defining protease specificity with proteomics: a protease with a dibasic amino acid recognition...

7
Defining protease specificity with proteomics: A protease with a dibasic amino acid recognition motif is regulated by a two-component signal transduction system in Salmonella Microbial proteases play diverse and important roles in bacterial virulence but their detection and characterisation is often hampered by their limited abundance or lack of expression in the absence of suitable environmental signals. We describe here a sen- sitive proteomic approach to detect proteases that are under the control of a virulence regulator and to characterise their recognition motifs. Using MG ++ -depleted growth media or a mutant strain of Salmonella in which the PhoP-PhoQ virulence regulatory system is constitutively active, truncated forms of DnaK, elongation factor G, elonga- tion factor Tu and ribosomal protein S1 proteins were detected. Two other global regu- latory mutants and cells exposed to acid or to oxidative stress failed to produce the truncated proteins, indicating specific control of the protease activity by the PhoP- PhoQ system. Our results suggest that at least two proteases are induced. To define the proteolytic cleavage sites of one of the proteases, peptides from each of the trun- cated proteins were identified by tryptic mass fingerprinting/nanoelectrospray mass spectrometry and mapped onto the sequence of the intact protein. Alignment of the regions around the cut site indicates that the protease recognises a dibasic amino acid motif characteristic of the omptin protease family. The induction of such proteases in bacteria depleted of Mg ++ ions may contribute to the PhoPQ-mediated resistance of Salmonella to cationic antimicrobial peptides. Additionally, our results suggest it would be prudent to keep the concentration of this ion above micromolar levels during bacte- rial sample preparation for proteomic analyses. Keywords: Proteomics / Protease specificity / Salmonella EL 3541 Phillip Adams 1 Richard Fowler 1 Gillian Howell 1 Niamh Kinsella 1 Paul Skipp 1 Peter Coote 2 C. David O©Connor 1 1 Division of Biochemistry & Molecular Biology, School of Biological Sciences, University of Southampton, Hampshire, UK 2 Department of Microbiology Unilever Research Colworth, Bedfordshire, UK 1 Introduction Proteolytic cleavage of key target molecules is an integral part of the virulence mechanisms of many microbial pathogens. While such processes may involve the activa- tion of a host protease, in many cases a proteolytic activ- ity specified by the pathogen itself is involved. Such pro- teases play diverse roles, including activation of a toxin [1, 2], inactivation of a specific host defence protein, e.g., IgA by IgA protease [3] or control of the stability of other proteins that need to be up- or downregulated during infection (e.g., control of RpoS sigma factor by ClpXP [4, 5]). Additionally, some proteases function as toxins them- selves, notably the Tetanus and Botulinum toxins, which specifically cleave receptors involved with the docking of synaptic vesicles to the plasma membrane in neuronal cells, and anthrax lethal factor, which cleaves mitogen- activated protein kinase kinases 1 and 2 [6, 7]. Because proteases involved in virulence may have very specific targets they are often expressed in quantities that pre- clude biochemical characterisation. Additionally, some proteases may only be expressed when bacteria are in an appropriate host environment and hence are normally undetectable in cells grown under laboratory conditions. There is therefore a need for a microscale approach that allows the sensitive detection of protease activities that are under the control of virulence regulators. Ideally, such an approach should also permit the characterisation of the proteolyic cleavage sites on target molecules, as this may provide valuable clues about the type of protease involved and its biological mechanism. One of the major virulence regulators in Salmonella typhi- murium (official designation, Salmonella enterica serovar Typhimurium) is the PhoP-PhoQ signal transduction sys- tem. PhoPQ mutants of S. typhimurium and S. typhi are attenuated for virulence in mice and man, respectively, and are hypersensitive to a variety of antimicrobial pep- tides [8, 9]. Additionally, S. typhimurium phoPQ mutants show decreased survival rates in cultured macrophages relative to wild-type cells and are more efficiently proc- essed for presentation to the immune system [10, 11]. Correspondence: Dr. C. David O©Connor, Department of Bio- chemistry, University of Southampton, Bassett Crescent East, Southampton SO16 7PX, UK E-mail: [email protected] Fax: +44-(0)-1703-594459 Electrophoresis 1999, 20, 2241±2247 2241 WILEY-VCH Verlag GmbH, 69451 Weinheim, 1999 0173-0835/99/1111-2241 $17.50+.50/0 Proteomics and 2-DE

Upload: phillip-adams

Post on 06-Jun-2016

212 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

�������� ������ ��� ��� �� ��� ����� ��� ������ ��� � ������ ���� � �� �� �������� �� �������� �� � �� ����� ������������ �� ����� �� ����������

