deteksi mikobakterium menggunakan manual mgit dan bactectm mgittm 960 system
TRANSCRIPT
DETEKSI MIKOBAKTERIUM MENGGUNAKAN MANUAL MGIT
DAN BACTECTM MGITTM 960 SYSTEM
DIDIK AGUS SANTOSO,dr Dr. JUSAK NUGRAHA,dr,MS,SpPK(K)
1
Manual MGIT Micobacterium Growth Indikator Tube
2
• BBL™ MGIT™ Tubes (4mL ; 7 mL) – Modified Middlebrook 7H9 Broth Base – Fluorescent indicator untuk deteksi oxygen – Fluorochrom, tris4,7-‐difenil-‐1, 10-‐phenonthroline rutenium pentahydrate klorida yang ditanam dalam silikon pada bagian bawah tabung
– Di produksi dengan 10% CO2 atmosfer.
MGIT™ Growth Supplement – Sebagai suplemen pertumbuhan mikobakterium
• Oleic Acid – penRng untuk metabolisme mikobakterium • Albumin (bovine) – mengikat free fa=y acids yang dapat meracuni mikobakterium
• Dextrose – sumber energi untuk mikobakterium • Catalase – menghancurkan peroksida • Polyoxyethylene stearate (POES) -‐-‐ meningkatkan pertumbuhan of M. tuberculosis dan membantu uniform inokulasi
4
BBL™ MGIT™ PANTA ™ – An0microbial mixture:
• Polymyxin B • Amphotericin B • Naladixic Acid • Trimethoprim • Azlocillin
– MENEKAN pertumbuhan non-‐mikobakterium
5
Kultur Negatif
Sedikit atau Tidak ada Fluoresensi
Kultur Positif
Fluoresensi kuat
Sensor
Broth
Bagian atas
Sistem Deteksi MGIT
F F F
F FO2
FO2 F
F
F F
CO2
O2
O2
O2
O2 O2
F F FO2
FO2 FO2 FO2
FO2
F
FO2 FO2
CO2
O2 O2
O2 O2
O2
O2
O2 O2
CO2
CO2
O2
6
7
Bahan yang disediakan dalam satu Kit MGIT: • BBL MGIT Mycobacteria Growth Indicator Tube, 4 ml, 1 box/ 25 tabung;
• BBL MGIT OADC, 6 vial, 15 mL, untuk 150 tes
• Campuran anRbioRk BBL MGIT PANTA, 6 vial liophilized, untuk 150 tes.
BAHAN & ALAT
BAHAN & ALAT • Bahan yang Sdak Tersedia dalam Kit: • Tabung FALCON 50 mL , • 4% NaOH, 2,9% Na-‐Sitrat, bubuk NALC, bufer fosfat pH 6,8 steril; atau cukup BBL Mycoprep 75mL atau 150 mL .
• vortex mixer, • inkubator 37oC, • pipet steril Falcon 1mL • pipet transfer steril Falcon • lampu UV 365 nm, • 0,4% larutan Na-‐sulfit untuk kontrol posiRf, • mikroskop untuk AFB Staining dan bahan-‐bahan untuk pewarnaan slide,
• pipet 100 µL dan 500 µ L, • desinfektan tuberkulosidal.
8
9
SPUTUM : • Spesimen diproses memakai metode NALC-‐NaOH sebagaimana anjuran CDC Public health Mycobacteriology: A Guide for the Level III Laboratory.6
• Atau memakai BBL MycoPrep kit. GASTRIC ASPIRATES: • Spesimen didekontaminasi seperR sputum. • Jika volume spesimen lebih dari 10 mL, maka pekatkan dengan sentrifugasi. Resuspensi spesimen ke sekitar 5 mL air steril dan kemudian didekontaminasi.
CAIRAN TUBUH (CSF, cairan synovial, cairan pleural, dsb.): • Spesimen yang diperoleh secara asepRk dan diperkirakan Rdak ada bakteri dapat diinokulasi langsung tanpa dekontaminasi.
• Jika volume spesimen lebih dari 10 mL, pekatkan dengan sentrifugasi pada 3.000 x g selama 15 menit. Buang supernatan cairan.
• Inokulasi tabung MGIT dengan endapannya. • Spesimen yang diperkirakan mengandung bakteri lain harus didekontaminasi. JARINGAN: • Spesimen jaringan hendaknya diproses sebagaimana anjuran CDC Public health Mycobacteriology: A Guide for the Level III Laboratory.6
FECES: • Suspensikan 1 g feces ke dalam 5 mL Middlebrook Broth. Vortex suspensi selama 5 deRk. • Lanjutkan sebagaimana sputum.
