Diagnosticul de laborator al infeciilor produse de fungiAspecte clinice, izolarea i identificarea (prelevarea probelor, examenul microscopic direct, nsmnarea pe medii de cultur)Micozele sau infeciile fungice

Aspecte clinicePolimorfeDiversitateaspeciilorafectatesia localizarilorMicozelesuntsuspectatedeseoridupaeseculaltorterapiiColectarea probelorPrelevare probe: biopsie tisular, aspiraie, raclare se evit pe ct posibil utilizarea tampoanelorTehnici aseptice n obinerea tuturor probelor decontaminarea zonelor adiacente de piele sau mucoas (nu este recomandat pentru dermatofii)Trimiterea prelevatelor ctre laborator n cel mai scurt timp posibil evitarea deshidratrii !Procedurile invazive trebuie aplicate cnd este cazul, n favoarea pacientului bronhoscopie, lavaj alveolar, cateterizare, biopsie, aspiraieProcesarea prelevatelor imediat dup recepia n laborator (cele umede)EXAMENUL MICROSCOPIC DIRECTScuame, fragmente unghiale: calcofluor, KOHFire de pr:n cazul firelor de pr, se pot observa hife i artrospori rezultai prin fragmentarea hifelor. Localizarea acestor elemente dermatofitice care invadeaz tija pilar, ofer indicii privind etiologia afeciunii3 tipuri de parazitare: endo-ectotrix, endotrix i favictipul endo-ectotrix-artrosporii rezultai n urma fragmentrii filamentelor miceliene apar att n interiorul, ct i la exteriorul firului de pr; deosebim subtipuri de parazitare, n funcie de diametrul i numrul sporilor:- subtipul microsporic(spori cu diametrul de cca. 2m, extrem de numeroi, formnd un manon compact i bine evideniat n jurul tijei pilare -ntlnit la M. audouinii, M. canis, rar la M. ferrugineum); -subtipul microid (spori cu diametrul de cca. 2m, formnd un manon mai puin dens; ntlnit la T. erinaceii T. mentagrophytes); -subtipul megasporic(spori mai mari n diametru, msurnd cca. 4-5 m i formnd un manon nentrerupt; ntlnit la T. equinumi T. verrucosum).tipul endotrix, la care artrosporii rezultai prin segmentarea filamentelor miceliene din interiorul tijei pilare, vor determina fragmentarea firului de pr; n aceste fragmente de mici dimensiuni sunt observabili la microscop numeroi spori de form rotund care nlocuiesc practic medulara pilar. Acest mod de parazitare se ntlnete la T. tonsurans, T. Violaceum i T. Soudanensetipul favic, la care filamentele miceliene intrapilare sunt numeroase i formeaz adevrate galerii n interiorul firului de pr, galerii ce devin vizibile microscopic sub forma unor benzi de culoare brun, cu traiect rectiliniu, uneori cu ramificare dicotomic; se ntlnete la T. schoenleinii.Aspergillusfilamente5-10 umseptate, dichotomicramificateMEDII DE CULTIVAREMedii neselective: Suport creterea majoritii speciilor fungice i bacteriene contaminante i patogene: Sabouraud Dextrose Agar; Potato Dextrose agar; Brain Heart Infusion agar; Cornmeal agarMedii selective: Conin antibiotice selective pentru inhibarea dezvoltrii contaminanilor bacterieni sau fungici: Brain Heart Infusion cu cloramfenicol i gentamicin, Agar Mycobiotic sau Mycosel (cicloheximid)Medii difereniale: Includ suplimente de cretere sau reageni ce permit mbuntirea dezvoltrii anumitor fungi sau detecteaz unii produi metabolici: Trichophyton Agars, Niger seed agar, Mediul Christensen (testarea ureazei), mediile cromogene (ChromAgar Candida, Candiselect4, Chromogenic Candida Agar)SABOURAUD DEXTROSE AGAR AVANTAJEA sporulare mbuntitB permite creterea majoritii fungilor DEZAVANTAJEA -dezvoltarea contaminanilor bacterieniB -dezvoltarea contaminanilor fungiciC -cretere slab a unor fungi pretenioi metabolicCORNMEAL AGAR (Agar cu fin de porumb) AVANTAJEApermite o bun difereniere a levurilorB accentueaz producia de pigment DEZAVANTAJEA creterea contaminanilor bacterieniB creterea contaminanilor fungiciBHI cu antibiotice (Infuzie cord-creier cu antibiotice) AVANTAJEA inhib creterea contaminanilor fungici i bacterieniB permite dezvoltarea fazei filamentoase la fungii dimorfici DEZAVANTAJEA -inhib Nocardia asteroidesB inhib unele tulpini de Cryptococcus neoformansC inhibit faza levuric a fungilor dimorficiPDA (Agar cu extract de cartof glucozat) AVANTAJEA permite o bun dezvoltare pentru majoritatea fungilorB mbuntete sporularea DEZAVANTAJEA nu inhib dezvoltarea bacteriilorB nerecomandat ca mediu de izolareAditivi pentru mediile de izolare a fungilorGentamicin ( 50 g/ml) + cloramphenicol (50 g/ml)Ciprofloxacin (5 g/ml)Cycloheximid (0.5 mg/ml)Snge defibrinat de berbec (10%)Utilizarea cycloheximideiPrevine mascarea fungilor cu cretere lent de ctre coloniile speciilor cu dezvoltare rapidInhib dezvoltarea unor specii cunoscute ca patogenePermite izolarea speciilor de fungi dimorfici cu cretere lentObligatoriu se va folosi n paralel i un mediu fr cycloheximidCycloheximida---Fungi inhibai:Aspergillus fumigatusCryptococcus neoformansPseudallescheria boydiiCandida kruseiTrichosporon speciesUtilizarea plcilor PetriSuprafa larg pentru izolarea coloniilorAerarea culturilor este mbuntitFaciliteaz pregtirea preparatelor microscopiceContaminare destul de frecventMai puin sigur de manipulat n laboratorDeshidratare frecvent dac grosimea mediului nu este adecvatUtilizarea eprubetelor pentru cultivareDeshidratare redus ??Suprafa redus pt izolarea coloniilor individualeDac dopul este fest, culturi neviableManipulare mai sigur n laboratorMai dificil de pregtit preparatele din culturiIncubarea culturilor:30C este optim i recomandat Umiditatea relativ trebuie s fie mare 30-40 ml mediu per plac Protecie cu parafilm Tuburile trebuie meninute orizontal 30-45 minColorani pentru preparatele microscopice:Lactophenolcotton blueLactophenolaniline blueTehnici de examinare microscopic a fungilor din culturi:Examenul microscopic al fragmentelor de colonii fungice urmrete:-Aspectul hifelor septate sau nu-aspectul miceliului difuz, gros, colorat, incolor-Prezena i tipul sporilor sexuai zigospori, ascospori-Prezena corpilor fructificani asexuai (tipul i aspectul sistemului sporal, aranjarea (mbinarea) conidioforilor i a sporangioforilor, forma, culoarea, mrimea i eventuala septare a sporului)-prezena i tipul unor structuri particulare: rizoizi, stoloni, scleroi.

