daftar pustaka -...

48

DAFTAR PUSTAKA

1. Abbas K A, Lichtmant A H. Basic Immunology Fourth Edition.

Philadelphia: Elsevier; 2012. h.15-20.

2. Kresno S B. Imunologi Diagnosis dan Prosedur Laboratorium. Jakarta:

Badan Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia; 2010.

3. Baratawidjaya K G. Imunologi Dasar Edisi ke-10. Jakarta: Badan Penerbit

Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia; 2012.

4. Rich Robert. Clinical Immunology Fourth Edition. USA: Elsevier; 2013.

h.114-18.

5. Dharmana Edi, Neni Susilaningsih, Noor Wijayahadi. Pengaruh

Pemberian Tolak Angin Anak Terhadap Proliferasi Limfosit, produksi

Interferon, Fungsi Fagositosis Makrofag Dan Produksi ROI. Semarang:

Universitas Diponegoro dan PT Sido Muncul; 2009.

6. Hariwangsa N T. Pengaruh Pemberian Tolak Angin Anak Cair Terhadap

Kadar Interferon Gamma (IFN-γ) Pada Mencit Swiss. Semarang:

Universitas Diponegoro; 2010.

7. Wahab A S, Madarina Julia. Sistem Imun, Imunisasi, dan Penyakit Imun.

Jakarta: Penerbit Widya Medika; 2002. h.13

8. Abbas K A, Lichtmant A H, Pillai S. Cellular and Molecular Immunologi.

Seventh ed. Philadelphia : W B Saunders Company; 2012.

9. Peakman Mark, Vergani Diego. Basic and Clinical Immunology Second

Edition. USA: Elsevier; 2009. h.77-81.

10. Baratawidjaja K G, Iris Rengganis. Alergi Dasar Edisi ke-1. Jakarta:

Interna Publishing; 2009.

49

11. Paul, William. Fundamental Immunology SSeventh Edition. Philadelphia:

Lippincott Williams and Wilkins; 2013. 602-04.


208-09.


216.

14. Tolak Angin-Tolak Angin Anak. Obat Herbal Terstandard Tolak Angin.

[Internet]. [cited 2016 Jan 21]. Available from:

http://xa.yimg.com/kq/groups/78262509/931225350/name/TA-TAA-

SARI.pdf

15. Kohei Kamiya, Toshiko Satake. Chemical constituents of Baeckea

frutescens leaves inhibit copper-induced low-density lipoprotein oxidation.

Fitoterapia [Internet]. 2009. [cited 2015 Nov 12]. Available from:

sciencedirect.com

16. Sunarti, Siti. Jungrahab (Baeckea frustescens L.). Satu-satunya Tumbuhan

Obat dari Marga Baeckea di Indonesia dan Koleksinya di Herbarium

Bogoriense; 2011.

17. Kamiya, Kohei. Chemical Constituents of Baeckea frustescens Leaves

Inhibit Copper-induced low-density Lipoprotein Oxidation [Internet].

2009. [cited 2015 Nov 14]. 8(10): 185-189. Available from:

www.elsevier.com/locate/foodchem

18. Jia, Bei-Xi. Baeckeins F-I, Four Novel C-methylated Biflavonoids from

the Roots of Baeckea frutescens and Their Anti-inflamatory Activities

[Internet]. 2014. [cited 2015 Nov 14]. 155(14): 31-37. Available from:

www.ellsevier.com/locate/foodchem

19. Dai, Do N. Chemical Composition of Essential Oil of Baeckea frutuescens

L. [Internet]. 2015. [cited 2015 Nov 14]. 8(1): 26-32. Available from:

www.sciencedomain.org

http://xa.yimg.com/kq/groups/78262509/931225350/name/TA-TAA-SARI.pdf

http://xa.yimg.com/kq/groups/78262509/931225350/name/TA-TAA-SARI.pdf

50

20. Baliga, M. S. Radioprotective potential of mint: A brief review. J Cancer

Res Ther [Internet]. 2010. [cited 2015 Nov 12]. 6(3): pp 255-62.

21. Departemen Farmakologi dan Terapeutik Fakultas Kedokteran Universitas

Indonesia. Farmakologi dan Terapeutik. Edisi 5. Jakarta: Balai Penerbit.

Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia; 2010.

51

Lampiran 1.

PROSEDUR ISOLASI MAKROFAG PERITONEAL MENCIT

(dikutip dari Lewis JG, 1995)

Untuk mendapatkan 1-3 x 106 sel/ml

Alat :

1. Gunting dan pinset

2. Semprit 10 ml steril dengan jarum ukuran 18 atau 20 gauge

3. Tabung sentrifus 50 ml steril

4. Pipet Pasteur steril

5. Tabung berlapis silikon

6. Hemacytometer

7. Laminar flow hood

8. Refrigerated centrifuge

Bahan / reagen :

1. Sodium pentobarbitol, 50 mg/ml

2. Ethanol, 70% (v/v)

3. Free Hank’s balanced salt solution (CMF-HBSS), mengandung Ca2+

dan

Mg2+

(GIBCO)

4. Asam acetat 3 % (v/v) + crystal violet 1 mg/100 ml

5. Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 (GIBCO)

52

6. Fetal Bovine Serum, FBS

7. Glutamin (GIBCO)

8. Penicillin-Streptomycin (GIBCO)

Prosedur :

1. Mencit dibunuh dengan dislokasi leher atau inhalasi dengan sodium

pentobarbitol atau CO2, dibaringkan telentang dan seluruh permukaan

ventral disiram ethanol 70%

2. Buat irisan kecil pada kulit menggunakan gunting pada medial abdomen.

Robek kulit menggunakan 2 pinset kearah kepala dan ekor mencit, sehingga

kulit terkelupas, dan tampak peritoneum. Basahi peritoneum dengan ethanol

70% untuk menyingkirkan bulu- bulu yang rontok

3. Injeksikan 2-3 ml CMF-HBSS dalam rongga peritoneum menggunakan

semprit 10ml dengan jarum no. 18 atau 20 (lebih baik pakai no 26). Injeksi

dilakukan di bagian perut bawah dimana lemak berada di sekitar kandung

kemih. Lokasi ini dipilih karena setelah penyuntikan jarum akan ditarik dan

abdomen/peritoneum dipijat, lemak akan melekat pada lubang jarum

sehingga cairan tidak keluar selama pemijatan. Peritoneum dipijat pelan

kemudian disemprot lagi dengan ethanol 70%

4. Injeksikan 7-8 ml HBSS. Sedot kembali cairan dalam rongga peritoneum

sampai habis (dengan jarum 18/ 20 ujung jarum menghadap ke atas/ventral),

bila masih ada sisa cairan dihisap menggunakan pipet Pasteur steril.

Masukkan cairan ke dalam tabung sentrifuse steril

5. Cairan disentrifus 800 xg pada suhu 20o C selama 5 menit. Bila cairan

terkontaminasi darah, maka cuci sel- sel tersebut 2 kali menggunakan CMF-

HBSS

53

6. Tambahkan medium komplit yang terdiri dari RPMI 1640 mengandung

penicillin (50 U/ml), streptomycin (50μg/ml), glutamine (20mM) dan 10%

FBS

7. Setelah itu cairan peritonium diambil sebagian dimasukkan ke dalam

tolliven blue. Hitung sel- sel dengan Hemacytometer setelah dilarutkan

dalam 3% asam acetat untuk melisiskan sel darah merah

8. Kultur sel dalam medium komplit dengan kepadatan 5 x 105 sel/ml selama 2

jam dalam CO2 inkubator pada suhu 37o C

9. Cuci sel- sel tersebut dengan HBSS sebanyak 3 kali, kemudian tambahkan 1

ml medium komplit untuk selanjutnya dikultur dalam CO2 inkubator pada

suhu 37o C selama 24 jam

Modifikasi dari Lewis JG. Isolation of Alveolar Macrophages, Peritoneal

Macrophages, and Kupffer cells. In : Methods in Immunotoxicology vol 2, editor

: Burleson GR, Dean JH, Munson AE. New York: A John Wilye Liss & sons Inc

Publ, 1995;15-26

54

Lampiran 2. Prosedur Isolasi Splenosit

PROSEDUR ISOLASI SPLENOSIT

(Metode Mishell (1980) dan Ding (1994)