Pencernaan, Dekontaminasi dan Pemekatan Spesimen
Prosedur Pencernaan/Dekontaminasi Sputum dengan NALC/NaOH
10
1. Siapkan larutan segar dengan menambahkan dalam jumlah yang sama 4% NaOH dan 2,9% sodium sitrat. Tambah 0,5 g bubuk NALC per 100 mL larutan NaOH-‐Na Sitrat. Setelah NALC ditambahkan, gunakan larutan dalam 24 jam.
3.Biarkan spesimen selama 15-‐20 menit.
5.Pekatkan spesimen dengan sentrifuge berkecepatan 3.000 x g selama 15 menit
2 Masukkan spesimen ke dalam tabung Falcon 50 mL. Spesimen jangan lebih dari 10 mL. Tambahkan larutan NALC dengan volume yang sama dengan spesimen. Dengan tutup tertutup rapat, vortex tabung (sekitar 5-‐20 deRk per tabung) dan balik tabung untuk memasRkan bahwa larutan NALC menyentuh seluruh permukaan tabung dan tutupnya.
4.Isi tabung sampai 45 mL dengan bufer fosfat steril dengan pH 6,8. Kocok dengan tangan.
6.Secara haR-‐haR buang larutan supernatan dari pelet.
7.Resuspensi endapan dengan bufer fosfat dengan memakai pipet Pasteur steril untuk memperoleh volume akhir 1 -‐ 3 mL.
Prosedur Pencernaan/ Dekontaminasi Sputum
dengan MYCOPREP™
LANGKAH 1
11
Siapkan satu Botol MYCOPREP (NALC/NaOH). Buka tutup Botol. Tekan ampul untuk memecahkan NALC. Tutup botol. Kocok dengan baik, larutan siap digunakan.
LANGKAH 2
LANGKAH 3 Biarkan spesimen selama 15-‐20 menit
LANGKAH 5 Pekatkan spesimen dengan sentrifuge berkecepatan 3.000 x g (Clay Adams Dynac-‐II/III) selama 15 menit.
Masukkan spesimen ke dalam tabung Falcon 50 mL. Spesimen jangan lebih dari 10 mL. Tambahkan larutan NALC dengan volume yang sama dengan spesimen. Dengan tutup tertutup rapat, vortex tabung (sekitar 5-‐20 deRk per tabung) dan balik tabung untuk memasRkan bahwa larutan NALC menyentuh seluruh permukaan tabung dan tutupnya.
LANGKAH 4 Isi tabung sampai 45 mL dengan bufer fosfat steril dengan pH 6,8. Kocok dengan tangan.
LANGKAH 6 Secara haR-‐haR buang larutan supernatan dari pelet.
LANGKAH 7 Resuspensi endapan dengan bufer fosfat dengan memakai pipet Pasteur steril untuk memperoleh volume akhir 1 -‐ 3 mL
LANGKAH 1
12
Prosedur Penyiapan Tabung MGIT
Label tabung MGIT dengan nomor spesimen.
LANGKAH 2 Buka tutup tabung MGIT, dan secara asepRk tambahkan 0,5 mL MGIT OADC.
LANGKAH 3 Secara asepRk tambah 0,1 mL MGIT PANTA yang telah dilarutkan. Untuk hasil yang terbaik, tambahkan OADC dan anRbioRk PANTA tepat sebelum inokulasi spesimen.
LANGKAH 4 Tambah 0,5 mL suspensi spesimen yang telah diproses dengan BBL Mycoprep.
LANGKAH 5 Tutup tabung dengan rapat dan kocok dengan baik.
LANGKAH 6 Bersihkan tabung dan tutup dengan desinfektan tuberculosidal.
LANGKAH 7 Inkubasi tabung pada suhu 37oC LANGKAH 8 Baca tabung seRap hari mulai Hari-‐2
13
Tabung Kontrol PosiSf
Kosongkan broth dari tabung MGIT baru. Label tabung “Kontrol Posi0f”, dan dicatat tanggalnya. Siapkan 0.4% larutan sodium sulfite (0,4 g dalam 100 mL aquades/
aquademin steril). Tambahkan 5 mL larutan sodium sulfite ke tabung, kencangkan tutupnya,
dan biarkan minimum 1 jam pada suhu kamar sebelum dipakai. Kontrol PosiRf dapat digunakan berkali-‐kali. SeRap Kontrol PosiRf dapat
dipakai sampai empat minggu jika disimpan dalam suhu kamar.
