo de cortado del cuajo y el incremento del rendimiento del cuajo. Este efecto parece ser por la capacidad de gelificación de los β-glucanos y su capacidad para formar estructuras grandes y elásticas de la matriz caseína – proteína y glucanos (Tabla 4).

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Tabla 3. Productos de carne frescos enriquecidos con fibra diaria y materiales enriquecidos con fibra.

PRODUCTO INGREDIENTES AÑADIDO COMO

CONTENIDO DE FIBRA

(g/100g) FUENTE

Empanadas de carne molida

Fibra: remolacha, avena, y guisante

Sustituto de grasa 3,0-6,0 d (Troutt et al.,

1992)

Carne Salvado: trigo y cebada

Sustituto de grasa,

ingrediente funcional

5,0 - 10,0 d

(Vosen, Rogers, Halloran, Martin,

& Armstrong, 1993)

Hamburguesa de carne Salvado de trigo Sustituto de

grasa 5,0-15,0 d (Mansour & Khalil, 1997)

Hamburguesa de carne Fibra de avena Sustituto de

grasa 0,4-2,0 d

(Desmond, Troy, & Buckley,

1998)

Empanadas de cerdo Harina de cebada Sustituto de

grasa 4,0 -10 d (Kumar & Sharma, 2004)

Empanadas de carne Harina de avena Sustituto de

grasa 2,0 -4,0 d (Serdaroglu, 2006)

Filete de ternera

empanada de carne

Fibra soluble de avena (β - glucanos)

Sustituto de grasa,

ingrediente funcional

1,4 e (Piñero et al.,

2008)

Empanadas de pollo Hongos Oyster

Ingrediente funcional, reemplaza la carne

3,4 -4,9

(Rosli, Solihah, Aishah,

Fakurudin, & Mohsin, 2011)

Notas: d % de ingrediente añadido, e estimado de la composición de datos

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Tabla 4. Aplicaciones industriales de β-glucanos.

Tabla adaptada de (Zhu, Du, & Xu, 2016)

Área de aplicaciones Productos Funcionalidad

Alimentos Formulación de salsa prebiótica con β -glucanos Efecto perceptible en propiedades físicas y sensoriales

Pan libre de gluten con β -glucanos Resultados aceptables de análisis sensorial Productos diarios con β -glucanos Reduce calorías y el colesterol

Yogurt con β -glucanos Proteólisis rápida, menor liberación de grandes péptidos y una mayor proporción de aminoácidos libres

Extruido rápido para comer snacks Manipula la respuesta glucémica Bebida que contiene β -glucanos Control del consumo de alimentos y reduce la energía 24 horas Pasteles que contiene β -glucanos Atributos de buena calidad Usado en productos alimenticios Como espesante y estabilizador emulsificante y agente absorbente de aceite

Medicinas Material de apósito para heridas Gran diámetro de la cavidad interior

Material para sustituir un hueso Fácil manipulación y buena adaptación a la forma y dimensiones Poli membranas que contiene β -glucanos Efecto acelerado de cicatrización de heridas

Cosméticos Película que forma la crema hidratante Eficacia para reducir líneas de expresión y muecas Producto cosmético Tratamiento de pérdida de colágeno en el envejecimiento de la piel Gotas para los ojos con β -glucanos Gran retención de humedad

Alimentos para animales Aditivo para alimento de animal Aumenta la inmunidad y como potencial agente anti tumor

Aditivo para alimento de peces Incrementa el número de anticuerpos específicos secretando células y niveles específicos de suero

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En este estudio se presenta la cuantificación de β- glucanos en bagazo, malta y en hongos mediante métodos enzimáticos (Mushroom and yeast beta glucan, KYBGL09/14, Megazyme y Mixed linkage beta glucan, Método McCleary - EBC Método 4.16.1, Megazyme) y para la cuantificación de arabinoxilanos (glucosa, xilosa, galactosa, arabinosa y manosa) en las mismas matrices, mediante cromatografía- IR, usando la columna Aminex HPX-87 P.

2. OBJETIVOS

Los principales objetivos del trabajo son:

1. Optimizar la metodología para la determinación de β-D glucanos mediante el kit enzimático Megazyme para la cuantificación de dicho compuesto en hongos y bagazo.

2. Optimizar la metodología para identificar y cuantificar el perfil de azúcares, para la determinación de arabinoxilanos en malta y bagazo mediante cromatografía HPLC-RI.

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3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 Material biológico

Para realizar el trabajo se utilizaron muestras comerciales de hongos, malta y bagazo de cerveza (Figura 11).

a) b) c)

d) e) f)

Figura 11. a) Robellón (Lactarius deliciosus), b) Shiitake (Lentinus edodes), c) Hongo Blanco (Boletus edulis), d) Champiñón (Agaricus bisporus), e) Malta y f) Bagazo.

3.2 Cuantificación de β- glucanos en hongos mediante el método enzimático: hongos y levaduras beta glucanos, (K-YBGL 09/14, Megazyme)

3.2.1 Principio:

El kit contiene exo -1,3-β- glucanasa, β-glucosidasa, amiloglucosidasa e invertasa; el reactivo GOPOD para la determinación de glucosa (glucosa oxidasa peroxidasa, y 4-aminoantipirina), y una solución de glucosa.

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Glucanos totales: Los 1-3 y 1-6 β - glucanos y α-glucanos se solubilizan con HCl 37% v/v durante 45 min a 30 °C y los fragmentos restantes de los glucanos son hidrolizados con la enzima 1,3 β-glucanasa y β-glucosidasa, lo cual da la medida de glucanos totales.

α- glucanos: se miden específicamente por la hidrólisis de glucanos a glucosa usando amiloglucosidasa e invertasa. Los β-glucanos se determinan por diferencia, y se expresa como (%) peso de hongo seco, ya que hasta ahora no se ha descrito un método enzimático específico para la cuantificación directa de β-glucanos en hongos.

3.2.2 Materiales y reactivos

El ensayo se realizó mediante el Kit enzimático Mushroom and yeast beta glucan, KYBGL09/14, Megazyme, y se usó las soluciones: tampón de acetato de sodio (200 mM, pH 5,0), tampón de acetato de sodio (1,2 M, pH 3,8). Hidróxido de potasio (2M). Ácido clorhídrico (37%V/V, 10 M). El control es el 49% de (1-3) (1-6)- beta glucano de levadura. Los champiñones frescos se secaron a 40°C en la estufa durante 48 horas (hasta peso constante; 78.5 % de humedad), mientras que las otras muestras de hongos se compraron deshidratados (Figura 11).

3.2.3 Método Determinación de Glucanos totales (incluye alfa y beta glucanos, D-glucosa presente en los oligosacáridos, sacarosa y D- glucosa libre)

a) Solubilización e hidrólisis parcial de los glucanos totales, D- glucosa presente en los oligosacáridos, sacarosa y D- glucosa libre.

Los hongos secos, se molieron (molinillo, Moulinex) y se pesó 100 mg de cada muestra y el control en tubos de vidrio. Se añadió 1,5 mL de ácido clorhídrico concentrado (HCl, al 37% v/v) y se incubo en un baño termostático a 30ºC durante 45 minutos. Luego se añadió 10 mL de agua y se incubó en el baño hidrostático (VITA Sdad. Anma, España) a 100ºC durante 2 horas. Se enfrió los tubos a temperatura ambiente y se añadió 10 mL de KOH 2N, la solución se transfirió a un matraz (25 mL) con 200Mm del tampón de acetato de sodio a pH5 y se filtró la suspensión a través de lana de vidrio.

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b) Medida del contenido total de glucanos, D-glucosa, sacarosa y D- glucosa libre.

