PROCESO DE LABORATORIO IN VITRO PARA EL DIAGNOSTICO DEL VIRUS DE LA NECROSIS PANCREATICA INFECCIOSA (IPNV)

Becario: Arturo Morales López, Unidad Académica de Ciencias Químico Biológicas de la Universidad Autónoma de Guerrero, becario del programa AMC xrthur90@hotmail.com, Área II.

Asesor-Investigador: Dr. César Ortega Santana, Responsable del área de Sanidad Acuícola en el Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal (CIESA) de la Universidad Autónoma del Estado de México, cortegas@uaemex.mx.

RESUMEN

El virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) es el agente etiológico de una

enfermedad sistemática aguda, altamente contagiosa, usualmente letal para peces salmónidos

jóvenes. El virus tiene distribución mundial y provoca severas pérdidas; una forma de control y

prevención es realizar su diagnóstico oportuno en granjas donde llevan a cabo cultivos de trucha

arcoíris. En este trabajo se usaron “muestras ciegas” para el diagnóstico de IPNV utilizando

células de cultivo de la línea RTG-2 (Rainbow trout gonad) y CHSE-214 (Chinook salmon

embryo). El proceso inició con la toma y obtención de órganos para el diagnóstico viral (hígado,

riñón y bazo), seguido de la preparación de placas de células para inoculación de las muestras

biológicas, luego de la inoculación las muestras que presentaron efecto citopático (CEP)

sugestivo de la presencia de IPNV fueron sometidas a la prueba de inmunofluorescencia indirecta

(IFAT). En la prueba de inmunofluorescencia indirecta, la muestra positiva debe presentar una

fluorescencia específica de color verde únicamente en el citoplasma de las células infectadas. El

proceso realizado en este estudio está basado en la recomendación de la Organización

Internacional de Salud Animal (OIE, 2006), considerada la “prueba de oro” para el diagnóstico

de IPNV y otros virus de peces, específicamente salmónidos, el cual es un proceso único en el

país e inclusive en Latinoamérica. En este trabajo, las líneas celulares (RTG-2 y CHSE-214)

mostraron ser aptas para la detección de IPNV.

PALABRAS CLAVE: IPNV, infección, virus, células, inmunofluorescencia.

INTRODUCCIÓN

En México, el cultivo de la trucha arcoíris comenzó a finales del siglo XIX, con

importaciones de huevo de Estados Unidos. Sin embargo, esta actividad se vio afectada por la

ocurrencia de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) en enero del año 2000, en una granja de

trucha de la región central del país, reportando los síntomas típicos de IPNV en alevines, con

pérdidas de aproximadamente 5,000 alevines en solo 5 semanas. Este grupo de peces fue

originalmente importado en un lote de 300,000 huevos en Noviembre de 1999 (Ortega et al.,

2002).

La introducción y movimiento de los huevos de trucha y alevines en distintas partes del

país son prácticas comunes, ya que el gran déficit de este insumo para poblar las granjas fuerza a

los productores de depender en la importación de peces, lo cual incrementa el riesgo de propagar

el IPNV y otros agentes infecciosos, poniendo en riesgo los recursos económicos que generarían

las granjas productoras de trucha arcoíris (Ortega et al., 2007).

Ya que el cultivo de la trucha arcoíris es prácticamente mundial, el problema con IPNV

no es exclusivo de México, de igual manera, la industria acuícola chilena se ha convertido en los

últimos años en una de las más importantes del mundo, en donde se estiman pérdidas de cerca de

US$ 100 millones debido a enfermedades que afectan en distintas etapas de producción de

salmónidos, incluyendo IPNV. El mercado chileno cuenta actualmente con una vacuna de

administración oral contra IPNV reconocida por la autoridad de salud pecuaria nacional, no

obstante, aún existen barreras clínicas, tecnológicas y económicas que subsanar para mejorar su

aceptación dentro de la industria (Aranda et al., 2007).

El virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV)

El virus de la necrosis pancreática (IPNV), miembro de la familia Birnaviridae es el

agente etiológico de una enfermedad sistemática aguda altamente contagiosa, usualmente letal

para salmónidos jóvenes, cuya distribución mundial provoca severas perdidas económicas en

varias especies de peces. Los animales que sobreviven a la enfermedad clínica y los infectados

después de los 6 meses de edad se convierten en portadores asintomáticos, perpetuando el riesgo

de infección (Wolf, 1998; Rodríguez et al., 2001; Vega et al., 2011). El desarrollo y resultado

final de la infección es influido por factores que dependen del virus y del hospedero, los cuales a

su vez son afectados por el ambiente (Rodríguez et al., 2003). Por consiguiente, para comprender

los mecanismos que facilitan el establecimiento y la evolución de la infección es importante

considerar no solo las propiedades del virus, sino también aquellos elementos del hospedero que

median la interacción inicial entre virus y célula y que determinan que una infección sea o no sea

productiva en especies susceptibles (Ortega y Enríquez, 2007). En México, la presencia de IPNV

fue confirmada en crías de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) importadas como “ovas ojo”

desde Norteamérica, creando una situación de emergencia para la producción de trucha en el país

(Ortega et al., 2002).

La virulencia, que es la habilidad relativa del agente patógeno para causar enfermedad, es

una manifestación de la interacción entre los efectos adversos producidos por componentes del

virus y los mecanismos de defensa desarrollados por las células para tratar de eliminar la

infección; sin embargo, el resultado de tal interacción siempre es determinado por el virus a

través de sus factores de virulencia, función que puede ser ejercida por cualquier componente de

la partícula viral (Lyles, 2000). Las diferencias en el nivel de virulencia observadas entre distintas

cepas de IPNV han sido atribuidas a su variación genética (Dobos, 1995), y con la propiedad del

virus para modificar las vías de señalización celular a través de las proteínas virales de

señalización celular a través de las proteínas virales codificadas por su segmento A, capaces de

manipular la maquinaria celular para facilitar la síntesis viral y evadir la respuesta de defensa

(Larsen et al., 2004). En este sentido, las proteínas virales consideradas como los principales

factores de virulencia de IPNV son la VP2, componente de la cubierta externa de la cápside viral

que participa en el reconocimiento del virus a las células; la proteína VP5 de función no

concluyente, dado que se ha observado no ser necesaria para establecer la infección y la

multiplicación viral, pero con actividad antiapoptótica que aparentemente no tiene relación en el

establecimiento del estado portador (Liu y Vakharia, 2004; Nanda y Baron, 2006).

IPNV presenta alta variabilidad antigénica y genotípica, característica que influyen en la

interacción virus-célula, la virulencia y el desarrollo del estado portador; sin embargo, los

mecanismos involucrados en dichos procesos no están plenamente determinados (Rodríguez et

al., 2003). Debido a las diferencias existentes en las características del agente, la fisiología de los

animales y las condiciones ambientales en que viven, se hace necesario generar un conocimiento

dirigido a identificar estos mecanismos en organismos acuáticos, que permita comprender los

procesos celulares, involucrados en el desarrollo de la enfermedad y con ello establecer mejores

estrategias para su manejo o evitar su ocurrencia (Ortega y Enríquez, 2007).

La trucha arcoíris Oncorhynchus mykiss (Walbaum, 1792)

La trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) tiene un cuerpo de forma alargada, fusiforme

con 60-66 vertebras, 3-4 espinas dorsales, 10-12 radios dorsales, 3-4 espinas anales, 8-12 radios

anales y 19 radios caudales. Presenta una aleta adiposa, usualmente con borde negro. Tiene una

coloración azul a verde oliva sobre una banda rosada a lo largo de la línea lateral y plateada por

debajo de ella. El lomo, los costados, la cabeza y aletas están cubiertas con pequeños puntos

negros. La coloración varía con el hábitat, tamaño y condición sexual. Existe una tendencia de los

desovantes en corrientes a ser más oscuros con color más intenso, mientras que los desovantes de

lagos son más brillantes y más plateados. La ausencia de dientes hioideos es la característica que

más fácilmente permite distinguirla de Oncorhynchus clarki (FAO, 2006).

La trucha arco iris es nativa de las cuencas que drenan al Pacífico en Norte América. Las

pesquerías de trucha son mantenidas, o su cultivo es practicado, en las cuencas altiplánicas de

muchos países tropicales y sub-tropicales de Asia, este de África y Sudamérica. Como resultado,

se han desarrollado varios linajes o cepas locales domesticadas, mientras que otras han surgido a

través de selección masiva y entrecruzamiento para mejorar la calidad de los peces para cultivo.

Muchos países están reportando producción de trucha arco iris cultivada, de los cuales, algunos

tienen producción relativamente insignificante en comparación con la producción de los sistemas

más grandes que se localizan en los principales países productores en Europa, Norte América,

Chile, Japón y Australia (FAO, 2006).

