desecación de bacterias benéficas y su impacto en agrobiotecnología: avances y retos

7/26/2019 Desecacin de bacterias benficas y su impacto en agrobiotecnologa: avances y retos

1/19

Seminario de Investigacin y Cultura scar Snchez Daza

2011

BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLAINSTITUTO DE CIENCIASF ACULTAD DE INGENIERA QUMICA


2/19

B ENEMRITA U NIVERSIDAD A UTNOMA DE P UEBLA

ENRIQUE AGERA IBEZRector JOS R AMN EGUBAR CUENCASecretario general ALFONSO ESPARZA ORTIZ TesoreroLILIA CEDILLO R AMREZ

Vicerrectora de Extensin y Difusin de la Cultura JORGE TORRES J COMEDirector del Instituto de CienciasSCAR ARROYO PORRASDirector de la Facultad de Ingeniera Qumica

Cuerpo Acadmico de Qumica e Ingeniera Qumica Bsicas y Aplicadas DR . JOS LUIS ALCNTARA FLORESDRA. Y ASMI R EYES ORTEGAMIQ ESIQUIO ORTIZ MUOZ

Martn Prez Zenteno Edicin, correccin

J. Carlos JimnezFormacin

Instituto de Ciencias Facultad de Ingeniera Qumica Benemrita Universidad Autnoma de Puebla4 Sur 104, Colonia Centro, CP 72 000, Puebla, Pue.Impreso en Mxico/ Printed in Mexico

ISBN: 03-2013-08161 1583700-01


3/19

5

ndice

PRESENTACIN-7-

en agrobiotecnologa: avances y retos

Jess Muoz Rojas -9-

La etnografa y los mayasRodolfo Reyes Corts

-25-

Eugenia Corvera Poir -49-

MESA REDONDA

Esiquio Ortiz Muoz -67- Martha Moreno Bravo

-69- Arturo Snchez Daza

-77- Adrin Mendieta

FOTOGRAFAS-85-

Construyendo otras realidades Accin Directa Autogestiva

-93- Poema

Estudiantes del Grupo de Investigacin de laFacultad de Ingeniera Qumica

-101-


4/19

9

L AS BACTERIAS SON RESPONSABLES del mantenimiento de vida de nuestro sus hospederos. Por ejemplo, algunas bacterias son capaces de estimularel crecimiento de plantas; otras degradan compuestos txicos para el am-biente o materia orgnica muerta, y otras son importantes por producirproductos de importancia para el consumo humano.

Bacterias promotoras del crecimiento de plantas

Las bacterias promotoras del crecimiento de plantas desempean sus be- FBN ), que consiste en captar ni- 2 ) y transformarlo mediante una enzima denomi-

FBN es desa-rrollada por bacterias diversas, entre las que destacan aquellas del gneroRhizobium , que interaccionan con leguminosas en una forma mutualista.

alargamiento celular de plantas, principalmente en races, permitiendo una

como las auxinas, giberelinas y citocininas; algunos ejemplos incluyen la

AIA ) por Gluconacetobacter diazotrophicus en caa de azcar y Azospirillum brasilense en maz.

3) El control biolgico, donde una cepa productora de sustancias inhi- Ecologa Molecular Microbiana, Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiolgicas, Institu-to de Ciencias de la BUAP. La conferencia se present el da 7 de julio de 2011.

en agrobiotecnologa: avances y retos

Jess Muoz-Rojas*


5/19

10

Seminario de Investigacin y Cultura OSD 2011

bitorias impide el crecimiento de microorganismos patgenos por accin

antagonista, por lo que las plantas se mantienen sanas en comparacin con

incluyen el efecto de A. brasilense contra hongos por la accin de sider-foros y la inhibicin de bacterias productoras de Pink disease por parte Burkholderia , productoras de molculas

inhibitorias.4) La produccin de ACC desaminasa, una protena que impide el paso

de ACC una molcula seal que retarda el crecimiento de plantas en etapas tem-pranas, por lo que la inhibicin de su sntesis repercute positivamente enel crecimiento de las plantas. Adems, debido a que el proceso implicauna desaminacin, el amonio generado es absorbido por las plantas comofuente de nitrgeno, por lo que las plantas se ven favorecidas en su creci-miento. Un ejemplo explorado recientemente lo constituye la interaccinde la bacteria Burkholderia unamae MTl641 T con el tomate.