Untuk mendapatkan 5 x 107 – 2 x 10

8 sel/ mencit

Alat :

1. Pemanas alkohol

2. Beaker glass volume 50 – 75 ml

3. Gunting

4. Pinset

5. Petri dishes plastik

6. Refrigerated centrifuge

7. Pipet Pasteur

8. Laminar flow hood

9. Spuit disposable 5 cc

Bahan :

1. Sodium pentobarbitol, 50 mg/ml

2. Ethanol, 70% (v/v)

3. Free Hank’s balanced salt solution (CMF-HBSS), mengandung Ca2+

dan

Mg2+

(GIBCO)

4. Lysing buffer (NH4Cl 0,17 M)

5. Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 (GIBCO)

55

6. Fetal Bovine Serum, FBS

7. Glutamin (GIBCO)

8. Penicillin-Streptomycin (GIBCO)

Prosedur :

1. Mencit dibunuh dengan dislokasi leher atau inhalasi dengan sodium

pentobarbital, dibaringkan telentang dan seluruh permukaan ventral

disiram ethanol 70%.

2. Buat irisan kecil pada kulit menggunakan gunting pada medial abdomen.

Robek kulit menggunakan 2 pinset kearah kepala dan ekor mencit,

sehingga kulit terkelupas, dan tampak peritoneum. Basahi peritoneum

dengan ethanol 70% untuk menyingkirkan bulu- bulu yang rontok.

3. Rendam gunting dan pinset dalam ethanol 95%. Gunting peritoneum

dengan irisan berbentuk huruf U mengelilingi limpa. Peritoneum dilipat ke

atas, angkat limpa dengan menggunakan pinset. Pisahkan limpa dari

pembuluh darah dan jaringan sekitarnya menggunakan gunting. Letakkan

limpa pada petri dish berisi 1,5 ml HBSS.

4. Semprotkan media menggunakan spuit ke dalam limpa sampai semua sel

keluar.

5. Dengan menggunakan pipet Pasteur, pindahkan suspense sel tabung

pemusing. Biarkan sel- sel yang menggumpal mengendap selama 5 atau 6

menit.

56

6. Pindahkan suspense sel ke tabung yang lain dan pusingkan sel pada

kecepatan 200 xg selama 10 menit pada suhu 4oC. Pellet yang didapat

diresuspensikan dalam 2 ml lysing buffer pada suhu ruang (25oC) dikocok-

kocok untuk melisiskan eritrosit, lalu pusingkan pada kecepatan 200 xg

selama 10 menit pada suhu 4oC.

7. Buang supernatant dan pellet dicuci 2x dengan RPMI dengan cara dipipet

berulang- ulang dan dipusingkan pada kecepatan 200 xg selama 10 menit

pada suhu 4oC.

8. Hitung sel- sel menggunakan hematocytometer.

9. Untuk keperluan pemeriksaan sitokin (mis : IFN–γ), kultur sel dengan

kepadatan 3 x 106 sel/ml dalam medium komplit yang terdiri dari RPMI

1640 mengandung penisilin (50 U/ml), streptomycin (50 µg/ml),

glutamine (1 mM) dan 10 % FBS selama 72 jam dalam CO2 inkubator

pada suhu 37oC.

57

Lampiran 4. Prosedur Pemeriksaan TNF-

PROSEDUR PEMERIKSAAN TNF-

Reagen (kit) yang tersedia :

1. Microwell plate berlapis Ab monoklonal spesifik terhadap TNF- mencit

2. Biotin-Conjugate

3. Streptavidin-HRP

4. Mouse TNF- standard lyophilized

5. Calibrator diluent

6. Sample diluent

7. Assay buffer

8. Wash buffer

9. Substrate Solution

10. Stop Solution

11. Adhesive films

Alat dan bahan tambahan yang dibutuhkan :

1. Micropipet

2. Distilled water

3. ELISA reader

4. Tube eppendorf

Persipan reagen :

1. Pembuatan standard dilution :

58

- Siapkan tube 7 buah (S1-S7).

- Tambahkan 100 μl sample diluent ke dalam masing-masing tube.

- Tambahkan 100 μl mouse TNF- standard ke dalam tube S1.