Tehnici folosite pentru studiul morfologiei microscopice a fungilor obinui n urma nsmnrii prelevatelor :-Levuri frotiuri (colorate Gram, cu albastru de metilen, etc) sau preparate extemporanee ntre lam i lamel cu tu de India sau lactofenol i albastru de anilin-Fungi filamentoi -preparate extemporanee cu lactofenol i albastru de anilin, preparate cu band adeziv sau preparate obinute prin cultivarea pe lam

Preparatul extemporaneu cu lactofenol i albastru de anilin (levuri)-Este o metod rar utilizat pentru studierea morfologiei levurilor-Este expeditiv-Se examineaz la microscop x10, x20, x40, x100-se pune o cantitate redus, astfel nct densitatea suspensiei obinute s fie mic-Se preleveaz cu ajutorul unui ac sau a unei microspatule un fragment de dimensiuni milimetrice din colonia de examinat-Se etaleaz n pictura de lactofenol de pe lam i se dilacereaz cu micri fine miceliul, utiliznd 2 ace-se acoper cu o lamel curat, se nclzete uor la flacr pentru a obine un film ct mai fin de lactofenol i eliminarea bulelor de gaz-se examineaz la microscop la x10, x20, x40, x100

Preparatul extemporaneu cu band adeziv-Se prelev structurile fungice de la nivelul coloniilor cu ajutorul unui fragment de band adeziv transparent (tip scotch), cu care se amprenteaz marginea coloniei-fragmentul de band adeziv se lipete pe o lam cu o pictur de lactofenolPentru coloniile care sporuleaz intens (Aspergillus spp., Penicilium spp., etc) se recomand pregtirea a 2-3 preparate cu banda adeziv din acelai loc: prima va fixa sporii, iar urmtoarele vor recolta conidioforii (se surprind toate aspectele utile ncadrrii taxonomice).