5) La induccin de la respuesta de defensa de plantas. Algunas bac-terias como son capaces de inducir un tipo de res-

puesta de defensa en plantas mediado por una molcula seal denominadacido jasmnico. Las plantas que desencadenan esta respuesta de defensason protegidas ante el ataque de patgenos debido a que se estimul laformacin de molculas de tipo fenlico que los contrarrestan.

6) La solubilizacin de nutrientes no biodisponibles. Algunas bacteriassolubilizan algunos minerales que son esenciales para el desarrollo de lasplantas, por ejemplo el fsforo y el zinc. Bacterias que realizan estas fun-ciones son Azospirillum brasilense , para la solubilizacin de fsforo, y G.diazotrophicus , para la solubilizacin de zinc a partir de rocas.

Inoculantes bacterianos -

parte de formulaciones que impacten positivamente la agricultura. Estasformulaciones son llamadas inoculantes; estn constituidas por un so-


6/19

11

ser encargado de transportar de forma viable y en nmeros adecuados

sitio donde ser aplicada la formulacin. En funcin del tipo de bacteriaque constituye el inoculante podra tomar diferentes nombres: si el aporteque la bacteria otorgar a la planta es va FBN la formulacin se llamarbiofertilizante. Si el aporte de la bacteria ocurre por va hormonal se de-

-bilizacin de nutrientes se llamar biosolubilizante. Y si el aporte es parala degradacin de compuestos txicos se denominar biodegradante.

En la BUAP y en la UNAM se han desarrollado monoinoculantes queportan la bacteria A. brasilense para potenciar el rendimiento de cultivos deinters agrcola, principalmente gramneas. Sin embargo se han reportadoy publicado inconsistencias en la capacidad de estas formulaciones parapromover el crecimiento de maz. Algunas de las posibles causas por lasque la bacteria pudiera fallar para promover el crecimiento de plantas esel tipo de suelo y el pH, que pueden afectar la interaccin en la rizsfe-

climatolgicas, sobre todo en zonas de agricultura de temporal. Para ase-gurar efectos promotores del crecimiento de plantas se ha propuesto lacoinoculacin de dos especies bacterianas o una especie bacteriana conun hongo de tipo micorrzico de tipo solubilizador de fosfatos. Por ejem-plo, se ha explorado la coinoculacin de Bradyrhizobium japonicum con A.brasilense en soya, observndose incrementos positivos en relacin con lamonoinoculacin con ambas bacterias. Otro ejemplo es la coinoculacinde A. brasilense y micorrizas, donde se observa un mejor aporte de dichacoinoculacin.

Recientemente se ha planteado que lo consorcios de diferentes espe-cies de bacterias funcionan mejor que las bacterias solas, por lo que se hanexplorado formulaciones multiespecies. Por ejemplo, en Brasil se ha for-mulado un inoculante multiespecies formado por A. amazonense , Herbaspi- rillum seropedicae , H. rubrisubalbicans , G. diazotrophicus y B. tropica . Aunque almomento solo se ha explorado la capacidad de las bacterias para colonizarla caa de azcar, es una formulacin prometedora para potenciar el desa-

DESECACIN DE BACTERIAS BENFICAS Y SU IMPACTO EN AGROBIOTECNOLOGA


7/19

12


rrollo de la planta. En el laboratorio de Ecologa Molecular Microbiana se

han desarrollado inoculantes multiespecies, uno de ellos denominado IMM-1

pinto, amarillo y pozolero). El IMM-1 es una formulacin lquida y estcompuesto por una bacteria representante de cada uno de los gneros si-guientes: Azospirillum , Bradyrhizobium , Gluconacetobacter , Burkholderia , Pseudo- monas y Sphingomonas . El IMM-1 potenci el crecimiento de plantas de maz

est probando su efectividad en 500 hectreas de cultivo, con resultadosbastante bien aceptados por los agricultores.