Se transfirió una alícuota de 0,1 mL a tubos de vidrio de 10 mL. Se añadió 0,1 mL de una mezcla de 1,3 beta- glucanasa y beta- glucosidasa en 200 mM del tampón acetato de sodio a pH 5 y se incubó a 40 º C en el baño por 60 minutos. Se agregó 3 mL de una mezcla de GOPOD y se incubó a 40°C durante 20 minutos y se midió la absorbancia en el espectrofotómetro (UV 1800 - SHIMADZU, Japón) a 510 nm frente a un blanco de reactivo.

c) Determinación de Glucanos alfa con D-glucosa presente en la sacarosa y glucosa libre

Para la solubilización e hidrólisis parcial de los alfa-glucanos, se molieron los hongos secos y se pesó 100 mg en tubos de vidrio, se mezcló con 2 ml de KOH 2M durante 20 minutos en un baño de hielo. Se añadió 8 mL de una solución de tampón acetato (1,2 M a pH 3,8), con 0,2 mL de amiloglucosidasa (1630 U/mL) con invertasa (500 U/mL). Se incubó en el baño hidrostático a 40°C (memmert, España) por 30 minutos, se filtró en papel Whatman Nº1, y se transfirió 0,1 mL en tubos de vidrio (10 mL), con 0,1 mL de tampón acetato (200 mM a pH 5), y 3 mL de GOPOD. Se incubó a 40ºC por 20 minutos, luego se midió la absorbancia a 510 nm frente a un blanco de reacción.

3.3 Cuantificación de β- glucanos en bagazo (K-BGLU 05/15, método 4.16.1 Megazyme)

3.3.1 Principio:

Las muestras se suspenden e hidratan en una solución tampón de pH 6,5, se incuban con enzima liquenasa y se filtran. Una alícuota del filtrado se hidroliza completamente con β-glucosidasa. La D-glucosa producida se evalúa usando un reactivo de oxidasa y peroxidasa. El ensayo es específico para el enlace (1-3), (1-4)- β- D- glucanos.


El ensayo se realizó mediante el Kit enzimático (Mixed linkage beta glucan, KYBGLU 05/15, Megazyme), y se usaron las soluciones Fosfato de sodio (20mM, pH 6,5) y Acetato de sodio (50 mM, pH 4).

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3.3.3 Método Determinación de β – glucanos en bagazo. Método (EBC Método 4.16.1)

Para la determinación β – glucanos, primero el bagazo se secó en estufa (Dry-Line VWR) a 40ºC por 24 h para estabilizarlo, se molió, se pesó 1,00 g aproximadamente de bagazo en tubos falcon, en la balanza (Sartorios, España), junto con el control (harina de cebada estándar del Kit), se añadió 5 mL de etanol acuoso (50% v/v), se incubaron en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos (VITA Sdad. Andina, España). Se mezcló el contenido vórtex (WhirliMixer) y se añadió 5 mL de etanol acuoso (50% V/V). Se centrifugo a 1,000 gravedades (Beckman J2-MC, EEUU) por 10 minutos, se descartó el sobrenadante y se añadió 10 mL de 50% (V/V) de etanol acuoso, el pellet se suspendió en 5 mL de tampón sodio fosfato (20mM pH 6,5). Se incubo los tubos en un baño de agua hirviendo por 5 minutos, se agitó (vórtex) cada 2 minutos, se dejó enfriar los tubos hasta 40ºC y se añadió 0,2 mL de liquenasa (10 U). Se mezcló y se incubó en el baño a 40ºC (memmert, España) por 1 hora. Se ajustó el volumen de cada tubo a 30 mL con agua destilada, se mezcló y se filtró a través de un filtro circular whatman Nº 41. Se transfirió 0,1 mL de cada filtrado a tres tubos de ensayo (10 mL), se añadió 0,1 mL de tampón de acetato de sodio (50 mM, pH 4), a uno de los tubos (reacción del blanco), mientras a los otros dos (reacción), se añadió 0,1 mL de β- glucosidasa (0,2 U, en tampón acetato 50 mM, pH4). Se añadió dos tubos, para el reactivo blanco: 0,1 mL de agua destilada más 0,1 mL de tampón sodio acetato, y para la glucosa standard: 0,1 mL del tampón acetato de sodio más 0,1 mL del estándar D-glucosa (50 ug/0,1 mL o 100 ug/0,1 mL). Se incubo todos los tubos a 40 º C por 15 min. Luego se añadió 3mL del reactivo de GOPOD a cada tubo y se incubó a 40ºC por 20 min y se midió la absorbancia a 510 nm.

3.4 Cuantificación de arabinoxilanos en bagazo por HPLC-IR

3.4.1 Principio:

Este procedimiento se basa en dos pasos de hidrólisis para fraccionar la biomasa en formas que sean más fáciles cuantificarlas. Durante la hidrólisis, los carbohidratos poliméricos son hidrolizados a sus formas monómeras, los cuales son solubles en el líquido de hidrólisis. Estos monómeros se miden por HPLC - RI.

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Mediante HPLC-RI se obtiene un cromatograma (representación gráfica de la señal que da el detector al pasar los diferentes analitos en función del tiempo), en el cual se encuentran picos de los azúcares a analizar y el control. Cada pico sale a un tiempo de retención (TR), con un área y una altura determinada, que sirve para cuantificar (García Martínez).


a) Preparación de soluciones madre

Se preparó las soluciones madre de los azúcares a 20 mg/L, se pesó 100 mg de cada azúcar con 5 mL de agua desionizada, y a partir de estas soluciones se prepararon los estándares de glucosa, galactosa, arabinosa, manosa y xilosa a 200 ppm.

b) Preparación de la recta

A partir de las soluciones madre (20 mg/mL), se preparó los puntos de la recta a diferentes concentraciones: (2 mg/mL; 1,5 mg/mL; 1,0 mg/mL; 0,5 mg/mL; 0,2 mg/mL; 0,1 mg/mL, y 0,05 mg/mL), el mix está conformado por glucosa, xilosa, galactosa, arabinosa y manosa).

c) Interpretación del cromatograma y cuantificación del analito

En el cromatograma de cada solución madre y de las muestras se obtiene el pico correspondiente a cada analito. El tiempo de retención del pico del analito será el mismo en todos los cromatogramas; no obstante, el área es diferente dependiendo de la concentración del analito. Para cuantificar el analito en la muestra, se realizó una tabla con la concentración del analito y área correspondiente a cada concentración, con estos datos se construyó la recta de calibrado, mediante la representación del área del pico frente a la concentración del compuesto, con la ecuación de la recta y = mx + b, donde (y) es el área del pico, y (x) será la concentración de la muestra.

d) Condiciones del equipo:

Cromatografo: HPLC –IR Fase móvil: agua Milli Q. Pre columna: BIORAD, Micro- Guard, IG CarboC Cartridgen, Cat: #125-0503,

30 x 4,6 mm, control:220004632 (Collaboratory, USA) Columnas utilizadas:

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.1 Aminex HPX-87C, 300 mm x 7,8 mm. Número de serie: 432535. BIORAD, USA: Flujo máx: 1mL/min. Presión máx: 103 bares. Temperatura del horno: 85ºC

.2 Aminex HPX-87P, 300 mm x 7,8 mm. Número de serie: 428500. BIORAD, USA: Flujo máx: 0,6 mL/min. Presión: 34,3 bares. Temperatura del horno: 85ºC

Detector: Índice de Refracción (RI)

3.4.3 Método Determinación de arabinoxilanos en hongos, malta y bagazo.

Para cuantificar los arabinoxilanos, se pesó 300 ±10,0 mg de muestra y estándares (Sigma, Q A) (Anexo 7.2) en tubos de vidrio (30 mL), en la balanza (Metter Toledo, España) y el control estándar de arabinoxilanos (contiene 30% arabinosa), se añadió 3± 0,01 mL de H2SO4, 72% v/v, se agitó por 1 min. Los tubos se incubaron en un baño de agua 30 ± 3 ºC (VITA Sdad Andina) por 60±5 minutos, se agitó cada 5 min para que el ácido hidrolice toda la muestra, la solución se trasvasó a ampollas de vidrio (100mL) y el ácido se diluyó al 4% con 84 ± 0,04 mL de agua deionizada. La hidrólisis de las muestras se realizó a 121ºC durante 1 hora en una estufa. Se enfriaron los tubos a temperatura ambiente, se transfirió una alícuota de 10 mL de cada muestra y se neutralizó hasta pH: 5-6 con CaCO3. Seguidamente, se decantó el sobrenadante y se tomó aproximadamente 1 mL con una jeringa con filtro de nylon (0,2 micras) y se depositó en viales. Los estándares, los mix de azúcares patrón y las muestras, se analizaron por HPLC- RI, con la columna Aminex HPX-87P.