La trucha arco iris es un pez resistente y fácil de desovar, de crecimiento rápido (3 a 4

años de vida), tolerante a una amplia gama de ambientes y manipulaciones. Es capaz de ocupar

muchos hábitats diferentes, que abarcan desde un ciclo de vida anádromo (que vive en el océano

pero desova en ríos y corrientes con fondos de grava, flujos rápidos y bien oxigenados) hasta

habitar de manera permanente en lagos. La especie puede soportar amplias gamas de variación de

temperatura (0-27 °C), pero el desove y crecimiento ocurren en una gama más estrecha (9-14 °C).

La selección de características superiores también se logra por entrecruzamiento, aumentando las

tasas de crecimiento, resistencia a las enfermedades, fecundidad y mejorando la calidad y sabor

de la carne. Las hembras no desovarán naturalmente en sistemas de cultivo; de modo que los

juveniles deben ser obtenidos ya sea por desove artificial en un partidero o por recolección de

huevos de poblaciones silvestres. Las larvas están bien desarrolladas al momento de la eclosión.

En la naturaleza, las truchas adultas se alimentan de insectos acuáticos y terrestres, moluscos,

crustáceos, huevos de peces y otros peces pequeños, pero el alimento más importante son los

camarones de agua dulce, que contienen los pigmentos carotenoides responsables del color

rosado-naranja en la carne. En acuicultura, la inclusión en los alimentos de los pigmentos

sintéticos astaxantina y cantaxantina causa que se produzca esta coloración rosada (FAO, 2006).

En base a lo previamente establecido, es importante diagnosticar el virus de la necrosis

pancreática (IPNV) en las granjas donde llevan a cabo los cultivos de trucha arcoíris como una

forma de control y prevención.

MATERIAL Y MÉTODO

El procedimiento de diagnóstico de la necrosis pancreática infecciosa (IPN) consiste en

pruebas de aislamiento del virus en cultivos celulares, seguido de la identificación inmunológica

(OIE, 2006).

Peces: Las muestras utilizadas fueron “muestras ciegas” previamente obtenidas con fines

académicos para el diagnóstico de IPNV; cabe mencionar que en el CIESA se reciben muestras

provenientes de distintos comités establecidos en el país (Querétaro, Michoacán, Guerrero,

Morelos, Hidalgo, Tlaxcala, Veracruz y del Estado de México) y público en general (Sinaloa,

Tabasco, Oaxaca, etc.). Los peces pertenecen a la especie Oncorhynchus mykiss (trucha arcoíris)

y los órganos que se utilizan para este diagnóstico es el hígado, riñón y bazo.

Control positivo: Cepa Mexicana de IPNV (VR-299) previamente obtenida (Ortega et al., 2002).

Línea celular: RTG-2 (Rainbow Trout Gonad), y CHSE-214 (Chinook Salmon Embryo) de la

especie Oncorhynchus tshawytscha.

Toma y obtención de órganos para diagnostico viral (OIE, 2006)

Sacrificar a los peces por un método humanitario dependiendo de su tamaño. Colocar los peces muertos o insensibilizados sobre una charola o sobre una toalla de papel.

Rociarlos con alcohol al 70%. Realizar grupos de 5 peces. Diseccionar a los peces y extraer asépticamente trozos de riñon, hígado y bazo en proporción 3:1:1 respectivamente hasta completar 1 g aproximadamente. Colocar los órganos en el tubo de plástico que contiene 9

ml de MEM (Medio Mínimo Esencial) al 2% de suero fetal bovino, quedando una disolución 1:10.

El contenido del tubo (el cual debe estar en un recipiente frio) se deposita en un mortero esteril y frio; después se regresa parte del medio al tubo.

En el mortero que contiene los órganos y parte del medio se adiciona arena de rio esteril, para macerar los órganos. La mezcla resultante se vacia nuevamente en el tubo de origen.

Se centrifugan los tubos de 3500 rpm durante 15 minutos a una temperatura de 4 °C. El sobrenadante obtenido se extrae con una jeringa y se hace pasar a través de un filtro esteril

con una membrana de 0.2 μm de diámetro. La mezcla filtrada se coloca en otro tubo estéril identificado y se coloca en refrigeración a 4 ± 3 °C, estando lista para ser inoculado.

Preparación de placas de células para inoculación viral (OIE, 2006)

Calcular el número de pozos que se requieren preparar y la cantidad necesaria de medio MEM 10% para las placas y la botella de cultivo celular.

Retira el MEM contenido en el frasco o botella con monocapa celular. Lavar las células adicionando a la botella 0.5 ml de tripsina, procurar que la solución recorra toda la superficie de la monocapa e inmediatamente retirarla. Repetir este procedimiento una vez más.

