daniel l. voisin, allan e. herbison and dominique a. poulain- central inhibitory effects of muscimol...

8/3/2019 Daniel L. Voisin, Allan E. Herbison and Dominique A. Poulain- Central inhibitory effects of muscimol and bicuculline

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J o u r n a l o f P h y s i o l o g y ( 1 9 9 5 ) , 4 8 3 . 1 , p p . 2 1 1 - 2 2 4

C e n t r a l i n h i b i t o r y e f f e c t s o f m u s c i m o l and b i c u c u l l i n e on t h em i l k e j e c t i o n r e f l e x i n t h e a n a e s t h e t i z e d r a t

D a n i e l L . V o i s i n , A l l a n E . H e r b i s o n * a n d D o m i n i q u e A . P o u l a i nINSERM U 3 7 8 , N e u r o e n d o c r i n o l o g i e M o r p h o f o n c t i o n n e l l e , U n i v e r s i t e d e B o r d e a u x I I ,

1 4 6 r u e L e o S a i g n a t , F - 3 3 0 7 6 B o r d e a u x C e d e x , F r a n c e a n d * L a b o r a t o r y o fN e u r o e n d o c r i n o l o g y , T h e B a b r a h a m I n s t i t u t e , C a m b r i d g e C B 2 4 A T , UK1 . I n o r d e r t o d e t e r m i n e w h e t h e r G A B A e r g i c m e c h a n i s m s a r e i n v o l v e d i n t h e c o n t r o l o f t h e

m i l k e j e c t i o n r e f l e x i n t h e r a t , we e x a m i n e d t h e e f f e c t s o f c e n t r a l a d m i n i s t r a t i o n o f aGABAA r e c e p t o r a g o n i s t ( m u s c i m o l ) a n d a n t a g o n i s t ( b i c u c u l l i n e ) o n t h e m i l k e j e c t i o nr e f l e x i n t h e u r e t h a n e - a n a e s t h e t i z e d r a t .2 . I n t r a c e r e b r o v e n t r i c u l a r ( i . c . v . ) i n j e c t i o n o f b o t h m u s c i m o l ( n = 1 7 ) , a t d o s e s o f 5 , 1 0 a n d

2 0 n g , a n d b i c u c u l l i n e ( n = 1 5 ) , a t d o se s o f 0 0 1 , 0 1 a n d 0 3 , g , i n h i b i t e d t h e m i l ke j e c t i o n r e f l e x i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r . T h e b i c u c u l l i n e - i n d u c e d i n h i b i t i o n w a sa c c o m p a n i e d b y d e s y n c h r o n i z a t i o n o f t h e e l e c t r o e n c e p h a l o g r a m a n d , a t t h e h i g h e s t d o s e ,b y a l t e r a t i o n i n t h e s e n s i t i v i t y o f t h e mammary g l a n d t o o x y t o c i n . No s i g n i f i c a n t e f f e c to n t h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x w a s s e e n w i t h i . c . v . i s o t o n i c s a l i n e ( n = 5 ) .

3 . I n j e c t i o n o f 2 0 ( n = 5 ) o r 4 0 n g ( n = 2 ) m u s c i m o l o r 0 1 , u g b i c u c u l l i n e ( n = 5 ) I . c . v . d i d n o ts i g n i f i c a n t l y a l t e r t h e r i s e i n i n t r a m a m m a r y p r e s s u r e e v o k e d b y e l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n o ft h e n e u r o h y p o p h y s i s .

4 . B i l a t e r a l 4 0 0 n l m i c r o i n f u s i o n s d i r e c t l y i n t o t h e s u p r a o p t i c n u c l e i o f e i t h e r m u s c i m o l( 2 0 - 1 0 0 n g m l - ' ; n = 1 0 ) o r b i c u c u l l i n e ( 0 ' 1 5 n g m l - ' ; n = 5 ) r e s u l t e d i n a n i n h i b i t i o n o ft h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x , w h i c h w a s n o t a c c o m p a n i e d b y d e s y n c h r o n i z a t i o n o f t h ee l e c t r o e n c e p h a l o g r a m .

5 . T h e e f f e c t s o f I . c . v . i n j e c t i o n s o f m u s c i m o l ( 1 5 a n d 2 0 n g ) a n d b i c u c u l l i n e ( 0 0 1 , 0 - 1 2 a n d0 3 , g ) o n t h e e l e c t r i c a l a c t i v i t y o f t w e n t y - s e v e n a n t i d r o m i c a l l y i d e n t i f i e d s u p r a o p t i cm a g n o c e l l u l a r n e u r o n e s w e r e e x a m i n e d . B o t h c o m p o u n d s r e s u l t e d i n a n i n h i b i t i o n o f t h eb a c k g r o u n d f i r i n g o f o x y t o c i n e r g i c a n d v a s o p r e s s i n e r g i c c e l l s , a n d d e l a y e d t h e o c c u r r e n c eo f h i g h f r e q u e n c y b u r s t s i n o x y t o c i n n e u r o n e s . I n f i v e s u p r a o p t i c n e u r o n e s , b i c u c u l l i n ei n d u c e d a t r a n s i e n t a c t i v a t i o n b e f o r e i n h i b i t i o n .

6 . T h e p o w e r f u l i n h i b i t o r y a c t i o n o n t h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x o f b o t h m u s c i m o l a n db i c u c u l l i n e p r o v i d e s e v i d e n c e f o r t h e i m p o r t a n c e o f GABA n e u r o n e s i n m a i n t a i n i n g t h ef u n c t i o n a l i n t e g r i t y o f t h e m e c h a n i s m s w h i c h a l l o w t h e i n t e r m i t t e n t a n d p u l s a t i l e r e l e a s eo f o x y t o c i n d u r i n g s u c k l i n g .

I n t h e l a c t a t i n g r a t , s u c k l i n g l e a d s t o t h e p u l s a t i l e r e l e a s eo f o x y t o c i n , w h i c h a c t s o n t h e m y o e p i t h e l i a l c e l l s o f t h emammary g l a n d t o i n d u c e m i l k e j e c t i o n . R e f l e x m i l ke j e c t i o n s p e r s i s t u n d e r u r e t h a n e a n a e s t h e s i a : t h e y b e g i n1 0 - 2 0 m i n a f t e r t h e o n s e t o f s u c k l i n g a n d t h e n o c c u r e v e r y5 - 1 0 m i n ( L i n c o l n , H i l l & W a k e r l e y , 1 9 7 3 ) . E x t r a c e l l u l a rr e c o r d i n g s o f o x y t o c i n n e u r o n e s d u r i n g s u c k l i n g ( s e eP o u l a i n & W a k e r l e y , 1 9 8 2 ) s h o w t h a t t h e y m a i n t a i n as t e a d y b a c k g r o u n d a c t i v i t y r a n g i n g f r o m 1 t o 1 0 s p i k e s s - 'a n d t h a t j u s t b e f o r e e a c h m i l k e j e c t i o n t h e n e u r o n e ss u d d e n l y f i r e a t u p t o 5 0 Hz f o r 1 - 4 s , w i t h a r i s e i n i n t r a -mammary p r e s s u r e i n d u c i n g m i l k e j e c t i o n o c c u r r i n g s o m e1 5 - 2 0 s l a t e r . A t t h e e n d o f e a c h h i g h f r e q u e n c y d i s c h a r g e

t h e n e u r o n e s d i s p l a y a s h o r t ( 5 - 2 0 s ) a f t e r - i n h i b i t i o n .T h e s e h i g h f r e q u e n c y b u r s t s a r e h i g h l y s t e r e o t y p e d . T h e yo c c u r s y n c h r o n o u s l y a m o n g s t a l m o s t a l l m a g n o c e l l u l a ro x y t o c i n c e l l s o f t h e h y p o t h a l a m u s ( B e l i n & M o o s , 1 9 8 6 ) i nr e s p o n s e t o a c o n t i n u a l r a t h e r t h a n a n i n t e r m i t t e n ts t i m u l u s , a n d a r e a s p e c i f i c r e s p o n s e t o s u c k l i n g ( P o u l a i n ,W a k e r l e y & D y b a l l , 1 9 7 7 ) . H o w e v e r , we s t i l l r e m a i n i nc o n s i d e r a b l e i g n o r a n c e a b o u t t h e m e a n s b y w h i c h o x y t o c i nc e l l s f i r e s y n c h r o n o u s l y , h ow b u r s t i n g a c t i v i t y c a n b ee l i c i t e d s p e c i f i c a l l y a s a r e s p o n s e t o s o m e , b u t n o t o t h e re x c i t a t o r y i n p u t s a n d a b o u t h o w a n d w h e r e t h e s y s t e mt r a n s d u c e s a c o n t i n u o u s s t i m u l u s i n t o a n i n t e r m i t t e n tr e s p o n s e ( s e e L e n g , 1 9 8 8 ) .

3 2 9 0

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J . P h y s i o l . 4 8 3 . 1D . L . V o i s i n , A . E . H e r b i s o n a n d D . A . P o u l a i nM o r p h o l o g i c a l e v i d e n c e s u g g e s t s an i m p o r t a n t r o l e f o r t h ei n h i b i t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r y - a m i n o b u t y r i c a c i d ( G A B A )i n r e g u l a t i n g t h e a c t i v i t y o f o x y t o c i n n eur on es ( T h e o d o s i s ,P a u t & T a p p a z , 1 9 8 6 ; D e c a v e l & V a n D e n P o l , 1 9 9 0 ) .S u p r a o p t i c n e u r o n e s r e c e i v e a r i c h G A B A e r g i ci n n e r v a t i o n : o x y t o c i n a n d v a s o p r e s s i n c e l l s a re c o n t a c t e di n a s i m i l a r f a s h i o n b y GABA synapses, w h i c h r e p r e s e n tn e a r l y h a l f o f t h e synapses w i t h i n t h e n u c l e u s ( T h e o d o s i s e ta l . 1 9 8 6 ; G i e s & T h e o d o s i s , 1 9 9 4 ) . M o r e o v e r , G A B A e r g i ct e r m i n a l s o f t e n f o r m synapses w i t h two o r morep o s t s y n a p t i c o x y t o c i n e r g i c e l e m e n t s i n t h e same p l a n e o fs e c t i o n ( s h a r e d s y n a p s e s ) . S u c h a s y n a p t i c c o n f i g u r a t i o n i sm o s t o f t e n e n c o u n t e r e d i n t h e s u p r a o p t i c n u c l e i o fl a c t a t i n g a n i m a l s , w h i c h s u g g e s t s t h a t G A B A e r g i csynapses may p a r t i c i p a t e i n t h e s t r u c t u r a l p l a s t i c i t y t h a tt h e n u c l e u s u n d e r g o e s when i t s neurones a re h i g h l ys t i m u l a t e d ( T h e o d o s i s e t a l . 1 9 8 6 ; G i e s & T h e o d o s i s , 1 9 9 4 ) .T h e source o f G A B A e r g i c i n n e r v a t i o n t o t h e s u p r a o p t i cn u c l e u s h a s n o t b e e n f u l l y i n v e s t i g a t e d b u t i s b e l i e v e d t ocome a t l e a s t i n p a r t f r o m t h e p e r i n u c l e a r zone o f t h es u p r a o p t i c n u c l e u s ( R o l a n d & S a w c h e n k o , 1 9 9 3 ) .E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l d a t a a l s o s u g g e s t an i m p o r t a n t r o l e f o rGABA w i t h i n t h e s u p r a o p t i c n u c l e u s . E x t r a c e l l u l a rr e c o r d i n g s i n v i v o h a v e shown p o w e r f u l i n h i b i t o r y a c t i o n so f GABA on t h e e l e c t r i c a l a c t i v i t y o f p u t a t i v e o x y t o c i nn eur on es ( B i o u l a c , G a f f o r i , H a r r i s & V i n c e n t , 1 9 7 8 ;A r n a u d , C i r i n o , L a y t o n & R e n a u d , 1 9 8 3 ) w h i l e i n v i t r oe x p e r i m e n t s h a v e b e e n a b l e t o d e m o n s t r a t e a d i r e c t h y p e r -p o l a r i z i n g a c t i o n o f GABA w i t h i n t h e s u p r a o p t i c n u c l e u s( M a s o n , P o u l a i n & C o b b e t t , 1 9 8 7 ; R a n d l e & R e n a u d , 1 9 8 7 ) .F u r t h e r m o r e , e v i d e n c e o f f r e q u e n t spontaneous GABA-m e d i a t e d i n h i b i t o r y p o s t s y n a p t i c p o t e n t i a l s i n s u p r a o p t i cn eur on es ( R a n d l e , B o u r q u e & R e n a u d , 1 9 8 6 ; Wuarin &D u d e k , 1 9 9 3 ) s u g g e s t s t h a t GABA may b e i n v o l v e d i nm a i n t a i n i n g r e s t i n g b a c k g r o u n d e l e c t r i c a l a c t i v i t y .I n o r d e r t o d e t e r m i n e w h e t h e r GABAergic mechanisms arei n v o l v e d i n t h e c o n t r o l o f t h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x i n t h e r a twe i n v e s t i g a t e d t h e e f f e c t s o f i n t r a c e r e b r o v e n t r i c u l a r( i . C . v . ) i n j e c t i o n s o f a GABAA r e c e p t o r a g o n i s t ( m u s c i m o l )a n d a n t a g o n i s t ( b i c u c u l l i n e ) on t h e pattern o f t h e m i l ke j e c t i o n r e f l e x , t h e a m p l i t u d e o f m i l k e j e c t i o n s i n d u c e d bye l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n o f t h e n e u r o h y p o p h y s i s , and t h ee l e c t r i c a l a c t i v i t y o f i d e n t i f i e d o x y t o c i n neurones i n t h es u p r a o p t i c n u c l e u s d u r i n g s u c k l i n g . I n a d d i t i o n , wee x a m i n e d t h e e f f e c t s on t h e p a t t e r n o f t h e m i l k e j e c t i o nr e f l e x o f b i l a t e r a l m i c r o i n f u s i o n s o f b o t h compounds d i r e c l yi n t o t h e s u p r a o p t i c n u c l e i .

