DENEYİN AMACI:Pseudomonas putida’ nın fenol içeren ortama adaptasyonu, boncuk ile immobilizasyonu ve dolgu yatak reaktörüne uygulaması sonucu pseudomonas putida’nın ortamdaki fenolü kullanarak enerji elde etmesi ve dolayısıyla ortamdaki fenolün arındırılmasıTEORİK BİLGİ:

- BakteriBakteriler tek hücreli prokaryotik mikroorganizmalardır. Metabolizmaları yüksek organizmaların tersine çok farklı tiplerdedir. Bu farklanmalar üzeinden bakterilerin taksonomisi çıkarılmıştı, ancak bu farklanmalar günümüz genetik sınıflandırmasıla örtüşmez. Metabolizmaları 3 ana kriter üzerinde sınıflanır; büyüme için kullanılan enerjinin çeşidi, karbon kaynağı ve büyüme için kullanılan elektron alıcıları.

Karbon metabolizması hem heterotrofik olup organik karbon bileşikleri karbon kaynağı olarak kullanır, hem de ototrofik olarak karbondioksitin fiksasyonu sayesinde gerçekleşir. Enerji metabolizması ise ışığın kullanımına dayanan fotosentez yada kimyasal bileşiklerin kullanımıyla kemosentez üzerinden gerçekleşir.

Bakterileride üretim optimum koşullar sağlandığında gözlenen hızlı bölünmelerle sağlanır.(yaklaşık 10dkda bir katlanarak artar.) Her birinden identik 2 klon oluşur.(eşeysiz üreme). Laboratuvarda bakteri katı yada sıvı besiyerinde büyütülür. Agar plakaları gibi katı besiyerleri saf kültürler izole edebilmek için kullanılır. Sıvı besierleriyse sayımda ve yüksek sayıda bakteri gerektiğinde kullanılır. Çalkalanan sıvı besiyerinde medium, hücre süspansiyonu halindedir, böylece hücrelerin bölünmesi ve transferi kolaylaşır. Sıvı besiyerinden bakteriyi izole etmek zordur. Seçici besiyeri kullanımıyla spesifik organizmaların berlirlenmesi sağlanabilir.

Bakteriyel büyüme 3 fazdan oluşur, fazla nutrient olan bir ortama alınan bakteriler öncelikle kendilerini ortama adapte ederler. Bu ilk faza “lag” fazı denir ve çok küçük bir büyüme kaydedilir. Büyüme faktörleri ve enzimler, biyosentez

hızının yüksek olduğu bu fazda çokça üretilir. Büyümedeki 2. faz logaritmik olarak tanımlanr ve yüksek exponansiyel büyüme gözlenir. Bu büyümenin oranı (k) ve ikiye katlanmanın aldığı zaman (jenerasyon zamanı – g) log fazdaki değerlerdir. Bu fazda besinler aksimum hızda tüketilir ta ki besinlerden birinin büyümeyi sınırlayıcı bir faktör oluşturması ile durağan fazın başlamasına neden olur. Metabolik aktivite düşer ve DNA tamiri, antioksidan ve gıda transportuylailgili genlerin ekspresyonu artar.

Pseudomonas Putida

Kingdom: BacteriaPhylum: ProteobacteriaClass: Gamma ProteobacteriaOrder: PseudomonadalesFamily: PseudomonadaceaeGenus: PseudomonasSpecies: P. putida16S rRNA analizlerine daynarak kendi ismini verdiği P. putida grubuna dahil

edilmiştir.Morfolojik olarak pseudomonasların çoğu gram negatif,sporsuz,düz ya da hafif oval çubuk şeklindedirler.Tipik olarak bir yada daha fazla polar flagellaya sahiptirler.

Çok farklı metabolizma örnekleri gösterir; toluen gibi organik çözgenleri degrade edebilmek gibi. Bu özellik biyoremediyasyonda(biyoremediasyon: mikroorgan,zmaların, fungi yada eşil bitkilerin yada onların enzimlerinin çevredeki kontaminantlardan arındırılması, orijinal haline geri getirilmesi olarak tanımlanabilir.biyoremediyasyon toprağa kontamine olmuş kirletenleri temizlemek için kullanılabilir. Örneğin petrol atıklarının nitrat ve/yada sülfat fakültatif endojen yada ekzojen bakterilerce ham petrole bozundurularak temizlenmesi gibi.)

yada mikroorganizmalardan yağ elde edebilmek için kullanılabilmesini sağlar. P. putida, aynı degradasyon özelliğini gösteren P. aeroginosa gibi patojen bazı diğer Pseudomonas türlerinden daha güvenli olduğundan tercih edilir.

Pseudomonas Putida’nın fenol ile bağlantısı

C6H5OH formüllü toksik, renksiz kristal katı. Sudaki çözünürlüğü yüksek ve biraz asidiktir. –OH grubundaki H’i verme eğilimindedir. Fenol aslında tüm canlılar için çok zehirli bir bileşiktir. Hücre zarını parçalayarak hücre yapısının dışarı çıkmasına neden olur, ayrıca hücre proteinlerinin de denatüre olmasına neden olur. Bu nedenle fenol atıklarının toprağa ve suya karışmadan yok edilmesi gerekir. Tüm bu zararlarının yanında Fenol ekonomik olarak en önemli hidroksillenmiş aromatik bileşiklerdendir. Yıllık 7 milyon tondan fazla üretimi genelde bisfenol A ve fenolik reçine üretimi içindir. Şu anda üretiminin ana methodu benzenden üretilen kümeninin, kimyasal oksidasyonu şeklindedir. Bu proses yüksek enerji ister ve fazla toksik atığı vardır, ayrıca riskli, patlayıcı ara maddelere sahiptir. Bunun yanında yakıt fiyatlarındaki artış ve hızla artan ihtiyaç fenolün “yeşil” üretim metodlarına yöneltmiştir. . De-novo olarak sentezlenen tirozinin fenole dönüşümü, çözgen tolerant P. putida S12’de gerçekleştirilir.

BIYOREAKTÖRLER

İçerisine konan mikroorganizma kültürleri, hayvan veya bitki hücreleri yada enzimler tarafından katalizlenen biyokimyasal reaksiyonların gerçekleştiği, optimum koşulların sağlandığı ve sonuçta ürünün elde edildiği cihazlara denir.

Biyoreaktörde, hücrelerin üremesi için ve substrat ve ürünlerin fazlar arası aktarımı için sıcaklık, pH, substrat derişimi gibi uygun koşulların sağlanması gerekir.

Biyo-proses, genelde mekanik karıştırmalı yada mekanik olmayan karıştırmaya sahip (hava baloncukları gibi)reaktörlerde gerçekleştirilir.

SINIFLANDIRMASI:

Biyoraktöreler besi yerinin reaktöre verilişine, sisteme oksijen verilip verilemesine, biyoliojik ajanın tipine ve karıştırma ve havalandırma tiplerine göre sınıflandırılabilir.

1. OPERASYON TİPİNE GÖRE : Besi yerinin akışına bağlı olarak biyoreaktörler;

1.1 KESİKLİ PROSESLER : kesikli sistemlerde reaktöre giren yada çıkan bir besiyeri söz konusu değildir. Substratın tamamı reaktöre başlangıçta konur. Az bir miktar biyokütle aşılandıktan sonra büyümeynin durmasına neden olacak bir besininin bitmesi yada ortama bir inhibitör ürün oluşumunu engelleyinceye değin üretim devam eder.Eğer belli bir fazda büyüme gerekiyorsa kesikli kültürler tercih edilir.çünkü bu kültürlerde faz ayrımı yapılabilir.örneğin gıdada aroma verilmesi sadece belli fazlarda gercekleşiraynı zamanda ticari ürünler büyüme durduğunda üretilir. Kesikli prosesin avantajı, kontrolü için az emek gerektirmesidir. Üretilecek ürün az miktarda isteniyorsa ekonomik olark uygundur.

1.2 YARI KESİKLİ PROSESLER : Yarı kesikli sistemde, reaktöre sürekli olarak besiyeri eklenir ancak ortamdan uzaklaştırılmaz. Yani reaktördeki sıvı hacmi giderek artar. Bu proses substratın ortamda az olması gerektiği durumlarda kullanılır. Ayrıca reaksiyonun hızı da besleme hızıyla kontrol edilir.

1.3 SÜREKLİ PROSESLER : Reaktör sürekli beslenir ve genellikle aynı hızda da ortamdan uzaklaştırılır. Aynı şekilde reaksiyonun hızı da kontrol edilmiş olur. Hacmin sabit tutulabilmesi ve reaksiyonun kontol altında tutulabilmesi bir “kemostat” hali yaratılabilir. Bunun anlamı reaktör içindeki her noktada reaktör bileşenlerinin konsantrasyonu eşittir.Buna bağlı çalışan prosesler vardır. Turbidıostatta ise giriş besleme hızı çıkış hücre derişimi ile kontrol edilir. Kesikli kültürden farkı olarak mikroorganizmlar belirli fazlarda bulunmazlar. Endüstriyel açıdan sürekli kültürlerle çalışmak kesikli kültürlere göre daha az maliyetlidir. Zaman açısından da sürekli kültürler avantajlıdır . Ancak uygulamada daha az tercih edilir.Bunun nedeni(en önemli dezavantajı) kontaminasyondur.Çünkü nutrientler devamlı besleme ve boşaltılırken dışarısı ile temas halindedir. Bu yüzden Yöntemin en iyi uyum sağladığı proses atık arıtma tesisleridir.Çünkü ortam zaten kontaminedir.