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 Cuantificación de β- glucanos en hongos K-YBGL09/14, Megazyme).

La cuantificación de beta-glucanos en los hongos (cuerpo fructífero) se realizó mediante el método enzimático (K-YBGL09/14, Megazyme). Se realizaron dos replicas y cada una de ellas por duplicado. La metodología utilizada se basa en la determinación del contenido de glucanos totales y alfa-glucanos y finalmente, la determinación de los beta-glucanos se realiza por diferencia.

La Tabla 5, presenta el resultado del contenido de glucanos totales, alfa-glucanos y beta-glucanos expresado en materia seca (% g/100 dry mass) de cada hongo.

Se observa que en general, los hongos Shiitake presentan un contenido de 33,9-34,5 % de glucanos totales (Shiitake (Lentinus edodes); promedio= 34,20 %), el hongo blanco entre 23,5 y 28,6 % (Hongo Blanco (Boletus edulis), promedio = 26,05 %), el Robellón entre 22,6 y 28,9 % (Robellón (Lactarius deliciosus); promedio = 25,75 %) y finalmente, los champiñones (Agaricus bisporus) secos tienen un porcentaje de 13,4 %

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y los champiñones frescos un 1,2 %. El contenido en glucanos totales podría relacionarse con el contenido de glucosa total. Sin embargo, se recomienda realizar análisis adicionales para confirmar los resultados y obtener un valor más real. Por ejemplo, mediante cromatografía HPLC acoplado a índice de refracción (HPLC-RI). Dicha metodología se utilizó para cuantificar los azúcares en bagazo (ver apartado 4.3).

Teniendo en cuenta el contenido de alfa-glucanos, Hongo Blanco contiene entre 4,0 y 4,9 %, Shiitake entre 2,9 y 1,9%, los Champiñones secos 2,2 %, y finalmente, los hongos que presentaron menor contenido de alfa-glucanos fueron los Robellón (1,8%).

El control utilizado para determinar los beta-glucanos de levadura contiene teóricamente un 49 % de beta-glucanos con un error aceptado del método de ±3%. Los resultados obtenidos coinciden con los resultados esperados.

La Figura 12 representa el porcentaje de β-glucanos en las diferentes especies de hongos, determinadas con el método enzimático específico para hongos y levaduras. Los resultados obtenidos indican que el rango de concentración obtenido de beta -glucanos varió entre 11,2 y 32,7 g/100g en base seca. En particular, los hongos Shiitake (Lentinus edodes) son los que mostraron niveles altos de beta glucanos (de 31,1 a 32,7 %), seguido por los hongos Robellón (Lactarius delicious; entre 20,7 y 27,1 %), y los hongos blancos (Boletus edulis; entre 24,6 y 18,6%), y los champiñones presentaron el menor porcentaje de beta- glucanos (11.2 %); el resultado de Shiitake es menor comparado con el valor de beta-glucanos de Manzi, 2000 que tiene 46% de beta-glucanos en los hongos Shiitake, según lo que justifica dicho autor, esta diferencia puede ser debida a la presencia de material inerte en el residuo de fibra, que podría haber dificultado la difusión de enzimas durante la determinación de beta-glucanos, y también es posible que la beta-glucanasa natural de los hongos estaba activa durante el análisis. El origen de los hongos y las condiciones ambientales también influyen en la cantidad final de beta-glucanos y pueden ser otra de las razones de esta diferencia.

Los Champiñones frescos presentaron 1,2% de glucanos totales, 0,02 % de alfa-glucanos y 1,21 % de beta-glucanos. Teniendo en cuenta su contenido en humedad (78,53 % humedad; Figura 13), el valor equivalente en peso seco es de 5,65% de glucanos totales, 0,1% α-glucanos y el 5,59 % β-glucanos. Probablemente estos valores de glucanos totales, beta y alfa pueden ser mayores ya que el método está validado para muestras deshidratadas. En España, una de las especies más comercializadas de hongos son los champiñones, a menudo en el formato de bandejas laminadas con 250 g de peso neto. Si consideramos que 100 g de champiñones contienen 1,21 g de β-glucanos, una bandeja de 250 g de champiñones tendrá un total de 3,02 g de β-glucanos, cantidad suficiente para tener efectos beneficiosos si se toma regularmente.

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Tabla 5. Contenido de glucanos totales, alfa y beta de distintas especies de hongos determinadas con el método enzimático específico para hongos y levaduras (Megazyme K-YBGL09/14). Resultado representa el promedio obtenido de dos determinaciones (duplicado).

NOMBRE COMÚN

NOMBRE CIENTÌFICO

GLUCANOS TOTALES (%) 1

α -GLUCANOS (%)1

β-GLUCANOS (%)1

Promedio D.S. Promedio D.S. Promedio D.S. Hongo Blanco 1 (secos)

Boletus edulis 23,5 2,36 4,9 0,33 18,6 2,03

Hongo Blanco 2 (secos)

Boletus edulis 28,6 1,03 4,0 0,39 24,6 1,42

Champiñones 1 (secos)

Agaricus bisporus 13,4 1,79 2,2 0,75 11,2 1,05

Champiñones 2 * (frescos)

Agaricus bisporus 1,2 0,22 0,02 0,002 1,21 0,22

Shiitake 1 (secos) Lentinus edodes 33,9 0,89 2,9 0,68 31,1 1,36 Shiitake 2 (secos) Lentinus edodes 34,5 1,45 1,9 0,90 32,7 0,55 Robellón 1 (secos) Lactarius deliciosus 22,6 1,63 1,8 0,13 20,7 1,50 Robellón 2(secos) Lactarius deliciosus 28,9 0,89 1,8 0,02 27,1 0,92 Control (49% de (1-3) (1-6) - β glucanos de levadura.

50,2 2,66 0,3 0,24 50,0 2,41

1 El contenido de glucanos totales, alfa y beta, se expresa en % peso de hongo seco. * El contenido de beta-glucanos en champiñones frescos

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Figura 12. Porcentaje de β-glucanos en diferentes especies de hongos, determinadas con el método enzimático específico para hongos y levaduras

(Megazyme K-YBGL09/14). Resultado representa el promedio obtenido de dos determinaciones (duplicado). El control contiene 49 % (1-3-) (1-6)-β-glucanos de levadura.

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Figura 13. Porcentaje de humedad y peso seco de los champiñones frescos, obtenidos

sometiendo 5 g de champiñones frescos a 102 º C durante 48 horas (hasta peso constante).

4.2 Cuantificación de β- glucanos en bagazo (K-BGLU 05/15, Método 4.16.1 Megazyme)

4.2.1 Estabilización del bagazo

Debido al alto porcentaje de humedad (> 70% p/p) y el contenido de azúcar fermentable, el bagazo se deteriora muy fácilmente. Sin embargo, el secado del bagazo es una alternativa interesante en términos de reducción del volumen del producto, estabilización de la matriz y reducción del coste de transporte y almacenamiento. Así, y con el objetivo de optimizar el análisis, se realizaron pruebas para estabilizar el bagazo.

Para la estabilización del bagazo se realizaron dos pruebas de secado a 40°C y 50°C durante 48 horas (hasta peso constante). Para ello se pesaron cinco muestras para cada temperatura y se determinó la pérdida de peso. Posteriormente, las muestras fueron sometidas a las mismas condiciones de extracción, para determinar si la temperatura de secado afectaba al contenido de beta-glucanos.