FIGURA 1Efecto del inoculante multiespecies en el crecimiento de plantas de maz

Plantas no inoculadas Plantas muti inoculadas


8/19

13

FIGURA 2

Efecto de un inoculante multiespecies en el crecimiento de mazorca Arriba se muestran mazorcas de plantas no inoculadas y abajoplantas de mazorcas inoculadas con el inoculante multiespecies IMM-1.

La desecacin de bacterias

Adentrndonos un poco ms en el terreno de los factores adversos queafectan la efectividad de las bacterias de los inoculantes podemos resaltardos factores que son de suma importancia: la competencia contra microor-ganismos indgenas y la disponibilidad de agua. En referencia a la compe-tencia de microorganismos es necesario contar con organismos altamentecompetitivos y que enfrenten bien a bacterias presentes en la rizsfera de



9/19

14


FIGURA 3

Ejemplo de bacteria productora de sustancias inhibitoriasLa bacteria es capaz de inhibir al crecimiento de otrasen el ambiente donde se desarrolla.

En cuanto a la disponibilidad de agua, una vez que las bacterias soninoculadas en semillas de plantas y estas son sembradas en el terreno deinters, inmediatamente ocurre prdida de agua de las clulas bacterianashasta el extremo de desecarse debido a que normalmente los sitios de

de agua de las clulas hasta llegar al equilibrio con el agua presente en el

-

HR ). En estas condiciones las clulas

bacterianas conservan solo 10% de agua del peso total de masa seca. Al-gunas bacterias, como el caso de Rhizobium leguminosarum , resisten slo porcuatro das en estado desecado. Asociada a semillas esta baja superviven-

las plantas, en este caso las leguminosas. Por esta razn el grupo Supervi-

Molecular Microbiana del ICBUAP trabaja intensamente en estudiar c mo


10/19

15

cules son las bacterias ms resistentes ante este estrs. Bajo condicionesde laboratorio la desecacin se realiza en cmaras a 25C y 50%HR , dondese ha explorado la resistencia a la desecacin de bacterias de diversos gne-ros y especies. Se observa que muchas de ellas son resistentes a la deseca-cin y otras resultan sensibles (F igura 4). La resistencia a la desecacin semide con valores parametrizados a partir de un concepto llamado BSR sus siglas en ingls Bacterial Survival Rate), que es la tasa de supervivencia

antes de la desecacin y el nmero de bacterias que sobrevive despus dela desecacin-rehidratacin y en distintos periodos de desecacin-rehidra-

BSR UFC/ml DD UFC /ml AD ).

UFC -madoras de colonia. DD AD antes de ladesecacin.

FIGURA 4

HR )Se muestra la supervivencia de tres cepas del gneroKlebsiella , donde la cepa T29A



11/19

16


Bsqueda de genes implicados en la resistencia a la desecacin bacteriana Las cepas bacterianas que han resultado ms resistentes a la desecacin,como es el caso de Klebsiella variicola T29A, han sido consideradas paraexplorar cules son los genes involucrados en dicha resistencia, para ellose ha hecho uso de herramientas moleculares. Una de las ms usadas en ellaboratorio es la mutagnesis al azar usando minitransposones de tipo

Tn5. Los minitransposones saltan desde un vector plasmdico hasta el ge-noma de la bacteria en estudio de forma azarosa insertndose y truncan-do la funcin del gen en el que ha cado la insercin. El plsmido pUT

porta los transposones miniTn5, los cuales bordean un gen de resistenciaa kanamicina. Adems el plsmido posee un origen de replicacin R6Kque depende de la protena lambda-pir que se encuentra en el genoma de Escherichia coli S-17 lambda-pir) y una transposasa

-

genoma. Este plsmido es transferido desde E. coli mediante conjugacin K. variicola

no puede replicarse debido a que la cepa receptora no produce la protenalambda-pir. Por lo tanto el plsmido es suicida y la nica forma de conser-

var la resistencia a la kanamicina por parte de la clula receptora es que eltransposn salte a su genoma. La seleccin de cepas de K. variicola T29A2que adquirieron un transposn en su genoma se realiza en un medio concitrato como fuente de carbono y kanamicina; en el citrato no crece E. coli y en Kanamicina solo crecen las cepas de K. variicola mutagenizadas.