Adicionar 1 ml de tripsina a la botella con células, dejándola actuar durante 5 a 10 min, observando al microscopio cada minuto. Cuando las células se observan redondas, se golpea suavemente con la mano en un extremo de la botella para desprender las células. Una vez que las células se han despegado se adiciona 1.5 ml de MEM 10% para bloquear la actividad de la tripsina sobre las células, y se realiza un pipeteo suave sobre la pared de la botella para homogenizar el contenido de la botella. Acto seguido se adiciona la cantidad necesaria de medio MEM al 10% para completar el total de cultivo que se desea preparar.

Separar 20 ml de la suspensión de células para la botella de cultivo celular; el resto del medio se adiciona, según corresponda. En la placa de 24 pozos, colocar 1 ml ± 100 μl, sellar e identificar cada botella a una temperatura de 20 °C.

Inoculación de muestras biológicas (OIE, 2006)

En un tubo de plástico estéril se depositan 900 μl de MEM con 2% de suero fetal bovino y posteriormente se le adicionan 100 μl de muestra, quedando a una dilución 1:100. Agitar en vortex e identificar con el número de la muestra original.

INOCULACIÓN: Inicialmente, a cada pozo de la placa de cultivo se le retiran 900 μl del medio MEM, sin tocar el fondo para no dañar la monocapa de células. Acto seguido, se inoculan con 100 μl de cada muestra debidamente identificada en diluciones 1:10 y 1:100 por duplicado, sin tocar la monocapa celular. En la misma placa se dejan dos pozos sin inocular para usarse como control negativo y como control positivo también se inoculan dos pozos con 100 μl del virus de referencia.

La placa se sella con cinta aislante blanca para permitir la adsorción, se incuba durante 1 hora a 15 °C. Después de este tiempo, a cada pozo de la placa se adiciona 1 ml ± 100 μl de

MEM al 2% de suero fetal bovino. Las placas inoculadas son selladas con cinta aislante y se colocan en incubación para permitir la replicación viral a una temperatura de 15 °C por 7 dias; en este tiempo es necesario checar las placas cada 24 horas, buscando el efecto citopatico (ECP) causado por el virus citopatogénico a las células.

Inmunofluorescencia indirecta (IFAT; OIE, 2006).

Se debe preparar una placa de 6 pozos con anterioridad para esta prueba, en la cual se colocan en cada poco un cubreobjetos cubreobjetos (esto dependerá del número de muestras que hayan mostrado ECP) y se repite el procedimiento de inoculación.

Se espera a que se observe ECP en más del 50% de los pozos inoculados con las “muestras ciegas” y se procede a realizar la tinción.

TINCIÓN: Se deben extraer los cubreobjetos de los pozos de la placa de 6 pozos y dejarlos secar a temperatura ambiente con ayuda de la campana de flujo laminar.

Agregar acetona fría (-20 °C) hasta tapar el cubreobjetos y dejar secar (entre 15 a 30 min). Lavar los portaobjetos en un recipiente y agregar abundante solución de lavado previamente

diluida (1:25) y dejarlos reposar por 3 a 5 min. Repita este procedimiento 2 veces más. Remover los portaobjetos del recipiente y eliminar el exceso de solución evitando que el tejido se seque.

Agregar sobre cada portaobjetos 100 μl del reactivo oligoclonal, previamente diluido 1:100 con la solución de dilución e incubar los portaobjetos a temperatura ambiente por 30 min en una cámara humeda cerrada. Evitar que se seque la solución del anticuerpo.

Repetir el lavado con la solución de lavado. Agregar sobre cada portaobjetos 100 μl del conjugado-FITC, previamente diluido 1:100 con

la solución de dilución. Incube los portaobjetos a temperatura ambiente por 30 min en una cámara húmeda cerrada y en oscuridad.

Repetir el lavado con la solución de lavado y dejar secar en la oscuridad a temperatura ambiente.

Colocar una gota de resina para la fijación sobre el cubreobjetos evitando la formación de burbujas. Las muestras se deben de examinar en un microscopio de fluorescencia con un aumento de 1000x para realizar el diagnóstico.

RESULTADOS

Una muestra positiva en las placas debe presentar el efecto citopático (ECP) ocasionado

por IPNV. La presencia de IPNV ocasionara una desnaturalización en la monocapa formada por

las células, provocando que se redondeen y se desprendan de la pared de la placa (figura 1). Se

diagnostica una muestra negativa cuando las células, después de 7 días no muestran ECP y se

observa la monocapa sin ningún daño.