��������� ������� �� ������� ��� ������ ����� �� �������� ��������� �� ����������� ��� �������������� �� ���� ������� � ���� ������ ��������� �� ���� ����������� �� �� ������� �� ������� ������������ �������� �� �������� ���� � ��������� ������� ������ � ���� ������� �� ��� ����� �� ������ �� � ����������������� ��� � ����������� ���� ���������� ������ ����� ����������� ���������� �� � ���� ����� �� ���������� �� ����� �� �������� ��������� �������� � ��� �� ���������� �����! ������� ����� �� "��#! ��������� ����� �! ���������� ����� $� ��� ��������� ����� %& ������ ���� ������� $�� ���� ������ ��������� ����� ��� ����� ������ � ���� �� � �������� ����� ������ � ������ ��������� ������! ��������� ������� ������ �� �� ������ ����� � �� �������� � ���� '�� ������ ������ �� � ���� �� ������� ��� �������� $� �������� ����� �� �������� ���� �� ��� �� �� �������! ����� ���� ���� �� �� �������� ������ ���� ��������� � � �� ���� ������������(������������� ������������ ��� ���� ��� �� ��)����� �� �� ���� ������ *������� �� ��������� ������ �� �� ��� �������� �� �� ������ ���������� � ������� ����� �������� ������������ �� �� ���� ������ ����� � $�� �������� �� ���� ������� ��������� ������ �� ���� ���� �� �������� � �� ���� �������� ��������� ������������ � ������� ������������ ������ *��������� ! ��� ������ ������ � ������� ����� � ��� �� ����������� �� ��� ��� ����� ���������� ������ ������ ��������� ����� �������� ��� ������� ���� ����

�������� ��������� ( ������� �������� ( %��������� +, -./&

������� ������

�� ���� ������

������� ������

���� ���������

���� !"����

���� #�$

#% ��&�� '(#����

&"������� �� 0��������� 1��������� 0����� ! %������� 0��������� %�������!�������� �� %�������!2�������! �#3"������ �� ����������� �������� 4�������5������! 0�����������! �#

� )���� ��

������ �� �������� �� �� ���� ��������� �� �� ��������� �� �� ��������� ���������� �� ��� ����������������� ����� ���� �������� �� ������� �� ��������� �� � ��� ������! �� ��� ����� � ����� �� ������ �������� � �� ������ ����� �� ��������� %��� �������� �� ������� �����! ��������� �������� �� � ����6&! 37! ���������� �� � ������� ��� ������� �����! ���!8�* � 8�* ������ 6-7 �� ������ �� �� ������ �� ���������� �� ���� � �� �� �� ������������ �������������� 9���! ������ �� 4�% ����� ����� � 5�:� 6/!.7;� *��������� ! ���� ������� ������� �� ����� ����������! ����� �� $����� ��� 0������� �����! ��������������� ������ ������� �������� ��� �� ������� ��� ���� �������� � �� ����� �������� �� �������������! ��� ������ ����� �����! ����� ������� �������������� ����� ������ ������� & ��� 3 6<! =7� 0������

������� �������� �� ��������� �� ���� ��� ������������ �� ��� ���� �������� �� )������� �� �������� ����������� ��������������� *��������� ! ����������� �� ��� �� �������� ���� ������� ��� �� ��������� ��� ���������� ��� ����� ��� ������� ���������� �� ����� ����� ����� �������� ����������$���� �� �������� � ���� ��� � ���������� ������ �������� �� �������� ������� �� ������ �������� ����� ����� �� ������ �� ��������� ���������� 8����� ! ������ ������ ������ ���� ���� �� �������������� ���� ����� �� �������� ���� �� ���� ���������! �� ����� ������ �������� ����� ���� �� � �� �������������� ��� �� ���������� ����������

'�� �� �� ��>�� ��������� ��������� �� ���������� �� �������� 9�������� ����������! ���������� ������� �������$ ��������; �� �� �������� ������ ���������� � ����� ���� ����� �� �� �� ������� ��� �� �� � ���������� ��� ��������� �� ���� ��� ���! ��������� !��� ��� � ���������� � � ����� �� ������������ ������ 6?! @7� *��������� ! �� �� ������� � ��� ��������� ��������� �������� ���� �� ������� ����������������� � ����� � ����� ��� ��� ���� ��������� ��������� ��� ��������� � �� ������ � ��� 6&A! &&7�

#��������� �� "�� 5� "���� 'B5�����! "������ �� 0���������� ! �������� �� %�������! 0���� 5������ +��!%������� %'&< =�:! �#*������ ����C������������+� �//�9A;�&=A-�.@//.@