- Lakukan pengenceran bertingkat.

2. Pengenceran wash buffer : 50 ml wash buffer diencerkan dalam 950 ml

distilled water.

3. Pengenceran Assay buffer : 5 ml assay buffer diencerkan dalam 95 ml

distilled water.

4. Pengenceran Biotin-conjugate : 0,06 ml biotin-conjugate diencerkan dalam

5,94 ml assay buffer.

5. Pengenceran Streptavidin-HRP : 0,06 ml Streptavidin-HRP dalam 5,94 ml

Assay buffer.

Persiapan sampel :

Sampel berupa supernatant yang berasal dari kultur splenosit selama 72 jam.

Prosedur pemeriksaan :

1. Tentukan jumlah microwell strips yang dibutuhkan.

2. Cuci microwell strips 2 kali dengan wash buffer.

3. Tambahkan 100 μl standard dilution ke dalam standard well.

4. Tambahkan 100 μl sample diluent ke dalam blank well.

5. Tambahkan 50 μl sample diluent ke dalam sample well.

6. Tambahkan 50 μl sample A, B, C ke dalam sample well.

7. Siapkan biotin-conjugate.

59

8. Tambahkan 50 μl biotin-conjugate ke semua well.

9. Tutup microwell strips dan inkubasi 2 jam pada suhu ruangan (18-25o C).

10. Siapkan Streptavidin-HRP.

11. Kosongkan dan cuci microwell strips 3 kali dengan wash buffer.

12. Tambahkan 100 μl streptavidin-HRP ke semua well.



15. Tambahkan 100 μl substrate solution ke semua well.

16. Inkubasi selama 10 menit pada suhu ruangan (18-25o C).

17. Tambahkan 100 μl stop solution ke semua well.

18. Baca dengan ELISA reader pada 450 nm.

60

Lampiran 4. Prosedur Pemeriksaan IFN-γ

PROSEDUR PEMERIKSAAN IFN-γ

Reagen (kit) yang tersedia :

12. Microwell plate berlapis Ab monoklonal spesifik terhadap IFN- γ mencit

13. Biotin-Conjugate

14. Streptavidin-HRP

15. Mouse IFN- γ standard lyophilized

16. Sample diluent

17. Assay buffer

18. Wash buffer

19. Substrate Solution

20. Stop Solution

21. Pewarna (blue-dye, green-dye, red-dye)

22. Adhesive films

Alat dan bahan tambahan yang dibutuhkan :

5. Micropipet

6. Distilled water

7. ELISA reader

8. Tube eppendorf

Persipan reagen :

6. Pembuatan standard dilution :

61

- Siapkan tube 7 buah (S1-S7).

- Tambahkan 100 μl sample diluent ke dalam masing-masing tube.

- Tambahkan 100 μl mouse IFN- γ standard ke dalam tube S1.

- Lakukan pengenceran bertingkat.

7. Pengenceran wash buffer : 50 ml wash buffer diencerkan dalam 950 ml

distilled water.

8. Pengenceran Assay buffer : 5 ml assay buffer diencerkan dalam 95 ml

distilled water.

9. Pengenceran Biotin-conjugate : 0,06 ml biotin-conjugate diencerkan dalam

5,94 ml assay buffer.

10. Pengenceran Streptavidin-HRP : 0,06 ml Streptavidin-HRP dalam 5,94 ml

Assay buffer.

Persiapan sampel :

Sampel berupa supernatant yang berasal dari kultur splenosit selama 72 jam.

Prosedur pemeriksaan :

