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Cuantificación del contenido de azúcares reductores
XIII Congreso de Fitomejoramiento:
Contribuyendo al sostenimiento de la vida a través del fitomejoramiento 6 - 8 de noviembre, Corpoica, Tibaitatá – Mosquera, Cundinamarca
Cuantificación del contenido de azúcares reductores y no reductores y su asociación genética con marcadores
SNPs en Solanum tuberosum grupo Phureja (Resultados preliminares)
Diana Duarte-Delgado, Luz Patricia Restrepo, Ajjamada Kushalappa y Teresa Mosquera
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Incremento en la demanda de alimentos
procesados (FAO, 2009)
Cambios en los hábitos de consumo a nivel
mundial (FAO, 2009)
Oportunidad: Papa criolla (Solanum tuberosum grupo Phureja)
Incrementar valor agregado
Contribuir a la seguridad alimentaria en
comunidades vulnerables
Introducción
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Cultivar de papa criolla para procesamiento en hojuela:
necesita desarrollo
Problema: contenido de azúcares reductores
Werij et al., 2012
Contenido de azúcares reductores
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amino acid
+
Reductores
+
No reductores
Reacción de Maillard
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Nader, 2011
Degradación del almidón en células de almacenamiento
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Cultivar de papa criolla para procesamiento en hojuela:
necesita desarrollo
Problema: contenido de azúcares reductores
Calidad de procesamiento en hojuela: rasgo complejo
Werij et al., 2012
Contenido de azúcares reductores
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Basic science
Molecular maps
Function maps for pathogen resistance
and tuber traits Comparative maps
Genome structure and evolution
Application
Markers for introgression
breeding
R-gene cloning Candidate genes
Genomic sequencing
*omics
Diagnostic markers for population-based
MAS
Engineering agronomic traits
Precision breeding
The molecular basis of complex traits
Biodiversity, haplotypes
Association studies
Ch. Gebhardt MPIZ
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Balding, 2006
Mapeo por asociación
Phenotypic trait
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Cuello de botella…
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Pregunta de investigación ¿Cuáles regiones del genoma de papa se asocian al contenido de azúcares reductores y no reductores en una población natural de Solanum tuberosum grupo Phureja, al emplear marcadores SNPs distribuidos ampliamente por el genoma y en regiones de genes candidatos?
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Objetivo General
Explorar la variación alélica de Solanum tuberosum grupo Phureja y su asociación genética con contenidos de azúcares reductores y no reductores
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1.Ajustar la metodología para la cuantificación de azúcares reductores y no reductores en grupo Phureja a través de la técnica de HPLC. 2.Caracterizar fenotípicamente la Colección Central Colombiana (CCC) de grupo Phureja y otros genotipos por su contenido de azúcares. 3.Asociar genéticamente los contenidos de azúcares reductores y no reductores con marcadores SNPs distribuidos ampliamente por el genoma y en regiones de genes candidatos.
Objetivos específicos
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Mapeo por Asociación
10 genes candidatos: Diseño y amplificación de
primers Identificación de SNPs
Aproximación GWAS: Metodología GBS
110 accessiones Colección Central Colombiana (CCC)
4 Cultivares comerciales Caracterización fenotípica del contenido de
azúcares : Latice rectangular triple
8 accessiones IPK German Germplasm Bank
• Agua • Doble tratamiento con MeOH • MeOH con carbón activado • MeOH con reflujo
Equipo: UHPLC Ultimate 3000 Dionex Detector: Índice de refracción Shodex Columna: Aminex HPX 87H 300 mm x 7.8 mm Fase movil: Ácido sulfúrico 10 mM
Condiciones cromatográficas
Métodos de extracción de azúcares
Ajustes para el análisis del contenido de
azúcares
Materiales y métodos
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Mapeo por Asociación
10 genes candidatos: Diseño y amplificación
de Primers Identificación de SNPs
Aproximación GWAS: Metodología GBS
110 accessiones Colección Central Colombiana (CCC)