2. OKSİJEN İHİTYACINA GÖRE BİYOREAKTRLER2.1 AEROBİK PROSESLER : zorunlu yada fakültatif

mikroorganizmaların üremesi için biyoreaktöre hava veya saf oksijen verilmesi gerekebilir. Oksijenin suda çözünürlüğü düşüktür. Bu nedenle endüstriyel boyutta ksıtlayıcı bir adımdır. Aerobik prosesler uygulanan tekniğe göre 2 ye ayrılır.

2.1.1 YÜZEY KÜLTÜR TEKNİĞİ : mikroorganizma besi ortamının yüzeyinde çoğalır ve yüzeyde m.o. hücreleri ve bunların metabolitlerinden oluşan bir tabaka yada mantarlarda bir misel örtüsü oluşur. Metabolitlerin besi ortamına difüzlenmesi de mümkündür. Besi ortamı katı, sıvı yada yarıkatı karakterde olabilir.

Yüzey kültür tekniğinin sakıncaları misel tabakasının duyarlılığı fermentasyon süresinin uzunluğu kapasitenin düşüklüğü operasyonun zorluğu prosesin otomasyonunun çok düşük oluşu

2.1.2 DERİN KÜLTÜR TEKNİĞİ : Hücreler çözelti içinde çoğalır. Reaktörler paslanmaz çelikten silindirik tanklardır. Derin kültür reaktörleri karıştırma ve havalandırma tekniklerine göre;

2.1.2.1 MEKANİK KARIŞTIRMALI BİYOREAKTÖRLER : Hava alttan verilirken karşıtırıcı bir enerji kaynağından güç alır ve çeşitli form ve yapıda olabilir.

2.1.2.2 KONVEKSİYON AKIMLI BİYOREAKTÖRLER : Bu reaktörde karıştırma ve gaz dağılımı sıvının pompalanmasıyla sağlanır.

2.1.2.3 PNÖMATİK ÇALIŞAN BİYOREAKTÖRLER2.2 ANAEROBİK PROSESLER : Reaktör mümkün olduğunca oksijensiz

kalmalıdır. 2.3 MİKROAEROBİK PROSESLER : mikroaerofilik mikroorganizmaların

üremesi ortamda çok az oksijen bulunasıyla sağlanır. Bu yüzden karıştırmanın ve oksijenin seyreltilmesi ve derişiminin ayarlanması ile kontrol sağlanır.

3. BİYOLOJİK AJANIN TİPİNE GÖRE BİYOREAKTÖRLER3.1 MİKROBİYAL FERMENTÖRLER : Ajan olarak M.O.ların kullanıldığı

biyoreaktörler. Ürün olarak bu M.O.ların kendileri biyomass, salgıladıkları metabolitler ve enzimler üretilir.

3.2 ENZİM REAKTÖRLERİ : Ortama konulan enzimin substratı dönüşüme uğratmasıyla ürün elde edilen reaktörlerlerdir.

3.3 HAYVAN VE BİTKİ HÜCRE KÜLTÜRÜ BİYOREAKTÖRLERİ

Ayrıca reaktörler şu şekilde de sınıflandırılabilir:

1) Durağan reaktörler;Karıştırmadan etkilenen çok hassas mikroorganizmalar için kullanılır. Hiçbir

karıştırma ve havalandırma yoktur. Yüzey alanı bu reaktörlerde sınırlayıcı faktördür. Küçük hacimlerde kullanılır.

T-flasklar küçük hacimlerde kullanılan havyan kültür ortamlarıdır. Yüzey alanını arttırmak amacıyla yatay olarak kullanılırlar. Büyük hacimli olanları tercih edilir.

Fernback erlenlerde durağan kültür ortamlarıdır.Yüzey kültürleri; bazı alkol ve sitrik asit üretimlerinde , mantar üretiminde

kullanılır. Yüzey alanını genişletmek için kültür üst üste tepsi gibi yerleştirilir. Karıştırma ve havalanma için ayrıca enerji harcanmaması yönünden avantajdır.

2) Çalkalamalı kültürler;Havalandırma için ekstra bir düzenek kullanılmıyor fakat çalkalama ile sıvı

yüzeğinin kırılması ve böylece yüzey alanının artması sağlanmış oluyor. Küçük hacmli kültüvasyonlar için uygundur.

3)Mekanik karıştırmalı biyoreaktörler;3L nin üzerindeki mikrobiyal fermantasyonların havalandırılması için

mekanik karıştırmalı reaktörler uygundur. O2 transferini sadece yüzeyde değil reaktörün aşağlarındada iyi olmasını sağlar. Fakat çok hızlı karıştırıldığı taktirde hücreler parçalanabilir yada çok köpük oluşabilir. Bunlara dikkat etmek gereklidir.

4) Kabarcık sürüşlü biyoreaktörler;

Mekanik karıştırma + hava girişi + havalandırmaKabarcık kolon reaktörü;

Küf , bitkihücreleri ile çalışırkenHava kaldırmalı dahili draft tüplü reaktör;

Daha iyi ve yeterli kütle ve ısı transferini sağlayan bir tüp içerir. Oldukça pahalı olması bir dezavantajdır.Harici draft tüplü hava kaldırmalı reaktör;

5) Akışkan yatak biyoreaktörler;- Süreklikültürlerde iyi bir kütle transferi sağlar- Yüksek biyokütle transferi sağlar. - İmmobilize hücre ve enzimlerin kullanıldığı reaktörlerdir. - Karıştırma pompayla sağlanır.- Hücreler/enzimler hafif partiküllerin yüzeyine immobilize edilir.- Genelde hava ve besiyeri alttan verilir. Yerçekimi ile pompanın yukarı doğru ittiği sıvı dengelenir ve sirkülasyon sağlanır.- Aerobik ve mikrobiyal sistemler için dağıtıcılarla O2 transferi sağlanır. (veya draft tüple.atık arıtımında cok sık kullanılır.)- Hayvan hücre kültürleri bağlanmış mikrotaşıyıcılarla kullanılır. - Sürekli ve kesikli modeller kullanılabilir. Eski fermentasyon sıvısının geri dönüşümü pompaya yapılan bir bağlantıyla sağlanır.

6) İmmobilize hücre reaktörleri - Genelde atık su arıtımında kullanılır.(özellikle dolgu yatak reaktörler) - Yüksek konsantrasyonlarda hücre kültürleriyle çalışılabilir.

- Dolayısıyla fazla kataliz olur ve yüksek O2 transferi gerektirir.- Kemostatlara göre daha stabildir. Kemostatlarda akış hızından dolayı

sıcaklık yükselir ve hücre sayısı azalır ve hücre sayısını arttırmak için zaman geçmesi gerekir.

- Dolgu yatak reaktöründe hücreler adsorbsiyonla yada tutuklama ile katı yüzeye immobilize edilir. Katı matriksteki hücreler substuratları bu katı yüzeyde dönüşüme uğratırlar.

- Endüdtride; atık su arıtımında, enzim ve aminoasit üretiminde, steroid transformasyonunda kullanılır.

- İmmobilizasyonun yapıldığı matriks agar, alginat veya carregenin olabilir.- Hücreler jellerin porlarına fiziksel olarak tutuklanır buda daha iyi bir hücre

tutumu ve etkin yüzey alanını sağlar.- Büyümeyen hücreler kullanılabilir, hücreler inaktif edilir. Bu şekilde

büyüme için ayrıca nutrient harcanmaz.- Kütle transfer hızı akış hızına bağlı olarak değişir. Uygun akış hızı

seçilmelidir.- Enerji kullanımı azdır. Maddi açıdan avantajlı bir yöntemdir.

HÜCRE İMMOBİLİZASYONUPseudomonas putida hücreli jelde tutuklama yöntemi ile immobilize edilir.Bu işlemin amacı bir dizi reaksiyonu tek bir hücrede uzun süreli olarak kullanmaktır.Bu özelliğinden dolayı hücre immobilizasyonu enzime nazaran avatajlıdır(hücre immobilzasyonu özellikleri ve avantajları).

 Ca-Alginate ile İmmobilizasyon

       Alginate deniz yosunlarında bulunan bir polisakkarit olup, aralarında (1-4) glukosidik bağları olan b-D-mannuronic (M) asit ve a-L-guluronic asit (G)'ten meydana gelir. Şekilde alginate'in kimyasal formülü görülmektedir. Endüstriyel olarak üretildiği mikroorganizmalar ise şunlardır:

Laminaria hyperborea, Macrocystis pyrifera,Ascophyllum nodosu , L.digitata, vb. Alginate molekülünün bileşimi elde edildiği organizmaya ve dokuya göre farklılıklar gösterir. Alginate iki ve üç değerlikli katyonlar ile reaksiyona girerek jel oluşturur. Katyonlar (Ca2+, Sr2+ ,Ba2+, Al3+, Fe3+ gibi) moleküldeki guluronic asitleri birbirlerine bağlayarak jel oluşumuna sebep olurlar.

Jel oluşturma özellikleri alginate molekülünün kompozisyon ve sırasına bağlıdır. G bloklarının uzunluğu jel formasyonunun başlıca yapısal durumunu belirler. Eğer molekülde G miktarı fazla ise sert ve kırılgan bir jel oluşur; eğer M miktarı fazla ise daha yumuşak ve elastik jel oluşumu gözlenir.

Genellikle hücrelerin immobilizasyonunda kullanılan bu metod enzimler için kullanıldığında, bazı özel tekniklerin kullanılması gereklidir. Alginate ile boncuk, kapsül ve fiber oluşturularak enzim veya hücre immobilize edilebilir.