FIGURA 5Representacin de un evento de transposicin

miniTn5 en una bacteria receptora


12/19

17

De esta forma, en el laboratorio se ha construido una mutateca de

alrededor de 8 500 mutantes, de las cuales 15 se han vuelto sensibles a ladesecacin, lo cual indica que estas mutantes poseen genes mutagenizadosimportantes para resistir al proceso de estrs. Los genes de las mutantes

PCR s arbitrarias ysecuenciados. La secuencia obtenida es comparada en la base de datospblica NCBI y el resultado del gen en cuestin otorga pistas del mecanis-mo que emplean las bacterias para resistir a la desecacin. Por ejemplo,encontramos que K. variicola T29A2 requiere de genes implicados en labiosntesis de polisacrido para resistir a la desecacin. Si este componenteno est presente las clulas perecen bajo estas condiciones.

Cabe destacar que para determinar el nmero de bacterias antes de la -

peticiones fue necesario desarrollar una metodologa de conteo masivo debacterias que se ha denominado GSPM con la cual podemos procesar hasta 96 muestras en dos horas para su re-cuento despus del crecimiento respectivo. Este mtodo est en vas de serpatentado y se encuentra en la segunda fase de evaluacin.

Formas alternativas de bacterias para tolerar a la desecacin Un modelo que llam la atencin del grupo de investigacin fue el de P. putida KT2440. Esta bacteria es muy estudiada a nivel internacional ya quees capaz de usar los compuestos aromticos como fuente de carbono yha sido propuesta como modelo para llevar a cabo la bioremediacin y la

la pregunta cmo una bacteria sensible a la desecacin puede ser cosmo-polita y estar presente en ambientes adversos? Cmo ha enfrentado labacteria las desecaciones a lo largo de su evolucin? Existen varias alter-nativas y en el laboratorio se han explorado algunas. Por ejemplo, sabemosque si P. putidaKT2440 es adicionada con disacridos o polialcoholes enconcentracin 200 mM estos protegen a la bacteria de la desecacin. Essugerido que las bacterias toman estos compuestos y sustituyen a las mo-lculas de agua durante la desecacin otorgando estabilidad a los fosfolpi-



13/19

18


dos de membrana e impidiendo que sta pase de una fase de cristal lquida

a una fase de gel. Esta teora es conocida como teora de sustitucin demolculas de agua.

Por otro lado, esos compuestos tambin protegen a protenas com-plejas de sufrir desnaturalizacin y una vez que la clula se rehidrata loscomponentes celulares pueden volver a funcionar. Sin embargo en la na-turaleza slo en pocos ambientes se podran alcanzar concentraciones de

-tes es la rizsfera de plantas, por lo que se explor la posibilidad de que losexudados de maz protegieran a P. putida KT2440 de la desecacin. Paranuestra sorpresa solo una variedad de maz produjo compuestos rizosfri-

FIGURA 6Supervivencia a la desecacin deP. putida KT2440 a 25C y 80% HR

La lnea verde muestra que la bacteria sobrevive mejor cuando est en presenciade exudados de plantas de una variedad criolla.

Otras seis variedades criollas exploradas de maz fueron incapaces deproducir sustancias protectoras para la desecacin de bacterias, por lo que


14/19

19

a pesar de que la interaccin con plantas es una posibilidad que las bac-

terias poseen para soportar la desecacin, no parece la alternativa generalpara sobrevivir en el ambiente y salta a la vista que hay otra forma alterna-tiva para sobrevivir a esta situacin adversa.

Es interesante que una vez que la bacteria cae completamente en susupervivencia puede volver a ser aislada si se rehidrata en presencia deexudados de planta, independientemente de si protegieron o no de for-

previamente haban perdido la capacidad para crecer en los medios de cul-

que las bacterias durante la desecacin son capaces de entrar en un estado

viable no cultivable como estrategia de supervivencia, lo que equivale aque las bacterias detienen su divisin celular quizs para evitar un gastoenergtico innecesario en condiciones adversas.

FIGURA 7Supervivencia a la desecacin-rehidratacin deP. putida KT2440.

BSR en eje vertical y das durante la desecacin en el eje horizontal. -

tacin durante 24 h y durante 48 h. El estado viable cultivable se recupera en la rehi-dratacin de 24 y 48 h. En periodos largos de desecacin solo se recupera el estado

viable cultivable en clulas bacterianas con rehidratacin de 48 h.