METHODSA n i m a l sA l l e x p e r i m e n t s were p e r f o r m e d on W i s t a r r a t s i s s u e d from theINSERM 1 7 6 ( B o r d e a u x ) b r e e d i n g u n i t (280-380 g b o d yw e i g h t ) on d a y 9 - 1 2 o f l a c t a t i o n . A n i m a l s were maintained i na 1 4 h l i g h t - 1 0 h d a r k e n v i r o n m e n t , a nd g i v e n f o o d a n d w a t e r

S u r g i c a l p r e p a r a t i o n sOn d a y s 8 - 1 1 o f l a c t a t i o n , l a c t a t i n g r a t s were s e p a r a t e d f r o ma l l b u t one o f t h e i r pups. T h e f o l l o w i n g m o r n i n g , r a t s werea n a e s t h e t i z e d w i t h u r e t h a n e ( 1 1 g k g - ' i . P . ) p l u s x y l a z i n e( 4 mg I . M . ) . T h i s p r o c e d u r e i s known t o p r o v i d e a s t a b l e l e v e l o fa n a e s t h e s i a f o r s e v e r a l h o u r s ( I s h e r w o o d & C r o s s , 1 9 8 0 ) . As i l i c o n e c a t h e t e r ( S i l a s t i c , Do w C o r n i n g , M i d l a n d , M I , U S A )was i n s e r t e d i n t o t h e r i g h t j u g u l a r v e i n . T o o b t a i n r e c o r d s o fintramammary pressure, a p l a s t i c c a n n u l a ( P P 5 0 , P o r t e x ,H y t h e , UK) was p l a c e d i n t h e t e a t d u c t o f an i n g u i n a lmammary g l a n d a n d c o n n e c t e d t o a pressure t r a n s d u c e r ( P 2 5 ,S t a t h a m ) . T h e a n i m a l s were t h e n p l a c e d i n a s t e r e o t a x i c f r a m e( N a r i s h i g e E q u i p m e n t , T o k y o , J a p a n ) w h e r e r e c t a ltemperature was m a i n t a i n e d a t 3 6 - 5 - 3 7 - 5 C b y at h e r m o s t a t i c a l l y c o n t r o l l e d e l e c t r i c b l a n k e t ( A n i m a l B l a n k e tC o n t r o l U n i t , E a l i n g , U K ) . A 1 0 c 1 H a m i l t o n s y r i n g e wasp o s i t i o n e d s t e r e o t a x i c a l l y w i t h i t s n e e d l e i n s e r t e d i n t o t h et h i r d v e n t r i c l e , a n d two s i l v e r e l e c t r o d e s were p o s i t i o n e d i ns m a l l h o l e s d r i l l e d i n t h e f r o n t a l c r a n i u m t o r e c o r d t h ee l e c t r o e n c e p h a l o g r a m ( E E G ) on a pen r e c o r d e r . F o re l e c t r o p h y s i o l o g i c a l r e c o r d i n g s , a b i p o l a r s t i m u l a t i n g e l e c t r o d e(SNEX 1 0 0 , R h o d e s M e d i ca l I n s t r u m e n t s, P a r i s , F r a n c e ) wasl o w e r e d i n t o t h e p i t u i t a r y s t a l k t o e n a b l e a n t i d r o m i ca c t i v a t i o n o f m a g n o c e l l u l a r n e u r o n e s , a n d a g l a s s m i c r o p i p e t t ef i l l e d w i t h a 2 % Pontamine Sky B l u e - 0 - 7 MK C l s o l u t i o n wasp o s i t i o n e d i n t o t h e s u p r a o p t i c n u c l e u s . F o r m i c r o i n f u s i o ne x p e r i m e n t s , i n s t e a d o f p o si t i o n i n g a H a m i l t o n s y r i n g e w i t hi t s n e e d l e i n s e r t e d i n t o t h e t h i r d v e n t r i c l e , b i l a t e r a l i n f u s i o nc a n n u l a e ( o . d . 0 - 2 5 mm) were i n s e r t e d so t h a t t h e i r t i p s werel o c a t e d i m m e d i a t e l y a b o v e or w i t h i n e a c h s u p r a o p t i c n u c l e u s .Each i n f u s i o n c a n n u l a was c o n n e c t e d t o a 1 0 # 1 l H a m i l t o ns y r i n g e by S i l a s t i c a n d p o l y t h e n e t u b i n g . T h e t wo s y r i n g e swere p l a c e d i n a m i c r o l i t r e i n f u s i o n pump ( H a r v a r dA p p a r a t u s , S o u t h N a t i c k , MA, U S A ) . F o r c o n t r o l a n i m a l s , t h ec o n n e c t i n g t u b i n g , s y r i n g e s a n d i n f u s i o n c a n n u l a e were f i l l e dw i t h an a r t i f i c i a l c e r e b r o s p i n a l f l u i d ( A C S F ) o f c o m p o s i t i o n( m M ) : 1 2 4 N a C l , 5 K C l , 2 5 NaHCO3, 5 D - g l u c o se , 2 C a C l 2 ; pHa d j u s t e d t o 7 4 ) . F o r e x p e r i m e n t a l r a t s , t h e s y r i n g e s ,c o n n e c t i n g t u b i n g and i n f u s i o n c a n n u l a e were f i l l e d w i t h ACSFc o n t a i n i n g m u s c i m o l o r b i c u c u l l i n e .M i l k e j e c t i o n e x p e r i m e n t sT h r e e h o u r s a f t e r a d m i n i s t e r i n g t h e a n a e s t h e t i c s , n i n e o r t e npups were p o s i t i o n e d on t h e n i p p l e s o f t h e m o t h e r . M i l ke j e c t i o n s were r e a d i l y c h a r a c te r i z e d b y an a b r u p t a n dt r a n s i e n t r i s e i n intramammary pressure w h i c h was f o l l o w e di m m e d i a t e l y b y t h e s t r e t ch r e a c t i o n o f t h e pups ( F i g . 1 ) . A f t e ra t l e a s t s i x m i l k e j e c t i o n s had b e e n o b s e r v e d , 1 m l o f e i t h e ri s o t o n i c s a l i n e , m u s c i m o l ( 5 , 1 0 , 2 0 ng m l ' ; S i g m a ) o rb i c u c u l l i n e m e t h i o d i d e ( 0 - 0 1 , 0 - 1 , 0 3 s g u 1 F ' ; S i g m a ) wasi n j e c t e d i n t o t h e t h i r d v e n t r i c l e w i t h i n 1 m i n f o l l o w i n g t h e l a s tm i l k e j e c t i o n . F o r m i c r o i n f u s i o n e x p e r i m e n t s , a f t e r a t l e a s t s i xm i l k e j e c t i o n s had b e e n o b s e r v e d , 4 0 0 n l o f ACSF, m u s c i m o l( 2 0 , 4 0 , 1 0 0 ng m l - 1 ) or b i c u c u l l i n e m e t h i o d i d e ( 0 1 5 mg m l - 1 )were s i m u l t a n e o u s l y i n f u s e d i n e a c h s u p r a o p t i c n u c l e u s over ap e r i o d o f 1 2 m i n . A s m a l l b u b b l e o f a i r was p l a c e d i n e a c hc o n n e c t i n g t u b e t o m o n i t o r t h e m o v e m e n t o f f l u i d d u r i n g t h ei n f u s i o n . F o r b o t h i . C . V . i n f u s i o n an d m i c r o i n f u s i o nexperiments c h a n g e s i n t h e f r e q u e n c y o f m i l k e j e c t i o n s werea s s e s s e d by d e t e r m i n i n g a c o n f i d e n c e i n t e r v a l w i t h a 98 %p r o b a b i l i t y e s t i m a t e o f t h e i r f r e q u e n c y , a c c o r d i n g t o t h e d a t ao b t a i n e d d u r i n g t h e pretreatment p e r i o d , i n o r d e r t o c h e c k i fany o f t h e v a l u e s w i t h i n 3 0 m i n o f d r u g treatment were

a d l i b i t u m .

2 1 2

o u t s i d e t h e l i m i t s a s d e f i n e d a b o v e ( s e e C l a r k e , F a l l , L i n c o l n &) by guest on October 31, 2010jp.physoc.orgDownloaded from J Physiol (
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J 4 G A B A e r g i c c o n t r o l o f t h e m i l k e j e c t i o n r e f l e xM e r r i c k , 1 9 7 8 ) a n d b y c a l c u l a t i n g t h e m i l k e j e c t i o n r a t i o( d u r a t i o n o f t h e l o n g e s t i n t e r v a l b e t w e e n m i l k e j e c t i o n sf o l l o w i n g d r u g i n j e c t i o n d i v i d e d b y t h e mean i n t e r v a l b e f o r et r e a t m e n t ) . T h e EEG w a s r e c o r d e d i n l a c t a t i n g r a t sc o n t i n u o u s l y d u r i n g t h e s u c k l i n g p e r i o d . T h e s e n s i t i v i t y o f t h emammary g l a n d t o e x o g e n o u s o x y t o c i n was c h e c k e d b y g i v i n gI . V . s y n t h e t i c o x y t o c i n ( S y n t o c i n o n , S a n d o z , B a s e l ,S w i t z e r l a n d ; 0 ' 5 m i l l i u n i t s ( m U ) ) . F o r m i c r o i n f u s i o ne x p e r i m e n t s t h e p o s i t i o n s o f t h e i n f u s i o n c a n n u l a e w e r ea s c e r t a i n e d u s i n g c o n v e n t i o n a l h i s t o l o g i c a l m e t h o d s . D a t aw e r e t a k e n o n l y f r o m t h o s e a n i m a l s i n w h i c h b o t h i n f u s i o nc a n n u l a e w e r e d e t e r m i n e d t o b e f u n c t i o n i n g a n d f o u n d t o b el o c a t e d b i l a t e r a l l y j u s t a b o v e s u p r a o p t i c n u c l e i . I n o r d e r t oe s t i m a t e t h e s p r e a d o f f l u i d f r o m t h e i n f u s i o n c a n n u l a e , t w or a t s w e r e i m p l a n t e d w i t h c e r e b r a l c a n n u l a e a s d e s c r i b e d a b o v ea n d 4 0 0 n l o f a 2 % ammonium f e r r o u s s u l p h a t e s o l u t i o nd i s s o l v e d i n ACSF w a s i n f u s e d i n t o o n e s u p r a o p t i c n u c l e u so v e r a p e r i o d o f 1 2 m i n . A n i m a l s w e r e t h e n k i l l e d ; t h e i r b r a i n sw e r e r e m o v e d a n d p l a c e d i n t o a 4 % p a r a f o r m a l d e h y d e f i x a t i v ec o n t a i n i n g p o t a s s i u m f e r r o c y a n i d e a n d p o t a s s i u m f e r r i c y a n i d e .T h e f o l l o w i n g d a y t h e b r a i n s w e r e s e c t i o n e d a t 5 0 , u m o n av i b r a t o m e a n d t h e s p r e a d o f t h e f e r r o u s s o l u t i o n i d e n t i f i e d( F i g . 7 ) .I n a f u r t h e r s e t o f e x p e r i m e n t s d e s i g n e d t o a s s e s s t h e e f f e c t s o fi . c . v . i n f u s i o n s o n t h e n e u r o h y p o p h y s i s d i r e c t l y , e l e c t r i c a ls t i m u l a t i o n o f t h e n e u r o h y p o p h y s i s ( s t i m u l u s p a r a m e t e r s : 3 sa t 5 0 H z , b i p h a s i c 1 ms s q u a r e w a v e ; 2 0 0 - 4 0 0 1 s A a m p l i t u d ep e a k t o p e a k ) w a s c a r r i e d o u t a t 5 m i n i n t e r v a l s t o i n d u c e au n i f o r m r i s e i n i n t r a m a m m a r y p r e s s u r e e q u i v a l e n t t o t h a te v o k e d b y a b o l u s o f a b o u t 0 ' 5 mU o x y t o c i n i . v . A f t e r a t l e a s ts i x c o n s i s t e n t i n t r a m a m m a r y p r e s s u r e r e s p o n s e s t o e l e c t r i c a ls t i m u l a t i o n , 1 m l o f e i t h e r m u s c i m o l ( 2 0 , 4 0 n g u l - ' ) o rb i c u c u l l i n e m e t h i o d i d e ( 0 - 1 j u g f F 1 - ) w a s i n j e c t e d i n t o t h e t h i r dv e n t r i c l e , a n d t h e e f f e c t s o n i n t r a m a m m a r y p r e s s u r e i n c r e a s e sr e l a t e d t o e l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n o f t h e n e u r o h y p o p h y s i so b s e r v e d f o r 3 0 m i n . S t a t i s t i c a l a n a l y s i s u s e d t o a s s e s s c h a n g e si n i n t r a m a m m a r y p r e s s u r e i n c r e a s e s c o n s i s t e d i n d e t e r m i n i n ga c o n f i d e n c e i n t e r v a l w i t h a 98 % p r o b a b i l i t y e s t i m a t e o f t h e i ra m p l i t u d e , a c c o r d i n g t o t h e d a t a o b t a i n e d d u r i n g t h ep r e t r e a t m e n t p e r i o d , a n d t o c h e c k i f a n y o f t h e v a l u e s w i t h i n3 0 m i n o f d r u g t r e a t m e n t w e r e o u t si d e t h e l i m i t s a s d e f i n e da b o v e .E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l r e c o r d i n g e x p e r i m e n t sE x t r a c e l l u l a r n e u r o n a l a c t i v i t y w a s r e c o r d e d t h r o u g h ap r e a m p l i f i e r (MOD-DAM-5A d i f f e r e n t i a l a m p l i f i e r , WPIi n s t r u m e n t s ; p a s s b a n d , 0 - 1 - 3 0 k H z ) c o n n e c t e d t o a no s c i l l o s c o p e . S i g n a l s w e r e s t o r e d o n a m a g n e t i c t a p e w i t h aH i t a c h i m a g n e t i c t a p e r e c o r d e r a n d s i m u l t a n e o u s l y s e n t t o as i g n a l d i s c r i m i n a t o r ( N 7 5 0 s p i k e a n a l y s e r , M e n t o r ,M i n n e a p o l i s , MN, U S A ) w h o s e o u t p u t w a s p l o t t e d o n a c h a r tr e c o r d e r . F i n a l a n a l y s i s o f d a t a w a s c a r r i e d o u t u s i n g t h eS p i k e 2 s o f t w a r e f o r t h e i n t e r f a c e CED 1 4 0 1 ( C a m b r i d g eE l e c t r o n i c D e s i g n , C a m b r i d g e , UK) w i t h a 3 8 6 m o d e l Twin S e tc o m p u t e r . A t t h e e n d o f t h e e x p e r i m e n t s , t h e d y e P o n t a m i n eS k y B l u e w a s e x t r u d e d e l e c t r o p h o r e t i c a l l y f r o m t h e r e c o r d i n ge l e c t r o d e b y p a s s i n g a c u r r e n t o f 5 1 s A f o r t O m i n a n d 2 0 1A f o r1 0 m i n . A n i m a l s w e r e k i l l e d b y a n o v e r d o s e o f u r e t h a n e , a n dt h e b r a i n r e m o v e d a n d p l a c e d i n a 4% p a r a f o r m a l d e h y d es o l u t i o n . T h e p o s i t i o n o f t h e t i p o f t h e e l e c t r o d e w a sa s c e r t a i n e d u s i n g c o n v e n t i o n a l h i s t o l o g i c a l m e t h o d s .S u p r a o p t i c m a g n o c e l l u l a r n e u r o n e s w e r e i d e n t i f i e d b y a n t i -d r o m i c i n v a s i o n a f t e r e l e c t r i c a l s t i mu l a t i on o f t h e p i t u i t a r ys t a l k . O x y t o c i n e r g i c n e u r o n e s w e r e i d e n t i f i e d f u r t h e r b y e i t h e r

