PRACTICAS EN BIOQUIMICA: Cuantificacin de Protenas

Mtodo de BiuretGornell AG, C. J. Bardawill, and M. M. DAVID. Determination of serum proteins by means of the biuret. reaction. J. BioZ. Chem. 177: 751-766, 1949El mtodo de Biuret se basa en la reaccin de sales de Cu+2 con molculas que contienen ms de dos enlaces peptdicos en un medio alcalino; el cobre es reducido a Cu+ formando complejos color prpura que tienen un mximo de absorcin a 540 nm. El mtodo se usa para soluciones que tienen de 0.5 a 10 mg protena/ml.

Es un mtodo poco sensible. Es til cuando se quiere analizar grandes lotes de protena.

Existen compuestos que interfieren con la lectura, tales como tioles y sales de amonio, que pueden removerse precipitando la protena con un volumen igual de cido tricloroactico al 10%, resuspendiendo el precipitado que contiene las protenas en NaOH 1 N.

Mtodo de LowryLowry, OH, NJ Rosbrough, AL Farr, and RJ Randall. J. Biol. Chem. 193: 265. 1951 El color producido por el mtodo de Lowry resulta de la reaccin de Biuret sobre los enlaces peptdicos, adems de la reduccin del reactivo de fosfomolibdato-fosfotungstato (Folin-Ciocalteu) por las protenas pretratadas con cobre en medio alcalino. El Cu+ y los grupos R de la tirosina, triptofano y cistena reaccionan con el reactivo de Folin, produciendo un producto inestable que es reducido a azul de molibdeno/tungsteno. El color azul, es determinado a 650 nm. Este es un mtodo muy sensible, por lo que permite trabajar con soluciones muy diludas de protenas (0.02 - 0.5 mg protena/ml).

Mtodo de BradfordBradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248El mtodo de Bradford de basa en que el Azul Brillante de Coomasie G-250 cambia de rojo a azul, al unirse a residuos aromticos y arginina en las protenas.El complejo protena-colorante tiene un coeficiente de extincin elevado, lo que le confiere gran sensibilidad. La reaccin entre el colorante y la protena es muy rpida (aproximadamente 2 min), y el completo protena-colorante permanece disperso en solucin por un tiempo relativamente largo. Rango de deteccin: 0.5-10 mg protena/ml.

Absorcin Ultravioleta de las Protenas

La mayora de protenas presenta un mximo de absorbancia a 280 nm, debido a la presencia de aminocidos aromticos (tirosina, triptofano y fenilalanina).La absorbancia a 280 nm puede usarse para medir protenas en concentraciones entre 0.1 y 0.5 mg/ml, en la ausencia de sustancias que interfieran con la lectura. Algunas preparaciones de protenas parcialmente purificadas pueden tener cidos nucleicos, los cuales tienen un mximo de absorcin a 260 nm. Una ecuacin para calcular la concentracin de protena en la presencia de cidos nucleicos en cubetas de 1 cm de paso es:

(protena)mg/ml = 1.55 A280nm - 0.76 A260nm

La ecuacin fue derivada para enolasa (A280/A260 = 1.75) en la presencia de cido nucleico de levadura (A280/A260 = 0.49) y por tanto puede no ser precisa para otras protenas y otros cidos nucleicos. La absorbancia a 280 nm de una solucin de protena 0.1% (p/v) vara entre 0.5 y 2.5, dependiendo de la proporcin de aminocidos aromticos que contengan.

Absorcin Ultravioleta de las Protenas Todas las protenas absorben fuertemente debajo de 230 nm. Por ejemplo, la albmina srica bovina (0.1% p/v) absorbe 5.0 y 11.7 a 225 y 215, respectivamente (comparado con 0.66 a 280 nm). La absorbancia por debajo de 230 nm es debido al enlace peptdico. Consecuentemente los valores de A 0.1% son casi los mismos para todas las protenas. Concentraciones de protenas en el rango de 10 a 100 ug/ml pueden determinarse de la diferencia de absorbancias a 215 y 225 nm. Se prepara una curva standard graficando A vs. protenas.

(protena)ug/ml = 144 (Acm215 - Acm225)

La diferencia de absorbancia es usada para minimizar errores que resulten de compuestos no proteicos en solucin. Altas concentraciones de ciertos buffers pueden interferir (no se puede usar 0.1 N NaOH para disolver la protena, pero 5 mM NaOH no causa problemas).