4 Cultivares comerciales Caracterización fenotípica del contenido de
azúcares : Latice rectangular triple
8 accessiones IPK German Germplasm Bank
• Agua • Doble tratamiento con MeOH • MeOH con carbón activado • MeOH con reflujo
Equipo: UHPLC Ultimate 3000 Dionex Detector: Índice de refracción Shodex Columna: Aminex HPX 87H 300 mm x 7.8 mm Fase móvil: Ácido sulfúrico 10 mM
Condiciones cromatográficas
Métodos de extracción de azúcares
Ajustes para el análisis del contenido de
azúcares
Materiales y métodos
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Objetivo específico 1 Ajustar la metodología para la cuantificación de azúcares reductores y no reductores en grupo Phureja a través de la técnica de HPLC. • Condiciones cromatográficas:
Condiciones cromatográficas
Temperatura de la columna 18°C
Temperatura del detector 35°C
Fase móvil Ácido sulfúrico 10mM
Fase de almacenamiento Ácido sulfúrico 5mM
Fase de limpieza Acetonitrilo 2,5% en ácido sulfúrico 5mM
Flujo 0,3ml/min
Volumen de inyección 20 µl
Tiempo por muestra 35 min
Resultados
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• Selección de la metodología para extracción de azúcares: Análisis
de un DCA y pruebas de Tukey
Método Concentración promedio sacarosa (ppm)
Agua (Cunningham et al., 1988) 2566,22 a
Doble tratamiento con MeOH (Karkacier et al., 2003) 4925,64 c
MeOH con carbón activado (Marangoni et al., 1997) 3479,68 ab
MeOH con reflujo (Arevalo & Sastoque, 1999) 4322,76 b
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• Validación del método de cuantificación
Reproducibilidad Repetibilidad Linealidad Promedio (ppm) CV (%) Promedio (ppm) CV (%) Promedio R² SD
Glucosa 40.08 1.21 52.06 4.61 0.9998 0.00015 Fructosa 40.42 0.83 41.33 3.67 0.9997 0.00021 Sacarosa 40.41 0.72 40.49 4.44 0.9997 0.00016
Límite de
detección (ppm) Límite de
cuantificación (ppm) % de Recuperación
Glucosa 4 5 111.47 Fructosa 2 3 103.10 Sacarosa 2 2 96.13
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a. Cromatograma de patrones en mezcla b. Cromatograma de Col 102
a. b.
Cromatogramas de patrones y de tubérculo crudo
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Cromatogramas de genotipos contrastantes a. Col 52 b. IPK-170031
a. b.
Cromatogramas para azúcares en tubérculo crudo
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Objetivo específico 3 Asociar genéticamente los contenidos de azúcares reductores y no reductores con marcadores SNPs distribuidos ampliamente por el genoma y en regiones de genes candidatos.
Genes candidatos seleccionados para diseño de primers
Gen Candidato Función Cromosoma
InvGE Apoplastic invertase IX Pain-1 Vacuolar acid invertase III Stp23 Plastidic starch phosphorylase III StpL Plastidic starch phosphorylase V AGPaseS-a ADP-glucose pyrophosphorylase I SssI Soluble starch synthase III GWD Glucan-water dikinase V UGPase UDP-glucose pyrophosphorylase XI Sps Sucrose phosphate synthase VII G6pdh Glucose-6-phosphate dehydrogenase II
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Nader, 2011
Degradación del almidón en células de almacenamiento
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• Se ha ajustado una metodología cromatográfica precisa, reproducible y repetible para la cuantificación de azúcares en tubérculos de grupo Phureja.
• Los resultados obtenidos revelan variabilidad en el contenido de azúcares de genotipos de grupo Phureja.
• Una vez se cuenten con los datos fenotípicos completos, el análisis
de asociación será llevado a cabo a partir de SNPs con el propósito de identificar regiones genómicas con influencia en la calidad de fritura, en este importante grupo de papas cultivadas para Colombia.
Conclusiones y perspectivas
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Seguridad Alimentaria y Nutrición
Proyecto desarrollado con el apoyo financiero del International Development Research Centre (IDRC), www.idrc.ca, y el Gobierno de Canadá, a través del Department of Foreign Affairs, Trade and Development Canada (DFATD), Canada, www.international.gc.ca
El mejoramiento de la producción de papa como contribución a la seguridad alimentaria en comunidades nativas en Colombia
Agradecimientos
Contrato de acceso al recurso genético RGE0069
Grupo: Genética de rasgos de interés agronómico
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¡Gracias por su atención!