a p o s i t i v e c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e i r b u r s t i n g p a t t e r n o f f i r i n ga n d r e f l e x m i l k e j e c t i o n s o r , when m i l k e j e c t i o n s w e r e n o to b s e r v e d , b y t h e i r r e s p o n s e t o 2 0 # a g ( k g b o d y w e i g h t ) - ' i . v .c h o l e c y s t o k i n i n ( C C K ; s u l p h a t e d CCK-8 f r o m S i g m a ; L e n g ,Wa y & D y b a l l , 1 9 9 1 ) . T h e f o l l o w i n g p a r a m e t e r s w e r ec o m p a r e d b e f o r e a n d a f t e r i . c . v . i n j e c t i o n o f e i t h e r d r u g ( 1 5 o r2 0 n g m u s c i m o l , 0 ' 1 2 o r 0 3 mg b i c u c u l l i n e ) : ( a ) b a c k g r o u n da c t i v i t y , d e t e r m i n e d a s t h e mean n u m b e r o f s p i k e s s - 1 o v e rs u c c e s s i v e 1 m i n p e r i o d s ( e x c l u d i n g a n y h i g h f r e q u en c y b u r s t -r e l a t e d a c t i v i t y ) ; ( b ) i n t e r v a l s ( i n m i n ) b e t w e e n s u c c e s s i v e h i g hf r e q u e n c y b u r s t s ; a n d ( c ) n e u r o s e c r e t o r y b u r s t a m p l i t u d e ,d e t e r m i n e d a s t h e t o t a l n u m b e r o f s p i k e s p e r n e u r o s e c r e t o r yb u r s t . S t a t i s t i c a l a n a l y s i s u s e d t o a s s e s s d r u g - i n d u c e d c h a n g e si n b a c k g r o u n d f i r i n g c o n s i s t e d i n d e t e r m i n i n g f o r e a c h c e l l ac o n f i d e n c e i n t e r v a l w i t h a 98 % p r o b a b i l i t y e s t i m a t e o f v a l u e so f f i r i n g r a t e , a c c o r d i n g t o d a t a o b t a i n e d d u r i n g t h ep r e t r e a t m e n t p e r i o d . T h e n o r m a l i t y o f d i s t r i b u t i o n o f t h e s ed a t a w a s e n s u r e d p r e v i o u s l y . F i r i n g w a s j u d g e d t o h a v e b e e ns i g n i f i c a n t l y i n h i b i t e d o r a c t i v a t e d i f a t l e a s t t w o s u c c e s s i v ev a l u e s w i t h i n 2 0 m i n o f d r u g t r e a t me n t w e r e o u t s i d e t h e l i m i t sd e f i n e d a b o v e . T h e d u r a t i o n o f t h e e f f e c t u p o n f i r i n g w a sa s s e s s e d b y c o u n t i n g t h e n u m b e r o f s u c c e s s i v e 1 m i n p e r i o d sf o r w h i c h t h e e f f e c t was o b s e r v e d . C h a n g e s i n t h e f r e q u e n c y o fh i g h f r e q u e n c y b u r s t s w e r e a s s e s s e d f o l l o w i n g t h e m e t h o d o fC l a r k e e t a l . ( 1 9 7 8 ) , a n d b y c a l c u l a t i n g t h e m i l k e j e c t i o n r a t i o .A l l r e s u l t s a r e g i v e n a s m e a n s + S . E . M .

RESULTSE f f e c t s o f i . c . v . m u s c i m o l and b i c u c u l l i n e o n t h ep a t t e r n o f t h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x and EEG a c t i v i t yT h i r t y - s e v e n o f f i f t y ( 7 4 % ) a n a e s t h e t i z e d r a t s d i s p l a y e dt h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x d u r i n g s u c k l i n g . T h e d e l a y t o t h ef i r s t m i l k e j e c t i o n v a r i e d f r o m 3 t o 3 6 m i n ( m e d i a n ,1 0 m i n ) . S u b s e q u e n t r e f l e x m i l k e j e c t i o n s o c c u r r e d a ti n t e r v a l s f r o m 4 ' 4 + 1 - 2 t o 7 ' 6 + 1 - 3 m i n ( r a n g e o f t h emean o f t h e s e v e n e x p e r i m e n t a l g r o u p s i n t h e p r e - t e s tp e r i o d ) . I n a l l g r o u p s s p o n t a n e o u s o s c i l l a t i o n s i n i n t r a -mammary p r e s s u r e u n r e l a t e d t o m i l k e j e c t i o n w e r eo b s e r v e d d u r i n g r e c o r d i n g ( F i g . 1 B ) . i . c . v . i n j e c t i o n o f t h ev e h i c l e a l o n e d i d n o t m o d i f y t h e p a t t e r n o f t h e r e f l e x i na n y a n i m a l o f t h e c o n t r o l g r o u p ( n = 5 ) , n o r t h e EEGa c t i v i t y i n t h e t h r e e r a t s i n w h i c h i t was r e c o r d e d( F i g . 1 A ) ; t h e mean m i l k e j e c t i o n r a t i o was e q u a l t o1 t 1 + 0 1 ( t h e m i l k e j e c t i o n r a t i o a s d e f i n e d b y C l a r k e e t a l .( 1 9 7 8 ) i s t h e d u r a t i o n o f t h e l o n g e s t i n t e r v a l b e t w e e n m i l ke j e c t i o n s f o l l o w i n g d r u g i n j e c t i o n d i v i d e d b y t h e meani n t e r v a l b e f o r e t r e a t m e n t ) .T h e GABAA r e c e p t o r a g o n i s t m u s c i m o l a t 5 , 1 0 a n d 2 0 n gi n h i b i t e d t h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x i n 2 / 5 , 4 / 5 a n d 7 / 7a n i m a l s , r e s p e c t i v e l y ( F i g . 2 ; P < 0 0 2 ) . T h e mean m i l ke j e c t i o n r a t i o i n e a c h g r o u p w a s r e s p e c t i v e l y 1 ' 9 + 0 2 ,3 ' 3 + 06 a n d 6 - 6 + 1 . 1 . A s i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o n w a s f o u n db e t w e e n t h e d o s e o f m u s c i m o l i n j e c t e d a n d t h e d u r a t i o n o fi n h i b i t i o n , a s q u a n t i f i e d b y t h i s r a t i o ( F i g . 2 ; r = 0 - 8 1 ;P < 0 ' 0 0 1 ) . D u r i n g t h e p e r i o d o f i n h i b i t i o n o f t h e r e f l e x ,t h e mammary g l a n d r e m a i n e d r e s p o n s i v e t o e x o g e n o u so x y t o c i n ( F i g . 1 C ) . T h e a m p l i t u d e o f m i l k e j e c t i o n so c c u r r i n g a f t e r t h e p e r i o d o f i n h i b i t i o n w a s t h e s a m e a s

J . P h y 8 i o l . 4 8 3 . 1



4/15

2 1 4 D . L . V o i s i n , A . E . H e r b i s o n a nd D . A . P o u l a i n

AA 1 0 m i nI s o t o n i c s a l i n e

150,uV

10 m m H g5 m i n

B I | | | | I - |A 1 0 m i nM u s c i m o l ( 1 0 n g )

.1 - aI I 4l~ 1. , I i f V Ia . ii u t15 0 u V

Q 1 0 mmHg

5 m i n

C I_ 1A 10 m i nM u s c i m o l ( 2 0 n g )V_ , z a j t ~ 6 u I_ ~ ~ ~ ~ ~ ~ I T v w 1 50V1 1 1 1 P ' I q ' J T J I- - , I T " - l l ,-l l - T - JJ l"V--Vt 1 * 7 * I*1\-II I1 I1 0 mmHg

5 m i n O x y

F i g u r e 1 . I n t r a c e r e b r o v e n t r i c u l a r i n j e c t i o n o f m u s c i m o l i n h i b i t s t h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x i n t h er a tT h e e f f e c t s o f i . c . v . i n j e c t i o n ( a r r o w h e a d s ) o f i s o t o n i c s a l i n e ( A ) o r 1 0 ( B ) a n d 2 0 n g ( C ) m u s c i m o l o nt h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x a n d o n t h e EEG o f i n d i v i d u a l l a c t a t i n g r a t s . T h e t o p l i n e s h o w s a d i a g r a m a t i cr e p r e s e n t a t i o n o f e a c h r e f l e x m i l k e j e c t i o n ( v e r t i c a l b a r ) o c c u r r i n g d u r i n g t h e t i m e o f t h e e x p e r i m e n t .A c t u a l EEG a n d i n t r a m a m m a r y p r e s s u r e r e c o r d i n g s ( b o t t o m t r a c e ) f o r t h e p e r i o d s s h a d e d o n t h e t o pl i n e a r e g i v e n b e l o w a t a n e x p a n d e d s c a l e . N o t e t h a t i . c . v . s a l i n e ( A ) h a d n o e f f e c t o n m i l k e j e c t i o nr a t e a n d a m p l i t u d e , w h i l e m u s c i m o l a t b o t h 1 0 ( B ) a n d 2 0 n g ( C ) i n h i b i t e d t h e o c c u r r e n c e o f m i l ke j e c t i o n s . I n B s t a r s m a r k s p o n t a n e o u s o s c i l l a t i o n s i n i n t r a m a m m a r y p r e s s u r e u n r e l a t e d t o h i g hf r e q u e n c y d i s c h a r g e s o f o x y t o c i n n e u r o n e s . I n C n o t e t h a t d u r i n g t h e p e r i o d o f m u s c i m o l - i n d u c e di n h i b i t i o n , t h e mammary g l a n d s e n s i t i v i t y t o o x y t o c i n wa s n o t a f f e c t e d , s i n c e i . v . i n j e c t i o n o f0 ' 5 mU o x y t o c i n ( l a r g e o p e n a r r o w , O x y ) e l i c i t e d an i n c r e a s e i n i n t r a m a m m a r y p r e s s u r e . I n a l l c a s e st h e EEG was n o t a f f e c t e d b y i . c . V . i n j e c t i o n s .