Figura 1: Células CHSE-214 mostrando ECP después de 4 días de haber sido inoculadas con las muestras ciegas.

En la prueba de inmunofluorescencia indirecta, una muestra positiva debe presentar una

fluorescencia específica de color verde del tejido. La presencia de IPNV aparece como una

fluorescencia verde difusa en el citoplasma de las células infectadas (figura 2). Se diagnostica una

muestra negativa por la ausencia de fluorescencia en las células o tejido.

Figura 2: Prueba de inmunofluorescencia indirecta en células RTG-2, mostrando la presencia de IPNV en el citoplasma.

DISCUSIÓN

Para el diagnóstico de IPNV, se llevó a cabo en base al protocolo recomendado por la OIE

(2006), en el cual se sigue un proceso ciertamente complicado y tardado debido a los multiples

pasos que se deben realizar con suma cautela y el tiempo que tardan las células en crecer y

mostrar el Efecto citopático (ECP), sin embargo, es considerado como la prueba irrefutable para

el diagnóstico del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) en peces, específicamente

salmónidos, y otras enfermedades virales con características particularmente parecidas. Cabe

mencionar que el trabajar con cultivo de células requieren de condiciones de laboratorio

especificas al igual que de equipo apto (esterilización y calibración). De igual manera, ambas

líneas celulares (RTG-2 y CHSE-214) mostraron ser aptas para la detección de IPNV.

Se usó el virus de referencia utilizado por el laboratorio, y de igual manera, se analizaron

“muestras ciegas” en las cuales se obtuvieron resultados positivos que contrastan lo observado en

el control positivo por lo cual indica que se está llevando un desequilibrio en las células ya que

IPNV induce muerte celular por represión del gen del factor de sobrevivencia Mcl-1 (moléculas

pro y antiapoptosis). Se sugiere que las proteínas virales podrían estar relacionadas de forma

directa o indirecta en este proceso; sin embargo, el mecanismo responsable aún no es claro. Al

parecer en la batalla virus-hospedero, la célula en un intento por contrarrestar al virus responde

induciendo apoptosis. En contraste, el virus trata de producir la mayor progenie posible

liberándola de la célula infectada a través de la lisis celular. Por tanto, el resultado de la infección

podría depender de la habilidad del hospedero para montar una respuesta apoptótica (Ortega y

Enríquez, 2007).

IPNV-Fluoro Test es un ensayo de inmunofluorescencia indirecta para la detección del

virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) en muestras de tejidos de peces así como en

líneas celulares infectadas con el patógeno. IPNV-Fluoro Test indirecto utiliza una mezcla de

anticuerpos monoclonales que son específicos para el virus IPN del serotipo Sp como VR-299.

Al agregar este reactivo a preparaciones de tejidos que contienen el patógeno, los anticuerpos

reaccionan con las proteínas VP2 y VP3 del IPNV. Después de una etapa de lavado para remover

el anticuerpo libre, la presencia del virus se detecta con un anticuerpo anti-IgG de ratón

conjugado con FITC y posterior observación en un microscopio de fluorescencia. La presencia de

virus se visualiza como una intensa fluorescencia verde en el citoplasma de las células infectadas

(OIE, 2006). En cuanto al desarrollo del protocolo para la detección de IPNV en México, este

proceso es único en el país e inclusive en Latinoamérica, ya que laboratorios similares solo

existen en Chile.

CONCLUSION

Durante la realización de este trabajo, se recalca que el proceso de laboratorio para el

diagnóstico de IPNV de acuerdo al protocolo recomendado por la OIE (2006) es bastante

complicado y tardado, pero sus resultados para la detección de enfermedades emergentes en

peces causadas por virus son inequívocos, por lo cual es de suma importancia realizar este tipo de

procedimientos para lograr llevar un sistema de control y prevención entre las granjas de trucha

arcoíris que existen en México. Su diagnóstico ayuda en el mejoramiento de los sistemas de

inocuidad dentro de las mismas granjas para exportar y vender productos de calidad. De igual

manera, sería deseable trabajar con muestras de animales sospechosos o en muestras de animales

supuestamente libres del virus como medida de confirmación.

Es importante señalar que no cualquier laboratorio está calificado para llevar a cabo este

tipo de diagnóstico, ya que se requieren de condiciones de laboratorio y conocimientos o

habilidades técnicas que mejoren la calidad del servicio brindado a la sociedad.

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