Boncuk(Bead) ile İmmobilizasyon;

       %2’ lik Na-alginate çözeltisine fenole adapte edilmiş hücre (3,4 mL)ilave edildikten sonra manyetik karıştırıcıda karıştırılır. Bu çözelti 0.2M CaCl2 çözeltisine şırınga yardımı ile damlatılarak ilave edilir.Şırınganın ucu kesik

olmalı ve karışım damlatılırken damlacıkların aynı boyutta olmasına özen gösterilir.Oluşan boncuklar 1 saat süre ile CaCl2 içerisinde bekletirlir. Na-alginate, CaCl2 ile temas ettiğinde Na-Ca değişimi nedeniyle suda çözünmeyen Ca-alginate boncuk'ları  meydana gelir ve hücreler bu boncuk'ların içlerine yerleşir. Aşağıdaki şekilde boncuk ile immobilizasyon  gösterilmiştir. Zamanla hücreler i bu boncuk'lardan dışa sızarlar. Bu durumu önlemek için çeşitli metodlar geliştirilmiştir;

   Oluşturulan boncuk bir membran ile kaplanabilir. Enzimlerin molekül ağırlıkları bazı polimerler yardımıyla  artırılabilir. Mesela, dextransucrase, molekül ağırlığının dextran polimerleriyle artırılmasıyla başarılı bir şekilde Ca-alginate içine immobilize edilmiştir.

     Hücreler alginate molekülüne karbodiimid kullanılarak kovalent olarak bağlanabilir. Aspergillus oryzae b-galactosidase, karbodiimide kullanılarak alginate'e kovalent olarak bağlanmış ve daha sonra Ca-alginate boncuk'larında immobilize edilmiştir.  Kolloidal silika yardımıyla bead'ler sağlamlaştırılabilir. Boncuklar kurutularak gözenekler küçültülebilir.

DOLGU YATAK REAKTÖRÜNDE İMMOBİLİZASYON:Dolgu yatak reaktörü için peristaltik pompa,geri soğutuculu kolon,manyetik

karıştırıcıdan oluşturulacak sistem kullanılır.Daha önceden boncuk şeklinde hazırlanmış hücreler reaktöre

doldurulmadan bir gece 50 mg/mL fenol çözeltisinde bekletilir (+4 C°).Boncuk şeklindeki hücreler ,alt tarafı tıkalı (sıvı geçirebilen) kolon içerisine yaklaşık ¾ ü kadar doldurulur ve cam yünü ile üzerleri kapatılır.(Cam yünü hücrelrin dağılmasını engellemek için konur).Substrat olarak kullanılacak olan sıvı(MSM içerisnde 20mg/mL lik fenol) toplma kabına doldurulur ve pompa çalıştırılır.Kolonda sıvı yükselmesi ile oluşan hava kabarcıkları ince spatül yardımı ile çıkartılır.Hava alma işlemi bittikten sonra tekrar cam pamuğu yerleştirilir(cam yünü, kolondaki sıvı akışı ile boncukların hareket etmesini engeller).

Bütün hazırlıklar bittikten sonra artık reaktör kullanılmaya hazırdır.Peristaltik pompanın hızı ayarlanır ve beklenir.Reaktörün çalışma sıcaklığı 28 C° olmalıdır fakat sıcak su aletinin sıcaklık ayarı çalışmadığı için alet kullanılmadı.Laboratuvar sıcaklığı( yaklaşık 20 C°) reaktör çalışma sıcaklığı olarak kullanıldı.

Reaktör çalıştırılmadan önce ve çalıştıktan sonra her 30 dak. bir enjektör ile örnek alınır.Bu örnekler eppendorf tüplerine konur (fenol tüketim miktarlarının bulunması için)MİKROORGANİZMALARIN BÜYÜME MODELLERİ VE MİKROBİYAL BÜYÜME KİNETİKLERİFermentasyonlar kesikli ve sürekli proseslerde yürütülebilmektedirler. Burada kesikli vesürekli sistemlerin kinetikleri incelenecektir.KESİKLİ KÜLTÜRKesikli kültür sistemlerinde büyüme kapalı bir sistem veya kapalı bir çevrede gerçekleşir.Kesikli kültür sistemleri uygun büyüme ortamı içeren bir kap veya fermantör olup optimumpH, sıcaklık ve redoks potansiyeli koşullarında çalıştırılırlar. Büyüme, ortamdaki gereklibileşenlerin tükenmesi veya toksik ürünlerin birikimi, pH değişimi gibi çevresel değişikliklergözlenene kadar devam eder. Tipik bir kesikli büyüme eğrisi Şekil l de gösterilmiştir. Büyümeeğrisinde gözlenen fazlar aşağıdaki gibi açıklanabilir.Gecikme fazı (lagfazı) : Mikroorganizmalar ortama aşılandıktan sonra hemen bir büyümegözlenmez. Bu periyot boyunca hücreler, mevcut substratların kullanımı için gerekli enzimlerisentez ederek yeni çevrede büyümeye adapte olurlar. Bu fazın süresi hücrelerin alındığıbüyüme ortamı ile aşılandıkları ortamın benzerliğine yada farklılığına bağımlıdır. Eğer bu ikiortam aynı ise gecikme fazı kısa veya hiç gözlenmeyecektir. Eğer bu iki ortam farklı ise bu fazuzun olacaktır. Gecikme fazının kısaltılması mikrobiyal teknolojide ekonomik yönden büyükyararlar sağlar.Hızlandırılmış büyüme fazı: Hücre sayısı ve bölünme hızı artmaya başlar.Eksponansiyel veya logaritmik faz: Gecikme fazından sonra gözlenen bu fazda organizmanınbüyüme hızı sabit kalana kadar artar. Bu koşullar altıda hücrenin bütün bileşenlerinin sentezisabit bir hızla artar, hücre popülasyonu iki katı olur ve düzenli aralıklarla iki katı olmaya

devam eder.Yavaşlamış büyüme fazı: Büyüme hızı ve bölünme hızı yavaşlamaya başlar.Durağan faz: Bu fazda, büyüme hızı sıfıra düşer ve hücre kuru ağırlığı sabit kalır, net büyümegözlenmez. Hücrelerin büyümesinin durmasının sebebi, gerekli besinlerin tüketilmesi, toksikmaddelerin birikimi veya hücre çevresindeki bir değişim ( örneğin pH) olabilir.Gerileme fazı: Durağan fazı gerileme fazı takip eder ki bu fazda ölüm hızı büyüme hızındanbüyüktür. Mikroorganizmaların ölüm hızlan arttığı için zamanla konsantrasyonda azalmagözlenir.Kesikli büyüme eğrisi organizmanın kalıtımsal olarak taşıdığı bir özellik değil, kapalı birsistemdeki çevre koşullarından kaynaklanan bir durumdur.Mikrobiyat hücrelerin büyümesi otokatalitik bir olaydır. Bu nedenle, hücre kuru ağırlığındakiartış hızı başlangıçta bulunan hücrelerin konsantrasyonu ile orantılıdır. Tek hücreliorganizmaların eksponansiyel büyümesi sırasında hücre kuru ağırlığı düzenli aralıklarla ikikatma çıkar. Eksponansiyel faz aşağıdaki eşitlikle tanımlanabilir.

Burada x: Mikrobiyal biyokütlenin konsantrasyonut: zaman (saat)μ: spesifik büyüme hızı, saat -1l nolu eşitliğin integrasyonu aşağıdaki eşitliği verir.

X0 = Başlangıç biyokütle konsantrasyonuxt = t anındaki biyokütle konsantrasyonu2 nolu eşitliğin doğal logaritması alınırsaln xt = lnx0 +μt (3)Zamana karşı biyokütle konsantrasyonunun doğal logaritmasının grafiği bir doğruyu verir veeğim µ'yü verir. Eksponaasiyel faz boyunca organizmanın büyümesi maksimum spesifik hızdaolur. Büyüme limitasyonunun doğası değişik aralıktaki substrat konsantrasyonunun varlığında

organizmanın büyümesi ve durgun fazda biyokütle konsantrasyonuna karşı başlangıç substratkonsantrasyonunu grafiğe geçirilerek belirlenebilir (Şekil 2). Şekil 2 den görülmektedir ki Ave B bölgelerinde başlangıç substrat konsantrasyonundaki bir artış durgun fazda biyokütleüretiminde orantılı bir artış vermektedir. Bu durum aşağıdaki eşitlikle ifade edilebilr.X= Y (SR-S) (4)X : Üretilen biyokütle konsantrasyonuY : Verim faktörü ( g biyokütle üretilen/g substrat tüketilen )SR : Başlagıç substrat konsantrasyonuS : Atık(residual) substrat konsantrasyonuA ve B bölgesinde s büyümenin durma noktasında sıfıra eşittir. Bundan dolayı eşitlik (4) farklımiktarlarda substratın üretilen biyokütlenin tahmini için kullanılabilir. C ve D bölgesindebaşlangıç substrat konsantrasyonundaki bir artış biyokütle üretiminde orantısal bir artışvermemektedir. Bu substrat azalması veya toksik ürünlerin birikiminden kaynaklanabilir.Verim faktörü Y herhangi bir substratın biyokütle dönüşümünün etkinliğinin bir ölçüsü olupçeşitli biyokütle konsantrasyonları üretmek için gerekli substrat konsantrasyonununtahmininda kullanılabilir.Büyüme hızındaki düşüş substrat miktarının azalmasından kaynaklanmaktadır ve jj, ileresidual büyüme limitli substrat arasındaki ilişki ile tanımlanabilir. Bu eşitlik 5 degösterilmiştir(Monod,1942).