J . P h y s i o L 4 8 3 . 1

[ . i , A ! II T I M



5/15

J . P h y s i o L 4 8 3 . 1 G A B A e r g i c c o n t r o l o f t h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x 2 1 5

8 -7 -

F i g u r e 2 . T h e e f f e c t o f m u s c i m o l upon t h e m i l k 0 6e j e c t i o n r a t i o i s d o s e d e p e n d e n t ( 7 / 7T h e mean m i l k e j e c t i o n r a t i o i s p l o t t e d a g a i n s t t h e d o s e 5o f m u s c i m o l u s e d . E a c h p o i n t i s t h e mean v a l u e d e r i v e d A cf r o m a l l t h e r a t s t e s t e d a t e a c h d o s e ; t h e S . E . M . i s a 4Id e n o t e d b y t h e v e r t i c a l b a r . T h e c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t i s E 3s i g n i f i c a n t a t P < 0 1 0 0 1 ( r = 0 O 8 1 ) . T h e r a t i o b e s i d e e a c h X/p o i n t g i v e s t h e n u m b e r o f r a t s i n w h i c h m i l k e j e c t i o n 2( 4 / )r e f l e x w a s i n h i b i t e d v & . t h e n u m b e r o f r a t s t e s t e d a t e a c h ( 2 / 5 )d o s e . 1 -

( 0 / 5 )0 5 1 0 1 5 2 0

M u s c i mo l d o s e ( n g )

A 1 0 m i nB i c u c u l l i n e ( 0 1 p g )15 0 u V _ _ _ _ _ _

1 0 mmHg |N> \>ayNyA6 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 5i nO x y O x y

A 1 0 m i nB i c u c u l l i n e ( 0 3 u g )15 0 # V l_IJiL

1 0 m m H g f AO x y O x y O x y Ox y 5 m i n

F i g u r e 3 . I n t r a c e r e b r o v e n t r i c u l a r i n j e c t i o n o f b i c u c u l l i n e i n h i b i t s t h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x a n dd e s y n c h r o n i z e s t h e EEGT h e e f f e c t s o f i . C . v . i n j e c t i o n ( a r r o w h e a d s ) o f b i c u c u l l i n e a t 0 1 ( A ) o r 0 3 , u g ( B ) on t h e m i l k e j e c t i o nr e f l e x a n d o n t h e EEG o f i n d i v i d u a l l a c t a t i n g r a t s . T h e t o p l i n e s h o w s a d i a g r a m a t i c r e p r e s e n t a t i o no f e a c h r e f l e x m i l k e j e c t i o n ( v e r t i c a l b a r ) o c c u r r i n g d u r i n g t h e t i m e o f t h e e x p e r i m e n t . A c t u a l EEGa n d i n t r a m a m m a r y p r e s s u r e r e c o r d i n g s ( b o t t o m t r a c e ) f o r t h e p e r i o d s s h a d e d on t h e t o p l i n e a r eg i v e n b e l o w a t a n e x p a n d e d s c a l e . B i c u c u l l i n e a t b o t h 0 . 1 ( A ) a n d 0 3 # s g ( B ) i n h i b i t e d t h e o c c u r r e n c eo f m i l k e j e c t i o n s . I n b o t h c a s e s i . c . v . i n j e c t i o n s p r o v o k e d an EEG d e s y n c h r o n i z a t i o n . D u r i n gi n h i b i t i o n o f t h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x i n d u c e d b y 0 t 1 , t g o f b i c u c u l l i n e ( A ) , t h e mammary g l a n d w a ss t i l l r e s p o n s i v e t o 0 5 mU e x o g e n o u s o x y t o c i n ( o p e n a r r o w ) . I n B n o t e t h a t d u r i n g t h e p e r i o d o fb i c u c u l l i n e - i n d u c e d i n h i b i t i o n , t h e mammary g l a n d s e n s i t i v i t y t o o x y t o c i n wa s a l t e r e d , b u t p a r t i a l l yr e c o v e r e d b e f o r e t h e e n d o f t h e p e r i o d o f i n h i b i t i o n .



6/15

D . L . V o i s i n , A . E . H e r b i s o n a n d D . A . P o u l a i nt h a t o b s e r v e d b e f o r e i . c . v . a d m i n is t r a t i o n o f m u s c i m o l( F i g . l B a n d C ) . T h e EEG w a s r e c o r d e d i n 3 / 5 , 4 / 5 a n d 4 / 7a n i m a l s r e c e i v i n g 5 , 1 0 a n d 2 0 n g m u s c i m o l , r e s p e c t i v e l y( F i g . l B a n d C ) , a n d n o a l t e r a t i o n w a s o b s e r v e d e x c e p t f o ro n e r a t ( 2 0 n g ) , w h i c h d i s p l a y e d a s l i g h t d e s y n c h r o n i z a t i o n ,i n t e r m s o f a m p l i t u d e .T h e l o we st d o s e o f b i c u c u l l i n e ( 0 - 0 1 , u g ) i n h i b i t e d t h e m i l ke j e c t i o n r e f l e x i n o n e o f f i v e a n i m a l s t e s t e d a n d t h e e f f e c tw a s a c c o m p a n i e d b y a d e s y n c h r o n i z a t i o n o f t h e E E G . A t0 - 1 j u g , b i c u c u l l i n e ( F i g . 3 A ) p r o d u c e d d e s y n c h r o n i z a t i o n o ft h e EEG i n a l l a n i m a l s , i n c o n c e r t w i t h a n i n h i b i t i o n o f t h em i l k e j e c t i o n r e f l e x i n t h r e e o u t o f f i v e r a t s . T h e EEGd e s y n c h r o n i z a t i o n l a s t e d f o r a p p r o x i m a t e l y h a l f a s l o n g a st h e i n h i b i t i o n o f t h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x ( F i g . 3 A ) . A t a d o s eo f 0 3 j u g , b i c u c u l l i n e i n h i b i t e d t h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x a n dd e s y n c h r o n i z e d t h e EEG i n 5 / 5 a n i m a l s ( F i g . 3 B ) ; t h i s w a sa c c o m p a n i e d b y s h o r t - l a s t i n g c o n v u l s i o n s o f t h e a n i m a l . A tt h i s d o s e , t r a n s i e n t f l u c t u a t i o n s i n i n t r a m a m m a r y p r e s s u r ew e r e r e c o r d e d d u r i n g t h e p e r i o d o v e r w h i c h t h e m i l ke j e c t i o n r e f l e x w a s i n h i b i t e d a n d mammary s e n s i t i v i t y t oe x o g e n o u s o x y t o c i n w a s m a r k e d l y r e d u c e d ( F i g . 3 B ) . T h em e a n m i l k e j e c t i o n r a t i o i n e a c h g r o u p o f b i c u c u l l i n e -t r e a t e d a n i m a l s w a s 2 - 0 + 0 - 6 , 2 - 8 + 04 a n d 6 - 4 + 1 - 2 i na n i m a l s r e c e i v i n g 0 - 0 1 , 0 - 1 a n d 0 3 j u g b i c u c u l l i n e ,

AI l l

r e s p e c t i v e l y . A s i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o n w a s f o u n d b e t w e e nt h e d o s e o f b i c u c u l l i n e i n j e c t e d a n d t h e d u r a t i o n o fi n h i b i t i o n a s q u a n t i f i e d b y t h i s r a t i o ( r = 0 8 1 ; P < 0 ' 0 0 1 ) .E f f e c t s o f i . C . v . m u s c i m o l a n d b i c u c u l l i n e o ne l e c t r i c a l l y e v o k e d i n c r e a s e s i n i n t r a m a m m a r yp r e s s u r eT r a i n s o f e l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n o f t h e n e u r o h y p o p h y s i s( 5 0 H z , 3 s ) , a t i n t e r v a l s o f 5 m i n , e l i c i t e d a u n i f o r m r i s e i ni n t r a m a m m a r y p r e s s u r e e q u i v a l e n t t o t h a t e v o k e d b y0 5 mU o x y t o c i n i . v . I n j e c t i o n o f 2 0 ( n = 5 ) o r 4 0 n g ( n = 2 )m u s c i m o l I . c . v . d i d n o t c h a n g e t h e r i s e i n i n t r a m a m m a r yp r e s s u r e w i t h i n a 3 0 m i n p e r i o d ( F i g . 4 A ) . I n j e c t i o n o f0 - 1 j u g b i c u c u l l i n e I . c . v . d i d n o t m o d i f y t h e a m p l i t u d e o fe l e c t r i c a l l y e v o k e d i n c r e a s e s i n i n t r a m a m m a r y p r e s s u r e i nt h r e e a n i m a l s ( F i g . 4 B ) , w h i l e i n t w o o t h e r r a t s a d e c r e a s ew a s o b s e r v e d f o r j u s t a s i n g l e s t i m u l a t i o n ( o n e a t 2 0 m i na n d o n e a t 3 0 m i n p o s t - i n j e c t i o n ) .E f f e c t s o f i . c . v . m u s c i m o l a n d b i c u c u l l i n e o n t h ea c t i v i t y o f m a g n o c e l l u l a r n e u r o n e s i n t h e s u p r a o p t i cn u c l e u s ( S O N )T w e n t y - s e v e n a n t i d r o m i c a l l y i d e n t i f i e d SON n e u r o n e sw e r e r e c o r d e d . T h e s e n e u r o n e s d is p l a y e d a n t i d r o mi cr e s p o n s e s f u l f i l l i n g t h e u s u a l c r i t e r i a o f s t a b l e l a t e n c y( r a n g e , 7 - 1 7 m s ) , h i g h f r e q u e n c y f o l l o w i n g , a n d

M u s c i m o lI , y

O x y

B B i c u c u l l i n e

O x y

* *- * * * * *5 m i n

F i g u r e 4 . No e f f e c t s o n intramammary p r e s s u r e r i s e s e v o k e d by e l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n o f t h en e u r o h y p o p h y s i s a r e s e e n a f t e r i . c . v . i n j e c t i o n o f m u s c i m o l o r b i c u c u l l i n eT h e e f f e c t s o f i . C . V . i n j e c t i o n o f 2 0 n g m u s c i m o l ( A ) a n d 0 1 j u g b i c u c u l l i n e ( B ) o n m i l k e j e c t i o n s e v o k e db y e l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n o f t h e n e u r o h y p o p h y s i s i n a n a e s t h e t i z e d l a c t a t i n g r a t s a r e i l l u s t r a t e d . T h en e u r a l l o b e w a s s t i m u l a t e d ( s t a r ) e v e r y 5 m i n ( 5 0 Hz f o r 3 s a t 2 0 0 j u A ) i n o r d e r t o p r o d u c e r i s e s i ni n t r a m a m m a r y p r e ss u r e e q u i v a l en t t o t h o s e e v o k e d b y i . v . i n j e c t i o n o f 0 ' 5 mU o x y t o c i n ( o p e na r r o w ) . A f t e r a c o n t r o l p e r i o d , m u s c i m o l o r b i c u c u l l i n e w e r e i n j e c t e d : n o e f f e c t s o n i n t r a m a m m a r yp r e s s u r e r i s e s w e r e s e e n a f t e r I . c . v . i n j e c t i o n o f e i t h e r d r u g ( a r r o w h e a d s ) .

J . P h y s i o L 4 8 3 . 12 1 6



7/15

J 4 8 G A B A e r g i c c o n t r o l o f t h e m i l k e j e c t i o n r e f l e xc a n c e l l a t i o n o f t h e a n t i d r o m i c p o t e n t i a l b y c o l l i s i o n w i t h as p o n t a n e o u s o r t h o d r o m i c p o t e n t i a l . T h e c e l l s w e r eh i s t o l o g i c a l l y l o c a l i z e d w i t h i n t h e S O N . F o u r t e e n c e l l s w e r ec l a s s i f i e d a s o x y t o ci n n e u r o n es : e l e v e n d i s p l a y e d h i g hf r e q u e n c y d i s c h a r g e s b e f o r e r e f l e x m i l k e j e c t i o n s , a n d t h r e eo t h e r s w e r e a c t i v a t e d b y i . v . i n j e c t i o n s o f C C K . E i g h t c e l l sd i s p l a y e d a p h a s i c p a t t e r n o f a c t i v i t y , a n d w e r e c o n s i d e r e dt o b e p u t a t i v e v a s o p r e s s i n n e u r o n e s . F i v e c e l l s s h o w i n g ac o n t i n u o u s o r a s l o w i r r e g u l a r p a t t e r n o f f i r i n g r e m a i n e du n i d e n t i f i e d .E f f e c t o f m u s c i m o l o n t h e e l e c t r i c a l a c t i v i t y o fm a g n o c e l l u l a r n e u r o n e s . M u s c i m o l w a s t e s t e d o n s e v e no x y t o c i n n e u r o n e s ( f o u r i d e n t i f i e d t h r o u g h t h e m i l ke j e c t i o n r e f l e x , a n d t h r e e a c c o r d i n g t o t h e i r r e s p o n s e t o I . v .C C K ) , t w o u n i d e n t i f i e d m a g n o c e l l u l a r n e u r o n e s , a n d t h r e ep h a s i c c e l l s . I n s i x o u t o f s e v e n o x y t o ci n n e u r o n e s ,m u s c i m o l i n d u c e d a s i g n i f i c a n t d e c r e a s e i n t h e b a s a l f i r i n gr a t e . A t 1 5 n g ( F i g . 5 A ) t h e f i r i n g o f t h r e e c e l l s w a si n h i b i t e d f r o m 1 P 7 + 0 1 t o 0 1 6 + 0 - 2 H z , f o r 2 - 1 0 m i n , a n d

A

B

C

a t 2 0 n g ( F i g . 5 B ) t h e f i r i n g o f t h r ee o u t o f f o u r c e l l sd e c r e a s e d f r o m 3 - 9 + 0 9 t o 0 5 + 0 1 Hz f o r 1 3 - 2 1 m i n .F o r t h e n e u r o n e s i d e n t i f i e d i n r a t s d i s p l a y i n g r e f l e x m i l ke j e c t i o n s , t h i s e f f e c t w a s a c c o m p a n i e d a t 1 5 n g b y a ni n c r e a s e d d e l a y b e t w e e n h i g h f r e q u e n c y d i s c h a r g e s ( m i l ke j e c t i o n r a t i o s o f 2 f 0 a n d 3 7 ) . H i g h f r e q u e n c y b u r s t so c c u r r i n g a f t e r t h e a d m i n i s t r a t i o n o f t h e d r u g w e r e w i t h i nt h e s a m e r a n g e a s t h o s e o c c u r r i n g d u r i n g t h e p r e t r e a t m e n tp e r i o d . T h e 2 0 n g d o s e d i s r u p t e d t h e r e f l e x i n t w o a n i m a l su n t i l t h e e n d o f t h e e x p e r i m e n t ( a t l e a s t 4 5 m i n ) . I n t h et w o u n i d e n t i f i e d c e l l s t h e b a s a l f i r i n g r a t e w a s i n h i b i t e df r o m 3 - 3 + 0 ' 1 a n d 2 - 4 + 0 - 2 t o 0 1 + 0 - 1 a n d 05 + 0 - 1 Hzf o r 1 1 a n d 4 m i n , r e s p e c t i v e l y . Two p h a s i c n e u r o n e s w e r ei n h i b i t e d b y 2 0 n g m u s c i m o l f o r 8 a n d 1 5 m i n ( f i r i n g r a t ed e c r e a s i n g f r o m 4 - 7 + 2 - 3 t o 0 7 + 0 1 6 H z ; F i g . 5 C ) , w h i l en o e f f e c t w a s n o t e d f o r t h e p u t a t i v e v a s o p r e s s i n e r g i c c e l lw h i c h e x h i b i t e d l o n g s i l e n t p e r i o d s i n t h e p r e t r e a t m e n tp e r i o d . I n a l l c e l l s t e s t e d t h e l a t e n c y b e t w e e n i n j e c t i o n o fm u s c i m o l a n d o n s e t o f i n h i b i t i o n w a s l e s s t h a n 1 m i n .