Lutarea preparatelor extemporanee-Este necesar pentru a evita evaporarea lichidului de montare-suprafeele lamei i lamelei pe care se aplic substanele de etanare, trebuie s fie perfect uscate i curate-Substanele folosite la etanare nu trebuie s reacioneze cu lichidul de montare, s fie impermeabile, elastice, persistente i s adere de suprafaa sticlei-acestea sunt: -rinile naturale (colofoniul, guma arabic, erlacul, balsamul de Canada), lacul pentru unghii, Cimentul Thorner (Glyceel), amestecul de cear galben de albine i colofoniu, amestecul de colofoniu i lanolin (60% respectiv 40%)

Identificarea fungilor filamentoiFungi hialini septaihife septate, uneori pigmentate in vitro, niciodat in vivonmulire asexuat prin spori externi CONIDIIConidiile sunt produse la nivelul unor hife specializate, cu morfologie particular CORPI FRUCTIFICANI sau CONIDIOFORICelulele productoare de conidii FIALIDE------Preparatul cu band adeziv (tip scotch)------Preparatul cu band adeziv (varianta modificat)Aspergillus:Morfostructural, fungii acestui gen se caracterizeaz prin prezena unor formaiuni de fructificare cu aspect particular, cunoscute sub denumirea de capete aspergilareConidioforii sunt lungi i se termin cu o vezicul de diferite formePe vezicul se prind unul sau dou rnduri de celule conidiogene alungiten funcie de numrul rndurilor de celule conidiogene, capetele aspergilare pot fi uniseriate (un singur rnd de celule conidiogene fialidele) sau biseriate (dou rnduri de celule conidiogene metule + fialide).Speciile genului Aspergillus pot fi uniseriate (prezint doar capete aspergilare uniseriate), uni-biseriate (prezint n aceeai cultur att capete aspergilare uniseriate, ct i biseriate) sau biseriate (prezint doar capete aspergilare biseriate).Aceste fialide produc i elibereaz prin strangulare- conidiile dispuse sub form de lanuriSpecii uniseriate de interes medicalA. clavatus, A. glaucus, A. restrictus, A. fumigatusSpecii uni-biseriate de interes medicalA. niger, A. candidus, A. ochraceus, A. flavusSpecii biseriate de interes medicalA. versicolor, A. nidulans,A. ustus, A. Terreus

Fusariumpeste 100 specii de fungi fitopatogeni sau saprobioi n sol.Coloniile au cretere rapid, atingnd un diametru de peste 7 cm n 10 zile (PDA).Textura coloniilor este lnoas, iar culoarea aversului i reversului variaz n limite largi: alb, roz, crem, galben, purpurie, roie, brun, albastr sau albastr-verzuie.Microscopic se observ hife hialine, septate, care dau natere din loc n loc unor conidiofori aciculari, terminai cu fialide productoare de conidii.Conidiile sunt de dou tipuri: macroconidiilungi, cu 2-5 septe, fusiforme sau curbate sub form de pstaiei microconidiiscurte, uni-sau bicelulare, elipsoidale, sferice, clavate sau reniforme, dispuse n grmezi (solidarizate ntr-o mas gelatinoas) sau lanuri scurte.

Paecilomycesaproximativ 40 specii de fungi saprobioi n mediul ambiant, pe substraturi vegetale n descompunere.Unele dintre acestea (P. javanicus, P. lilacinus, P. marquandii, P. variotii) au fost ocazional semnalate n infecii la om, n general la pacieni imunocompromii.Unele specii sunt termotolerante dezvoltndu-se la 37C (P. lilacinus) , 40C (P. Variotii) sau termofile (P. crustaceus), la 45C.Coloniile au aspect catifelat sau pulverulent, cretere rapid, culoare alb, orange-pal, crem, roz, violet-deschis sau galben-brun.Celulele conidiogene (fialidele) iau natere la nivelul unor conidiofori ramificai sau nu, cu lungime variabil n funcie de specie (50-600 m). Ele sunt alungite, dilatate la baz i se ngusteaz treptat spre apexConidiile sunt unicelulare, hialine sau uor pigmentate, netede sau echinulate, au diverse forme (ovoidale, fusiforme, cilindrice) i sunt dispuse sub form de lanuri divergente.Ca i la Penicillium, conidioforii se ramific sub form de verticil (emergena elementelor de fructificare a fialidelor, de la acelai nivel al axului care le poart (similar unui penson)