S: residual substrat konsantrasyonuKs: substrat kullanım sabitiEğer μ =μmax/2 ise Ks nümerik olarak substrat konsantrasyonuna eşit. Eğer organizma limitlisubstrat için çok yüksek bir ilgiye sahipse (düşük Ks değeri) büyüme hızı substratkonsantrasyonu çok düşük bir seviyeye düşene kadar etkilenmeyecektir. Sonuçtayavaşlama fazı böyle kültürler için etkilenmeyecektir.Bununla beraber eğer organizmasubstrata düşük bir ilgiye sahipse (yüksek Ks değeri), büyüme hızı yüksek substratkonsantrasyonu ile etkilenecektir. Sonuçta böyle kültürler için yavaşlama fazı uzun olacaktır.

Pirt (1975) mikrobiyal kültürler ile ürün oluşum kinetiklerini büyümeye bağlı ve büyümeyebağlı olmayan ürünler açısından tartışmıştır

SÜREKLİ KÜLTÜRKesikli kültürdeki eksponansiyel faz kaba taze ortamın ilavesi ile uzatılabilir. Kaba ortamınakışı kabın hacmi ile orantılıdır. Seyrelme hızı D;D=F/V (9)F : akış hızı (dm-3V-1)V: Hacim (dm3)D:h-1Hücre konsantrasyonundaki net değişim

Yatışkın konumda hücre konsantrasyonu sabit kalacaktır yani dx/dt =0

Sonuçta yatışkın koşulda spesifik büyüme hızı seyrelme hızıyla kontrol edilir.Kesikli kültürdeorganizma maksimum spesifik büyüme hızıyla büyüyor, sürekli kültürde seyrelme hızı sadecemaksimum spesifik büyüme hızından düşükken kontrol ediliyor. Seyrelme hızının etkisini

kontrol eden mekanizma Monod tarafından 1942 de gösterilen eşitlikle

gösterilebilir. Yatışkın durumda μ=DD= μmaxS/Ks+SS : substratın yatışkın konum konsantrasyonuS= KsD/μmax -D (13)Bu eşitlik seyrelme hızıyla hesaplanan substrat konsantrasyonunu tahmin eder. Yatışkınkonumda hücre konsantrasyonu iseX=Y(SR-S) (14)X: sürekli sistemdeki yatışkın konum hücre konsantrasyonu 13 ve 14 nolu eşitliğinbirleştirilmesi ile aşağıdaki denklem bulunur.

DENEYİN YAPILIŞI: Deneydeki amacımız pseudomonas putidanın fenole adapte edilmesi ve onun fenolü karbon kaynağı olarak kullanılmasının sağlanmasıdır. Adaptasyon sırasında hücre büyümesi de kinetik açıdan incelenmiştir.

Stok P. putida kültüründen ara stok hazırlanarak nütrient agara (katı)ekim yapıldı

(24 saat 280C de inkübe edildi)Nütrient agardan nütrient broth (sıvı) ekim yapıldı (24 saat 280C de inkübe edildi)Mineral salt medium (MSM) ortamına (250 ml’lik erlene, toplam hacim

50ml olcak şekilde) ekim yapıldı. Nütrient Broth ortamından MSM ortamına geçerken kullandığımız MSM ortamını içine 1 günlük enerji kaynağı olarak 1g/L olacak şekilde glukoz katıldı. Böylece hücre sayısının arttırılması sağlanmış oldu.

(24 saat 280C de inkübe edildi)Bundan sonra mikroorganizmalar her gün eski ortamından yeni MSM

ortamına aşılandı. Her seferinde MSM’ye katılan glukoz miktarı biraz daha azaltıp fenol miktarı biraz daha arttırılarak toplam derişim 250mg/L olacak şekilde mikroorganizmaların fenole adapte olması sağlandı

200 mg/L glukoz + 50 mg/L içeren MSM 150 mg/L glukoz + 100 mg/L içeren MSM100 mg/L glukoz + 150 mg/L içeren MSM50 mg/L glukoz + 200 mg/L içeren MSM

250 mg/L fenol içeren MSM Bir erlene de 250 mg/L olacak şekilde glukoz katılarak hiç fenol katılmaz. 6 tane glukoz tayini için 6 tane de fenol tayini için kullanılacak 12 erlen

hazırlandı. Daha sonra 50, 100, 150, 250, 350 ve 500 mg/L fenol ve glukoz içeren bu erlenlere optik dansitesi 0.4 olan 1er ml mikroorganizma aşılandı v inkübe edildi. Her erlenden optik dansitesinin ölçümü, ayrıca fenol ve glukoz tayinleri için belirli aralıklarla örnek alınarak spektrofotometrik olarak ölçümleri yapıldı

Optik dansitenin belirlenebilmesi için(ki bu da farklı ortamlarda büyüteceğimiz Pseudomonas putida hücrelerini saymak içindir) bir standart grafiğine ihtiyaç vardır. Bunun için hücre süspansiyonu belli oranlarda (0,45’i geçmeyecek şekilde)seyreltilrek 560 nm’de absorbansları okundu. Daha sonra serum fizyolojikle 10-5 10-6 10-7 e seyreltilerek nütrient agara ekim yapıldı ve inkubasyona bırakıldı.daha sonra koloni sayım yöntemiyle hücre sayısı bulundu. Seyreltme katsayısıyla çarpılarak absorbans değerine karşılık gelen hücre sayısı bulunacak,Absorbansa - hücre sayısı grafiği çizilerek optik dansite standart grafiği oluşturulacaktı fakat koloni sayımında Koloni sayıları 30-400 tane arasında olmalıdır.bu aralığın dışında hücreler homojen olarak dağılmazlar.denememizde hücre yoğunluğu fazla geldiğinden koloniler karışmıştır.bu yüzden sayım yapılamamış ve daha onceki denemelerden elde edilen standartlar kullanılmıştır. . Kullanılan denklem y=0,6267 x dir.

Hücre için 10ml MSM ortamı içeren 4 tüp 15 dakika santrifüjlendi. Her bir tüpün altta kalan hücre pastası 1 ml serum fizyolojikte çözüldü. Bunun 3,4 ml’si 6,6 ml %3’lük Na-arginat’la karıştırıldı. Böylece %2’ilk Na-arginat çözeltisi içeren hücre süspansiyonu elde edilmiş oldu. Daha sonra buz içinde bulunan erlenin içindeki CaCl2 e şırıngayla damla damla hücre+aljınat ilave edildi. Oluşan boncuklar süzüldü. CaCl2 ‘le yıkanarak immobilize olmayan hücreleri yıkadık. Böylece hücreler immobilize edilmiş oldu.

Daha sonra immobilize hücreler reaktöre doldurularak kurulan reaktör tamamlandı.toplamda 9ml olan immobilize edilecek materyalimiz 332tane boncuk içerisine hapsedildi.(reaktör içerisine koyarken sayıyoruz bunu)Reaktör çalıştırılarak fenol çözeltisinin reaktörden geçerek hücrelerin fenolü parçalamaları sağlandı.

Akış hızının hesaplanmasıAkış hızını bulmak için öncelikle immobilize hücrelerimizi reaktöre

koyduktan sonra oluşan boşluk hacmini(çalışılacak hacmi) bulmamız gerekir.bunun içinVboşluk=Vreaktör hacmi-Vdolu hacim formülünden faydalanılır. Vdoluluk hacmini bulmak için başka bir mezurde 5ml ortam hazırladık ve bu ortama önceden hazırladığımız 20 adet içi boş boncuk ekledik ve artan hacmi

ölçerek bir boncuğun kapladığı hacmi bulduk. Ölçülen yükseklik(h): 5,2cm

20 tane hücreye karşı 0,2 ml artış gözledi 332 hücreye karşı 3,32 ml artış olacagını hesapladık

iç hacmi=Π.r2.h (0,75)2.3,14.5,4 =9,54cm3 Vboşluk=9,54 – 3,32 = 6,22cm3 Akış hızı=6,22/(72:60)= 5,18

Kurulumda kullanılan pompanın amacı:fenolu kullanacak,dönüşüme uğratıcak hucrelerın uzerıneyollamaktır.her yarım saatte bir reaktörden şırıngayla örnek alınır ve azalan fenol miktarı grafiğe geçilir.

Reaktörden örnek alınırken…..