M u s c i m o l ( 1 5 n g )

M u s c i m o l ( 2 0 n g )

M u s c i m o l ( 2 0 n g )

4 0 uC D )C oJ L A A A d d " L L i m i l ~ ~~ ~ ~ l o u 5 m i n

F i g u r e 5 . I n t r a c e r e b r o v e n t r i c u l a r i n j e c t i o n o f m u s c i m o l i n h i b i t s t h e f i r i n g o f m a g n o c e l l u l a rn e u r o n e sT h e e f f e c t s o f i . c . V . i n j e c t i o n s o f m u s ci m o l o n t h e e l e c t r i c a l a c t i v i t y o f o x y t o c i n c e l l s ( A a n d B ) , a n dv a s o p r e s s i n c e l l ( C ) a r e i l l u s t r a t e d . T h e d i f f e r e n t t r a c e s r e p r e s e n t t h e u n i t a c t i v i t y a n d t h e f i r i n g r a t ei n s p i k e s s - ' . A r r o w h e a d s r e p r e s e n t t h e i . C . v . i n j e c t i o n o f t h e d r u g . I n A , i . c . v . m u s c i m o l ( 1 5 n g )t r a n s i e n t l y i n h i b i t e d t h e b a c k g r o u n d f i r i n g o f o x y t o c i n n e u r o n e s , a n d d e l a y e d t h e o c c u r r e n c e o f h i g hf r e q u e n c y b u r s t s ( m a r k e d b y t h e d o t s ) . M u s c i m o l ( 2 0 n g ) a l s o h a d a n i n h i b i t o r y e f f e c t o n t h e e l e c t r i c a la c t i v i t y o f c o n t i n u o u s l y f i r i n g n e u r o n e s i d e n t i f i e d b y t h e i r r e s p o n s e t o i . v . C CK ( B ) , a n d o n p h a s i cn e u r o n e s ( C ) .

2 1 7. P h y s i o l . 4 8 3 . 1



8/15

D . L . V o i s i n , A . E . H e r b i s o n a n d D . A . P o u l a i nE f f e c t o f b i c u c u l l i n e o n t h e e l e c t r i c a l a c t i v i t y o fm a g n o c e l l u l a r n e u r o n e s . B i c u c u l l i n e w a s t e s t e d o n s e v e no x y t o c i n n e u r o n e s ( a l l i d e n t i f i e d t h r o u g h t h e m i l k e j e c t i o nr e f l e x ) , t h r e e u n i d e n t i f i e d c e l l s , a n d f i v e p h a s i c n e u r o n e s .I n t r a c e r e b r o v e n t r i c u l a r i n j e c t i o n o f 0 4 1 2 4 a g b i c u c u l l i n es i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d t h e b a s a l f i r i n g o f s i x o u t o f s i xo x y t o c i n c e l l s f o r 2 - 1 8 m i n ( 1 P 2 + 3 * 1 m i n ) w i t h f i r i n gr a t e s c h a n g i n g f r o m 5 - 6 + 1 P 9 t o 2 - 0 + 1 P 3 H z . I n t h r e e

A

B

C

D

c e l l s , b i c u c u l l i n e h a d a d u a l e f f e c t o n t h e b a c k g r o u n d f i r i n gs i n c e n e u r o n e s w e r e a c t i v a t e d f o r a s h o r t t i m e , b e f o r e b e i n gi n h i b i t e d . T h e a c t i v a t i o n l a s t e d f r o m 3 0 s t o 3 min a n dr e s u l t e d i n a mean i n c r e a s e o f 1 P 0 + 0 4 Hz o v e r t h ep r e v i o u s b a s a l f i r i n g r a t e . I n t h e t h r ee o t h e r o x y t o c i nn e u r o n e s o n l y t h e i n h i b i t o r y e f f e c t w a s s e e n ( F i g . 6A a n dB ) . I n t h r e e a n i m a l s f o r w h i c h e n o u g h h i g h f r e q u e n cyb u r s t s w e r e r e c o r d e d , t h e e f f e c t o n t h e b a c k g r o u n d f i r i n g

B i c u c u l l i n e ( 0 1 2 u t g )

_______ V~ ~ ~ ~ ~* * * a_~~~~~~ [ _ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ i

B i c u c u l l i n e ( 0 - 1 2 i g )V K \ -~ ~ ~ ~ ~ ~ . I

B i c u c u l l i n e ( 0 1 2 u g )V

B i c u c u l l i n e ( 0 - 1 2 u g )

5 m i n

I 4 0 u t04 Q c n0 * 5 .U O

F i g u r e 6 . I n t r a c e r e b r o v e n t r i c u l a r i n j e c t i o n o f b i c u c u l l i n e i n h i b i t s t h e f i r i n g o f m a g n o c e l l u l a rn e u r o n e sT h e e f f e c t s o f I . c . V . i n j e c t i o n s o f b i c u c u l l i n e o n t h e e l e c t r i c a l a c t i v i t y o f o x y t o c i n c e l l s ( A a n d B ) , v a s o -p r e s s i n c e l l s ( C ) a n d c o n t r o l c e l l s ( D ) a r e i l l u s t r a t e d . T h e d i f f e r e n t t r a c e s r e p r e se n t t he i n t r a -mammary p r e s s u r e , t h e u n i t a c t i v i t y a n d t h e f i r i n g r a t e i n s p i k e s s ' . A r r o w h e a d s r e p r es e n t t h ei . C . V . i n j e c t i o n o f t h e d r u g . E a c h c i r c l e m a r k s t h e o c c u r r e n c e o f a r e f l e x m i l k e j e c t i o n - r e l a t e d b u r s t .B i c u c u l l i n e ( 0 ' 1 2 , u g ) i n h i b i t e d t h e b a c k g r o u n d f i r i n g o f o x y t o c i n n e u r o n e s a n d d e l a y e d t h eo c c u r r e n c e o f t h e c o m i n g h i g h f r e q u e n c y b u r s t ( A a n d B ) . I n s o m e c e l l s a t w o - s t e p e f f e c t o n t h eb a c k g r o u n d f i r i n g w a s o b s e r v e d , s i n c e i n h i b i t i o n w a s p r e c e d e d b y a t r a n s i e n t a c t i v a t i o n ( B ) . Ani n h i b i t o r y e f f e c t w a s a l s o o b s e r v e d i n p h a s i c n e u r o n e s ( C ) , a l t h o u g h i n m o s t o f t h e c o n t r o l n e u r o n e sa n a c t i v a t i o n w a s s e e n a f t e r i . c . V . b i c u c u l l i n e ( D ) .

J . P h y s i o l . 4 8 3 . 12 1 8



9/15

J 8 G A B A e r g i c c o n t r o l o f t h e m i l k e j e c t i o n r e f l e xw a s a c c o m p a n i e d b y a n i n c r e a s e d d e l a y b e t w e e nn e u r o s e c r e t o r y b u r s t s ( m i l k e j e c t i o n r a t i o s o f 2 - 7 , 4 - 6 a n d5 0 ) . H i g h f r e q u e n c y b u r s t s o c c u r r i n g a f t e r t h ea d m i n i s t r a t i o n o f t h e d r u g w e r e i n t h e s a m e r a n g e o fa m p l i t u d e a s t h o s e o c c u r r i n g d u r i n g t h e p r e t r e a t m e n tp e r i o d . A l o w e r d o s e o f b i c u c u l l i n e ( 0 0 1 u s g ) w a s a l s o t e s t e di n o n e o x y t o c i n c e l l a n d n o a l t e r a t i o n i n t h e b a s a l f i r i n gr a t e o r i n t h e a m p l i t u d e a n d f r e q u e n c y o f h i g h f r e q u en c yb u r s t s w a s o b s e r v e d . T h e e f f e c t s o f a l a r g e r d o s e o fb i c u c u l l i n e , 0 3 0 j u g , w e r e e x a m i n e d i n t w o u n i d e n t i f i e dn e u r o n e s w i t h a b a s a l f i r i n g r a t e o f 1 - 2 + 0 1 a n d1 P 7 + 0 1 H z . I n b o t h c e l l s , a b r i e f a c t i v a t i o n ( 3 0 - 6 0 s ) o ft h e e l e c t r i c a l a c t i v i t y u p t o 4 Hz w a s o b s e r v e d , t h e n a t o t a li n h i b i t i o n ( 1 - 3 m i n ) , b e f o r e t h e c e l l w a s l o s t b e c a u s e o f t h ec o n v u l s i o n s o f t h e a n i m a l . A n o t h e r u n i d e n t i f i e d s l o wi r r e g u l a r l y f i r i n g n e u r o n e w a s i n h i b i t e d ( f r o m 0 - 8 + 0 1 t o0 O 0 2 + 0 . 0 1 H z ) f o r 1 2 m i n b y 0 O 1 2 / s g b i c u c u l l i n e . T h ef i r i n g o f f o u r p u t a t i v e v a s o p r e s s i n e r g i c n e u r o n e s w a s a l s oi n h i b i t e d b y i . c . v . i n j e c t i o n o f 0 1 2 j u g b i c u c u l l i n e f r o m4 ' 2 + 1 . 5 t o 1 P 1 + 1 P 0 Hz f o r 5 - 2 3 m i n , b u t t h i s e f f e c t w a sn e v e r p r e c e d e d b y a c t i v a t i o n ( F i g . 6 C ) . T h e l o w es t d o se o fb i c u c u l l i n e ( 0 0 1 , u g ) i n h i b i t e d o n e p h a s i c a l l y b u r s t i n g c e l lf o r a p e r i o d o f 5 m i n ( f i r i n g d e c r e a s i n g f r o m 2 - 2 + 0 1 t o0 - 8 + 0 . 1 H z ) . I n a l l c a s e s , c h a n g e s i n f i r i n g b e g a n w i t h i n1 m i n o f b i c u c u l l i n e i n j e c t i o n .E f f e c t o f m u s c i m o l and b i c u c u l l i n e o n c o n t r o l c e l l s .R e c o r d i n g s w e r e m a d e f r o m t w e l v e c e l l s w i t h s p o n t a n e o u sf i r i n g r a t e r a n g i n g f r o m 2 - 0 + 0 - 1 t o 2 5 - 2 + 0 . 1 H z , w h i c h

. 3 V

w e r e n o t a n t i d r o m i c a l l y d r i v e n , a n d w e r e f o u n d t o b el o c a t e d i m m e d i a t e l y a b o v e t h e s u p r a o p t i c n u c l e u s . O ft h e s e , e i g h t w e r e t e s t e d w i t h 0 1 2 j u g b i c u c u l l i n e i n j e c t e di . c . v . : f i v e w e r e a c t i v a t e d ( f r o m 2 - 1 + 0 9 p r i o r t o4 - 1 + 0 9 Hz a f t e r i . c . v . ; F i g . 6 D ) , t w o i n h i b i t e d ( f r o m2 - 4 + 1 1 t o 0 . 5 + 04 H z ) , a n d o n e u n a f f e c t e d . T h e e f f e c t so f I . c . v . m u s c i m o l ( 1 5 n g ) o n t h e e l e c t r i c a l a c t i v i t y w a st e s t e d o n t w o c e l l s w h i c h w e r e i n h i b i t e d , a n d t w o o t h e r sw h i c h w e r e u n a f f e c t e d .E f f e c t s o f m i cr o i n f u s i o n s o f m u s c i m o l and b i c u c u l l i n ed i r e c t l y i n t o t h e s u p r a o p t i c n u c l e i o n t h e p a t t e r n o ft h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x and EEG a c t i v i t yS e v e n t y p e r c e n t o f t h e a n a es t h e t i z e d r a t s ( n = 3 0 )d i s p l a y e d t h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x d u r i n g s u c k l i n g . T h ed e l a y t o t h e f i r s t m i l k e j e c t i o n v a r i e d f r o m 8 t o 4 4 m i n( m e d i a n = 1 8 m i n ) . S u b s e q u e n t r e f l e x m i l k e j e c t i o n so c c u r r e d a t i n t e r v a l s f r o m 5 - 8 + 1 P 4 t o 8 & 0 + 1 P 6 m i n( r a n g e o f t h e m e a n o f t h e e x p e r i m e n t a l g r o u p s i n t h e p r e -t e s t p e r i o d ) . B i l a t e r a l m i c r o i n f u s i o n s o f ACSF a l o n e d i d n o tm o d i f y t h e p a t t e r n o f t h e r e f l e x i n a n y a n i m a l o f t h ec o n t r o l g r o u p ( n = 4 ) ; t h e m e a n m i l k e j e c t i o n r a t i o w a se q u a l t o 1 P 4 + 0 1 . I n t h e t w o r a t s w h i c h r e c e i v e d a 2 %ammonium f e r r o u s s u l p h a t e s o l u t i o n , t h e f l u i d d i f f u s e d o u to f t h e i n f u s i o n c a n n u l a i n a s p h e r i c a l m a n n e r t o i n c l u d e t h es u p r a o p t i c n u c l e u s a n d t h e a d j a c e n t d o r s a l a n d l a t e r a lp e r i n u c l e a r r e g i o n s ( F i g . 7 ) . T h e a v e r a g e r a d i u s o f f l u i ds p r e a d f r o m t h e t i p o f t h e i n f u s i o n c a n n u l a e w a s4 0 0 + 2 5 , m .

S O N %i4 k , .