PenicilliumPeste 700 de specii ubicuitare, al cror habitat este reprezentat de sol. De aici, ele contamineaz aerul, apa i implicit suprafeele din diverse ncperi.Majoritatea au abilitatea de a se dezvolta pe substraturi nutritive vegetale pe care le degradeaz sau crora le induc un anumit grad de toxicitate prin elaborarea micotoxinelor.Coloniile sunt uor de recunoscut: cretere rapid ( ajung la maturitate n cteva 5-7 zile), culoare alb la nceput, apoi verzuie, albastr-verzuie, rar gri sau roiatic, aspect catifelat, pufos sau granularColoniile unor specii pot produce un pigment de culoare glbuie, purpurie sau roie-brun, difuzibil n mediuMicroscopic, se remarc conidioforii neramificai sau ramificai sub form de verticil, avnd un rnd de fialide plasat terminal.Fialidele dau natere unor lanuri de conidii unicelulare, sferice, elipsoidale, fusiforme sau cilindrice, n general hialine, de 2-4 m diametru.Acest ansamblu structural format din conidioforul ramificat sau nu, fialide i lanurile de conidii poart numele de penicil.Penicilul poate fi monoverticilat, biverticilat sau terverticilat, in functie de gradul de ramificare al conidioforului.ScopulariopsisColoniile se dezvolt rapid pe medii uzuale ,au aspect catifelat sau pulverulent, iar culoarea variaz n funcie de specie, de la alb, crem, cafeniu, lamaro-sepia, brun sau chiar negru.Microscopic, celule conidiogene cu baza dilatat, grupate adeseori cte 2-4 i conidii produse n lanuri (conidiogenez de tip anelidic) ,de form sub sferic, ovoidal, cu baza truncat,hialine sau pigmentate n brun-deschis.

Diagnosticul infeciilor produse de dermatofiiStadiile imperfecte(asexuate)ale dermatofiilor, numite i forme anamorfe, sunt grupate n 3 genuri Epidermophyton, Microsporum i Trichophyton, n timp ce stadiile perfecte (sexuate) cunoscute i ca forme teleomorfe, sunt incluse n genul Arthroderma.

Micozele sau infectiile fungice

Aspectele clinice ale dermatofitozelorPolimorfeDiversitatea speciilor afectate si a localizarilorColectarea probelorPrelevare probe: raclarese evit pe ct posibil utilizarea tampoanelorTehnicile aseptice n obinerea tuturor probelor (decontaminarea zonelor adiacente de piele sau mucoas) nu sunt recomandate pentru dermatofiiTrimiterea prelevatelor ctre laborator n cel mai scurt timp posibilevitarea deshidratrii!Procesarea prelevatelor imediat dup recepia n laborator (cele umede)Lumina Woods -+ doar pentru M. Canis 50%

Incubarea culturilor:30C este optim i recomandatUmiditatea relativ trebuie s fie mare30-40 ml mediu per placProtecie cu parafilmTuburile trebuie meninute orizontal 30-45 min

Medii de cultur specifice dermatofiilor:DermatophyteTest Medium(DTM) reprezintun mediu solid selectiv utilizat n micologia medical.Are ca baz agar Sabouraud dextroz cu adaos de cicloheximid pentru a inhiba contaminanii saprofii, antibiotice pentru inhibarea bacteriilor i un indicator de pH, rou fenol.Indicatorul de pH este util n identificarea fungilor dermatofii, care utilizeaz nitrogenul din substrat pentru metabolismul propriu, rezultnd produi alcalini i determinnd modificarea culorii mediului n rou.Fungii tipici saprofii utilizeaz carbohidraii din mediu rezultnd produi acizi, fr modificarea culorii mediului.D.T.M. agar baz ajut la izolarea i identificarea timpurie a membrilor din speciile Microsporum i Trichophyton prin schimbarea culorii mediului n rou (ATENIE LA REZULTATE FALS POZITIVE!!!!).Speciile cu cretere rapid pot modifica complet culoarea mediului, n interval de 3 zile, n timp ce speciile cu cretere lent vor avea nevoie de mai mult timp pentru a modifica culoarea.Unii saprofii, levuri i bacterii pot schimba n rou culoarea mediului,dar pot fi uor deosebii prin caracteristicile de morfologie cultural.Clasificarea complet a dermatofiilor depinde de observaiile microscopice coroborate cu testele biochimice i serologice.Mycobiotic Agar este un excelent mediu baz la care se adaug ageni antifungici, cicloheximid i cloramfenicol pentru a se studia efectul acestora pe fungi. Acest mediu se dovedete util n izolarea dermatofiilor i a altor fungi patogeni din specimene clinice.Microsporum canisyorkshire terrier prezinta sensibilitate crescuta (foarte greu de tratat, uneori imposibil!!!)