ABSORBANS DEĞERLERİ VE HESAPLAMALR

FENOL OPTİK DANSİTE DEĞERLERİ

50 mg/L 100 mg/L 150 mg/L 250 mg/L 350 mg/L 500 mg/L  HÜCRE   HÜCRE   HÜCRE   HÜCRE   HÜCRE   HÜCRE

ABS YOĞ. ABS YOĞ. ABS YOĞ. ABS YOĞ. ABS YOĞ. ABS YOĞ.0 0,081 İPTAL 0,0873 0,1393 0,07 0,1173 0,0844 0,1347 0,0715 0,1141 0,072 0,11491 0,126 0,2011 0,1758 0,2805 0,11 0,1760 0,1155 0,1843 0,1108 0,1768 0,1245 0,19872 0,1115 0,1779 0,0981 0,1565 0,09 0,1409 0,094 0,1500 0,0807 0,1288 0,0828 0,13213 0,112 0,1787 0,0982 0,1567 0,09 0,1411 0,108 0,1723 0,099 0,1580 0,0844 0,13474 0,1149 0,1833 0,1233 0,1967 0,08 0,1307 0,0967 0,1543 0,0985 0,1572 0,0935 0,14925 0,1291 0,2060 0,0979 0,1562 0,11 0,1771 0,1186 0,1892 0,0939 0,1498 0,1088 0,17366 0,1056 İPTAL 0,1102 0,1758 0,08 0,1315 0,0956 0,1525 0,0939 0,1498 0,0869 0,13877 0,1412 0,2253 0,1057 0,1687 0,13 0,2145 0,0888 0,1417 0,1197 0,1910 0,0893 0,14258 0,1131 İPTAL 0,1155 0,1843 0,11 0,1734 0,1035 0,1652 0,1036 0,1653 0,0857 0,13679 0,1367 0,2181 0,1079 0,1722 0,11 0,1754 0,1136 0,1813 0,1108 0,1768 0,0962 0,1535# 0,108 0,1723 0,1219 0,1945 0,1 0,1653 0,1207 0,1926 0,1178 0,1880 0,098 0,1564# 0,106 0,1691 0,1091 0,1741 0,11 0,1755 0,151 0,2409 0,1053 0,1680 0,1096 0,1749# 0,1752 0,2796 0,3301 0,5267 0,37 0,5851 0,36 0,5744 0,2266 0,3616 - -# 0,0806 0,1286 0,3438 0,5486 0,37 0,5953 0,3681 0,5874 0,2385 0,3806 0,111 0,1771# 0,1059 0,1690 0,3558 0,5677 0,4 0,6359 0,3792 0,6051 0,2987 0,4766 0,1228 0,1959# 0,1108 0,1768 0,354 0,5649 0,39 0,6279 0,3685 0,5880 0,4016 0,6408 0,1256 0,2004# 0,1507 0,2405 0,3203 0,5111 0,43 0,6916 0,3489 0,5567 0,6394 1,0203 0,1551 0,2475

GLUKOZ OPTİK DANSİTE DEĞERLERİ

50 mg/L 100 mg/L 150 mg/L 250 mg/L 350 mg/L 500 mg/L  HÜCRE   HÜCRE   HÜCRE   HÜCRE   HÜCRE   HÜCRE

ABS YOĞ. ABS YOĞ. ABS YOĞ. ABS YOĞ. ABS YOĞ. ABS YOĞ.0 0,096 0,1532 0,0972 0,1551 0,1059 0,1690 0,0951 0,1517 0,1456 0,2323 0,072 0,11491 0,1504 0,2400 0,1695 0,2705 0,111 0,1771 0,138 0,2202 0,1154 0,1841 0,1245 0,19872 0,1065 0,1699 0,1206 0,1924 0,1131 0,1805 0,1132 0,1806 0,0859 0,1371 0,0828 0,13213 0,1232 0,1966 0,1304 0,2081 0,1243 0,1983 0,107 0,1707 0,1026 0,1637 0,0844 0,13474 0,1566 0,2499 0,1611 0,2571 0,156 0,2489 0,1412 0,2253 0,1373 0,2191 0,0935 0,14925 0,1864 0,2974 0,1964 0,3134 0,189 0,3016 0,1688 0,2693 0,1101 0,1757 0,1088 0,17366 0,2133 0,3404 0,2425 0,3869 0,249 0,3973 0,2116 0,3376 0,1349 0,2153 0,0869 0,13877 0,189 0,3016 0,2723 0,4345 0,3157 0,5037 0,2434 0,3884 0,1315 0,2098 0,0893 0,14258 0,1991 0,3177 0,2694 0,4299 0,3615 0,5768 0,3292 0,5253 0,1297 0,2070 0,0857 0,13679 0,1944 0,3102 0,2695 0,4300 0,3567 0,5692 0,4795 0,7651 0,1893 0,3021 0,0962 0,153510 0,1901 0,3033 0,2484 0,3964 0,3322 0,5301 0,4841 0,7725 0,1967 0,3139 0,098 0,156411 0,1931 0,3081 0,259 0,4133 0,3176 0,5068 0,4756 0,7589 0,1938 0,3092 0,1096 0,174912 0,0884 0,1411 0,0976 0,1557 0,0945 0,1508 0,3454 0,5511 0,5882 0,9386 - -13 0,035 0,0558 0,1301 0,2076 0,1168 0,1864 0,4223 0,6738 0,5178 0,8262 0,111 0,177115 0,1467 0,2341 0,1769 0,2823 0,1573 0,2510 0,4614 0,7362 0,6765 1,0795 0,1228 0,195917 0,1911 0,3049 0,2063 0,3292 0,2752 0,4391 0,5378 0,8581 0,9375 1,4959 0,1256 0,200419 0,2 0,3191 0,2089 0,3333 0,2693 0,4297 0,5188 0,8278 0,5696 0,9089 0,1551 0,2475

FENOL GRAFIKLERI

FENOL 50mg/L OPTİK DANSİTE GRAFİĞİ

0,0000

0,0500

0,1000

0,1500

0,2000

0,2500

0 2 4 6 8 10 12 14

ZAMAN (SAAT)

HÜ

CR

E Y

OĞ

UN

LU

Ğ

FENOL 100mg/L OPTİK DANSİTE

0,0000

0,1000

0,2000

0,3000

0,4000

0,5000

0,6000

0 5 10 15 20

Zaman (saat)

HÜ

CR

E Y

OĞ

UN

LU

ĞU

FENOL 150mg/L OPTİK DANSİTE

0,0000

0,1000

0,2000

0,3000

0,4000

0,5000

0,6000

0,7000

0,8000

0 5 10 15 20

Zaman (saat)

HÜ

CR

E Y

OĞ

UN

LU

ĞU

FENOL 250mg/L OPTİK DANSİTE

0,00000,10000,20000,30000,40000,50000,60000,7000

0 5 10 15 20

Zaman (saat)

HÜ

CR

E Y

OĞ

UN

LUĞ

U

FENOL 350mg/L OPTİK DANSİTE

0,0000

0,2000

0,4000

0,6000

0,8000

1,0000

1,2000

0 5 10 15 20

Zaman (saat)

HÜ

CR

E Y

OĞ

UN

LUĞ

U

FENOL 500mg/L OPTİK DANSİTE

0,0000

0,0500

0,1000

0,1500

0,2000

0,2500

0,3000

0 5 10 15 20

Zaman (saat)

HÜ

CR

E YO

ĞU

NLU

ĞU

GLUKOZ GRAFIKLERI

GLUKOZ 50mg/L OPTİK DANSİTE

0,0000

0,0500

0,1000

0,1500

0,2000

0,2500

0,3000

0,3500

0,4000

0 2 4 6 8 10 12 14

Zaman (saat)

HÜ

CR

E Y

OĞ

UN

LU

ĞU

GLUKOZ 100mg/L OPTİK DANSİTE

0,0000

0,1000

0,2000

0,3000

0,4000

0,5000

0 2 4 6 8 10 12 14

Zaman (saat)

HÜ

CR

E Y

OĞ

UN

LU

ĞU

GLUKOZ 150mg/L OPTİK DANSİTE

0,0000

0,1000

0,2000

0,3000

0,4000

0,5000

0,6000

0,7000

0 2 4 6 8 10 12 14

Zaman (saat)

HÜ

CR

E Y

OĞ

UN

LU

ĞU

GLUKOZ 250mg/L OPTİK DANSİTE

0,00000,10000,20000,30000,40000,50000,60000,70000,80000,9000

0 2 4 6 8 10 12 14

Zaman (saat)

HÜ

CR

E Y

OĞ

UN

LU

ĞU

GLUKOZ 350 mg/L OPTİK DANSİTE

0,0000

0,2000

0,4000

0,6000

0,8000

1,0000

1,2000

1,4000

1,6000

0 5 10 15 20

Zaman (saat)

HÜ

CR

E Y

OĞ

UN

LU

ĞU

GLUKOZ 500mg/L OPTİK DANSİTE

0,0000

0,5000

1,0000

1,5000

2,0000

0 5 10 15 20

Zaman (saat)

HÜ

CR

E Y

OĞ

UN

LU

ĞU

Optik dansite grafiklerinden hücrelerin logaritmik faza girdiği zaman aralığı bulunur. Ve bu

aralıktaki optik dansite değerlerinin ln’leri alınarak lnx – zaman grafiği çizilir.

Log faz zamanlari

GLUKOZ50 mg/L 100 mg/L 150 mg/L

ZAMAN x ln x ZAMAN x ln x ZAMAN x ln x2 0,1699 -1,772 3 0,2081 -1,57 5 0,3016 -1,1993 0,1966 -1,627 4 0,2571 -1,358 6 0,3973 -0,9234 0,2499 -1,387 5 0,3134 -1,16 7 0,5037 -0,6865 0,2974 -1,213 6 0,3869 -0,949 8 0,5768 -0,556 0,3404 -1,078 7 0,4345 -0,834      

250 mg/L 350 mg/L 50 mg/LZAMAN x ln x ZAMAN x ln x ZAMAN x ln x

4 0,2253 -1,49 11 0,3092 -1,174 8 0,7147 -0,3365 0,2693 -1,312 15 1,0795 0,0765 9 1,0228 0,02266 0,3376 -1,086            7 0,3884 -0,946            8 0,5253 -0,644            9 0,7651 -0,268            

FENOL50 mg/L 100 mg/L 150 mg/L

ZAMAN x ln x ZAMAN x ln x ZAMAN x ln x

4 0,1833-

1,69641 11 0,174086 -1,7482 11 0,175523 -1,73999

5 0,2060-

1,57988 12 0,526727-

0,64107 12 0,585128 -0,53592

7 0,2253-

1,49029            250 mg/L 350 mg/L 50 mg/L

ZAMAN x ln x ZAMAN x ln x ZAMAN x ln x

11 0,240945-1,42319 11 0,168023

-1,78365 8 0,714696 -0,3359

12 0,574438-0,55436 12 0,361577

-1,01728 9 1,022818 0,022561

FENOL 50mg/L y = 0,0653x - 1,9371

R2 = 0,9312

-1,75

-1,7

-1,65

-1,6

-1,55

-1,5

-1,45

0 1 2 3 4 5 6 7 8

ZAMAN (SAAT)

