INSTITUTO POLITECNICO NACIONALESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICASDEPARTAMENTO DE BIOQUIMICADR. GUILLERMO CARVAJAL SANDOVAL

4QM1 SECCION 1 *LOPEZ RAMIREZ STEPHANY *MENDOZA GARCES DANIA FERNANDA

PRACTICA N1: DETERMINACION DE AMINOACIDOS TERMINALES CON GRUPO ALFA AMINO LIBRE. METODO DE SANGER

*INTRODUCCIONEn el procedimiento para establecer la secuencia aminocido, son muy importantes los mtodos usados para identificar los restos aminocidos terminales. El primer mtodo til para determinar el N-terminal de los polipptidos fue descrito por Sanger, quien encontr que el grupo alfa amino libre de los pptidos, que no han captado protones, reaccionan con el 2,4-dinitrofluorobenceno (DNFB) y forma derivados 2,4-dinitrofenilados. Cuando tales derivados de un pptido se someten a hidrolisis con HCl 6 N, todos los enlaces peptdicos se hidrolizan, pero el enlace entre el grupo 2,4-dinotrofenilo y el grupo alfa amino del aminocido N-terminal es relativamente estable frente a la hidrlisis cida. Por lo consiguiente, el hidrolizado del pptido dinitrofenilado contiene todos los restos aminocidos de la cadena peptdica en forma de aminocidos libres, a excepcin del resto N-terminal, el cual aparece como derivado 2,4-dinitrofenilado, de color amarillo. Este resto marcado puede separarse fcilmente de los aminocidos no sustituidos e identificarse por comparacin cromatografa con los derivados dinitrofenilados conocidos de los diferentes aminocidos.

*OBJETIVOS-El alumno utilizara el mtodo de Sanger para identificar los aminocidos del grupo alfa-amino terminal de la hemoglobina.

*METODOLOGIA1. Agregar en un tubo 30g de Hemoglobina y 2.4 mL de NaCO3 4.2%.2. Aadir 2 mL de DNFB al 5%. Agitar por una hora y mantener un pH de entre 8-9.3. Ajustar el pH por debajo de 3 con 12 gotas de HCl 3N.4. Extraer 3 veces la suspensin con 7 mL de ter saturado con solucin acuosa de FeSO4.5. Evaporar los residuos de ter en bao mara.6, Centrifugar a 3000 rpm durante 15min. Eliminar el sobrenadante.7. Aadir 5 mL de HCl 6 N y calentar en autoclave 3h a 15 lb por pulgada cuadrada de presin.8. Recoger el contenido del tubo con 5 mL de agua en un vaso de pp. Extraer 3 veces el hidrolizado con 7 mL de ter. Pasar a un vaso de pp.9. Calentar los extractos etreos y enfriar. Aadir 0.5mL de acetona y redisolver10. Realizar cromatografa.

*INTERPRETACION DEL PROCEDIMIENTO Determinacin del aminocido N-terminal de la protena.DINITROFENILIZACION

ELIMINACION DEL DNFB QUE NO REACCIONOAl extraer la fase etrea (paso 4) se elimina el DNFB que no reacciono con el N-terminal. HIDROLISIS DE LA DNP-PROTEINALa hidrolisis se lleva acabo con el HCl 6N, el cual rompe todos los enlaces peptdicos. Pero se mantiene el enlace entre el dinitrofenilo y el grupo amino. Todo esto bajo las condiciones de la autoclave (3 h y 15 lb de presin) por qu se necesita ms energa para romper dichos enlaces. IDENTIFICACION DEL RESIDUO N-TERMINAL POR CROMATOGRAFIA EN PAPEL.

*RESULTADOSCOMPUESTORf

DNP-Asp0.689

DNP-Val0.656

DNP-Glu0.712

DNFB0.423

PROBLEMA0.620 y 0.420

*ANALISIS DE RESULTADOS

En base a lo realizado en la prctica, la reaccin de sanger nos ayud a identificar el grupo -amino terminal de la hemoglobina, poniendo en evidencia la coloracin amarilla caracterstica de esta prueba, esta gracias al proceso intermedio llamado Dinitrofenilacion, que es la adicin del grupo Dinitrofenil al amino terminal de la protena. El proceso de identificacin consto de en una cromatografa en papel, colocando en l, cada uno de los derivados dinitrofenilados de los aminocidos tipo DNP-Asp, DNP-Val, DNP-Glu, DNFB, solucin problema, notando una similitud entre la solucin problema y la solucin de valina, la cual se confirm con clculos de Rf, donde la valina fue el dato ms cercano al del problema denotando as a este aminocido como el que contiene el grupo alfa-terminal de la protena de la hemoglobina, igualmente se observ la aparicin de una mancha que por medio de Rf que indico la presencia de DNFB que no reacciono lo cualquier decir que los lavados no se hicieron correctamente.

*CONCLUSIONES

El mtodo de Sanger es muy til para identificar solo un aminocidos alfa amino terminal de las cadenas de las molculas de las protenas, en este caso dela hemoglobina. Es muy mtodo muy preciso y confiable pero tiene la desventaja de ser muy tardado, si se comprar con los mtodos de identificacin actuales resulta ser un poco obsoleto. La cromatografa revelo la afinidad que tienen diferentes aminocidos y el DNFB con la hemoglobina.

*BIBLIOGRAFIA

*Lehninger, Albert, Nelson, David L. (1993). Principios de Bioqumica. Segunda Edicin, Ediciones Omega, Barcelona, Espaa.