Oc

F i g u r e 7 . F l u i d s p r e a d f o l l o wi n g m i cr o i n f u s i o n i n t o t h e s u p r a o p t i c n u c l e u sP h o t o m i c r o g r a p h o f c o r o n a l s e c t i o n t h r o u g h t h e s u p r a o p ti c n u c l e u s ( S O N ) s h o w i n g t h e r e g i o n o f f l u i ds p r e a d f o l l o w i n g a 4 0 0 n l i n f u s i o n o f a n i r o n s u l p h a t e s o l u t i o n . N o t e t h a t f l u i d d i f f u s i o n i n c l u d ed t h eSON a n d t h e a d j a c e n t d o r s a l a n d l a t e r a l p e r i n u c l e a r r e g i o n s . O C , o p t i c c h i a s m a ; 3 V , t h i r d v e n t r i c l e .C a l i b r a t i o n b a r , 0 5 mm.

J . P h y s i o l . 4 8 3 . 1 2 1 9



10/15

2 2 0A

J . P h y s i o l . 4 8 3 . 1D . L . V o i s i n , A . E . H e r b i s o n a n d D . A . P o u l a i n

M u s c i m o l ( 4 0 n g )V

1 0 mm H g5 m i n

B

B i c u c u l l i n e ( 0 - 1 5 u s g )V

B i c u c u l l i n e ( 0 - 1 5 u g )V

- - - - , _ y < X t o 1 0 mmHg5 m i n O x y

Figure 8 . B i l a t e r a l m i cr o i n f u si o n s o f b o t h m u s c i m o l and b i c u c u l l i n e i n t o t h e s u p r a o p t i c n u c l e ii n h i b i t t h e m i l k e j e c t i o n r e f l e xT h e e f f e c t s on t h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x o f m i c r o i n f u s i o n s ( h o r i z o n t a l b a r ) o f ACSF c o n t a i n i n g4 0 ng m l - ' o f m u s c i m o l ( A ) o r 0 1 5 j u g j u l 1 b i c u c u l l i n e ( B ) a re i l l u s t r a t e d i n i n d i v i d u a l l a c t a t i n g r a t s .T h e t o p l i n e s h o w s a d i a g r a m m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f e a c h r e f l e x m i l k e j e c t i o n ( v e r t i c a l b a r ) o c c u r r i n gd u r i n g t h e t i m e o f t h e e x p e r i m e n t . A c t u a l i n t r a m a m m a r y pressure r e c o r d i n g s ( b o t t o m t r a c e ) f o r t h ep e r i o d s s h a d e d on t h e t o p l i n e a re g i v e n b e l o w a t an e x p a n d e d s c a l e . I n t h e a n i m a l i l l u s t r a t e d i n B as e c o n d b i l a t e r a l m i c r o i n f u s i o n i n t o t h e s u p r a o p t i c n u c l e i ( 1 0 0 n l o f a b i c u c u l l i n e s o l u t i o n a t0 1 5 j u g f l F ' ) p e r f o r m e d a f t e r t h e r e f l e x h a d r e co v er e d i n d u ce d a f u r t h e r i n h i b i t i o n o f t h e m i l ke j e c t i o n r e f l e x . S t a r s mark s p o n t a n e o u s o s c i l l a t i o n s i n intrammmary pressure u n r e l a t e d t o h i g hf r e q u e n c y m i l k e j e c t i o n s . S u c h s p o n t a n e o u s o s c i l l a t i o n s were o b s e r v e d i n some a n i m a l s b u t noc o n s i s t e n t r e l a t i o n s h i p w i t h d r u g i n f u s i o n was d e t e r m i n e d .

B i l a t e r a l m i c r o i n f u s i o n s i n t o t h e s u p r a o p t i c n u c l e i o f 4 0 0 n lo f a m u s c i m o l s o l u t i o n a t 2 0 , 4 0 a n d 1 0 0 ng m l - ' i n h i b i t e dt h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x i n 2 / 3 , 2 / 3 a n d 4 / 4 a n i m a l s ,r e s p e c t i v e l y ( F i g . 8 A ; P < 0 0 2 ) . T h e mean m i l k e j e c t i o nr a t i o i n e a c h g r o up was r e s p e c t i v e l y 2 - 2 + 0 4 , 3 - 3 + 1 P 4a n d 5 - 4 + 2 - 6 . A c o r r e l a t i o n b e t w e e n t he d o s e o f m u s c i m o li n j e c t e d a n d t h e d u r a t i o n o f i n h i b i t i o n f a i l e d t o r e a c hs i g n i f i c a n c e ( r = 5 3 ; P= 0 5 3 ) . D u r i n g t h e p e r i o d o fi n h i b i t i o n o f t h e r e f l e x , t h e mammary g l a n d r e m a i n e dr e s p o n s i v e t o e x o g e n o u s o x y t o c i n , a n d no a l t e r a t i o n o f t h eEEG was o b s e r v e d i n t h e t h r e e a n i m a l s i n w h i c h i t wasr e c o r d e d . I n m o s t c a s e s , t h e i n h i b i t o r y e f f e c t o c c u r r e d a tt h e e n d o f t h e p e r i o d o f i n f u s i o n , a n d was s o m e t i m e sd e l a y e d . I n two o t h e r r a t s i n w h i c h t h e i n f u s i o n c a n n u l a ewere p o s i t i o n e d i n s u c h a way t h a t o n l y one s u p r a o p t i cn u c l e u s was l i k e l y t o h a v e b e e n i n f l u e n c e d b y t h e i n f u s i o n ,m u s c i m o l a t 2 0 a n d 4 0 ng m l - ' f a i l e d t o i n h i b i t t h e m i l ke j e c t i o n r e f l e x .B i l a t e r a l m i c r o i n f u s i o n s i n t o t h e s u p r a o p t i c n u c l e i o f 4 0 0 n lo f a b i c u c u l l i n e s o l u t i o n a t 0 - 1 5 mg m l - ' i n h i b i t e d t h e m i l k

e j e c t i o n r e f l e x i n 5 / 5 a n i m a l s ( F i g . 8 B ; P < 0 0 2 ) . Themean m i l k e j e c t i o n r a t i o was 5 - 8 + 1 2 . T h e EEG wasr e c o r d e d i n two cases a n d was n o t d e s y n c h r o n i z e d d u r i n gm i c r o i n f u s i o n s , a n d no a n i m a l s h o w e d any s i g n o fc o n v u l s i o n s . No a l t e r a t i o n s i n mammary s e n s i t i v i t y t oe x o g e n ous o x y t o c i n were n o t e d d u r i n g t h e p e r i o d o fi n h i b i t i o n o f t h e r e f l e x . T h e i n h i b i t o r y e f f e c t o f b i c u c u l l i n ea l w a y s a p p e a r e d b e f o r e t h e e n d o f t h e d u r a t i o n o fm i c r o i n f u s i o n . I n one r a t a s e c o n d b i l a t e r a l m i c r o i n f u s i o ni n t o t h e s u p r a o p t i c n u c l e i ( 1 0 0 n l o f a b i c u c u l l i n e s o l u t i o na t 0 - 1 5 # s g 4 t s - F , f o r 3 m i n ) p e r f o r m e d a f t e r t h e r e f l e xr e c o v e r e d a g a i n i n h i b i t e d t h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x ( F i g . 8 B ) .

DISCUSSIONI n c o n j u n c t i o n w i t h t h e w e a l t h o f e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l a n dm o r p h o l o g i c a l i n f o r m a t i o n i n d i c a t i n g a s u b s t a n t i a lG A B A e r g i c i n n e r v a t i o n o f t h e s u p r a o p t i c n u c l e u s ( N i c o l l &B a r k e r , 1 9 7 1 ; B i o u l a c e t a l . 1 9 7 8 ; A r n a u l d e t a l . 1 9 8 3 ;T h e o d o s i s e t a l . 1 9 8 6 ; M a s o n e t a l . 1 9 8 7 ; R a n d l e & R e n a u d ,1 9 8 7 ; D e c a v e l & V an De n P o l , 1 9 9 0 ; W u a r i n & D u d e k ,

1 0 m i n

1 0 m i nI F I I - - - - 1 -

http://jp.physoc.org/http://jp.physoc.org/http://jp.physoc.org/http://jp.physoc.org/


11/15

J y 8 G A B A e r g i c c o n t r o l o f t h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x1 9 9 3 ; G i e s & T h e o d o s i s , 1 9 9 4 ) , i t h a s n o t b e e n s u r p r i s i n g t oo b s e r v e i n o u r e x p e r i m e n t s t h a t m u s c i m o l i n h i b i t e d t h ee l e c t r i c a l a c t i v i t y o f o x y t o c i n n e u r o n e s a n d t h e m i l ke j e c t i o n r e f l e x i n s u c k l e d r a t s . A l t h o u g h t h e c o n c e n t r a t i o n so f m u s c i m o l r e q u i r e d t o i n h i b i t t h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x w e r es i m i l a r t o t h o s e u s e d b y o t h e r s t o s h o w t h a t I . c . v . m u s c i m o li n h i b i t s o x y t o c i n r e l e a s e i n d u c e d b y h a e m o r r h a g e a n dh y p e r t o n i c s a l i n e i n f u s i o n ( B i s s e t , C h o w d r e y , F a i r h a l l &G u n n , 1 9 9 0 ; R o b e r t s & R o b i n s o n , 1 9 9 1 ) , t h e y w e r e h i g hc o m p a r e d w i t h t h o s e u s e d i n e x p e r i m e n t s e l s e w h e r e i n t h eh y p o t h a l a m u s ( O s b o r n e , M a t a g a , O n o e & W a t a n a b e , 1 9 9 3 ;T o m i n a g a , S h i b a t a , Hamada & W a t a n a b e , 1 9 9 4 ) . T h i s i sl i k e l y t o r e s u l t f r o m t h e s u b s t a n t i a l h e t e r o g e n e i t y knownt o e x i s t a m o n g s t GABAA r e c e p t o r s w h e r e d i f f e r e n t s u b u n i tc o m b i n a t i o n s s h o w v a r y i n g a f f i n i t i e s f o r m u s c i m o l( M c K e r n a n e t a l . 1 9 9 1 ; S i v i l o t t i & N i s t r i , 1 9 9 1 ) . A t p r e s e n t ,t h e p r e c i s e s u b u n i t c o n f o r m a t i o n o f t h e GABAA r e c e p t o r se x p r e s s e d b y m a g n o c e l l u l a r n e u r o n e s i s n o t k n o w n b u tr e c e n t w o r k i n d i c a t e s t h a t o x y t o c i n c e l l s l o c a t e d i n t h es u p r a o p t i c n u c l e u s e x p r e s s a c l , a 2 , / 1 3 a n d Y 2 s u b u n i t s o f t h eGABAA r e c e p t o r ( F e n e l o n , S e i g h a r t & H e r b i s o n , 1 9 9 4 ;H e r b i s o n , 1 9 9 4 ; V . F e n e l o n & A . E . H e r b i s o n , u n p u b l i s h e do b s e r v a t i o n s ) . I r r e s p e c t i v e o f t h e p r e c i s e n a t u r e o f t h eGABAA r e c e p t o r s a c t i v a t e d i n o u r s t u d y , h o w e v e r , t h ec l e a r d o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n i . c . v . m u s c i m o la n d m i l k e j e c t i o n r e f l e x i n h i b i t i o n a r g u e s i n f a v o u r o f ap h y s i o l o g i c a l l y r e l e v a n t a c t i v a t i o n o f t h e s e r e c e p t o r s .E x p e r i m e n t a l e v i d e n c e i n d i c a t e s t h a t GABAA r e c e p t o r sl o c a t e d i n t h e n e u r o h y p o p h y s i s may r e g u l a t e o x y t o c i nr e l e a s e i n t o t h e b l o o d s t r e a m ; G A B A e r g i c n e r v e t e r m i n a l sh a v e b e e n o b s e r v e d o n n e u r o s e c r e t o r y n e r v e e n d i n g s i n t h en e u r o h y p o p h y s i s ( O e r t e l e t a l . 1 9 8 2 ) w h e r e l o w a f f i n i t yGABAA r e c e p t o r s a r e l o c a t e d ( M a t h i s o n & D r e i f u s s , 1 9 8 0 )a n d G A B A - a c t i v a t e d c h l o r i d e c h a n n e l s h a v e b e e ni d e n t i f i e d ( Z h a n g & J a c k s o n , 1 9 9 3 ) . F u r t h e r , t h e a c t i v a t i o no f t h e s e GABAA r e c e p t o r s i n h i b i t s o x y t o c i n r e l e a s e f r o mt h e i s o l a t e d n e u r o h y p o p h y s i s ( D y b a l l & S h a w , 1 9 7 9 ) . Weh a v e b e e n c a r e f u l i n t h i s s t u d y t o e n s u r e t h a t t h e e f f e c t s w eo b s e r v e d d i d n o t o r i g i n a t e f r o m t h e n e u r a l l o b e .P r i n c i p a l l y , m i l k e j e c t i o n s e v o k e d b y e l e c t r i c a l s t i m u l a t i o no f t h e p i t u i t a r y s t a l k w e r e n o t a l t e r e d f o l l o w i n g m u s c i m o lo r b i c u c u l l i n e i n f u s i o n s i n t o t h e t h i r d v e n t r i c l e .F u r t h e r m o r e , d u r i n g b o t h i . c . v . a n d m i c r o i n f u s i o ne x p e r i m e n t s , a n o r m a l m i l k e j e c t i o n c o u l d a l w a y s b ee v o k e d b y t h e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f o x y t o c i n ,s h o w i n g t h a t t h e s e n s i t i v i t y o f t h e mammary g l a n d w a sn o t a l t e r e d . I n s o m e a n i m a l s r e c u r r e n t o s c i l l a t i o n s i n i n t r a -mammary p r e s s u r e w e r e o b s e r v e d , b u t t h e y h a d n oc o n s i s t a n t r e l a t i o n s h i p t o t h e a d m i n i s t r a t i o n o f c o n t r o ls a l i n e , m u s c i m o l o r b i c u c u l l i n e . T h e s e o s c i l l a t i o n s , w h i c ha r e n o t c o r r e l a t e d t o t h e h i g h f r e q u e n c y d i s c h a r g e so b s e r v e d i n o x y t o c i n n e u r o n e s e v o k e d b y s u c k l i n g , a r et h o u g h t t o r e s u l t f r o m a p a r t i c u l a r m o d e o f mammaryg l a n d r e s p o n s e t o m o d e r a t e b u t s u s t a i n e d i n c r e a s e s i n t h eb a s a l a c t i v i t y o f o x y t o c i n n e u r o n e s ( P o u l a i n & T a s k e r ,1 9 8 5 ) .