Tabung Kontrol NegaSf
Adalah tabung MGIT baru, yang belum dibuka dan belum diinokulasi
14
Membaca Tabung MGIT: • Ambil tabung dari inkubator – Letakkan pada lampu UV bersebelahan dengan Kontrol PosiRf dan NegaRf. – Dianjurkan untuk membaca antara 4 -‐ 10 tabung sekaligus. – Sebaiknya menggunakan kaca mata pelindung UV pada saat mengamaR fluoresensi. – Gunakan cahaya normal ruangan. Hindari membaca di bawah matahari langsung atau di ruang yang gelap.
• Tandai tabung MGIT yang berfluoresensi terang, – Bandingkan dengan Kontrol PosiRf dan NegaRf. – Jika tabung MGIT lebih mirip Kontrol PosiRf, maka tabung tersebut posiRf. Jika lebih mirip Kontrol NegaRf, maka tabung tersebut negaRf.
– Pertumbuhan juga bisa diamaR dengan adanya kekeruhan yang Rdak homogen, buRran-‐buRran atau lempengan kecil dalam medium kultur.
• Dari tabung MGIT PosiRf lakukan pewarnaan acid-‐fast bacilli. – Tabung yang Smear-‐nya negaRf diperiksa adanya kontaminasi bakteri dengan menanamnya ke blood agar.
– Lakukan subkultur untuk idenRfikasi dan tes resistensi obat dengan mamakai cairan dari tabung BBL MGIT posiRf.
• Tabung MGIT negaRf dibaca terus seRap hari sampai delapan minggu atau sesuai dengan pengalaman laboratorium di masa yang lalu. Tidak dibacanya tabung selama beberapa hari, misalnya karena libur, dapat menyebabkan kelambatan pembacaan posiRf, tetapi Rdak berpengaruh negaRf terhadap performa media. Tabung MGIT yang negaRf Rdak bisa digunakan lagi.
15
REAGEN:
• Larutkan vial liophilized BBL MGIT Streptomycin dengan 4 mL aquademin/aquades steril untuk mendapatkan konsentrasi 40 µg/mL.
• Larutkan vial liophilized BBL MGIT Isoniazid dengan 4 mL aquademin/aquades steril untuk mendapatkan konsentrasi 5 µg/mL.
• Larutkan vial liophilized BBL MGIT Rifampin dengan 4 mL aquademin/aquades steril untuk mendapatkan konsentrasi 50 µg/mL.
• Larutkan vial liophilized BBL MGIT Ethambutol dengan 4 mL aquademin/aquades steril untuk mendapatkan konsentrasi 175 µg/mL.
PENYIMPANAN :
• Setelah diterima, simpan vial liophilized pada 2 -‐ 8oC. Setelah dilarutkan, larutan anRbioRk dapat dibekukan dan disimpan pada -‐70oC sampai 6 bulan. Sekali dicairkan, segera digunakan dan buang sisanya.
MGIT AST Tes Sensitivitas Antibiotika
16
Untuk penyiapan inokulum, tabung MGIT posiRf hendaknya digunakan sehari setelah ia pertama kali menjadi posiRf, sampai dan termasuk Rga hari setelah mula-‐mula posiRf.
Tabung yang telah posiRf lebih dari empat hari harus disubkultur ke tabung MGIT segar dan digunakan satu sampai Rga hari setelah tabung MGIT tersebut posiRf.
1. Vortex tabung MGIT selama 10 deRk. 2. Pipet 1,0 mL suspensi dari tabung MGIT tersebut ke dalam 4 mL saline steril (pengenceran 1:5).
Inokulum telah siap. Lanjutkan ke “Prosedur Inokulasi untuk Tes SensiRvitas”
PENYIAPAN INOKULUM dari TABUNG MGIT POSITIF
17
1. Tambahkan 4 mL BBL Middlebrook 7H9 Broth ke dalam tabung steril 16,5 x 128 mm dengan tutup, yang mengandung 8 -‐ 10 glass beads.
2. Ambil dengan loop steril sebanyak mungkin koloni yang berumur sampai dengan 14 hari. Usahakan agar Rdak mengenai media padatnya. Suspensikan koloni dalam Middlebrook 7H9 Broth. Kekeruhan suspensi hendaknya lebih dari 1,0 McFarland.
3. Vortex suspensi selama 2-‐3 menit untuk memecahkan kelompok yang besar. 4. Biarkan suspensi selama 20 menit tanpa diganggu. 5. Pindahkan cairan supernatan ke tabung bertutup steril lain (hindari berpindahnya endapan) dan biarkan 15 menit lagi.