La Figura 14 muestra el promedio del porcentaje de peso perdido durante el proceso de secado, que se estima que corresponde humedad que contenía el bagazo. Los resultados indican que el bagazo secado a 50°C pierde más humedad (81,29%) que el bagazo seco a 40°C (79,13%).

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Figura 14.Determinación del porcentaje humedad perdida en bagazo seco a 40 ° C y a 50 ° C.

Para definir cuál es la temperatura de secado más adecuada para obtener una extracción eficiente de β- glucanos se determinaron los β glucanos en muestras de bagazo secas a las dos temperaturas por duplicado y se midió la absorbancia (a 510 nm) cuatro veces para cada temperatura.

La Figura 15 muestra que no se obtuvieron diferencias en el contenido de β- glucanos entre los dos tratamientos térmicos (40 º C: 0,170 %; 50 º C: 0,173 %). Así, se escogió el secado a 40°C como la temperatura adecuada para eliminar la humedad lo máximo posible y evitar que altere los compuestos del bagazo. Además, el tratamiento a 40 º C se considera como la condición más eficiente energéticamente, ya que para las industrias uno de los mayores factores limitantes para la utilización de este tipo de técnicas es su costo.

El tratamiento térmico utilizado para estabilizar el bagazo difiere de las condiciones de temperatura y tiempo utilizadas en otros trabajos.

Tabla 6 muestra las condiciones de los dos principales trabajos realizados recientemente para la determinación de distintos compuestos en el bagazo. En dichos trabajos, las temperaturas utilizadas son superiores (55 º C y 60 º C).

La utilización de temperaturas inferiores (40 º C) permite minimizar el gasto energético por parte de la industria (en el caso que decida extraer los beta-glucanos del bagazo) y, por lo tanto, minimizar el coste económico y optimizar la preservación del bagazo.

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Tabla 6. Determinación de diferentes compuestos del bagazo, mediante método secado, para asegurar su preservación.

Muestra Método: Secado Compuestos

analizados Autor Temperatura (°C)

Tiempo (h)

BSG 55 42 Polisacáridos, ácidos fenólicos, lignina y

lípidos

(A. J. Jay, Parker, M. L., Faulks, R.,

Husband, F., Wilde, P., Smith, A.

C,Waldron K. W, 2008)

BSG 60 18 Contenido fenólico (Santos et al., 2003)

Figura 15.Porcentaje de β-glucanos en bagazo, secado en estufa a 40 °C y a 50 °C. Todas las

muestras se analizaron por duplicado.

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4.2.2 Pruebas de distintas concentraciones durante la extracción de beta-glucanos

Para optimizar el método de determinación de beta-glucanos, se realizaron pruebas con distintas concentraciones durante la etapa de extracción de los mismos. Las muestras se llevaron con agua destilada hasta 20 y 30 mL, para determinar la influencia de la dilución en la absorbancia (Figura 16) y en la extracción del porcentaje de beta-glucanos (Figura 17).

Figura 16. Determinación de absorbancia de muestras de bagazo secadas a 40°C con

diferentes volúmenes de dilución (20 y 30 mL). A y B: dilución a 20 mL; C y D: dilución a 30 mL. Todas las muestras se analizaron por duplicado.

En la Figura 16 se observa que las absorbancias del bagazo diluido a 20 mL (A y B) son mayores que las absorbancias de las muestras diluidas a 30 mL (C y D). Estos resultados confirman la hipótesis inicial ya que, a menor volumen de dilución, se espera mayor concentración de compuesto y por lo tanto, mayor intensidad de la reacción enzimática y mayor intensidad de color. Para calcular los resultados de beta-glucanos, fue necesario corregir los cálculos por el factor de dilución:

Para 20 mL: el factor de dilución es 18 Para 30 mL: el factor de dilución es 27

La Figura 17 presenta los resultados del contenido de beta-glucanos determinados en muestras de bagazo. Se observa que las muestras tienen similar porcentaje de beta-glucanos (0,165; 0,166; 0,166, 0,168, del bagazo A, B, C, D, respectivamente). Así, se observa que los distintos volúmenes de dilución no alteraron el resultado obtenido en el contenido de β-glucanos, tanto el promedio cómo sus desviaciones estándares. Así, se determinó fijar el volumen de 20 mL de dilución para la determinación de beta-glucanos en las muestras de bagazo, debido a que las absorbancias obtenidas son más elevadas.

28

Figura 17. Porcentaje de β-glucanos de muestras de bagazo secas a 40°C con diferentes

volúmenes de dilución (20 y 30 mL). A y B: dilución a 20 mL; C y D: dilución a 30 mL. Todas las muestras se analizaron por duplicado.

4.2.3 Prueba del tiempo de espera para el desarrollo del color

Para determinar si la lectura de la absorbancia es afectada por el tiempo, se realizó una prueba de lectura a tres tiempos distintos: 15, 30 y 45 minutos con el objetivo de optimizar la metodología. La prueba se realizó tanto para la matriz de interés (bagazo) cómo para el control (harina de cebada).

En la Figura 18 se verifica que los resultados del porcentaje de beta glucanos del bagazo y el control (harina de cebada) son parecidos en los tres tiempos de lectura; por ello se elige medir la absorbancia a los 15 min para minimizar el tiempo de análisis.

29

Figura 18. Desarrollo de color durante el análisis de beta-glucanos en muestras de bagazo y muestras control, considerando tres tiempos de medida: 15,30 y 45 minutos. Todas las

muestras se analizaron por duplicado.

4.2.4 Resultados del análisis de contenido de beta-glucanos en malta y bagazo

A partir de las pruebas anteriores, se decidió optimizar el método de determinación de beta-glucanos teniendo en cuenta las siguientes pautas:

1. Estabilizar el bagazo a 40 º C hasta peso constante 2. Realizar una dilución durante la fase de extracción de los beta-glucanos

de 20 mL y utilizar su correspondiente factor de dilución para realizar los cálculos (factor =18)

3. Realizar la medida de absorbancia tras 15 minutos de desarrollo del color.

La determinación de β- glucanos se realizó en tres matrices distintas: Harina de cebada (considerada el control), malta y bagazo. La Figura 19 muestra los resultados obtenidos, que indican que el contenido de β- glucanos fue de 3,27 % en la harina de cebada, 0,69% en la malta y 0,17% en el bagazo.

30

Figura 19. Determinación del % β-glucanos en el control harina de cebada, malta y bagazo.

Las tres matrices utilizadas para la determinación de beta-glucanos (harina de cebada, malta y bagazo) corresponden a muestras obtenidas en distintas etapas de la elaboración de la cerveza (Figura 8).

Según (Marconi et al., 2014) el contenido de β-glucanos en la cebada es del 6 al 8%, y según (Lee & Bamforth, 2009) el contenido total de β-glucanos en cebada varia normalmente de 2 al 8 % y dependen de factores genéticos y ambientales, además el 66% de betaglucanos de cebada están en forma soluble.

En la malta se observa una disminución del contenido de beta-glucanos respecto al contenido en la cebada. Dicha disminución puede estar relacionada con el propio proceso de germinación y elaboración de la malta, ya que las temperaturas de (50-60ºC) quizá no se desactivan las β- glucanasas endógenas, lo que puede dar lugar a un aumento de la despolimerización de los β- glucanos (Yoon S. H. , 1995) y por lo tanto, disminuir su contenido (Marconi et al., 2014) menciona que el contenido de beta-glucanos disminuye durante la germinación de la cebada a malta hasta un 92%, ya que se disuelve por acción de la enzima β-glucanasa, y que en el bagazo se observa un contenido de aproximadamente un 8 %.

En cuanto al bagazo, (Santos et al., 2003) afirma que la composición del bagazo quizá puede variar por la especie de la cebada, tiempo de cosecha, características del lúpulo y otros adyuvantes añadidos durante el proceso de elaboración de la cerveza. Se espera que el contenido de beta-glucanos presente en la malta se pueda extraer mayoritaria mente durante el proceso de maceración (etapa de maceración en Figura 8). El bagazo es el residuo de esta etapa, por lo que se espera que el contenido de beta-glucanos sea mínimo (aproximadamente 8 % según (Marconi, 2014). La Figura 20 representa la variación del contenido de beta-glucanos en cebada, malta y bagazo, según (Marconi et al., 2014). Ante esto, (Kuntz & Bamforth, 2007) dice que el contenido total β-glucanos

31

depende significativamente del tiempo de germinación y de la β-glucanasa ya que esta enzima está en su máxima actividad en la última etapa de germinación.