������� ������ &@@@! ��! 33/&D33/= 33/&

E �8,+F�G52 G����� ���2! <@/.& ��������! &@@@ A&=-�A?-.(@@(&&&&�33/& H&=�.A��.A(A

����� ����$��*

�������� ������ ���� ���������� �� �� �������� � ��� ������� ��� �������� �� ��������� �� ���������������� �� ������� � ���� ���� ��������� �� � ��������� �� �� ������������ ����������� �� ������� �������! ����� ���� 6&37� 8� ��� ���! �� �������� ��������� �� ������� �� ��� ������� �������� � ���������� � ��� �� ����������� ����� ���������������� ������ �� �� � ���� ����! �� ����� �� �������� � ��� �� ���������� �������! ������� ��������� ����� ��������� �� ������� ������ ����� ����������� 5������������� �� �� ���� �� ����� ���������� �� ���� ���� ��������� �������� �� � ������ ������� ��� ������� ��� �� ��� ���������� �������� ����� ���� ���� ���� �� �� ���� ����������� � $�� ������� ��������� �� ��� ������ ��� ���������������� �� ���� ��������� ��������� ������� ������������

$ ,������� ��� �����

$%� -� ����� ������

$�� �� �� ������� ������ ���� ���� %,&-// 6&-7 ����� � ����� ��������� ��� �������� ����������� $�� � ���� ������ ��� ��������� ��� %,&-// ����� �33 ��������� ��������� ���� ��� � ��� ���� I� J���� 6&/7� "������� �� ������ �������� �� �� ���� ���� ���� ����������� ��������� 9J� #�������! �� I�����! *� ����!*� ����! �� �������� ��� 5� "� '�5�����! �� ���������;� 0������ ���� �������� �� ,0 ������! 2 =�3! ��J�������� ������ ��������� &A �� �� &A �� ���� 6&37������ ���� ��)������ ��������� �54 ����������� ���� ������� ������� � ������� ���� ���������

$%$ ���� ������

I�� ���� ��� �� %,&-//! %,&-// � ���� ��� %,&-//�������� �����! �������� ������� ���� ������ & �� &AA��� & ���� �� ����� �������� ������ ��� ����� � -=�5��� ������� � �� *<AA �� A�. ������ ���������� 8� �������! %,&-// ��� %,&-// ��������� ����� ���� ����� ��� *<AA �� &�A � -=

�5 � ���� �� ���� ������� ������������� $� ������ �������� �����! - �� 23'3 �������� ���� ����� ������� �� *<AA �� A�. �� ,0 ��������� ��������� �������� ��� � ������ <A ��� ������ ����������� $� ������ � ��� ���� ���� �������� �������!������������� ���� ����� ����� �� ,0 ������! 2 =�3!���� ������ & �� /A ��� �������� ,0 ������! 2 .�A�I�������� ��������� � -=�5 ��� <A ��� �� ������ �����>���� � 2 -�A ��� 25�! ��� �������� � -=�5 ��� ������� -A ���� 8� ��� �����! ����� ���� �������� � -=�5� ������������ � . AAA �� ��� &. ��� ����� � K,*�&A�.AA ���� ��� 0������ K3�3& ���������! ������

���� �� �������� A�@L J�5� ��� �������� � ������������� � /�5� I�� ���� ���� �� ����� ��������! � �������� ��������� ������ �� ����� ���� ������ ������� ����

$%. !����� ���������

5��� ����� ���� ���������� �� . �, �� � ��� ������ 8 9@ �����! 3L �(� $���� :�&AA! 3L �(� 3�������������! 3L�(� *������� -�.D&A! ? �� ��� ���� ������� � ���������; ��� �������� ����� �� �%+ %����� &.A ��� / �3A � � ���� ��� /A � ������� �� ���� %����� ���� ������������M�� ��� ����� � D=A�5 ���� ����

$%/ 0������������ ��� ��������

$�������������� ��� ������������� ��� ����������������� �� ��������� �������� 6&.D&?7� 8����������2 ������� ���� 92 /D=; ��� &3D&/L ������� ����9*�����������������! 0��������������; ���� ���� ����� ���� ��� ������ ����������! ��������� � *��� ��������� ���� ���� ������ ������ ������� ����������������� ���� ���� ������ ��� 5�������� 0������� 0����

$%1 )���� ��������

���� ���� �������� �� ��������� �������� 6&<7 ��������� ���� ��� ����� ��������3" ������� �� /�A 9��������! J������������$ ��! �#;� '�� ����� ��� ����� � N�������� ���������� �� ��������� �� %,&-// � ���� ����� ������� � �� ���� ������ �� � ���� ���� ���������� ������ ���� ���������� � �� �������� � ���������� � ���� 8����� ���� ������ � *����������� �� .�A ��� �������� ��� �������

$%2 ,��� ��� �����

����� ���� ������������ ��� ������������� ������������ ���� �������� ��������� �� ��������� � ���� � ��� 6&@7� I�������� �� ��� �������� �� ������� ������ ��� ��� � ���! ����� ����� ���� ������ �������� 43 ����� 9A�. �, ��� ������;! ������ ���� ������� ���� ��� ����� �� & �, �� .AL �������O .L ���������� ������ ��� � ����������� ������������� ������� ���� ���� �������� ��� ������� �� ����� �� ,5$��������� ������������$'I �������� 9���������!���������! �#; ��� �� ��������� ������O ������� �������! &3AA GP ���� ������! /<D.3 GP ���������� ���!&AAD3AA ,(�P ������ ��������! ?A�5� "�� ���� ��������� �� �� /AAD&=AA ���� ����� ��� � � -A ��� ������������ ����������� $� ������� ����� ������� ������� � ����� �������� ����! �� B���+� %�)�����B ��������� 9���������; ��� �����

33/3 �� *���� � ��� ������� ������ &@@@! ��� 33/&D33/=

$%3 ������� ���� ����

$�� ����������� ������� ������ �� � �� ��������� ���� � ������ �� ������� ����������� J508 �������� ��� ������� ������ ����� �� �������� ������� ���%�I� �� �� ������ �������� ���� �� ���������63A7�

$%4 '��� � ���5���

8�����������! ����� �������� ��� ����� ��������)������� ���� ������� �� �� ��������� 6&=! 3&7�

. ������

.%� ��� �� � �&�� ���������� �������� �&��� � �� ������6 ������������ �� �����

� ���� ����� �� ���������� ���� ��������� ���������������� � �������� ��� � �� �������� �� ���������� ������������� ������� 9��� ; �� �������� �� � ��� ����� �� �� ������� �� ������������������ 6@! &37� �� �������� ������� �� ���������������� �� ����� � ��� � ���� ����� � ���� �������� ��� ������ �� �������� ��������� � �� �������� ��������� ��������� *���� �� ����� ��� �� ��������� �� �� � ���� ����� �� ����� �� ����� � ��������� �� ����� �� /A! /.! <. ��� <= �"� ��� � ��.�-A! /�?.! /�=. ��� /�@=! ��������� 9I��� &;� $� ����������� �������� �� �� �������� �� ���� ��������������� ��� �������� �� �� �������� � ���! ������ ���� ��� �� ����� ��������� ������� �� ����� ������ ����� �� ��������� ����� � ������ ��� ���������������� � ���� *��� ��� �� ������ ���� ���������� �� ����������� ����� ����� �������� �� ����������! ������ ��������� �� ���� �������� ������������ ��� �������� �� �������� 9I��� 3;�

.%$ 0�� /78 /18 21 ��� 23 "�� ������ ��� ����� �� �� ������� ����� ����8 ����� ����� ������� �����8 � ����� ������ � � �� �� " � +����&� �����

$� �������� �� �� �������� ��������� ������ ���������� ����� ���� ���� ������� ����� ���� ����� ����������! �� ������� ��� ���� ������� �� ������� ��������� ��� �� ����� �� ��� ���� ������ � ��������� ����925�; �� � �������� ������ *��������� ! �� ���� ���� �������� ������� �� ��������� ����� ����� 4�%! �������� ������� ����� �������� 6337! �� 0�*! � ������������� ����� �� �������� �� � ����� �� �������������������� �������� �� ������������� ��� ����� �� ���� 63-7� I����� - ����� �� ���� �� ���� ������������ ���������� ������ �� �� ����� ������ ��)������! ��������� �� ���� �������� �� �� �� �� �

������� ������ &@@@! ��! 33/&D33/= "������� ������ �������� ��� �������� 33/-

������ �% "������ �� ����� �� ����� ��������� ��������� �� �� �������� � ���� ������� ������ ������ � ���� ���� ��� ����� � ����� ��� ����� �� ������ ��� ��������� �����! ��������� � 9�;! 9�; %� &!������ �����P 3! *$� � ����� � ������P -! ����� ���������� ������� �� -A% ��������� ����� %&�� 9�;! 9�;!%� &! "��#P 3! ��������� ����������� ����������������P -! ����� �� �������� ������� �� "��#��9�;! 9�; %� &! -A% ��������� ������ %&P 3! ���+,P-! ����� �� �������� ������� �� ��������� ����� ���9�;! 9�; %� &! ������� ����� ������P 3! ����� ���������� ������� �� ��������� ����� $��� *������� ���� ������ ������ ����� ������ �� ��� ������������ �������� �� � ���� ��� ����� � ������ ��������� ��������� ����� �� �� ������! ��� ������ �� �� !������

������� ����� ������� 9�� ������������ �� ���� ������� �� ��� �������� ����� ���� ��������� ���� �������� ���������;� �� �������� �� �� �������� ���� ������ �� ���������� ������� �� �������� �� ���������� � ����

.%. )������ ��� � �� ���������� �� ���� ���� �������������

$� �������� �� �������� �� �� ������! � � �� ���������������� ������ ��� ���� ��� %����)��� �������� �������� �������� ���� ������ � ��������� ����

33// �� *���� � ��� ������� ������ &@@@! ��� 33/&D33/=

������ $% +���� �� ���� ��� ������� �� ����� �������� �������� �� �� ����� �� ������ ������� ������� ���� ����� � ����� ����� ����� ����������� ������� ���������� ���� ��������� ��� ����� �� �� ������� ��������� �����! ��������� � 9�;! 9�; %� &! �����������P 3! *$� � ����� � ������P -! ����� �� ��������������� �� -A% ��������� ������ %&�� 9�;! 9�; %� &!"��#P 3! ��������� ����������� ����������������P -! ����� �� �������� ������� �� "��#�� 9�;! 9�;%� &! -A% ��������� ����� %&P 3! ���+,P -! ����� ���������� ������� �� ��������� ����� ��� 9�;! 9�; %� &!������� ����� ������P 3! ����� �� �������� �������� �� ��������� ����� $��� *������� �� �� ������ ������� ����� ������ �� ��� ������������ �������� ������� �������� ���������� ��������� ������ ��� ����� ���� ������! ��� ������ �� �� !������

������ .% ��������� �� �� ����� �� ����� �� ����������� �������� � �� ���� � ���� ������� ���� ������� ���� ���������� %,&-// ����� ����� ����� ��������� ����� ��������� �� ��� �������� ���� ������������� 9�; � ���� �����! 9�; ����� � �����! 9�; ������� ���� �����! 9�; � ������ ������������� �����! 9�; ���������� �����! 9�; �������� ���� ������ %� &! �������� ����� ������ 9��M �� 8;P 3! ����� �� �������� �������� �� ��������� ����� $��� $�� ������� �� �� ������������ ������ �� ����� �� �� ������������ ������������� �� �������� ���������� ��������� ������ �������� �� �� ������ ��� ������ �� �� !������

�� $� 9+I�$�;! ��������� ����� %&! "��# ��� ���������� ����� � 9+I��;! ��� �� /A! /.! <. ��� <= �"� �������! ��������� � 2������! ��������� �� �� ���������� ����������� ��������� ��������� ������ ��������� � ��������� �� ���� �� �� �� ����� ��� ������������ ������� ��� ������� $�� ������� ��M�� ������� ������ ��� /-�-! <&�3! <@�& ��� ==�< �"�! ���������� � $��� ����������! ������ ��� �� ��� �� ������ �������� ��������� ��� �� �� ������ ��������������� ��� ��� �� ���� ������! ������ �������� ������ �� �� �� ����� ��� ��������� ����� �� ���������� �� �������� �������� �� �� �������� � ������������� �������� ��� �� ���� ������� �� ������)���� ������� ��������� ����� %&! +I��! +I�$� ���"��#�

.%/ )������ ��� � ������ ���&��� �������� �� � ������6 �������� ������

8��������� �� �� ����� ���� ��)������ �� ���� ������� �� ��� ����� ����� ������� ��� ���� ���� ��������� ����� ���� �� ����� �� � ������� �� ���������� � ���� �� ������� � �������� �� ������ �� ��������� ���� �� ���� �� �� ������� ������ � ������� � �� ����� ��������� � ������������� ������������ 6&@7 ��� �� ��)����� �� �� ���� ������

$�� ������ �� �� � �� ����� ������ �� ������ ������ ���� ����� ��� �������� ��� ���������� ���� 3�" ���� �� �� ��M� �� �� ������� ����� � �� �� �������� ������ �� �� ����� �� �������� ���� ������ ���������� �� ���� �� ���� ������� ���� ��� ���� � ������ ��������� ��)������ �� ���� ��������� � � ����������� ���� ��� � ������� I����� /* ����� �� ������ ������� ����� ��� ���� �� �� ���� ������� *��������� ��� +I�� ��� +I�$� ���� ���������! �������� ���� ������� �� "��# ��� ��������� ����� %& �� ��������� �� �������� ��� �������� �� ������� �� � ���������� ������� ����� ���� ���� 9I��� /0;� $� ������� ���� ���� ��� ������ ���������� � ��� �� �� ���� ��������� ������� ��� � ������� ��� ����������������! �� "�������� ��)����� �� �� ������� ���������� %& ����� ��� ��������� � ������+���� ����������� ��)�������� *� ������! �� ��)����� �������94*G8+%+J%; ����������� ������� � �� ��� ������ ����� � �� ����� ��� �� ��)����� �� �� ���������� %& ������ �������)������� �������� �� ���������� ����� %3 �� ���� �� ������ ����� ����� �����9��� �� �����;� �� �������� �� ��� ������ �������� �� �������� � ��� ���������� ��� ������� �������� ����� ���� ��)������ 8� �� ���� �� �� �������+I�� ��� +I�$� ������! �� ��� ����� �� ��������� �������� � � ������� ����� ���� ��)������ I�� �������! �� +I�� ���� ��� ���� ������� ����� ���� ��)������

9#-<@4-=A! #/=-4/=/! #<A.#<A<! 4<-?4<-@; � ���� ���������� 8�����! �������� ��� ����� ������ �������3-. �� �� ��������� � �� ���� ��� ������� � ��"�������� �� �� ����� ��������� � ������� 3-<�$��� ������� �� ���� �������� ��� �� ��M� �� �� �������� ����� 9<= �"�! ������ �� ==�< �"� ��� �� ���������; ������� ���� 3�" ����� %������� ! �� +I�$� ����� ������� �� ���� ��� ����� �� �������� ��������� � ��� �� ��� �� "� ��� #�������� ������� ���� ����� ��� �� ������ ���� ��� ���� ������� ��������� �������� �� ��� ������ ��� ��� ����� �����%���� ���� ������� ����� �� +I�� ��� +I�$� ��� ���

������� ������ &@@@! ��! 33/&D33/= "������� ������ �������� ��� �������� 33/.

������ /% 9*; ����� �� � �� �������� �� �� ���� ��������� ������ ��� �� ����� ���� ��)������ �� ��"��#! +I��! +I�$� ��� ��������� ����� %& �������$�� ������� �� ���� �� �� � �� ����� ��������� � ������������� ���� �������� ������� � �� ���������� ��)����� �� ����� �� ���� ����� 90; *������� ���� ������� �� "��# ��� ��������� ����� %& �� �������� ����� �� �������� ���� 8� �� ���� ����! �� ������� �� �� �������� ��� ��� ��������� � �������)�������� ����� +���� ����������� 95; 8�������� �� ��������� � ���� ���� ����� � ��� � ���� ���������� ���������� ��� ����'�$ �������� "�������� ��� ����� ������ �� �)��� ������ �� ����� ���� ������ ��������

����� �� ����� ��� �� ������� �������� � ���! ���������� �� �� � ��� ���� �������� � ���� ��� ���������� ��� �� � �����������M�� �������

/ ��� �����$��� ��� ��������� �� �������� �� � � �� ���� ������������� ������ � ���� ������ �������� ��� ������������ �� ����� �� �������� ���� �� ��� �� ����* �� ���������� ������ ��� ������ ��� ����������� �� �� � ���� �� ���������� ��)���� �� ������������ ���������� �� �� ������ �� )������� �������� �������� ������ ����� �� � ����� ���� � ���! �� �� ������ ����! � ��� �� ��������� ������ ����� ������������� ����� �� �������� ������� $�� ��� �� ������ ���� � ��� ���� ��������� �� ������� �� ������� ��������� ������� ��������� �� ������ ������������� ��� �� �������

����� ��� ������! ����� ����� �������� ����� ���� ��������� ��������� ���! ���������� ! ��������������� %&! +I�$� 9��� ����; ��� %3 9����������������; ���� ���� ������ ��� ������������� 8� ���� ���� ������� ���������� ����� �� ���� �������� � �� ���������� �� �� ������9�; ��� ����� �� ���� ����� ������ ������ 4����! �� ��� ����� ��������� �������� � ��� ��� ���� ����� $��� �������� �� ������� �� ��� �� �� ����� ���� �� �� � ���� ��� ���������� ��� ������� 9�� *����! ���������� �����������;�"�� ��� �� �� �� ������� ������! "��# ��� ���������� ����� %&! �� ������ �������� ��� ���� ��������� � ������ ����������� � ������� ����� ���� �����*��������� ! ���� � �� ���� ������������ ��� ��������)������� ������ ���� ����� �� ��������� ����� %3���� ��������� ����� �� �������� ������ �� ���������� ���� �������� 9��� �� �����;� 2������! ��������� ���� ������ �� � ���� ��� ���� ������ ������ ������� ��� �������� ��������! �� �� �� ������� +I�� ��� +I�$� ���� � ������� �� ���� �������� ���� ������� ����� ���� ��)������� 8� ����� ��������� ��������� ������� �������� ��� �� ���� ��� ���������� �������� ! � �� �� �������� � ������������ $��� ����� �� �������� � ��� �� �������� ��������������� �� � ��� �� �� ������� ���� ������5����� ! � �� ���� �� �������� � ���� ���� ���������� ����� ������� �������� ����� ��� ������� 8����� �����! �������! ��������� ������ ����� �����3�" ��� ������������� �� ���� �� ������ �� ���� �������� ���������� �� � ������� �� ��)�����P ������� ���������� ������ ��� �� ������ ��� )�������� �� �����! � �� �� ���������� � ���� ������� ������ ���������� � $��� �� �� ��������� ������ ��� ��������� �� ��� ��� �� ������� �� ����� �������

8� ������� � ���������� �� ������������ �� �������� ���� ������! � �� ���� ������������! ��� �����)���

����� �� �����! ���� ����� ���������� �� �� ������� ��� ����� �� �� ����� �� �������� ����� $��� ����� ��� ���� ������ ����� ���� �� � �� �������� �� ����� � �� ��������� ����� ��� ������! �� ���������� � ���� ��������� ������ �� ������� �������� ����� ���� ���� �� ������� ���������� %��� ����� �� ������������ �� �� ���� ����� �� �������!����� ���� � �� ������ �� �� �������� ���� ��������8��������� ! ���� ����� ��� ������ ����� � ���������� �� �� ��������� ���������� �� ���� ��������I�� ������! �� 8���(%�* ���� �� � ����� �� � ���������������� ������ �� �� ������� �������� �� ���������� �� �� ������������ ���� ���� �� ������ ������� ������ ������� ��� ����� 63/! 3.7� %������� ! ����� ���� �� $������� ����� �� �������� ��� � ����� ���������� �� ����� 8 �� ���������� ��� �������� �� �� �������� ������! ����� ���������� �� � �����������������! ��� ���� ������� �������� - � � ���������� 63<7�

$�� ��� ������������ ���� �� �� '�$ ������ ����� ���� �� ���� ��� ������� ������ ���� ������ ������� � ��� ������ ��������� �������� �� ������ ��������� ���� � ��� 63=7� '�� ������������ ��������� �������� �� ���������� ���� ������� � ��������� �� '�$�2������! �� ������ �� �� ��������� ����� �� ��� ������� ����� �� ������ �� �� � ���� ���� 9I��� /5;�$��� �� �������� ��� �� ����� ���� �� '�$ ������� ������ �� ������������ ���� ������� ���� ���� ����� ����� �� �� ������� �� ��� ���� ��� ������� ������������ 63?7� ����� ���� �������� �������� '�$ �� �� �� ������ �� �� �������� � ���������� � ���! ��� �������� ����� � �� ������ ����� ��� I�� ������! � �� �� � ����� �� �� �������� � ��� ������ � �������� �� ������� ��� �������� ��������� ����� ��� � �������� ���� %� ����� �������

$�� ���� ������� ��������� ��� �� ������ ���'��! ����� ��� ���� ���� ������ �� �� ���� ��� ��+!�� ���� �� �� �������� � � ���� � .3�3 ����������� �� ���������� ���������� 63=! 3@! -A7� * ����� ��� ������� �� '�� �� ����� �� ����������! �� � ��� ��� ���� ������ �� � ������ ������ �� �� ���� ������9� ���� �� ���� � �� ����� �� �� ������ �� �� ����#�&3 ����� ��&<..! ��� ������;� *��������� ! �������)����� ���� ��� ������� �� ���� ���� �� ������������ �� � ������� ������ ����� 0,*%$ ����� �� ��-����� �� �� ����� ������ ��)������ ����� �� � ������� ������������������� ������� 95� "� '�5�����! ����������� �����������;� 4������� ���� �� ����� ���� ����+ ������ ���� ��� �� � ������ /?L ��)���������� ��� '�$ ��� �� �� ���� ��� � �� �������� �� �� ����� �������� �� ������� ����� ����

33/< �� *���� � ��� ������� ������ &@@@! ��� 33/&D33/=

6-A7� I����� ������ ��� �������� �� ������� � ��������� �� �� �������� ��������� ����� ��������� �������������� � ��� �� ���� �������� ���� �� ���� ��������� � �������� �� �� ������� ��� ����� ������� ������ �� �� ���� � ��� �� �� ���� ����������� ��������� � ���� ���������� � ���� ��������� �� ���� � ���! ���! �� ���*0 � ��� 6-&7�������� �� ������ �� ���� ������! ��� ����������������� �� ��� ������ �� �� � �� ��������� � �������� �� ���� ����������� ������� ����� ���������������� ������ �������� �� ���������� ��� ������ �������� ��� ������� ���� ���� $��� ������ ����� ���������� �� ������ ��� �����)��� �������� �� ������������� �� ����� ���� � ����� I������ � ��� ���� ��������� �� ���� � � ������� ������������� �� �� �������������� �� � ����� �� �� �������

&� ��� '� (����� ��% )� "���� *�� ������� &� (����*�� � +��, �����%��� ��% (� )������ �� -���� '�+.��� ��% �� & �� *�� %����������� , � ���������� �* � /�������� �* ��� ����� ������ ��0������ /����% *�������� ������ *��� � 11�'# ��% � &�������,��� �� ���*���� �����.��%�%�

4������� ����� &?! &@@@

1 ������� ��

6&7 2�����! $� 0�! �������! %�! +��������! 2�! 2� 1���� # ���&@=@! �3�! &A=3?D&A=--�

637 0���� ! �� #�! 2����! �� 2�! 0����! K� 8�! ,��! 5� %�!2� "����� ��� &@?@! 34! &..D&<&�

6-7 #�����! ��! 4�������! K�! ,�����! 2�! �������! #�! I�������!+� G�! ��( � &@@<! 5��! -3&D--?�

6/7 �������! *�! I������! "�! *�����! %�! %��M! ��! 2������*������! 4�! �(1+ 2� &@@<! 53! &---D&--@�

6.7 Q���! F�! �������! %�! 2� 1�������� &@@?! 56�!&&./D&&.?�

6<7 %������! ��! �������! 0�! 4�����! '�! 0�������! I�! $���!,�! ���������! 5�! �(1+ 2� &@@3! 55! -.==D-.?-�

6=7 "������ ! J� %�! ����! 5� ��! ,���! %� 2�! ������! G� ��!#�����! #� 4�! 5������! $� "�! *��! J� ��! '��������!�� #�! I�������! #�! �����! #� "�! G���� �����! �� I�!������� &@@?! �6�! =-/D=-=�

6?7 2������! +� ,�! '���! 5� *�! #������! #� ��! ������! %� 8�!2� �*��� 7��� &@@<! 584! &/A?D&///�

6@7 ������! %� 8�! ���������! K� K�! 2� 1�������� &@@A! 58�!3/?.D3/@A�

6&A7 I�����! �� 8�! %������! 4� G�! 2�������! 5� ��! 2������! I�!����� "��� ���%� ���� /�� &@?<! 64! .&?@D.&@-�

6&&7 ����! �� K�! 2������! 5� G�! $�����! J� K�! J������! %� K�!�������! K� "�!(��� (��������� &@@.! 59! /<.D/=<�

6&37 ������ GR�����! +�! %������! I� 5�! ��������! +� *�! #���&@@<! 6�! &<.D&=/�

6&-7 ��� ! 5�! %�>��! �� K�! '�� :�� ���� &@=?! �3! &-@D&/<�

6&/7 5� ����! 5�! 4�����%����! G�! J����! I�! (��� (���������&@@<! ��! &/@D&<A�

6&.7 �S��! *�! �����! ��! �T����! %�! ������� ������ &@??! ;!.-&D./<�

6&<7 �! %��F�! ,�! F�! %M �����! *�! �����! 8� ��! ����! *�! '�5�����!5� "�! 2� 1�������� &@@<! 586! .3-D.-&�

6&=7 �! %��F�! ����! *�! '�5�����! 5� "�! 2� 1�������� &@@<! 586!.A-3D.A-?�

6&?7 '�5�����! 5� "�! I�����! ��! 2��! ,� ��! �����! K� J�! (� ��%� (��������� &@@?! �8! &@&D3A/�

6&@7 ����! ��! %���������! *�! 2�������! $�! 0���! %�!%��������! ,�! I���! $�! ����! ��! "���� &S@@<! 48;!/<<D/<@�

63A7 ������ �������� ��� �� �������� � �4,O �O((�����������������(

63&7 2�������! K� ,�! $� ���! 8� ��! ���! #�! '�5�����! 5� "�! (���(��������� &@@3! 9! 3?3.D3?-3�

6337 2������*�����! 4�! ��O J�������! I� 5�! 5����� 888! 4�!8�������! K� ,�! ,��! +� 5� 5�! ,��! #� 0�! ���������! 0�!4��������! �� %�! 4��� ! ��! %��������! ��! ��������! 2�+�! 9+���; ��� ���� �� ���� ��% ����������� #������� ��% (��������� 1�����! 3�� +��! *%� �����! ��������� "5! �&/@=D&.&3�

63-7 I�����! ��! ����! *�! 4���������! $� 0�! '�5�����! 5� "�!(��� (��������� &@@?! �6! 3<.D3=@�

63/7 +����! 5�! ��2��������! 2�! �����! 5�! %�������! �� K�! (���(��������� &@@=! 3! &A<-D&A=-�

63.7 %����! #� "�! %�������! %�! ��������! *�! "�*�����! $� ��!��������! �� 0�!(��� (��������� &@@=! 4! /.&D/<3�

63<7 %�������! '� *�! %�������� ��! F� G�!%���! #�! ���! $�!0��! F�! ������! K� "�! ������� &@@3! �36! &AA/D&AA=�

63=7 ��������! K�! "���! K� K�! 2� 1�������� &@?@! 585!3@A-D3@A.�

63?7 %���! %�! %�����! 4�! %�����! "� ,�! ��������! ��!0�����! +� ��! 2� 1�������� &@@?! 56�! /AA3D/AA<�

63@7 #�������! *�! %������! F��"�! 2������! ��! 2� 1��������&@@/! 589! -.@D-<=�

6-A7 %�������! #�! J��������! $�! 2� 1�������� &@??! 58�!<3.D.<-3�

6-&7 ����! K� %�! ������! %� 8�! 2� 1�������� &@@<! 586! <?.=D<?</�

������� ������ &@@@! ��! 33/&D33/= "������� ������ �������� ��� �������� 33/=