19. Tentukan jumlah microwell strips yang dibutuhkan.

20. Cuci microwell strips 2 kali dengan wash buffer.

21. Tambahkan 100 μl standard dilution ke dalam standard well.

22. Tambahkan 100 μl sample diluent ke dalam blank well.

23. Tambahkan 50 μl sample diluent ke dalam sample well.

24. Tambahkan 50 μl sample A, B, C ke dalam sample well.

25. Siapkan biotin-conjugate.

62

26. Tambahkan 50 μl biotin-conjugate ke semua well.


28. Siapkan Streptavidin-HRP.


30. Tambahkan 100 μl streptavidin-HRP ke semua well.



33. Tambahkan 100 μl substrate solution ke semua well.

34. Inkubasi selama 10 menit pada suhu ruangan (18-25o C).

35. Tambahkan 100 μl stop solution ke semua well.

36. Baca dengan ELISA reader pada 450 nm.

64

HASIL OUTPUT ANALISIS DATA

Explore

IFN-

Kelompok

Case Summaries

IFN-gamma

6 368.9276 399.11185 202.6730 7.46 948.92

6 214.3011 141.75122 196.2375 52.10 389.74

6 46.9091 53.66405 25.2300 8.14 148.51

18 210.0460 268.17118 95.0863 7.46 948.92

Kelompok

P1

P2

P3

Total

N Mean Std. Deviation Median Minimum Maximum

Tests of Normality

.845 6 .144

.912 6 .450

.781 6 .040

Kelompok

P1

P2

P3

IFN-gamma

Statistic df Sig.

Shapiro-Wilk

Lilliefors Significance Correctiona.

65

IFN-gamma

Tests of Normality

.923 6 .528

.925 6 .541

.958 6 .807

Kelompok

P1

P2

P3

Log10IFN_gamma

Statistic df Sig.

Shapiro-Wilk


Test of Homogeneity of Variances

IFN-gamma

12.074 2 15 .001

Levene

Statistic df1 df2 Sig.


Log10IFN_gamma

1.781 2 15 .202

Levene


66

Oneway

Explore

TNF-

Kelompok

ANOVA

Log10IFN_gamma

2.294 2 1.147 3.575 .054

4.813 15 .321

7.108 17

Between Groups

Within Groups

Total

Sum of

Squares df Mean Square F Sig.

Case Summaries

TNF-alfa

5 17.2586 11.37048 16.3340 .62 28.33

5 258.9940 90.72331 230.1100 186.65 417.01

5 1828.8900 213.13784 1864.2000 1467.00 2007.60

15 701.7142 840.50073 230.1100 .62 2007.60

Kelompok

P1

P2

P3

Total

N Mean Std. Deviation Median Minimum Maximum

Tests of Normality

.915 5 .501

.766 5 .041

.825 5 .127

Kelompok

P1

P2

P3

TNF-alfa

Statistic df Sig.

Shapiro-Wilk


67

TNF-alfa

Tests of Normality

.722 5 .016

.838 5 .160

.798 5 .078

Kelompok

P1

P2

P3

Log10TNF_alfa

Statistic df Sig.

Shapiro-Wilk



TNF-alfa

3.133 2 12 .080

Levene


68

NPar Tests

Kruskal-Wallis Test

Ranks

5 3.00

5 8.00

5 13.00

15

Kelompok

P1

P2

P3

Total

TNF-alfa

N Mean Rank

Test Statisticsa,b

12.500

2

.002

Chi-Square

df

Asymp. Sig.

TNF-alfa

Kruskal Wallis Testa.

Grouping Variable: Kelompokb.

69

NPar Tests

Mann-Whitney Test

NPar Tests

Mann-Whitney Test

Ranks

5 3.00 15.00

5 8.00 40.00

10

Kelompok

P1

P2

Total

TNF-alfa

N Mean Rank Sum of Ranks

Test Statisticsb

.000

15.000

-2.611

.009

.008a

Mann-Whitney U

Wilcoxon W

Z

Asymp. Sig. (2-tailed)

Exact Sig. [2*(1-tailed

Sig.)]

TNF-alfa

Not corrected for ties.a.


Ranks

5 3.00 15.00

5 8.00 40.00

10

Kelompok

P1

P3

Total

TNF-alfa


70

NPar Tests

Mann-Whitney Test

Test Statisticsb

.000

15.000

-2.611

.009

.008a

Mann-Whitney U

Wilcoxon W

Z



Sig.)]

TNF-alfa



Ranks

5 3.00 15.00

5 8.00 40.00

10

Kelompok

P2

P3

Total

TNF-alfa


Test Statisticsb

.000

15.000

-2.611

.009

.008a

Mann-Whitney U

Wilcoxon W

Z



Sig.)]

TNF-alfa



71

Foto Hasil Penelitian

73

Foto Kegiatan Penelitian

daftar pustaka -...

Documents