Ln

X

FENOL 100 mg/L y = 1,1071x - 13,927

R2 = 1

-2

-1,5

-1

-0,5

0

10,8 11 11,2 11,4 11,6 11,8 12 12,2

ZAMAN (SAAT)

Ln

X

y = 1,2041x - 14,985

R2 = 1

-2

-1,5

-1

-0,5

0

10,8 11 11,2 11,4 11,6 11,8 12 12,2

ZAMAN (SAAT)

Ln

X

FENOL 150 mg/L

y = 0,8688x - 10,98

R2 = 1

-1,6

-1,4

-1,2

-1

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0

10,8 11 11,2 11,4 11,6 11,8 12 12,2

ZAMAN (SAAT)

Ln

X

FENOL 250mg/L

y = 0,7664x - 10,214R2 = 1

-2

-1,5

-1

-0,5

0

10,8 11 11,2 11,4 11,6 11,8 12 12,2

ZAMAN (SAAT)

Ln

X

FENOL 350mg/L

FENOL 500 mg/L y = 0,0409x - 2,2352

R2 = 0,8598

-2

-1,5

-1

-0,5

0

0 5 10 15 20

ZAMAN (SAAT)

Ln

X

GLUKOZ 50 mg/L y = 0,1803x - 2,1365

R2 = 0,9914

-2

-1,5

-1

-0,5

0

0 1 2 3 4 5 6 7

ZAMAN (SAAT)

Ln

X

GLUKOZ 150mg/L

y = 0,2183x - 2,2583

R2 = 0,979

-1,4

-1,2

-1

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0

0 2 4 6 8 10

ZAMAN (SAAT)

Ln

X

GLUKOZ 250 mg/L

y = 0,2359x - 2,4909

R2 = 0,9738

-2

-1,5

-1

-0,5

0

0 2 4 6 8 10

ZAMAN (SAAT)

Ln

X

GLUKOZ 350 mg/L y = 0,4167x - 1,5903

R2 = 1

-1,4-1,2

-1-0,8-0,6-0,4-0,2

00,2

0 1 2 3 4 5

ZAMAN (SAAT)

Ln

X

GLUKOZ 500 mg/L y = 0,3585x - 3,2036R2 = 1

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0

0,1

7,8 8 8,2 8,4 8,6 8,8 9 9,2

ZAMAN (SAAT)

Ln X

FENOL MONOD GRAFIGI

[S] doğrunun denklemieğim =

1/ [S] 1/50 mg/L y=0,0653x-1,9371 0,0653 0,0200 15,314

100 mg/L y=1,1071x-13,927 1,1071 0,0100 0,9033150 mg/L y=1,2041x-14,985 1,2041 0,0067 0,8305250 mg/L y=0,8688x-10,98 0,8688 0,0040 1,151350 mg/L y = 0,7664x - 10,214 0,7664 0,0029 1,3048500 mg/L y=0,04909x-2,2352 0,0409 0,0020 24,45

Fenol MONOD GRAFİĞİ

00,20,40,60,8

11,21,4

0 100 200 300 400 500 600

SUBSTRAT KONSANTRASYONU (mg/L)

SP

ES

İFİK

BÜ

YÜ

ME

HIZ

I

GLUKOZ MONOD GRAFIGI

   doğrunun denklemi

eğim = m 1/[S] 1/m

50 mg/L y=0,1803x-2,1365 0,1803 0,020 5,54631100 mg/L y=0,1882x-1,7388 0,1882 0,010 5,31350150 mg/L y=0,2183x-2,2583 0,2183 0,007 4,58085250 mg/L y=0,2359x-2,4909 0,2359 0,004 4,23908350 mg/L y=0,4167x-1,5903 0,4167 0,003 2,39981500 mg/L y=0,3583x-3,2036 0,3585 0,002 2,78940

GLUKOZ MONOD GRAFİĞİ

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0 100 200 300 400 500 600

SUBSTRAT KONSANTRASYONU (mg/L)

SP

ES

İFİK

BÜ

YÜ

ME

HIZ

I

y = -123,74x + 1,6533

R2 = 0,9993

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0,0000 0,0010 0,0020 0,0030 0,0040 0,0050 0,0060 0,0070

1/[S]

1/m

Y=180,74x + 3,4661X=0 olursa y=3,4661= 1/max max=0,2885Eğim=Ks/max=180,74Ks=0,2885 X 180,74 =52,145

GLUKOZ TAYINIİ

STANDARTLARIN HAZIRLANMASI                       

V KÖR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10D.SU 1 0,99 0,975 0,95 0,9 0,85 0,8 0,75 0,7 0,6 0,5

GLUKOZ STD                      (10mM) - 0,01 0,025 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,4 0,5

DNS 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml10 DAKİKA KAYNAR SUDA BEKLETİLİR

D.SU 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml

C (mM) Absorbans

0 0

0,1 0,008

0,5 0,0284

1 0,0567

1,5 0,0885

2 0,118

2,5 0,14433 0,17454 0,236

Glukoz Standart Grafiği y = 0,0585x

R2 = 0,9996

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 1 2 3 4 5

Derişim (mM)

Ab

so

rban

s (

546n

m)

GLUKOZ 50mg/L GLUKOZ 100 mg/LÖrnek Tayini

ÖRNEK 0,5 mlDNS 0,5 ml

10 dak. kaynar suda bek.

D. SU 5 ml

        DERİŞİM mM       DERİŞİM mM

SAAT 1. ABS 2. ABS KulL. X=(Y/0,0585)XSF

1. ABS

2. ABS KUL. X=(Y/0,0585)XSF

0 0,004 - 0,004 0,0684 0,03 0,033 0,032 0,5385

1 0,000 - - İPTAL 0,025 0,036 0,031 0,5214

2 0,000 - - İPTAL - - - -

3 0,000 - - İPTAL 0,024 - 0,024 0,4103

4 0,001 - 0,001 0,0171 0,026 - 0,026 0,4444

5 0,000 - 0,000 0,0000 0,014 0,01 0,012 İPTAL

6 0,006 - 0,006 0,1026 0,015 0,006 0,015 İPTAL

7 0,010 0,010 0,010 0,1709 0,009 0,019 0,014 İPTAL

8 0,010 - 0,010 0,1709 0,017 - 0,017 0,2906

9 0,005 - 0,005 0,0855 0,011 - 0,011 0,1880

10 0,000 - 0,000 0,0000 0,002 - 0,002 0,0342

11 0,008 - 0,008 0,1368 0,008 - 0,008 İPTAL

12 0,008 - 0,008 0,1368 0,009 0,011 0,010 İPTAL

13 0,015 - 0,015 0,2564 0,020 - 0,020 İPTAL

15 0,002 - 0,002 0,0342 0,002 - 0,002 0,0342

17 0,014 0,015 0,015 0,2479 0,016 0,020 0,016 İPTAL

19 0,005 0,001 0,005 0,0855 0,001 0,001 0,001 0,0171

GLUKOZ150 mg/L GLUKOZ 250 mg/L    DERİŞİM mM       DERİŞİM mM

SAAT

1. ABS

2. ABS KULL. X=(Y/0,0585)XSF

ABS 1

ABS 2 KULL. X=(Y/0,0585)XSF

0 0,04 0,04 0,040 0,6838 0,085 0,095 0,095 1,62391 0,04 - 0,041 0,7009 0,015 0,021 0,018 İPTAL2 0,04 - 0,042 0,7179 0,092 0,103 0,092 1,57263 0,33 0,036 0,036 0,6154 0,099 0,096 0,096 1,6410

4 0,03 - 0,031 0,5299 0,102 0,088 0,095 1,62395 0,02 - 0,017 İPTAL 0,083 - 0,083 1,41886 0,02 0,028 0,020 0,3419 0,066 0,066 0,066 1,12827 0,02 0,016 0,015 0,2564 0,047 0,057 0,047 0,80348 0,02 - 0,018 İPTAL 0,027 - 0,027 0,46159 0,01 - 0,011 0,1880 0,023 - 0,023 0,3932

10 0,01 - 0,011 0,1880 0,001 - 0,010 0,170911 0,02 - 0,022 İPTAL 0,022 - 0,022 0,376112 0,03 0,033 0,032 İPTAL 0,01 0,016 0,013 0,222213 0,03 - 0,025 İPTAL 0,019 - 0,019 0,324815 0 - 0,002 0,0342 - - - -17 0,02 0,018 0,019 İPTAL 0,018 0,018 0,018 0,307719 0 - 0,001 0,0171 0,002 0,007 0,005 0,0769

GLUKOZ 350 mg/L GLUKOZ 500 mg/L        DERİŞİM mM       DERİŞİM mM

SAATABS 1

ABS 2 KUL X=(Y/0,0585)XSF ABS 1 ABS 2 KUL X=(Y/0,0585)XSF

0 0,134 0,137 0,137 2,3419 0,0685 0,0758 0,072 12,30771 0,138 - 0,138 2,3590 0,0675 0,0699 0,069 11,79492 0,141 - 0,141 2,4103 0,0687 0,067 0,068 11,62393 0,115 0,113 0,114 İPTAL 0,0627 0,0647 0,064 10,94024 0,117 - 0,117 İPTAL 0,0689 0,0654 0,067 11,45305 0,105 0,105 0,105 İPTAL 0,0645 0,0789 0,072 12,30776 0,141 - 0,141 2,4103 0,176 0,188 0,176 3,00857 0,113 0,113 0,113 İPTAL 0,154 - 0,154 2,63258 0,113 - 0,113 İPTAL 0,096 - 0,096 1,64109 0,108 - 0,108 İPTAL 0,049 - 0,049 0,837610 0,164 - 0,164 İPTAL 0,015 - 0,015 0,256411 0,141 - 0,141 2,4103 0,048 - 0,048 0,820512 0,027 0,020 0,024 0,4017 0,040 0,039 0,040 0,675213 0,003 - 0,003 İPTAL 0,025 - 0,025 0,427415 0,021 - 0,021 0,3590 0,012 - 0,012 0,205117 0,036 0,020 0,020 0,3419 0,021 0,021 0,021 0,359019 0,002 - 0,002 0,0342 - 0,002 0,002 0,0342

FENOL TAYINI

V (ml) KÖR (ml) STANDART (ml)

Stok fenol 10-5 - 2

NH4OH 2N 0,1 0,1

4-AAP %2 0,05 0,05

TÜPLER VORTEKSLENİR.