15/19

20


La estrategia de las bacterias de entrar en una fase viable no cultivable

ha sido corroborada mediante dos metodologas: 1) tincin de integridadcelular con el kit live/dead antes y despus de la desecacin-reehidratacin con un kit comercial que

SYTO 9, que tie de verde lasclulas cuya membrana no ha sido daada, y el bromuro de propilo, quetie las clulas de rojo cuando la membrana ha sido daada, debido a queesta molcula penetra y se intercala en el DNA y su intensidad sobrepasa al

verde del SYTO 9. -

pus de la desecacin su color se torna rojo, lo que implica que su mem-brana ha sido daada cuando ya no es posible cultivarlas. Bajo condicionesde rehidratacin prolongada las clulas recuperan parte de su integridad ynuevamente se observan de color verdoso. 2) El uso de una cepa que ex-

saber qu ocurre con el metabolismo de las clulas. La expresin de la

-

de que no podemos cultivar las bacterias despus del proceso desecacin-rehidratacin rpida las clulas estn viables y activas.

P. putida KT2440 sufri daos en su membrana y para contender con esasituacin entr en una fase viable no cultivable donde la bacteria no sedivide en los medios de cultivo convencionales. Despus aparentemente labacteria repara ligeramente su membrana durante la rehidratacin prolon-gada y vuelve a entrar en una fase viable cultivable con una divisin celularactiva. En cualquier momento las bacterias no dejaron de estar metabli-camente activas, siempre y cuando estn en condiciones hidratadas.

Una tercera forma mediante la cual P. putida KT2440 u otra bacteriasensible podra soportar periodos largos de desecacin sera adquiriendosustancias protectoras durante la interaccin con otros microorganismosprotectores. Al respecto se estn desarrollando experimentos en cointe-


16/19

21

raccin entre bacterias resistentes y sensibles que puedan aportarnos datos

nos pueden ayudar a comprender cmo podemos potenciar la resistenciade aquellas que deseamos resistan en interaccin con semillas de plantasen espacios de tiempo de baja disponibilidad de agua, pero tambin nospodran aportar conocimiento de cmo se pueden desarrollar inoculan-tes ms estables y con vida de anaquel mayor antes de su aplicacin enagricultura o bioremediacin, a pesar de pasar periodos prolongados encondiciones anhidrobiticas.

FIGURA 8 Arriba: clulas de P. putida KT2440 antes de la desecacin teidas con el kit live/dead.

Abajo: clulas bacterianas con metabolismo activo expresando la protena verde



17/19

22


AGRADECIMIENTOSMi agradecimiento a los organizadores del SIC-OSD 2011, es una actividadmuy acertada que espero sigan fomentando en los aos siguientes. Agra-dezco al CONACYT continuar el desarrollo del proyecto de investigacin y las becas otorga-das a estudiantes de posgrado. A la VIEP-BUAP por apoyar parte de estainvestigacin becando a estudiantes de licenciatura. Agradezco a todoslos estudiantes de mi grupo actual y a los que han egresado o dejado ellaboratorio por causas de fuerza mayor pero que han contribuido con su

granito de arena en estos trabajos. En especial quiero hacer mencin de lossiguientes estudiantes por sus contribuciones en conocimiento de fron-tera en nuestro grupo: Yolanda Elizabeth Morales-Garca, Ligia CatalinaMuoz-Arenas, Laura Abisa Pazos-Rojas, Andrs Corral-Lugo, OsvaldoRodrguez-Andrade, Laura Hernndez-Tenorio, Dalia Jurez-Hernndez,

Alma Anglica Poceros-Coba y Dalia Molina Romero.Finalmente quiero agradecer a dos colaboradores externos que han

apoyado incondicionalmente a miembros de mi grupo de investigacin:

R EFERENCIAS RECOMENDADASBERNAL, P., J. MUOZ-R OJAS, A. HURTADO, J. L. R AMOS y A. SEGURA. 2007.

A Pseudomonas putidacardiolipin synthesis mutant exhibits in-creased sensitivity to drugs related to transport functionality, en Environmental Microbiology 1135-1145, ISSN: 1462-2912.