En resumen, las condiciones del malteado pueden afectar las características moleculares y el contenido del β-glucano (Marconi et al., 2014). En particular el contenido total de β-glucanos disminuye durante el malteado debido a la acción de la β-glucanasa a la vez que la solubilidad del β-glucano incrementa. Otros autores (Du, Zhu, & Xu, 2014) , también obtuvieron bajo rendimiento de extracción de beta-glucanos. A pesar de que usaron otras técnicas, otros factores como tiempo, temperatura, presión, ciclos también influenciaron-(Tabla 7).

Teniendo en cuenta la disminución del 92 % de beta-glucanos (Marconi et al., 2014), se espera que a partir de una cebada que tenga un 3 % de beta-glucanos se obtenga un bagazo con aproximadamente un 0,24 % de beta-glucanos, y de una cebada con un 8 %, se obtenga 0,64 % en el bagazo. En el presente estudio, los valores obtenidos de beta-glucanos en bagazo son menores de los esperados (0,17 %). Esto se podría explicar debido a que la empresa cervecera que nos ha propocionado las muestras suelen añadir la enzima β- glucanasa para evitar la formación de gelificaciones y precipitados indeseados en la malta debido a la presencia de β- glucanos. Estas gelificaciones provocan problemas tecnológicos durante la etapa de fermentación, de modo que añadiendo la enzima durante la etapa de maceración evitan este proceso. Aun así, un contenido de beta-glucanos de 0,17 % en el bagazo parece ser interesante para la industria (se generan cantidades muy elevadas de residuo) para aprovechar este residuo con el fin de extraer este compuesto y comercializarlo para otras aplicaciones.

Figura 20. Contenido del % β-glucanos en harina de cebada, malta y bagazo (Marconi et al.,

2014)

32

Tabla 7. Rendimiento de extracción de β-glucanos de salvado de cebada con diferentes métodos

de extracción (Du et al., 2014)

Método de Extracción

Tiempo de Extracción

Temperatura de extracción

(°C)

Presión de

extracción (Mpa)

Poder de extracción

(w)

Frecuencia de

extracción (Hz)

Número de

ciclos

Rendimiento de β-glucano

crudo (%)

ASE 9 min 70 4 16,39 ASE 6 min 85 10 3 8,8

Reflux 2h 100 2,2 UAE 1 h 50 100 0,3 MAE 2 min 800 40 0,3

ASE: Acelerated solvent extraccion; UAE: Ultrasonic-assisted extraccion; MAE: Microwave-assisted extracción

La cantidad de beta-glucanos obtenida cómo promedio en las muestras de bagazo analizadas es de 170 mg/100 g de bagazo seco. Teniendo en cuenta que la ingesta de 200 mg de beta-glucanos al día favorece la disminución de colesterol en sangre y mejora le respuesta inmune (Mason, 2001) el bagazo tendría un potencial interesante para ser considerado como ingrediente funcional en la industria alimentaria.

33

4.3 Cuantificación de arabinoxilanos en bagazo

4.3.1 Selección de la columna cromatográfica Para optimizar el método de identificación y cuantificación de azúcares (glucosa, xilosa, galactosa, arabinosa, y manosa) en bagazo y malta, se utilizaron dos columnas adecuadas para el equipo HPLC-RI:

1. Columna HPX-87C (Aminex) 2. Columna HPX-87P (Aminex)

Según la bibliografía AMINEX, ambas columnas son aptas para la determinación de los azúcares de interés (xilosa y manosa), aunque en función de la matriz puede ser que una de ellas sea más adecuada que la otra. Las pruebas preliminares que se realizaron con la HPX-87C mostraron que la separación de los azúcares de interés no era óptima, y se optó para seguir con la columna HPX-87-P (Figura 21).

a) Mix (100 ppm), Glu (11,66 min), Xi (12,76 min), 85°C. HPX -87C.

Figura 21. Prueba preliminar para la determinación de

arabinoxilanos con la columna HPX-87C

Con la columna HPX-87P, se identificó el tiempo de retención similares a los de bibliografía de Aminex y el área de las hexosas que contienen el bagazo y la malta, especialmente glucosa, xilosa, galactosa, arabinosa y manosa, en contraste con la columna HPX-87 C que no identifico los picos de galactosa, arabinosa y manosa. Ante

34

esto, el método se realizó con la columna HPX-87P, para su respectiva identificación y cuantificación de los azúcares

4.3.2 Determinación de arabinoxilanos en muestras de malta y bagazo. La determinación de arabinoxilanos en muestras de bagazo y malta se realizó utilizando una columna HPX-87-P (Aminex). A continuación, se presentan las rectas de calibración (sección 4.3.3), la cuantificación de arabinoxilanos en bagazo (sección 4.3.4)

4.3.3 Rectas de calibración

Para la realización de las rectas de calibración se prepararon soluciones de estándares de glucosa, xilosa, galactosa, arabinosa y manosa de 200 ppm. La Figura 24 muestra el cromatograma obtenido para cada uno de ellos. Según los tiempos de retención, el posicionamiento de cada estándar fue el siguiente:

1. Glucosa: TR= 11,61 min. 2. Xilosa TR= 12, 63 min. 3. Galactosa TR= 13, 51 min. 4. Arabinosa TR= 14, 79 min. 5. Manosa TR= 15,74 min.

A continuación, y para confirmar que no existe solapamiento entre los distintos azúcares, se prepararon soluciones mix con los cinco azúcares a distintas concentraciones (de 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm, 500 ppm, 1000 ppm, 1500 ppm y 2000 ppm; Figura 22). A partir de los resultados de los cromatogramas de los mix a concentraciones crecientes, se elaboraron las rectas de calibración (Figura 24).

1. Recta de calibración para la Glucosa: y= 0,7073 x + 53,907 (R2= 0,9938) 2. Recta de calibración para la Xilosa: y= 1,2125 x – 98,489 (R2= 0,9881) 3. Recta de calibración para la Galactosa: y= 0,754x – 56,908 (R2= 0,9911) 4. Recta de calibración para la Arabinosa: y= 1,0159 x – 61,536 (R2= 0,9863) 5. Recta de calibración para la Manosa: y= 0,9669 x – 53,666 (R2= 0,9948)

35

a) Estándar de Glucosa (200 ppm), TR: 11,61 min b) Estándar de Xilosa (200 ppm), TR: 12,63 min.

[min.]Time

0 5 10 15 20

[mV]V

olta

ge

10

15

20

25

11,6

1

1

13,9

6

2

15,3

0

3

C:\Clarity Lite\WORK1\DATA\METASIN II\STD GLUCOSA 17 JUNMetasin - Detector 1C:\Clarity Lite\WORK1\DATA\METASIN II\STD GLUCOSA 17 JUNMetasin - Detector 2

[min.]Time

0 5 10 15 20

[mV]

Vol

tage

10

15

20

25

12,6

3

1

14,0

2

2

15,6

2

3

C:\Clarity Lite\WORK1\DATA\METASIN II\STD XILOSA 17 JUNMetasin - Detector 1C:\Clarity Lite\WORK1\DATA\METASIN II\STD XILOSA 17 JUNMetasin - Detector 2

c) Estándar de Galactosa (200 ppm), TR: 13,51 min. d) Estándar de Arabinosa (200 ppm), TR: 14,79 min.