K3Fe(CN)6 0,05 0,05

500 nm de absorbans ölçümü yapılır.

C ml/L ABS 1 ABS 2 KUL. ABS0,00001 0,1424 0,1244 0,1334

0,00002 0,2397 0,2492 0,2444

0,00003 0,3706 0,3821 0,3764

0,00004 0,5020 0,5064 0,5042

0,00005 0,6395 0,6232 0,6314

0,00006 0,7516 0,7206 0,7361

0,000075 0,9457 0,9444 0,945

FENOL STANDART GRAFİĞİ y = 12516x

R2 = 0,9992

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 0,00002 0,00004 0,00006 0,00008

DERİŞİM (mg/L)

AB

SO

RB

AN

S(5

00

)

50mg/L 100mg/L        Derişim (mg/L)         Derişim(mg/L)

Zaman sa

1. ABS

2. ABS ORT. Sey. x=y/12516

1. ABS

2. ABS KABUL Sey. x = y/12516

0 0,7672 0,7555 0,7614 10 0,000608301 0,3001 0,2989 0,2995 50 0,0011961 0,6859 0,6838 0,6849 10 0,00054718 0,3058 0,305 0,3054 50 0,001222 0,7508 0,7583 0,7546 10 0,000602868 0,3304 0,3314 0,3309 50 0,00132

3 0,7185 0,7223 0,7204 10 0,000575583 0,3057 0,3101 0,3079 50 0,001234 0,7567 0,7436 0,7502 10 0,000599353 0,3286 0,3286 0,3286 50 0,001315 0,754 0,7627 0,7584 10 0,000605904 0,3355 0,3171 0,3263 50 0,001306 0,5882 0,6 0,5941 11 0,000522139 0,7175 0,8114 0,7645 50 İPTAL7 0,5696 0,6034 0,5865 11 0,00051546 0,721 0,6821 0,7016 21 0,001188 0,5182 0,5847 0,5515 11 0,000484656 0,6624 0,6664 0,6644 21 0,001119 0,5542 0,5852 0,5697 11 0,000500695 0,6913 0,6251 0,6582 21 0,00110

10 0,4505 0,5258 0,4882 11 0,000429023 0,6961 0,5031 0,5996 21 0,0010111 0,2247 0,1792 0,2020 10 0,000161353 0,0333 0,0999 0,0666 50 0,0002712 0,3367 0,1753 0,2560 10 0,000204538 0,0338   0,0338 50 0,0001413 0,3506 0,2224 0,2865 10 0,000228907 0,1972   0,1972 50 İPTAL14 0,311 0,3021 0,3066 10 0,000244926 0,0391   0,0196 50 0,0000817 0,2625 0,2314 0,2470 10 0,000197307 0,0445 0,0148 0,0297 50 0,0001219 0,336 0,1735 0,2548 10 0,000203539 0,2348 0,1817 0,2083 50 İPTAL

FENOL 150 mg/L FENOL 250 mg/LDerişim(mg/L)         Derişim(mg/L)

Zaman sa

1. ABS

2. ABS KUL Sey x = y/12516 1 ABS 2 ABS KUL Sey. x = y/12516

0 0,3934 0,3595 0,3765 50 0,00150 0,4159 0,4206 0,4206 100 0,003361 0,3552 0,355 0,3551 50 0,00142 0,3733 0,3739 İPTAL 100 İPTAL2 0,4787 0,355 0,4169 50 0,00167 0,3443 0,3422 İPTAL 100 İPTAL3 0,3913 0,4013 0,3963 50 0,00158 0,536 0,5397 İPTAL 100 İPTAL4 0,4099 0,3595 0,3847 50 0,00154 0,4659 0,455 0,455 100 0,003645 0,4012 0,3632 0,3822 50 0,00153 0,4646 0,468 0,4646 100 0,003716 0,4806   0,4806 50 0,00192 0,354   İPTAL 100 İPTAL7 0,4549   0,4549 50 0,00182 0,2934   İPTAL 100 İPTAL8 0,4325   0,4325 50 0,00173 0,4437   0,4437 100 0,003559 0,4015   0,4015 50 0,00160 0,4242   0,4242 100 0,0033910 0,4177   0,4177 50 0,00167 0,3261   0,3261 100 0,0026111 0,0475   0,0475 50 0,00019 0,0244 0,0303 0,0274 100 0,0002212 0,0125   0,0125 50 0,00005 0,0368 0,0397 0,0383 100 0,0003113 0,0216   0,0216 50 0,00009 0,0328 0,0247 0,0288 100 0,0002314 0,0009   0,0009 50 0,00000 0,0703 0,0079 0,0391 100 0,0003117 0,0153 0,0206 0,0180 50 0,00007 0,0438 0,227 0,1354 100 İPTAL19 0,0178 0,0339 0,0259 50 0,00010 0,01414 0,1472 İPTAL 100 İPTAL

FENOL 350 mg/L FENOL 500 mg/L          Derişim(mg/L)         Derişim(mg/L)

Zaman sa1.

ABS2.

ABS ORT. Sey. x = y/125161.

ABS2.

ABS ORT. Sey. x = y/125160 0,444 0,489 0,4665 75 0,0028 0,6608 0,6686 0,6647 100 0,00531 0,4591 0,4347 0,4469 75 0,0027 0,7207 0,739 0,72985 100 0,00582 0,4456 0,4497 0,4477 75 0,0027 0,6821 0,6813 0,6817 100 0,00543 0,5203 0,4688 0,4946 75 0,0030 0,7284 0,7262 0,7273 100 0,00584 0,6161 0,3443 0,4802 75 0,0029 0,7429 0,7223 0,7326 100 0,00595 0,5436 0,4767 0,5102 75 0,0031 0,7088 0,7124 0,7106 100 0,00576 0,5693 0,5973 İPTAL 100 İPTAL 0,7643 0,7553 0,7598 100 0,00617 0,3202 0,2735 İPTAL 100 İPTAL 0,7231 0,76 0,74155 100 0,00598 0,4511 0,4394 0,4394 100 0,0035 0,8264 0,8188 0,8226 100 0,0066

9 0,4931 0,4608 0,4608 100 0,0037 0,6911 0,7023 0,6967 100 0,005610 0,4116 0,44 0,4116 100 0,0033 0,9821   0,9821 100 İPTAL11 0,1171 0,1467 0,1319 75 0,0008 0,2902 0,2931 0,2931 100 0,002312 0,116 0,1554 0,1357 75 0,0008 0,4 0,2914 0,2914 100 0,002313 0,1653 0,0779 0,1216 75 0,0007 0,3509 0,3927 0,3509 100 0,002814 0,0614 0,1094 0,0854 75 0,0005 0,3967 0,3634 0,3634 100 0,002917 0,0092   0,0092 75 0,0001 0,389 0,2588 0,2588 100 0,002119 0,1357 0,2813 İPTAL 75 İPTAL 0,4431 0,4352 0,43915 100 İPTAL

** 50 mg/L glukoz grafiği değerler uygun olmadığı için çizilemedi.

FENOL 50mg/L

0

0,0001

0,0002

0,0003

0,0004

0,0005

0,0006

0,0007

0,00 5,00 10,00 15,00 20,00

Zaman (saat)

DE

RİŞ

İM (

mg

/L)

FENOL 100mg/L

0,000000

0,000200

0,000400

0,000600

0,000800

0,001000

0,001200

0,001400

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718

ZAMAN (SAAT)

DE

RİŞ

İM (

mg

/L)

FENOL 150 mg/L

0,00000

0,00050

0,00100

0,00150

0,00200

0,00250

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 17 19

ZAMAN (SAAT)

DE

RİŞ

İM (

mg

/L)

FENOL 250 mg/L

0,000000,000500,001000,001500,002000,002500,003000,003500,00400

0 5 10 15 20

ZAMAN (SAAT)

DE

RİŞ

İM (

mg

/L)

FENOL 350 mg/L

0,0000

0,0010

0,0020

0,0030

0,0040

0 5 10 15 20

ZAMAN (SAAT)

DE

RİŞ

İM (

mg

/L)

FENOL 500 mg/L

00,0010,0020,0030,0040,0050,0060,007

0 5 10 15 20

ZAMAN (SAAT)

DE

RİŞ

İM m

g/L

GLUKOZ 50 mg/L

0,0000

0,0500

0,1000

0,1500

0,2000

0,2500

0,3000

0 4 6 7 8 9 11 12 13

ZAMAN (SAAT)

GL

UK

OZ

DE

RİŞ

İMİ

(mM

)

0

0,050,1

0,15

0,2

0,250,3

0,35

0,4

HÜ

CR

E Y

OĞ

UN

LU

ĞU

Hücre yoğunluğu

Glukoz derişimi

GLUKOZ 100 mg/L

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 3 4 8 9 10

ZAMAN (SAAT)

GL

UK

OZ

DE

RİŞ

İMİ

(mM

)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

HÜ

CR

E

YO

ĞU

NL

UĞ

U

Glukoz derişimi

Hücre Yoğunluğu

GLUKOZ 150 mg/L

0,00000,10000,20000,30000,40000,50000,60000,70000,8000

0 1 2 3 4 6 7 9 10

ZAMAN (SAAT)

GL

UK

OZ

D

ER

İŞİM

İ (m

M)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

HÜ

CR

E

YO

ĞU

NL

UĞ

U

GLUKOZ D.