6. Pindahkan cairan supernatan (harus mulus, tanpa gumpalan) ke tabung steril keRga.
7. Sesuaikan suspensinya ke standar 0,5 McFarland dengan nephelometer. 8. Encerkan 1,0 mL suspensi 0,5 McFarland tersebut ke dalam 4 mL saline steril (pengenceran 1:5).
Inokulum telah siap. Lanjutkan ke “Prosedur Inokulasi untuk Tes SensiRvitas”
PENYIAPAN INOKULUM DARI MEDIA PADAT
18
PROSEDUR 1 Prosedur Inokulasi untuk Tes SensiSvitas MGIT:
1. Ambil 5 tabung MGIT, label tabung pertama MGIT GC (Growth Control), selanjutnya MGIT STR, MGIT INH, MGIT RIF dan terakhir MGIT EMB.
2. Tambahkan secara asepRk 0,5 mL MGIT OADC ke Rap tabung. 3. Pipet secara asepRk, dengan mikropipet,
Ø 100 µL dari larutan 40 µg/mL MGIT Streptomycin ke tabung MGIT STR. Ø 100 µL dari larutan 5 µg/mL MGIT Isoniazid ke tabung MGIT INH. Ø 100 µL dari larutan 50 µg/mL MGIT Rifampin ke tabung MGIT RIF. Ø 100 µL dari larutan 175 µL MGIT Ethambutol ke tabung MGIT EMB. Ø Tidak ada anRbioRk ditambahkan ke tabung MGIT GC.
4. Inokulasikan 0,5 mL inokulum kedalam Rap tabung. Sapu tabung dengan desinfektan tuberkulosidal. Tutup rapat tabung dan kocok dengan baik.
5. Inkubasi pada suhu 37oC. 6. Streak 0,1 mL inokulum ke TSA dengan 5% Sheep Blood. Masukkan ke dalam
kantung plasRk. Inkubasi pada 35oC -‐ 37oC. Cek pada 48 jam. Jika Rdak ada pertumbuhan, lanjutkan dengan “Membaca Tabung MGIT” 7. Jika ada pertumbuhan di agar darah, buang tabung MGIT, ulangi prosedur dengan
kultur murni.
19
PROSEDUR 2 Membaca Tabung MGIT:
1. Ambil tabung MGIT dari inkubator pada hari keRga setelah inokulasi dan baca dengan lampu UV gelombang panjang.
2. Bandingkan tabung MGIT GC dengan tabung Kontrol PosiRf dan Kontrol NegaRf. 3. Jika fluoresensi tabung MGIT GC lebih mirip dengan Kontrol PosiRf dibandingkan Kontrol NegaRf, maka posiRf ada pertumbuhan. Sekali tabung MGIT GC posiRf, maka ia dipakai untuk menginterpretasikan tabung yang berisi obat.
• Tabung yang berisi obat diinterpretasikan pada hari dimana tabung MGIT GC posiRf, sampai dua hari kemudian, dan Rdak lebih dari empat belas hari.
• Jika tabung MGIT GC Rdak berfluoresensi dan lebih mirip Kontrol NegaRf, reinkubasi tabung dan lanjutkan membaca seRap hari sampai hari ke dua belas setelah inokulasi. Jika hasilnya equivokal (sulit menentukan apakah ada fluoresensi) maka tabung dianggap negaRf dan direinkubasi.
• Jika tabung MGIT GC negaRf sampai hari ke 12, maka tes-‐nya Rdak valid. Interpretasi Hasil Interpretasikan hasil MGIT sebagai sensiRf jika tabung yang berisi obat TIDAK berfluoresensi dalam waktu dua hari setelah MGIT GC posiRf. Interpretasikan sebagai resisten jika tabung yang berisi obat berfluoresensi pada atau dalam waktu dua hari setelah MGIT GC posiRf.
BACTEC™ MGIT™ 960 System • Merupakan alat generasi
terbaru dalam deteksi Mikobakterium
• BACTEC™ MGIT™ 960 : – Sederhana – Efisien – Performance – Safety
Instrumen BACTECTM MGITTM 960 System Di Lab. Mikrobiologi di RSUD dr. Soetomo
21
Sistem Deteksi BACTECTM MGITTM 960
22
Sistem Deteksi BACTECTM MGITTM 960
• Detektor ada diseRap bagian bawah rak: – Data dikumpulkan dari
seRap tabung, seRap jam sekali.
– Data dievaluasi dan tube posiMvity ditentukan berdasarkan soNware algorithms.
BACTEC™ MGIT™ 960 System
• Di desain untuk memenuhi kebutuhan pemeriksaan berjumlah banyak. Space-‐saving 960 tube capacity.