T h e p r e c i s e s i t e a t w h i c h m u s c i m o l a c t s i n t h eh y p o t h a l a m u s t o i n h i b i t t h e h i g h f r e q u e n c y b u r s t i n g o fo x y t o c i n n e u r o n e s d u r i n g s u c k l i n g i s n o t k n o w n . C l e a r l y ,t h e i . c . v . r o u t e o f a d m i n i s t r a t i o n a l l o w s l i t t l e s p e c i f i c i t y i nd e t e r m i n i n g t h i s s i t e . I n a n a t t e m p t t o d e f i n e b e t t e r t h el o c a t i o n o f m u s c i m o l a c t i o n , we h a v e c a r r i e d o u t a s e r i e s o fb i l a t e r a l s u p r a o p t i c n u c l e u s m i c r o i n f u s i o n e x p e r i m e n t sw h e r e we e st i ma t e t h e d i f f u s i o n r a d i u s t o b e a p p r o x i m a t e l y0 4 mm. A l t h o u g h we d o n o t k n o w i f t h e s p r e a d o f i r o ns u l p h a t e t h r o u g h n e r v o u s t i s s u e i s e q u i v a l e n t t o t h a t o fG A B A - r e l a t e d c o m p o u n d s , t h e a b s e n c e o f a n y e f f e c t s o nt h e EEG f o l l o w i n g m i c r o i n f u s i o n e x p e r i m e n t s c o m p a r e dw i t h i . c . v . a d m i n i s t r a t i o n i n d i c a t e s t h a t t h e s e t w oa p p r o a c h e s a r e n o t e q u i v a l e n t i n t h e n e u r o n a l s i t e s t h e yr e a c h . W i t h p r e s e n t t e c h n o l o g y , t h e r e f o r e , t h em i c r o i n f u s i o n e x p e r i m e n t s p r o v i d e t h e b e s t p o s s i b l e i nv i v o e v i d e n c e t h a t a c t i v a t i o n o f GABAA r e c e p t o r s l o c a t e dw i t h i n a n d / o r n e a r b y t h e s u p r a o p t i c n u c l e u s c a ne f f e c t i v e l y i n h i b i t t h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x i n l a c t a t i n g r a t s .C e r t a i n l y , s u p r a o p t i c o x y t o c i n n e u r o n e s r e c e i v e d i r e c tG A B A e r g i c i n p u t s ( T h e o d o s i s e t a l . 1 9 8 6 ; D e c a v e l & VanD e n P o l , 1 9 9 0 ; G i e s & T h e o d o s i s , 1 9 9 4 ) a n d e x p r e s s GABAAr e c e p t o r s ( F e n e l o n e t a l . 1 9 9 4 ; H e r b i s o n , 1 9 9 4 ) , a n ds u p r a o p t i c m a g n o c e l l u l a r n e u r o n e s a r e h y p e r p o l a r i z e d b yd i r e c t a p p l i c a t i o n o f GABA a c t i n g t h r o u g h GABAAr e c e p t o r s ( M a s o n e t a l . 1 9 8 7 ; R a n d l e & R e n a u d , 1 9 8 7 ) .H e n c e i t i s n o t u n r e a s o n a b l e t o t h i n k t h a t t h e i n h i b i t o r ye f f e c t s o f m u s c i m o l o n b o t h t h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x a n d t h ea c t i v i t y o f i d e n t i f i e d o x y t o c i n n e u r o n e s r e s u l t e d f r o md i r e c t a c t i o n s o n s u p r a o p t i c m a g n o c e l l u l a r c e l l s . S i n c ea p p r o x i m a t e l y 75% o f m a g n o c e l l u l a r o x y t o c i n n e u r o n e sa c t i v a t e d b y s u c k l i n g a r e f o u n d i n t h e s u p r a o p t i c n u c l e i( P o u l a i n & W a k e r l e y , 1 9 8 2 ) , i t i s n o t s u r p r i s i n g t o f i n d t h a tb i l a t e r a l s u p r a o p t i c i n f u s i o n s o f m u s c i m o l w e r e s u f f i c i e n t o nt h e i r own t o i n h i b i t t h e r e f l e x , w h i c h i s k n o w n t o c o n t i n u eu n a b a t e d i n a n i m a l s w i t h c o m p l e t e l e s i o n s o f t h ep a r a v e n t r i c u l a r n u c l e i ( W a k e r l e y , J u s s , F a r r i n g t o n &I n g r a m , 1 9 9 0 ) . T h e f a c t t h a t i n f u s i o n i n t o o n e s u p r a o p t i cn u c l e u s f a i l e d t o i n h i b i t t h e r e f l e x , s u g g e s t s t h a t a c r i t i c a ln u m b e r o f o x y t o c i n n e u r o n e s m u s t b e i n h i b i t e d t o p r e v e n tt h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x f r o m o c c u r r i n g .T h e m o s t i n t r i g u i n g f i n d i n g o f t h i s s t u d y h a s b e e n t h eo b s e r v a t i o n t h a t b i c u c u l l i n e a l s o i n h i b i t e d t h e m i l k e j e c t i o nr e f l e x a n d t h e h i g h f r e q u e n c y d i s c h a r g e s o f s u p r a o p t i co x y t o c i n n e u r o n e s i n r e s p o n s e t o s u c k l i n g . A s s l o w w a v es l e e p i s a p r e r e q u i s i t e f o r t h e o c c u r r e n c e o f t h e m i l k e j e c t i o nr e f l e x i n t h e r a t ( L i n c o l n , H e n t z e n , H i n , v a n d e r S c h o o t ,C l a r k e & S u m m e r l e e , 1 9 8 0 ) , i t c a n b e a r g u e d t h a t t h e EEGd i s t u r b a n c e f o l l o w i n g i . c . v . i n j e c t i o n o f b i c u c u l l i n ec o n t r i b u t e d t o t h e i n h i b i t i o n o f t h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x .H o w e v e r , i f t h i s w a s t h e o n l y f a c t o r i n h i b i t i n g t h e r e f l e xwe w o u l d h a v e e x p e c t e d t o s e e m i l k e j e c t i o n s r e t u r n a s t h eEEG r e s u m e d t h e s l o w w a v e p a t t e r n . T h a t t h i s w a s n o t t h ec a s e , w i t h t h e p e r i o d o f m i l k e j e c t i o n i n h i b i t i o n g r e a t l ye x c e e d i n g t h a t o f t h e EEG d i s t u r b a n c e s , i n d i c a t e d a m o r ed i r e c t e f f e c t o f GABAA r e c e p t o r b l o ck a d e o n t h e e l e c t r i c a l

J . P h y s i o l . 4 8 3 . 1 2 2 1



12/15

2 2 2 D . L . V o i s i n , A . E . H e r b i s o n a n d D . A . P o u l a i n J . P h y 8 i o l . 4 8 3 . 1a c t i v i t y o f o x y t o c i n n e u r o n e s . O u r m i c r o i n f u s i o ne x p e r i m e n t s s u p p o r t t h i s c o n t e n t i o n , a s b i l a t e r a l i n f u s i o n so f b i c u c u l l i n e i n t o t h e s u p r a o p t i c n u c l e i w e r e h i g h l ye f f e c t i v e i n i n h i b i t i n g t h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x w i t h o u ta l t e r i n g t h e E E G . S u c h o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t t o n i cGABA a c t i v i t y w i t h i n t h e s u p r a o p t i c n u c l e u s a n d / o r i t si m m e d i a t e v i c i n i t y i s r e q u i r e d f o r t h e n o r m a l h i g hf r e q u e n c y b u r s t i n g b e h a v i o u r o f o x y t o c i n n e u r o n e s i nr e s p o n s e t o s u c k l i n g .W h i l s t t h e i n v i v o i n h i b i t o r y a c t i o n s o f m u s c i m o l a r e e a s i l yu n d e r s t o o d a n d a r e , i n e s s e n c e , a n e x t e n s i o n o f p r e v i o u s i nv i t r o e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l f i n d i n g s r e l a t i n g t o GABA i n t h es u p r a o p t i c n u c l e u s ( M a s o n e t a l . 1 9 8 7 ; R a n d l e & R e n a u d ,1 9 8 7 ) , t h e n a t u r e o f b i c u c u l l i n e ' s i n h i b i t o r y e f f e c t s a r e n o tc l e a r . T h e s i t e o f b i c u c u l l i n e ' s i n h i b i t o r y a c t i o n may b ee i t h e r t h e s a m e a s t h a t o f m u s c i m o l , f o r e x a m p l e , d i r e c t l yo n t h e m a g n o ce l l u l a r n e u r o n e s , o r d i f f e r e n t f r o m t h a t o fm u s c i m o l . I n t h e f o r m e r c a s e , i t i sw o r t h n o t i n g t h a t a l ls p o n t a n e o u s i n h i b i t o r y p o s t s y n a p t i c p o t e n t i a l s i n m a g n o -c e l l u l a r n e u r o n e s o r i g i n a t e f r o m a c t i o n s o f GABA o n t h eGABAA r e c e p t o r ( R a n d l e & R e n a u d , 1 9 8 7 ; W u a r i n &D u d e k , 1 9 9 3 ) . A s e l s e w h e r e i n t h e b r a i n ( O t i s , S t a l e y &M o d y , 1 9 9 1 ) , i t s e e m s v e r y l i k e l y , t h e r e f o r e , t h a t s u p r a -o p t i c o x y t o c i n n e u r o n e s a r e s u b j e c t t o a s p o n t a n e o u s a n dc o n s t a n t b a r r a g e o f GABA r e l e a s e u n d e r n o r m a lc i r c u m s t a n c e s ( W u a r i n & D u d e k , 1 9 9 3 ) . What f u n c t i o n t h i so n - g o i n g b o m b a r d m e n t s e r v e s i s n o t k n o w n a l t h o u g h i t h a sb e e n s u g g e s t e d t o p l a y a r o l e i n l i m i t i n g t h e e f f e c t o fe x c i t a t o r y i n p u t w i t h i n n e u r a l s y s t e m s ( O t i s e t a l . 1 9 9 1 ) .A l t h o u g h we s h o w h e r e t h a t t h e r e m o v a l o f GABAAr e ce p t o r - me d i a t e d e v e n t s b y b i c u c u l l i n e d o e s n o t r e s u l t i ne p i l e p t i c a c t i v i t y b y t h e o x y t o c i n n e u r o n e s , we c a n n o td i s c o u n t t h e p o s s i b i l l i t y t h a t t h e a c u t e w i t h d r a w l o f GABAa c t i o n s may h a v e m o r e s u b t l e e f f e c t s i n a l t e r i n g t h e b a l a n c eo f e x c i t a t o r y a n d i n h i b i t o r y i n f l u e n c e s i m p o r t a n t f o rg e n e r a t i n g h i g h f r e q u e n c y b u r s t i n g i n o x y t o c i n n e u r o n e s .A l t e r n a t i v e l y , m u s c i m o l a n d b i c u c u l l i n e ma y h a v ed i f f e r e n t s i t e s o f a c t i o n w i t h i n t h e s u p r a o p t i c n u c l e u s a n di t s i m m e d i a t e v i c i n i t y . R e c e n t e v i d e n c e i n d i c a t e s t h a tl i g a n d s o f t h e GABAA r e c e p t o r s u c h a s m u s c i m o l a n db i c u c u l l i n e e x h i b i t v a r i a b i l i t y i n t h e i r a f f i n i t y f o r t h eGABAA r e c e p t o r d e p e n d i n g o n i t s s u b t y p e c o m p o s i t i o n( M c K e r n a n e t a l . 1 9 9 1 ; S i v i l o t t i & N i s t r i , 1 9 9 1 ; B u r e a u &O l s e n , 1 9 9 3 ) . T h u s , s u c h r e l a t i v e d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h es u p r a o p t i c n u c l e u s a n d n e u r o n e s i n i t s i m m e d i a t e v i c i n i t ymay u n d e r l y t h e common a c t i o n s o f a g o n i s t a n da n t a g o n i s t . F o r e x a m p l e , i m m u n o c y t o c h e m i c a l s t u d i e sh a v e s h o w n t h a t c e l l s e x p r e s s i n g GABAA r e c e p t o r s a r ep l e n t i f u l i n t h e p e r i n u c l e a r z o n e o f t h e s u p r a o p t i c n u c l e u s( H e r b i s o n , 1 9 9 4 ) a n d t h e r e i s e v i d e n c e t o s u g g e s t t h a tn e u r o n e s i n t h i s r e g i o n i n n e r v a t e m a g n o ce l l u l a r n e u r o n e s( T r i b o l l e t , A r m s t r o n g , D u b o i s - D a u p h i n & D r e i f u s s , 1 9 8 5 ;W i l k i n , M i t c h e l l , G a n t e n & J o h n s o n , 1 9 8 9 ) . H e n c e , t h ei n h i b i t o r y e f f e c t s o f b i c u c u l l i n e ma y a r i s e f r o m t h e d i s -