[min.]Time

0 5 10 15 20

[mV]

Vol

tage

10

15

20

25

13,5

1

1

15,2

6

2C:\Clarity Lite\WORK1\DATA\METASIN II\GALACTOSA 200 ppm 17 JUNMetasin - Detector 1C:\Clarity Lite\WORK1\DATA\METASIN II\GALACTOSA 200 ppm 17 JUNMetasin - Detector 2

Figura 22.Cromatogramas de los estándares de glucosa (a), xilosa (b), galactosa(c), arabinosa(d) (continua)

36

e) STD Manosa (200 ppm), TR: 15,74 min.

[min.]Time

0 5 10 15 20

[mV]

Vol

tage

10

15

20

25

14,1

6

1

15,7

4

2

C:\Clarity Lite\WORK1\DATA\METASIN II\MANOSA1 17 JUNMetasin - Detector 1C:\Clarity Lite\WORK1\DATA\METASIN II\MANOSA1 17 JUNMetasin - Detector 2

Figura 22 (continuación). Cromatogramas de los estándares, e) manosa

37

a) Mix (50 ppm), Glu, Xi, Ga, Ar, Ma, 85°C. HPX -87P. b) Mix (100 ppm), Glu, Xi, Ga, Ar, Ma, 85°C. HPX -87P.

[min.]Time

0 5 10 15 20

[mV]

Vol

tage

10

15

20

25

11,6

2

1

12,6

2

2

13,5

6

3

14,8

2

4

15,7

6

5

C:\Clarity Lite\WORK1\DATA\METASIN II\recta mix 50ppm Metasin - Detector 1C:\Clarity Lite\WORK1\DATA\METASIN II\recta mix 50ppm Metasin - Detector 2

[min.]Time

0 5 10 15 20

[mV]

Vol

tage

10

12

14

16

18

20

22

24

11,6

3

1

12,6

4

2

13,5

3

3

14,8

0

4

15,7

6

5


c) Mix (200 ppm), Glu, Xi, Ga, Ar, Ma, 85°C. HPX -87P. d) Mix (500 ppm), Glu, Xi, Ga, Ar, Ma, 85°C. HPX -87P.

[min.]Time

0 5 10 15 20

[mV]

Vol

tage

10

15

20

25

11,6

1

1

12,6

4

2

13,5

0

3

14,8

0

4

15,7

5

5


[min.]Time

0 5 10 15 20

[mV]

Vol

tage

10

20

30

40

50

60

70

11,6

2

1

12,6

4

2

13,5

0

3

14,8

0

4

15,7

6

5


Figura 23. Cromatogramas obtenidos para el mix de azúcares de Glucosa, Xilosa, Galactosa, Arabinosa y Manosa a distintas

concentraciones: a) 50 ppm, b) 100 ppm, c) 200 ppm, d) 500 ppm, e) 1000 ppm, f) 1500 ppm y g) 2000 ppm. (continua)

38

e) Mix (1000 ppm), Glu, Xi, Ga, Ar, Ma, 85°C. HPX -87P. f) Mix (1500 ppm), Glu, Xi, Ga, Ar, Ma, 85°C. HPX -87P.

[min.]Time

0 5 10 15 20

[mV]

Vol

tage

20

40

60

80

7,40

1

11,6

2

2

12,6

4

3

13,4

9

4

14,7

9

5

15,7

5

6


[min.]Time

0 5 10 15 20

[mV]

Vol

tage

20

40

60

80

100

120

140

11,6

2

1

12,6

4

2

13,4

9

3 14,7

9

4

15,7

4

5


g) Mix (2000 ppm), Glu, Xi, Ga, Ar, Ma, 85°C. HPX -87P.

[min.]Time

0 5 10 15 20

[mV]

Vol

tage

50

100

150

11,6

1

1

12,6

4

2

13,4

8

3 14,7

9

4

15,7

4

5


Figura 23. (Continuación). Cromatogramas obtenidos para el mix de azúcares de Glucosa, Xilosa, Galactosa, Arabinosa y manosa a distintas concentraciones: a) 50 ppm, b) 100 ppm, c) 200 ppm, d) 500 ppm, e) 1000 ppm, f) 1500 ppm y g) 2000 ppm.

39

a) Curva de glucosa b) Curva de xilosa

c) Curva de galactosa

d) Curva de arabinosa

Figura 24. Curvas calibración de la glucosa, xilosa, galactosa y arabinosa.

40

e) Curva de manosa

Figura 25 (Continuación). Curva calibración de la manosa

41

4.3.4 Resultados y cuantificación de arabinoxilanos en malta y bagazo

Se cuantificaron los arabinoxilanos de muestras control (mix de arabinoxilanos), muestras de malta y muestras de bagazo utilizando las rectas de calibración de arabinosa y xilosa. La Figura 26 muestra los cromatogramas obtenidos de las muestras mediante la columna HPX-87P, y la Tabla 8 muestra el contenido total de xilosa y arabinosa de las muestras.

Tabla 8. Concentración de los azúcares de xilosa y arabinosa.

Concentración (mg/L) Muestra Xi Ara

Bagazo 40 ºC 437,47 943,63 Malta 279,35 777,18

Control arabinoxilanos 1025,16 1034,61

Los resultados indican que la concentración de xilosa (437,47mg/L) de bagazo es mayor en comparación con la concentración de xilosa (279,35mg/L) en la malta, también existe más concentración de arabinosa (943,63mg/L) en bagazo que en la malta (777,18mg/L).

Según (Zhong X Lu et al., 2000) se necesita 15g/día (1500 mg/día) de Arabinoxilanos para mejorar el control metabólico en personas con diabetes tipo II , En nuestro caso se pesó aproximadamente 300 mg y se obtuvieron 437,47 mg/L de Xilosa y 943,63 mg/L de arabinosa, en promedio sería 690,55 mg/L de arabinoxilanos, Se necesitaría partir de aproximadamente 650 mg de bagazo, para obtener la cantidad de arabinoxilanos necesaria (1500 mg/día) para que mejore el síndrome glucémico ; sin embargo, se recomienda que se realice más pruebas, ya que los estudios son limitados.

42

a) Control de arabinoxilanos 30% arabinosa: Xi (12,64 min), Ga (13,60 min), Ar (14,79 min), 85 °C. HPX -87P.

b) Bagazo (40°C): Glu (11,61 min), Xi (12,64 min), Ar (14,79min). 85°C. HPX -87P.

[min.]Time

0 5 10 15 20

[mV]

Vol

tage

20

40

60

80

100

120

140

3,56

1

6,63

2

7,00

3

11,6

2

4

12,6

4

5

13,6

0

6 14,7

9

7

16,4

1

8

C:\Clarity Lite\WORK1\DATA\METASIN II\CONTRO 1ARABINOXILANOS 20 JUNMetasin - Detector 1C:\Clarity Lite\WORK1\DATA\METASIN II\CONTRO 1ARABINOXILANOS 20 JUNMetasin - Detector 2

c) Malta: Glu (11,61 min), Xi (12,64min), Ara (14,83 min). 85°C. HPX -87P.

. [min.]Time

0 5 10 15 20

[mV]

Vol

tage

50

100

150

6,90

1

9,96

2

11,6

1

3

12,6

4

4

14,8

3

5

16,8

1

6

C:\Clarity Lite\WORK1\DATA\METASIN II\MALTA 20 JUNMetasin - Detector 1C:\Clarity Lite\WORK1\DATA\METASIN II\MALTA 20 JUNMetasin - Detector 2

Figura 26. Cromatogramas obtenidos tras analizar por HPLC-RI el control de arabinoxilanos (a), bagazo secado a 40°C (b), Malta (c).

43

5. CONCLUSIONES

1. El método de determinación de beta-glucanos permitió cuantificar el porcentaje de beta-glucanos en 4 especies de hongos. Los hongos Shiitake (Lentinus edodes) resultaron ser una fuente muy importante de beta-glucanos, seguido de los hongos Robellón (Lactarius delicious) y los hongos blancos (Boletus edulis). Los champiñones (Agaricus bisporus) resultaron ser una fuente más limitada de beta-glucanos.