• Satu instrumen bisa memproses hingga 8000 specimen per Tahun.
Lamanya Protokol untuk pertumbuhan mulai 1 sampai 56 hari.
Lama protokol standar: 42 days
24
BACTEC™ MGIT™ 960 System
OpMonal Data Management: EpiCenter
Langkah pengerjaan yang mudah dengan scanning barcode : • Meminimalkan potensi kesalahan. • Instrumen secara otomaRs mengarahkan penempatan seRap
tube kedalam instrumen. • Instrumen mengindikasi posiRf secara VISUAL dan suara SIGNAL
pada saat terjadi pertumbuhan • 4 Langkah SIMPEL prosedur penggunaan alat
25
BACTEC™ MGIT™ 960 System Step 1: Select workflow.
26
Step 2: Scan tube.
BACTEC™ MGIT™ 960 System
27
Step 3: Load where indicated by solid green LCD
BACTEC™ MGIT™ 960 System
28
Step 4: Remove positives and completed negatives as they occur.
BACTEC™ MGIT™ 960 System
29
NoRficaRon of PosiRves
• Indicator lamp on drawer illuminates.
• Audible alert sounds.
+ – !
#1 09/19/96
00:59
37.2 ° C A / D17
5 0 0 7 10 0 0 0 0 0 0 0 74 192 0 1 1 1 233 117 319
NoRficaRon of PosiRves
31
Langkah kerja menggunakan Bactec MGIT 960
Isolasi
Pengumpulan spesimen
Pemrosesan spesimen
Penyiapan Tube
Instrument Loading
Instrument Loading
• Load tubes ke dalam instrumen setelah pemrosesan dan inokulasi.
• Tempatkan tubes pada rak and carry to instrument for loading.
33
Kultur PosiRf
• Instrumen akan mengeluarkan sinyal bila ada kultur yang posiRf.
• Keluarkan kultur posiRf dari instrumen dan lakukan Acid Fast Smear.
• AFB PosiRve: – Subkultur pada solid medium. – Laporkan : “Instrument PosiMve” “AFB Smear PosiMve” “ID Pending”.
34
BACTEC™ MGIT™ 960 SuscepMbility Test / Tes SensiRfitas
AnRbioRka • BACTEC MGIT 960 juga bisa digunakan untuk tes sensiRvitas anRbioRka pada pengobatan Tuberkulosis,yaitu: – Streptomycin – Isoniazid – Rifampin – Ethambutol – Pyrazinamide
35
BACTEC™ MGIT™ 960 • Pilihan tes sensiRvitas anRbioRka terdiri dari:
– Streptomycin, Isoniazid, Rifampin and Ethambutol (SIRE) tesMng against M. tuberculosis
• SIRE Kit to perform AST at the CriMcal ConcentraMons
• Separate kits are available to perform a 2nd test with higher concentraMons of S and I if needed
– PZA tesMng against M. tuberculosis
36
Komponen BACTEC™ MGIT™ 960 SIRE
• Terdiri dari: – BACTEC MGIT 960 SIRE Kit (40 tests/kit) – BACTEC MGIT 960 STR 4.0 Kit (20 tests/kit) – BACTEC MGIT 960 INH 0.4 Kit (20 tests/kit) – BACTEC MGIT 960 EMB 7.5 Kit* (20 tests/kit) – AST Starter Kit
* Not available in U.S. 37
Prosedur AST Instrument
1. Prepare Inoculum and inoculate SIRE tubes
2. Scan AST set into instrument 3. When complete,
scan out the set
4. Print the result
PZA test is performed in the same way, using just the 2-tube AST Set Carrier 38
Kelebihan BACTEC™ MGIT™ 960 System
• Non-‐radiometric. • Menggunakan MGIT media and sensor yang menetap.
• Effisien dengan Teknologi fluorometric • Akurat: deteksi pertumbuhan melalui deteksi penggunaan O2 oleh Mycobacteria.
• OtomaRs Quality Control – Untuk memasRkan alat berjalan secara presisi dan layak.
39
Kelebihan BACTEC™ MGIT™ 960 System • Monitoring BERKELANJUTAN:
– HASIL cepat, membantu pengobatan pasien • AMAN, Effisien, “on board incubaRon’.
– TIDAK memerlukan penanganan transfer tube setelah masuk dalam sistem
– Instrument ‘walk away’ v Kekurangan: • Harga instrumen mahal • Di Surabaya hanya ada 2 , RSUD Dr.Soetomo dan RKZ
40
Terima Kasih
41