BLTNER , D., P. GODOY , J.MUOZ-R OJAS, E. DUQUE, S.MORENO-MORILLAS,L. S NCHEZ y J. L. R AMOS. 2008. Rhizoremediation of lindane by

root-colonizing Sphingomonas , en Microbial Biotechnology 87-93,ISSN: 1751-7915.DUQUE E., J. J. R ODRGUEZ-HERVA, J. DE LA TORRE, P. DOMNGUEZ-CUEVAS,

J. MUOZ-R OJAS y J. L.R AMOS. 2007. The RpoT regulon of P. putida DOT-T1E and its role in stress endurance against solvents, en Journal of Bacteriology 207-219, ISSN: 0021-9193.

M ARN-CEVADA V., MUOZ-R OJAS J., C ABALLERO-MELLADO J., M ASCARA-ESPARZA M. A.,C ASTAEDA-LUCIO M., C ARREO-LPEZ R., ESTRADA


18/19

23

DE LOS S ANTOS P., y FUENTES-R AMREZ L. E. Antagonistic interac-tions among bacteria inhabiting pineapple, en Applied Soil Ecology . ISSN: 0929-1393.

MORALES-G ARCA Y. E., Duque E. Rodrguez-Andrade O., de la Torre J.,M ARTNEZ-CONTRERAS R. D., PREZ-y- TERRN R y MUOZ-R OJAS J. 2010. Bacterias preservadas, una fuente importante de recursosbiotecnolgicos, en BioTecnologa ISSN: 0188-4786.

MORALES-G ARCA Y. E., M. HERRERA y J.MUOZ-R OJAS. 2007. Cloranfeni-col, un antibitico clsico como alternativa en el presente, en Re- vista Mexicana de Ciencias Farmacuticas ISSN: 1870-0195.

MORALES-G ARCA Y. E., JUREZ-HERNNDEZ D., ARAGN-HERNNDEZ C.,M ASCARA-ESPARZA M. A., BUSTILLOS-CRISTALES M. R., FUENTES-R AMREZ L. E., M ARTNEZ-CONTRERAS R. D., AND MUOZ-R OJAS J.2011. Growth response of maize plantlets inoculated with Entero- bacter sp. as a model for alternative agriculture, enRevista Argentinade Microbiologa ISSN: 0325-7541.

MORALES-G ARCA Y. E., P AZOS-R OJAS L. A., BUSTILLOS-CRISTALES M. R.,K RELL T. Y MUOZ-R OJAS J. 2010. Mtodo rpido para la obten-cin de maz axnico a partir de semillas, Elementos 80:35-38, ISSN: 0187-9073.

MUOZ-R OJAS J. 2005. La interaccin Gluconacetobacter diazotrophicus -caade azcar como modelo para el estudio de la transmisin de bacte-

Elementos 57:57-62, ISSN: 0187-9073.MUOZ-R OJAS J. and J. C ABALLERO-MELLADO. 2003. Population dynam-

ics of Gluconacetobacter diazotrophicusin sugarcane cultivars and itseffect on plant growth, en Microbial Ecology ISSN: 0095-3628.

MUOZ-R OJAS J., P. BERNAL, E. DUQUE, P. GODOY , A. SEGURA y J. L.R AMOS. 2006. Involvement of cyclopropane fatty acids in the response ofPseudomonas putidaKT2440 to freeze-drying, en Applied and Environ- mental Microbiology ISSN: 0099-2240.

MUOZ-R OJAS J., L. E. FUENTES-R AMREZ, and J. C ABALLERO-MELLADO.2005. Antagonism among Gluconacetobacter diazotrophicusstrains inculture media and in association with sugarcane plants. FEMS



19/19

24


Microbiology Ecology ISSN: 0168-6496.SEGURA A., MOLINA L., FILLET S., K RELL T., BERNAL P., MUOZ-R OJAS J., yR AMOS J.-L. 2012. Solvent tolerance in Gram-negative bacteria,

en. Current Opinion in Biotechnology. ISSN: 0958-1669.

desecación de bacterias benéficas y su impacto en agrobiotecnología: avances y retos

Documents