2. La estabilización del bagazo a 40 ºC hasta peso constante (aprox. 24 h) se consideró más adecuada que el secado a 50ºC, porqué permite igualmente la preservación del bagazo, pero además representa un ahorro energético y económico ante una potencial explotación de este subproducto que lleve incorporado un valor añadido. También, se recomienda que en la metodología de cuantificación de beta-glucanos en el bagazo se utilice una dilución intermedia de 20 mL y realizar la lectura de absorbancia tras un tiempo de espera de 15 minutos

3. Los β-glucanos de cebada, malta, bagazo y hongos, deberían ser considerados como fuentes de beta-glucanos para las industrias de alimentos con sus potenciales beneficios sobre la salud. Sin embargo, existe el desafío de optimizar el procedimiento de extracción para producir un material consistente de β-glucanos a nivel industrial.

4. El uso de la columna HPX- 87P, permitió la correcta identificación y separación de los picos de glucosa, xilosa, galactosa, arabinosa y manosa que contiene el bagazo y la malta, a diferencia de la columna HPX-87 C, que no permitió identificar los picos de la galactosa, arabinosa y manosa.

44

6. BIBLIOGRAFÍA Bacic, A., & Stone, B. (1981). Chemistry and Organization of Aleurone Cell Wall Components

From Wheat and Barley. Functional Plant Biology, 8(5), 475-495. doi:http://dx.doi.org/10.1071/PP9810475

Bae, I. Y., Lee, S., Kim, S. M., & Lee, H. G. (2009). Effect of partially hydrolyzed oat β-glucan on the weight gain and lipid profile of mice. Food Hydrocolloids, 23(7), 2016-2021. doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.foodhyd.2009.03.016

Brennan, C., Tudorica, C., & Kuri, V. (2002). Soluble and insoluble dietary fibres (non-starch polysaccharides) and their effects on food structure and nutrition. LEATHERHEAD FOOD RA FOOD INDUSTRY JOURNAL, 5, 261-272.

Brennan, C. S., & Cleary, L. J. (2005). The potential use of cereal (1→3,1→4)-β-d-glucans as functional food ingredients. Journal of Cereal Science, 42(1), 1-13. doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.jcs.2005.01.002

Brown, G. D., & Gordon, S. (2005). Immune recognition of fungal β-glucans. Cellular Microbiology, 7(4), 471-479. doi:10.1111/j.1462-5822.2005.00505.x

Chihara, G. (2001). International Journal of Oriental Medicine Oriental Healing Arts Institute of U.S.A. (pp. 261-266).

Desmond, E., Troy, D., & Buckley, D. (1998). COMPARATIVE STUDIES OF NONMEAT ADJUNCTS USED IN THE MANUFACTURE OF LOW-FAT BEEF BURGERS. Journal of Muscle Foods, 9(3), 221-241.

Du, B., Zhu, F., & Xu, B. (2014). β-Glucan extraction from bran of hull-less barley by accelerated solvent extraction combined with response surface methodology. Journal of Cereal Science, 59(1), 95-100. doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.jcs.2013.11.004

EFSA NDA Panel (EFSA Panel on Dietetic Products, N. a. A. (2011). Scientific Opinion on the substantiation of health claims related to beta-glucans from oats and barley and maintenance of normal blood LDL-cholesterol concentrations (ID 1236, 1299), increase in satiety leading to a reduction in energy intake EFSA Journal, 9(6), 21. doi:10.2903/j.efsa.2011.2207

Faulds, C. B., Collins, S., Robertson, J. A., Treimo, J., Eijsink, V. G. H., Hinz, S. W. A., . . . Waldron, K. W. (2009). Protease-induced solubilisation of carbohydrates from brewers' spent grain. Journal of Cereal Science, 50(3), 332-336. doi:10.1016/j.jcs.2009.01.004

Fincher, B. G. B. (1975). Morphology and chemical composition of barley endosperm cell walls. Jnl Institute Brewing, 81(2), 116-122. doi:10.1002/j.2050-0416.1975.tb03672.x

Forrest, I. S., & Wainwright, T. (1977). The mode of binding of β- glucans and pentosans in barley endosperm cell walls. . Journal of the Institute of Brewing, 83(5), 279-286. doi:10.1002/j.2050-0416.1977.tb03809.x

García Martínez, E. Cuantificación de compuestos por cromatografía: Método del Patrón Externo.

Gill, A. A., Morgan, A. G., & Smith, D. B. (1982). Total β-glucan content of some barley cultivars Journal of the Institute of Brewing, 88(5), 317-319. doi:10.1002/j.2050-0416.1982.tb04115.x

Handayani, D. M., B.; Chen, j.; Tang, P.; Lip, C.; Chan, H.; Huang, X. . (2012). The Comparison of the Effect of Oat and Shiitake Mushroom Powder to Prevent Body Weight Gain in Rats Fed High Fat Diet. Food and Nutrition Sciences,, 3, 1009-1019. Retrieved from http://file.scirp.org/pdf/FNS20120700015_57764794.pdf

Henry, R. J., & Blakeney, A. B. (1986). DETERMINATION OF TOTAL β-GLUCAN IN MALT. Journal of the Institute of Brewing, 92(4), 354-356. doi:10.1002/j.2050-0416.1986.tb04422.x

Izydorczyk, M. S., & Dexter, J. E. (2008). Barley β-glucans and arabinoxylans: Molecular structure, physicochemical properties, and uses in food products–a Review. Food

45

Research International, 41(9), 850-868. doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.foodres.2008.04.001

Jay, A. J., Parker, M. L., Faulks, R., Husband, F., Wilde, P., Smith, A. C., . . . Waldron, K. W. (2008). A systematic micro-dissection of brewers’ spent grain. Journal of Cereal Science, 47(2), 357-364. doi:10.1016/j.jcs.2007.05.006

Jay, A. J., Parker, M. L., Faulks, R., Husband, F., Wilde, P., Smith, A. C,Waldron K. W. (2008). A systematic micro-dissection of brewers’ spent grain. Journal of Cereal Science, 47(2), 357–364. Retrieved from http://doi.org/10.1016/j.jcs.2007.05.006

Kerckhoffs, D. H. G., and Mensink, R., & (2003). Cholesterol-lowering effect of β-glucan from oat bran in mildly hypercholesterolemic subjects may decrease when β-glucan is incorporated into bread and cookies. American Journal of Clinical Nutrition, 78, 221-227. Retrieved from http://ajcn.nutrition.org/content/78/2/221.full#abstract-1

Knuckles B. E. , C. M. M., and Betschart A. A. (1992). Beta-Glucan-Enriched Fractions from Laboratory-Scale Dry Milling and Sieving of Barley and Oats. Cereal Chem, 69, 198 -202. Retrieved from AACCInternational website: http://www.aaccnet.org/publications/cc/backissues/1992/Documents/CC1992a47.html

Retrieved from http://www.aaccnet.org/publications/cc/backissues/1992/Documents/CC1992a47.html

Kumar, M., & Sharma, B. (2004). Quality and storage stability of low-fat pork patties

containing barley flour as-fat substitute. Journal of Food Science and Technology-Mysore, 41(5), 496-502.

Kuntz, R. J., & Bamforth, C. W. (2007). Time Course for the Development of Enzymes in Barley1. Journal of the Institute of Brewing, 113(2), 196-205.

Kyanko, M. V., Canel, R. S., Ludemann, V., Pose, G., & Wagner, J. R. (2013). β-Glucan content and hydration properties of filamentous fungi. Applied Biochemistry and Microbiology, 49(1), 41-45. doi:10.1134/s0003683813010080

Laroche, C. M., P. (2007). New Developments and Prospective Applications for β (1,3) Glucans. Recent Patents on Biotechnology, 1(1), 59-73. doi: 10.2174/187220807779813938

Lee, Y.-T., & Bamforth, C. W. (2009). Variations in solubility of barley β-glucan during malting and impact on levels of β-glucan in wort and beer. Journal of the American Society of Brewing Chemists, 67(2), 67-71.