EXAMENUL MICROSCOPIC DIRECTFire de prn cazul firelor de pr, se pot observa hife i artrosporirezultai prin fragmentarea hifelor. Localizarea acestor elemente dermatofiticecare invadeaz tija pilar, ofer indicii privind etiologia afeciunii3 tipuri de parazitare: endo-ectotrix, endotrix i favic tipul endo-ectotrix - artrosporii rezultai n urma fragmentrii filamentelor miceliene apar att n interiorul, ct i la exteriorul firului de pr; deosebim subtipuri de parazitare, n funcie de diametrul i numrul sporilor: subtipul microsporic (spori cu diametrul de cca. 2m, extrem de numeroi, formnd un manon compact i bine evideniat n jurul tijei pilare - ntlnit la M. audouinii, M. canis, rar la M. ferrugineum); subtipul microid (spori cu diametrul de cca. 2m, formnd un manon mai puin dens; ntlnit la T. erinacei i T. mentagrophytes); subtipul megasporic (spori mai mari n diametru, msurnd cca. 4-5 m i formnd un manon nentrerupt; ntlnit la T. equinum i T. verrucosum).

Microsporum canisAspectul microscopicSunt prezente hife septate, macroconidii i microconidii;Macroconidiile sunt numeroase, cu aspect de fus cu o poriune recurbat la apex, cu un perete celular gros, coninnd de la 6 la 15 celule;Microconidiile sunt unicelulare, cu aspect piriform i rar prezente.Aspectul macroscopicRata de cretere este rapid iar coloniile sunt plate uor reliefate, textura este de la fin la lnoas iar diametrul variaz de la 3 la 9 cm dup incubare pe Sabourauddextroz agar timp de 7 zile la 25C;Culoarea coloniilor de la suprafa este alb, glbuie iar reversul variaz de la galben la galben-orange,ocazional pal.

Microsporum gypseumReprezint un agent cauzal ocazional, localizat la nivelul scalpului sau pielii glabraten infeciile la om.Firele de pr afectate nu prezint fluorescen atunci cnd sunt examinate cu lampa Wood.O varietate mare de animale pot fi infectate sau pot servi ca vectori ai fungului.Morfologia microscopic a Microsporumgypseum:acesta prezint macroconidii abundente, simetrice, elipsoide, cu perete subire i separate n 4-6 celule.Aspect microscopicHife septate, macroconidii i microconidii prezente;Macroconidiile sunt abundente, elipsoide pn la fuziforme i simetrice ca form, rotunjite la capete, cu peretele subire, coninnd 3-6 celuleMicroconidiile sunt moderate ca numr, localizate lng hife i sunt sub form de bt de baseball.Cultura de Microsporum gypseum pe mediu mycobiotic are aspect plat, granular, cu o culoare deschisa de scorioar. Rata de cretere este rapid iar textura coloniilor variaz de la pudrat la granular, iar culoarea este bej sau maro scorioar, iar reversul este galben sau brun-rocat.Trichophyton mentagrophytes aspecte clinice la omPrincipalele rezervoare naturale ale varietilor ce afecteaz omul, sunt anumite mamifere mici, cum ar fi roztoarele, aricii i iepurii, dei numeroase alte specii de animale pot fi infectate.Cnd infecteaz oamenii, izolatele ce provin de la animale, precum speciile deT. mentagrophytesvar. mentagrophytes,sunt frecvent asociate cu leziuni inflamatorii ale scalpului, pielii glabrate, a unghiilor i zona brbii.Aspecte microscopiceSe pot gsi frecvent hife spiralate;Microconidiile sunt de la rotunde la piriforme, unicelulare, apar grupate sau pe lng hife nedifereniate, numeroase de cele mai multe ori, mai rare n preparatele provenite din probele de la om;Macroconidiile sunt de cele mai multe ori absente, dar dac sunt prezente, au pereii netezi i subiri, sub form de bt de baseball, multi-septatei solitare.Aspecte macroscopiceRata de cretere este moderat rapid iar textura izolatelor clinice de la om sunt fine spre pulverulente n timp ce izolatele clinice de la animale sunt granulare; culoarea coloniei este alb spre roz, iar reversul este galben, maro sau brun-rocat.