HÜCRE Y.

GLUKOZ 205 mg/L

0

0,5

1

1,5

2

0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

ZAMAN (SAAT)

GL

UK

OZ

DE

RİŞ

İMİ

(mM

)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

HÜ

CR

E

YO

ĞU

NL

UĞ

U

GLUKOZ D.

HÜCRE Y.

GLUKOZ 350 mg/L

0,0000

0,5000

1,0000

1,5000

2,0000

2,5000

3,0000

0 1 2 6 11 15 17 19

ZAMAN (SAAT)

GL

UK

OZ

DE

RİŞ

İM

(mM

)

00,20,40,60,811,21,41,6

HÜ

CR

E

YO

ĞU

NL

UĞ

U

GLUKOZ D.

HÜCRE YOĞ.

GLUKOZ 500 mg/L

02468

101214

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 15 17

ZAMAN (SAAT)

GL

UK

OZ

DE

RİŞ

İMİ

(mM

)

0

0,5

1

1,5

2

HÜ

CR

E

YO

ĞU

NL

UĞ

U

GLUKOZ K.

HÜCRE y.

FENOL 50 mg/L

0

0,0002

0,0004

0,0006

0,0008

1 2 3 4 5 7 9 10 11 12 13 15 17 19

ZAMAN (SAAT)

FENO

L DE

RİŞİ

Mİ

(mg/

L)

0

0,1

0,2

0,3

HÜCR

E YO

ĞUN

LUĞ

U

FENOL DERİŞİMİ

HÜCRE Y.

FENOL 100 mg/L

00,0002

0,00040,00060,00080,001

0,00120,0014

0 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13 17 19

ZAMAN (SAAT)

FE

NO

L D

ER

İŞİM

(m

g/L

)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

HÜ

CR

E

YO

ĞU

NL

UĞ

U

FENOL D.

HÜCRE Y.

FENOL 150 mg/L

0

0,0005

0,001

0,0015

0,002

0,0025

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 15 17 19

ZAMAN (SAAT)

FE

NO

L D

ER

İŞİM

İ (m

g/L

)

0,00000,10000,20000,30000,40000,50000,60000,70000,8000

HÜ

CR

E

YO

ĞU

NL

UĞ

U

FENOL D.

HÜCRE Y.

FENOL 250 mg/L

0

0,001

0,002

0,003

0,004

0 4 5 8 9 10 11 12 13 15

ZAMAN (SAAT)

FEN

OL

DE

RİŞ

İMİ

(mg/

L)

0

0,2

0,4

0,6

0,8H

ÜC

RE

Y

OĞ

UN

LUĞ

U

FENOL D.

HÜCRE Y.

FENOL 350 mg/L

0

0,0005

0,001

0,0015

0,002

0,0025

0,003

0,0035

0,004

0 1 2 3 4 5 8 9 10 11 12 13 15 17

ZAMAN (SAAT)

FE

NO

L D

ER

İŞİM

İ (m

g/L

)

0,0000

0,1000

0,2000

0,3000

0,4000

0,5000

0,6000

0,7000

HÜ

CR

E Y

OĞ

UN

LU

ĞU

FENOL D.

HÜCRE Y.

FENOL 500mg/L

0

0,001

0,002

0,003

0,004

0,005

0,006

0,007

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 13 15 17

ZAMAN (SAAT)

FE

NO

L D

ER

İŞİM

İ (m

g/L

)

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

HÜ

CR

E

YO

ĞU

NL

UĞ

U

FENOL D.

HÜCRE Y.

REAKTÖRDE FENOL TAYINI

İmmobilize edilen hücreler dolgu yatak reaktörüne doldurulur. Termostatla reaktör ısısı oda sıcaklığında sabit tutulur. Reaktör içine koyulan büyüme ortamı fosfat kullanılmamış ve %0,2’lik CaCl2 içerir. Bundan sonra her yarım saatte bir reaktörden örnek alınarak fenol tayini yapılır. Ortama fenol koyduğumuz için ortamın zaten zehirli olduğunu ve bu nedenle kontaminasyon olamayacağını varsayıyoruz.

ZAMAN (DAKİKA) ABSORBANS SEYRELTME C (mg/L)

30 0,087 25 0,0001737776

60 0,089 25 0,0001777725

90 0,06 25 0,0001198466

120 0,059 25 0,0001178492

150 0,039 25 0,0000779003

180 0,031 25 0,0000619207

210 0,027 25 0,0000539310

240 0,028 25 0,0000559284

270 0,028 25 0,0000559284

300 0,022 25 0,0000439438

330 0,02 25 0,0000399489

REAKTÖRDE FENOL TAYİNİ

0,0000000000

0,0000500000

0,0001000000

0,0001500000

0,0002000000

0 50 100 150 200 250 300 350

ZAMAN (DAKİKA)

DE

RİŞ

İM (

mg

/L)

YORUM: Bu çalışma ile çevre biyoteknolojisi alanında bir çalışma yapmış oluyoruz.çünkü denememizde zararlı bir bileşik olan fenol biyomas yada enerji kaynağı olarak kullanılıyor.

Fenole adapte olan hücrelerden bir kısmı Ca-arginatla immobilize edilmiş; Na-arginat çözeltisine karıştırılan hücreler CaCl2 çözeltisine damlatılır ve bu esnada Na+ ve Ca2 iyonları yer değiştir. Ca arginat suda çözülmez ve ayrı bir faz oluşturur. hücrelerse bu fazda tutuklanmış olurlar. İmmobilizasyondan sonra reaktöre konan hücreler fenol kullanmaya başlarlar. Fenolü düşük bir hızda reaktörden geçirmemiz gerekir eğer yüksek verim istiyorsak.Burada bir fenol bileşiğini nasıl yıktığını gösteren bir reaksiyon

denememizde dolgu yatak reaktör düzeneği kuruldu.Reaktöre yerleştirilen boncuklara susbsrat olarak içinde 10mg/ml fenol içeren MSM kullanıldı.Fosfatlı bileşikler kullanmamızın nedeni:fosfatların kalsiyum

iyonlarını çökerteceğinden doğru sonuçlar almamızı engellemesidir.reaktörün çalıştırılmasından sonra her yarım saatte bir örnek alınarak fenol tayini yapıldı.

Hücre yoğunluğuna zaman grafiğinden logaritmik faz belirlenir. Bu logaritmik fazdaki değerler alınarak lnx e karşı zaman grafikleri çizilir.oluşturulan grafiklerin eğimi spasifik büyüme kat sayısına eşittir. Farklı substrat konsantrasyonlarına karşı μ değerleri grafiğe geçirildiğinde MONOD eğrisi oluşturulmaktadır.

Glikozlu ortamda fenollü ortama nazaran lag fazın daha kısa olması beklenir çünkü glikoz birçok mikroorganizma için birincil enerji kaynağıdır.extra bir enerji gerektirmeden glukozu harcar. Ayrıca glikoz konsantrasyonunun artmasıyla uyum evresinin uzamasının fenole kıyasla çok daha az olduğu gözlenmiştir. Fenol (50mg/L)’de lag faz 0-2 saatler arasındayken fenol konsantrasyonunun artması ile bu süre 0-10 saatler arasına kadar uzamıştır. . P.putida, bu tip bir metabolizayı, içerdiği direnç geni denilebilecek özellikteki genlerine borçludur. hücre zarı, proteinleri ve yapılarını bozabilecek özellikteki fenole karşı yaptığı sadece bu genlerin transkripte olmasını 10 saat kadar beklemek ve oluşturduğu enzim ve diğer proteinler sayesinde fenolü karbon kaynağı olarak kullanabilmektedir.Yine de 500mg/L lik konsantrasyon bu uyum sürecini atlatamyacağı bir derişim değeri olarak göze çarpmıştır.

Monod grafiklerimizde faz ayrımları iyi gözlemlenemiyor.bunun nedeni deney esnasında yapılan bir hata(pipetleme gibi) olabilecegi gibi absorbans alma veya grafiğe yanlış geçme gibi bir sorunda olabilir Glukoz kullanılarak Yapılan denemelerde beklenen glukozun kullanılarak azalmasıdır.fakat grafiklerimizde bunu gözlemleyemedik.

Fenol kullanılan denemelerimizde fenol konsantrasyonunun uyum evresinde sabit,logarimik faz zaman aralıklarında hızlı bir düşüş ve sonundaysa sabit kaldığı gözlemlenmiştir.bu beklenen bir gelişmeydi.

Reaktörde yapılan fenol tayininde ise beklenildiği gibi fenol miktarında azalış tesbit edildi.