Lima, K. d. S. C., Souza, L. B. e., Godoy, R. L. d. O., França, T. C. C., & Lima, A. L. d. S. (2011). Effect of gamma irradiation and cooking on cowpea bean grains (Vigna unguiculata L. Walp). Radiation Physics and Chemistry, 80(9), 983-989. doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.radphyschem.2011.04.011

Lu, Z. X., Walker, K. Z., Muir, J. G., Mascara, T., & O'Dea, K. (2000). Arabinoxylan fiber, a byproduct of wheat flour processing, reduces the postprandial glucose response in normoglycemic subjects. The American journal of clinical nutrition, 71(5), 1123-1128.

Lu, Z. X., Walker, K. Z., Muir, J. G., & O'Dea, K. (2004). Arabinoxylan fibre improves metabolic control in people with Type II diabetes. Eur J Clin Nutr, 58(4), 621-628. doi:10.1038/sj.ejcn.1601857

Mälkki, Y. (2004). Trends in Dietary Fibre Research and Development. Acta Alimentaria, 33, 39-62.

Mansour, E. H., & Khalil, A. H. (1997). Characteristics of low-fat beefburger as influenced by various types of wheat fibers. Food Research International, 30(3), 199-205.

Manzi, P., & Pizzoferrato, L. (2000). Beta-glucans in edible mushrooms. Food Chemistry, 68(3), 315-318. doi:http://dx.doi.org/10.1016/S0308-8146(99)00197-1

Marconi, O., Tomasi, I., Dionisio, L., Perretti, G., & Fantozzi, P. (2014). Effects of malting on molecular weight distribution and content of water-extractable β-glucans in barley. Food Research International, 64, 677-682. doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.foodres.2014.07.035

Mason, R. (2001). What is Beta Glucan? A Concise Guide to the Benefits and

46

Uses of the Most Powerful Natural Immune

Enhancer Known to Science. Mussatto, S. I., Dragone, G., & Roberto, I. C. (2006). Brewers' spent grain: generation,

characteristics and potential applications. Journal of Cereal Science, 43(1), 1-14. doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.jcs.2005.06.001

Piñero, M. P., Parra, K., Huerta-Leidenz, N., Arenas de Moreno, L., Ferrer, M., Araujo, S., & Barboza, Y. (2008). Effect of oat’s soluble fibre (β-glucan) as a fat replacer on physical, chemical, microbiological and sensory properties of low-fat beef patties. Meat Science, 80(3), 675-680. doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.meatsci.2008.03.006

Rivero, M. (2011-2012). Extracción y reología de ß-glucanos de cebada y elaboración de masas de pan sin gluten enriquecidas con los extractos. (Máster en Calidad, Desarrollo e Innovación de Alimentos Trabajo final de Màster), UVa Biblioteca Universitaria. Retrieved from http://uvadoc.uva.es/handle/10324/1688

Rop, O., Mlcek, J., & Jurikova, T. (2009). Beta-glucans in higher fungi and their health effects. Nutrition Reviews, 67(11), 624-631. doi:10.1111/j.1753-4887.2009.00230.x

Rosli, W. W., Solihah, M., Aishah, M., Fakurudin, N. N., & Mohsin, S. (2011). Colour, textural properties, cooking characteristics and fibre content of chicken patty added with oyster mushroom (Pleurotus sajor-caju). International Food Research Journal, 18, 621-627.

Santos, M., Jiménez, J. J., Bartolomé, B., Gómez-Cordovés, C., & del Nozal, M. J. (2003). Variability of brewer’s spent grain within a brewery. Food Chemistry, 80(1), 17-21. doi:http://dx.doi.org/10.1016/S0308-8146(02)00229-7

Saritha, K., Prakash, B., Khedkar, G., & Reddy, Y. M. (2016). Mushrooms and Truffles: Role in the Diet.

Savin R, S. P., Nicolas ME, Wardlaw IF. (1997). Grain growth and malting quality of barley.

1. Effects of heat stress and moderately high temperature. Article in Australian Journal of Agricultural, 48, 615-624. doi:10.1071/A96064

Serdaroglu, M. (2006). The characteristics of beef patties containing different levels of fat and oat flour. International journal of food science & technology, 41(2), 147-153.

Skendi, A., Biliaderis, C. G., Lazaridou, A., & Izydorczyk, M. S. (2003). Structure and rheological properties of water soluble β-glucans from oat cultivars of Avena sativa and Avena bysantina. Journal of Cereal Science, 38(1), 15-31. doi:http://dx.doi.org/10.1016/S0733-5210(02)00137-6

Stuart, I. M., Loi, L., & Fincher, G. B. (1988). Varietal and environmental variations in (1→3,1→4)-β-glucan levels and (1→3,1→4)-β-glucanase potential in barley: Relationships to malting quality. Journal of Cereal Science, 7(1), 61-71. doi:http://dx.doi.org/10.1016/S0733-5210(88)80060-2

Tao, Y., Zhang, L., & Cheung, P. C. K. (2006). Physicochemical properties and antitumor activities of water-soluble native and sulfated hyperbranched mushroom polysaccharides. Carbohydrate Research, 341(13), 2261-2269. doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.carres.2006.05.024

Troutt, E., Hunt, M., Johnson, D., Claus, J., Kastner, C., & Kropf, D. (1992). Characteristics of low-fat ground beef containing texture-modifying ingredients. Journal of Food Science, 57(1), 19-24.

Vosen, T. R., Rogers, R. W., Halloran, J. D., Martin, J. M., & Armstrong, T. (1993). Effects of bran on sensory, storage, and compositional properties of low fat beef sloppy-joes1. Journal of Muscle Foods, 4(1), 71-79.

Wood , P., Fulcher, R., & Bruce, A. (1983). Studies on the specificity of interaction of cereal cell wall components with Congo Red and Calcofluor. Specific detection and histochemistry of (1 → 3), (1 → 4),-β-D-glucan. Journal of Cereal Science, 1, 95-110. doi:10.1016/S0733-5210(83)80027-7

Yoon S. H. , B. P. T., and Fastnaught C. E.. . (1995). Evaluation of Selected Barley Cultivars and Their Fractions for beta-Glucan Enrichment and Viscosity. Cereal Chemistry, 72, 187-190.

47

Zeković, D. B., Kwiatkowski, S., Vrvić, M. M., Jakovljević, D., & Moran, C. A. (2005). Natural and Modified (1→3)-β-D-Glucans in Health Promotion and Disease Alleviation. Critical Reviews in Biotechnology, 25(4), 205-230. doi:10.1080/07388550500376166

Zhu, F., Du, B., Bian, Z., & Xu, B. (2015). Beta-glucans from edible and medicinal mushrooms: Characteristics, physicochemical and biological activities. Journal of Food Composition and Analysis, 41, 165-173. doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.jfca.2015.01.019

Zhu, F., Du, B., & Xu, B. (2016). A critical review on production and industrial applications of beta-glucans. Food Hydrocolloids, 52, 275-288. doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.foodhyd.2015.07.003

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7. ANEXOS

7.1 Características de la columna HPX-87P.

49

7.2 Estándares para la determinación de Arabinoxilanos.

D (+) – Xilosa:

Lot # 03MO1181V SIGMA-ALDRICH Pcode:1001363245 Còdigo:X1500-10 MG

D (+) – Galactosa:

Lot # 021MOO05V SIGMA-ALDRICH Pcode:101112684 CAS:59-23-4 C6H12O6

D (+) – Manosa, D- Mannopyranose:

Lot # SLBD7623V Pcode:1001413392 M6020-256 CAS:3458-28-4 C6H12O6 Mw: 180,16 g/mol

D (-)-Arabinosa

Lot # 100M1365V Pcode:1001010627 CAS:10323203 C5H10O5

D (+) – Glucosa

Lot # 071MO1454V Pcode: 10121996467021-100G CAS: 50-99-7 C6H12O6 Mw: 180,16 g/mol

Patrón Arabinoxilanos

Wheat Arabinoxylan Enzyme de branched, 30% arabinose 3g, P- EDWAX30 Lote: 140601a Expiry:2020