i n h i b i t i o n o f l o c a l i n h i b i t o r y n e u r o n e s i n n e r v a t i n go x y t o c i n n e u r o n e s w h i l e m u s c i m o l may i n h i b i t o x y t o c i nn e u r o n e s d i r e c t l y . A l t h o u g h t h e n e u r o c h e m i c a l i d e n t i t y o ft h e p u t a t i v e l o c a l i n h i b i t o r y i n p u t i s n o t k n o w n , i f i t i s t ob e GABA i t s e l f t h e n t h e r e c e p t o r s o n t h e o x y t o c i n n e u r o n e st a r g e t e d b y t h e s e c e l l s m u s t e i t h e r b e r e l a t i v e l y i n s e n s i t i v et o b i c u c u l l i n e o r b e GABAB i n n a t u r e .I n s u m m a r y , we r e p o r t t h a t b o t h m u s c i m o l a n d b i c u c u l l i n ei n h i b i t t h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x i n l a c t a t i n g r a t s . T h e r e s u l t sw i t h m u s c i m o l p r o v i d e t h e f i r s t e v i d e n c e t h a t t h ea c t i v a t i o n o f GABAA r e c e p t o r s t o l e v e l s a b o v e t h a tn o r m a l l y o c c u r r i n g w i l l b l o c k t h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x . I nc o n t r a s t , t h e i n h i b i t i o n o b s e r v e d w i t h b i c u c u l l i n e i n d i c a t e st h a t t o n i c a c t i v i t y a t GABAA r e c e p t o r s l o c a t e d w i t h i n t h es u p r a o p t i c n u c l e u s a n d i t s i m m e d i a t e v i c i n i t y i s e s s e n t i a lf o r m a i n t a i n i n g t h e f u n c t i o n a l i n t e g r i t y o f t h e n e u r a ln e t w o r k t r a n s d u c i n g t h e s u c k l i n g s t i m u l u s i n t o i n t e r -m i t t e n t b u r s t i n g a c t i v i t y o f o x y t o c i n n e u r o n e s . O u r r e c e n ts t u d y s h o w i n g t h a t e x t r a c e l l u l a r GABA c o n c e n t r a t i o n s i nt h e s u p r a o p t i c n u c l e u s d o n o t a l t e r i n r e s p o n s e t o s u c k l i n go r i n d i v i d u a l m i l k e j e c t i o n s ( V o i s i n , C h a p m a n , P o u l a i n &H e r b i s o n , 1 9 9 4 ) s u g g e s t s t h a t t h e r o l e o f GABA may b ep e r m i s s i v e i n n a t u r e a n d n o t i n v o l v e d d i r e c t l y i n e v o k i n ge a ch h i g h f r e q u en c y b u r s t o f f i r i n g . I t i s o f i n t e r e s t t o n o t et h a t GABA h a s b e e n h y p o t h e s i z e d t o p l a y a v e r y s i m i l a rr o l e t o h e l p g e n e r a t e p u l s a t i l e a c t i v i t y w i t h i n t h eg o n a d o t r o p h i n - r e l e a s i n g h o r m o n e ( G n R H ) n e u r o n e s ;e x t r a c e l l u l a r GABA c o n c e n t r a t i o n s d o n o t c h a n g e i nr e l a t i o n t o i n d i v i d u a l p u l s e s o f l u t e i n i z i n g h o r m o n e a n db o t h GABAA r e c e p t o r a g o n i s t s a n d a n t a g o n i s t s i n f u s e di n t o t h e i m m e d i a t e v i c i n i t y o f t h e GnRH n e u r o n e s i n h i b i tp u l s a t i l e a c t i v i t y ( H e r b i s o n , C h a p m a n & D y e r , 1 9 9 1 ) .T o g e t h e r , t h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t a n o n - g o i n gb a l a n c e o f GABA a c t i v i t y may b e e s s e n t i a l f o r t h e n o r m a lf u n c t i o n i n g o f s e v e r a l n e u r o e n d o c r i n e n e t w o r k s a n d wep r o v i d e h e r e s u c h e v i d e n c e f o r t h e m a g n o c e l l u l a r o x y t o c i nn e u r o n e s d u r i n g l a c t a t i o n .

A R N A U L D , E . , C I R I N O , M . , L A Y T O N , B . S . & R E N A U D , L . P . ( 1 9 8 3 ) .C o n t r a s t i n g a c t i o n s o f a m i n o a c i d s , a c e t y l c h o l i n e ,n o r a d r e n a l i n e a n d l e u c i n e e n k e p h a l i n o n t h e e x c i t a b i l i t y o fs u p r a o p t i c v a s o p r e s s i n - s e c r e t i n g n e u r o n s . A m i c r o i o n t o p h o r e t i cs t u d y i n t h e r a t . N e u r o e n d o c r i n o l o g y 3 6 , 1 8 7 - 1 9 6 .B E L I N , V . & M o o s , F . ( 1 9 8 6 ) . P a i r e d r e c o r d i n g s f r o m s u p r a o p t i ca n d p a r a v e n t r i c u l a r o x y t o c i n c e l l s i n s u c k l e d r a t s : r e c r u i t m e n ta n d s y n c h r o n i z a t i o n . J o u r n a l o f P h y s i o l o g y 3 7 7 , 3 6 9 - 3 9 0 .

B I o U L A C , B . , G A F F O R I , O . , H A R R I S , M . & V I N C E N T , J . D . ( 1 9 7 8 ) .E f f e c t s o f a c e t y l c h o l i n e , s o d i u m g l u t a m a t e a n d GABA o n t h ed i s c h a r g e o f s u p r a o p t i c n e u r o n s i n t h e r a t . B r a i n R e s e a r c h 1 5 4 ,1 5 9 - 1 6 2 .B i s s E T , G . W . , C H O W D R E Y , H . S . , F A I R H A L L , K . M . & G U N N , L . K .( 1 9 9 0 ) . C e n t r a l i n h i b i t i o n b y y - a m i n o b u t y r i c a c i d a n d m u s c i m o lo f t h e r e l e a s e o f v a s o p r e s s i n a n d o x y t o c i n b y a n o s m o t i cs t i m u l u s i n t h e r a t . B r i t i s h J o u r n a l o f P h a r m a c o l o g y 9 9 ,5 2 9 - 5 3 5 .



13/15

J . P h y i o l . 4 8 3 . G A B A e r g i c c o n t r o l o f t h e m i l k e j e c t i o n r e f l e x 2 2 3B U R E A U , M . H . & O L S E N , R . W. ( 1 9 9 3 ) . GABAA r e c e p t o r s u b t y p e s :l i g a n d b i n d i n g h e t e r o g e n e i t y d e m o n s t r a t e d b y p h o t o a f f i n i t yl a b e l i n g a n d a u t o r a d i o g r a p h y . J o u r n a l o f N e u r o c h e m i s t r y 6 1 ,1 4 7 9 - 1 4 9 1 .C L A R K E , G . , F A L L , C . H . D . , L I N C O L N , D . W. & M E R R I C K , L . P .( 1 9 7 8 ) . E f f e c t s o f c h o l i n o r e c e p t o r a n t a g o n i s t s o n t h e s u c k l i n g -i n d u c e d a n d e x p e r i m e n t a l l y e v o k e d r e l e a s e o f o x y t o c i n . B r i t i s hJ o u r n a l o f P h a r m a c o l o g y 6 3 , 5 1 9 - 5 2 7 .D E C A V E L , C . & V AN DEN P O L , A . N . ( 1 9 9 0 ) . GABA: a d o m i n a n tn e u r o t r a n s m i t t e r i n t h e h y p o t h a l a m u s . J o u r n a l o f C o m p a r a t i v eN e u r o l o g y 3 0 2 , 1 0 1 9 - 1 0 3 7 .D Y B A L L , R . E . J . & S H A W , F . D . ( 1 9 7 9 ) . I n h i b i t i o n b y GABA o fh o r m o n e r e l e a s e f r o m t h e n e u r o h y p o p h y s i s i n t h e r a t . J o u r n a lo f P h y s i o l o g y 2 8 9 , 7 8 - 7 9 P .F E N E L O N , V . , S I E G H A R T , W. S . & H E R B I S O N , A . E . ( 1 9 9 4 ) .D i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n o f GABAA r e c e p t o r a s u b - u n i t s b ys u p r a o p t i c a n d p a r a v e n t r i c u l a r n e u r o n e s . E u r o p e a n J o u r n a l o fN e u r o s c i e n c e s u p p l . 7 , 8 2 .G I E , U . & T H E o D o s I s , D . T . ( 1 9 9 4 ) . S y n a p t i c p l a s t i c i t y i n t h e r a ts u p r a o p t i c n u c l e u s d u r i n g l a c t a t i o n i n v o l v e s GABAi n n e r v a t i o n a n d o x y t o c i n n e u r o n s : a q u a n t i t a t i v e i m m u n o -c y t o c h e m i c a l a n a l y s i s . J o u r n a l o f N e u r o s c i e n c e 1 4 , 2 8 6 1 - 2 8 6 9 .H E R B I S O N , A . E . ( 1 9 9 4 ) . I m m u n o c y t o c h e m i c a l e v i d e n c e f o ro e s t r o g e n r e c e p t o r s w i t h i n GABA n e u r o n e s l o c a t e d i n t h ep e r i n u c l e a r z o n e o f t h e s u p ra o p t i c n u cl e u s a n d GABAAr e c e p t o r s 6 2 / 4 / 3 s u b u n i t s o n s u p r a o p t i c o x y t o c i n n e u r o n e s .J o u r n a l o f N e u r o e n d o c r i n o l o g y 6 , 5 - 1 1 .H E R B I S O N , A . E . , C H A P M A N , C . & D Y E R , R . G . ( 1 9 9 1 ) . R o l e o fm e d i a l p r e o p t i c GABA n e u r o n e s i n r e g u l a t i n g l u t e i n i s i n gh o r m o n e s e c r e t i o n i n t h e o v a r i e c t o m i s e d r a t . E x p e r i m e n t a lB r a i n R e s e a r c h 8 7 , 3 4 5 - 3 5 2 .I S H E R W O O D , K . M . & C R O S S , B . A . ( 1 9 8 0 ) . E f f e c t o f t h e s u c k l i n gs t i m u l u s o n s e c r e t i o n o f p r o l a c t i n a n d l u t e i n i z i n g h o r m o n e i nc o n s c i o u s a n d a n a e s t h e t i z e d r a t s . J o u r n a l o f E n d o c r i n o l o g y 8 7 ,4 3 7 - 4 4 4 .L E N G , G . ( 1 9 8 8 ) . O v e r t u r e t o s y n c h r o n y a n d p e r c u s s i o n . I nP u l s a t i l i t y i n N e u r o e n d o c r i n e S y s t e m s , e d . L E N G , G . , p p . 3 - 9 .CRC P r e s s , B o c a R a t o n , F L , U S A .L E N G , G . , WAY, S . & D Y B A L L , R . E . J . ( 1 9 9 1 ) . I d e n t i f i c a t i o n o fo x y t o c i n c e l l s i n t h e r a t s u p r a o p t i c n u c l e u s b y t h e i r r e s p o n s e t oc h o l e c y s t o k i n i n i n j e c t i o n . N e u r o s c i e n c e L e t t e r s 1 2 2 , 1 5 9 - 1 6 1 .L I N C O L N , D . W . , H E N T Z E N , K . , H I N , T . , VAN DE R S C H O O T , P . ,C L A R K E , G . & S U M M E R L E E , A . J . S . ( 1 9 8 0 ) . S l e e p : a p r e r e q u i s i t ef o r r e f l e x m i l k e j e c t i o n i n t h e r a t . E x p e r i m e n t a l B r a i n R e s e a r c h3 8 , 1 5 1 - 1 6 2 .L I N C O L N , D . W . , H I L L , A . & W A K E R L E Y , J . B . ( 1 9 7 3 ) . T h e m i l ke j e c t i o n r e f l e x o f t h e r a t : a n i n t e r m i t t e n t f u n c t i o n n o t a b o l i s h e db y s u r g i c a l l e v e l s o f a n a e s t h e s i a . J o u r n a l o f E n d o c r i n o l o g y 5 7 ,

4 5 9 - 4 7 6 .M c K E R N A N , R . M . , Q U I R K , K . , P R I N C E , R . , C o x , P . A . , G I L L A R D ,N . P . , R A G A N , C . I . & W H I T I N G , P . ( 1 9 9 1 ) . GABAA r e c e p t o rs u b t y p e s i m mu n o p u r i f i e d f r o m r a t b r a i n w i t h a s u b u n i t - s p e c i f i ca n t i b o d i e s h a v e u n i q u e p h a r m a c o l o g i c a l p r o p e r t i e s . N e u r o n 7 ,6 6 7 - 6 7 6 .M A S O N , W. T . , P O U L A I N , D . A . & C O B B E T T , P . ( 1 9 8 7 ) . Gamma-a m i n o b u t y r i c a c i d a s a n i n h i b i t o r y n e u r o t r a n s m i t t e r i n t h e r a ts u p r a o p t i c n u c l e u s : i n t r a c e l l u l a r r e c o r d i n g s i n t h eh y p o t h a l a m i c s l i c e . N e u r o s c i e n c e L e t t e r s 7 3 , 2 5 9 - 2 6 5 .M A T H I S O N , R . D . & D R E I F U S S , J . J . ( 1 9 8 0 ) . S t r u c t u r e - a c t i v i t yr e l a t i o n s h i p s o f a n e u r o h y p o p h y s i a l GABA r e c e p t o r . B r a i nR e s e a r c h 1 8 7 , 4 7 6 - 4 8 0 .

N I C O L L , R . A . & B A R K E R , J . L . ( 1 9 7 1 ) . T h e p h a r m a c o l o g y o fr e c u r r e n t i n h i b i t i o n i n t h e s u p r a o p t i c n e u r o se c r e t o r y s y st e m .B r a i n R e s e a r c h

daniel l. voisin, allan e. herbison and dominique a. poulain- central inhibitory effects of muscimol...

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