diagnóstico del dengue. rol del laboratorio de salud ... · 1er día 2do día 3er día 4to día...
TRANSCRIPT
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
Lic. TM. Nancy Susy Merino Sarmiento
Laboratorio Metaxénicas Virales INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
Diagnóstico del dengue.
Rol del Laboratorio de
Salud Pública en el Perú
Flavivirus: Virus del Dengue
Barros BE & Figueiredo. LTM, 2004
Virionextracelular
(maduro)
Virionintracelular(inmaduro)
Nucleocápside
M
Dímero E
E
prM
Barros VE & Figueiredo LTM, 2004
70nm
DENV 1, 2, 3 y 4
FlaviviridaeFlavivirus
ARN +
40-50 nm
El genoma codifica los genes estructurales y no estructurales.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Dengue: Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control, WHO/HTM/NTD/DEN/2009.1
Pruebas para muestras < = 5 días Virológicas: Aislamiento viral en línea C6-36.
Moleculares: RT-PCR convencional y en tiempo real.
ELISA Antígeno NS1
Secuenciación genética (genotipos).
Pruebas para muestras >= 6 días Serológicas: in house
ELISA IgM Tariki para dengue (Prod. por el INS)
ELISA IgG de captura para dengue (Infección secundaria).
ELISA IgG Indirecta (Infección pasada).
PRUEBAS DISPONIBLES EN EL PAIS
Ficha Clínica Tipo de muestra y Obtención de
muestras Transporte y conservación de M. Tipo de prueba
En vigilancia centinela: En pacientes ambulatorios: Dos centros En pacientes hospitalizados: Todo paciente hospitalizado, debe tener diagnóstico
- En brotes y/o epidemias: 30 a 50 sueros.
Método de
Diagnóstico Obtención de muestras
Muestra
Biológica Cantidad
Conservación
y Transporte
Tiempo de
resultado en el
Sistema NETLAB
Anticuerpos: IgM,
IgG
Sangre.- A pacientes con
tiempo de enfermedad
igual o mayor a 6 días. Suero 2 ml
Estéril. Enviar
en cadena de
frío 2 – 8 C 3 días.
Detección del
antígeno Ag NS1,
detección de ARN,
aislamiento viral y
tipificación de los
serotipos.
Sangre.- A pacientes con
un tiempo de enfermedad
igual o menor a 5 días.
(período virémico)
Suero 2 ml.
Estéril. Enviar
en cadena de
frío 2 – 8 C
3 días para PCR y
hasta 30 días para
aislamiento viral.
Tejido.- Realizar la
necropsia dentro las 24
horas de fallecimiento
(Tejido bazo, hígado y/o
riñón).
Tejido 2 cm3
Estéril. Enviar
sin
preservante y
en cadena de
frío 2 – 8 C
3 días para PCR y
hasta 30 días para
aislamiento viral.
Histopatología e
inmunohistoquímic
a.
Tejido.- Realizar la
necropsia dentro de las 24
horas de fallecimiento
(Tejido bazo, hígado y/o
riñón). Tejido 2cm3
Enviar en
formol al 10%
tamponado, en
un volumen 10
veces del
volumen de la
muestra, a
temperatura
ambiente.
3 días.
ELISA CAPTURA IgM
ELISA CAPTURA IgM: Infección reciente
PERSONAL DEL CNSP Y CNPB
CONTROL DE REACTIVIDAD: LAB. DE MET. VIRALES-CNSP
DESCRIPCION Valor IC (95%)
Sensibilidad (%) 98.67 96.50 100.00
Especificidad (%) 94.62 90.35 98.88
Índice de validez (%) 96.79 94.54 99.03
Valor predictivo + (%) 95.48 91.89 99.08
Valor predictivo - (%) 98.40 95.80 100.00
Resultados de Sen, Esp, IV, VPP, VPN eI Kappa
obtenidos mediante el programa Epidat.
GRUPOS NÚMERO
DIAS NÚMERO
MUESTRAS POSITIVOS %
A 1-2 44 6 13.64%
B 3-4 38 12 30.77%
C 5-6 23 12 47.83%
D 7-8 13 13 100%
E 9-10 7 7 100%
F 11- a más 12 12 100%
TOTAL 137 62
44% positividad en sueros de pacientes con < 5 días, porcentaje significativo como para considerar la necesidad de buscar anticuerpos IgM aun en este periodo de la enfermedad, dentro de la vigilancia del dengue.
ELISA CAPTURA IgG DENGUE
ELISA CAPTURA IgG: Infección
secundaria
ELISA INDIRECTA IgG: Infección
pasada
- ELISA de captura de IgG: INFECCIONES SECUNDARIAS.
- ELISA IgG Indirecta: DETECTA ANTICUERPOS DE MEMORIA.
Sensitivity and specificity of three ELISA-based assays for discriminating primary
from secondary acute dengue virus infection
Vanda Akico Ueda Fick de Souzaa, Adriana Fumie Tatenoa, Renato Reis Oliveiraa, Renan B.
Dominguesb, Evaldo Stanislau Araújoac, Gustavo W. Kusterb, Cláudio Sérgio Pannutia
OBJETIVO:
Evalúa tres métodos para discriminar infeccion primaria de secundaria basada en ELISA
(ELISA IgG captura, IgM/IgG ratio e IgG titer)
PRUEBA ELISA ANTIGENO NS1
• Detecta antígeno NS1
• Diagnostico temprano de dengue.
• Suero de 1-5 días
V. Kumarasamya, A.H. Abdul Wahaba, S.K. Chuab, Z. Hassana, Y.K. Chema, M. Mohamada and K.B. Chua. Evaluation of a commercial dengue NS1 antigen-capture ELISA for laboratory diagnosis of acute dengue
virus infection. Journal of Virological Methods Volume 140, Issues 1-2, March 2007, Pages 75-79
Sensibilidad 93%
Especificidad 98% ??????
Sensibilidad (97.3%) en inf. aguda primaria
Sensibilidad (70.0%) en inf. aguda segundaria
VPP 100%
VPN 97.3%.
100.00%
55.00%
84.00%
56.00%
37.04%
58.59%
0.00%
10.00%
20.00%
30.00%
40.00%
50.00%
60.00%
70.00%
80.00%
90.00%
100.00%
1er día 2do día 3er día 4to día 5to día TE ≤ 5días
Sensibilidad ELISA NS1
50.00%
100.00%
91.30% 88.89% 90.00% 91.55%
0.00%
10.00%
20.00%
30.00%
40.00%
50.00%
60.00%
70.00%
80.00%
90.00%
100.00%
1er día 2do día 3er día 4to día 5to día TE ≤ 5días
Especificidad ELISA NS1 Tiempo de enfermedad
Especificidad ELISA NS1
n
1er día 50.00% 4
2do día 100.00% 38
3er día 91.30% 48
4to día 88.89% 43
5to día 90.00% 37 TE ≤ 5días 91.55% 169
* Comparado con la seroconversión de ELISA IgG
Tiempo de enfermedad
Sensibilidad ELISA NS1
n
1er día 100.00% 4
2do día 55.00% 38
3er día 84.00% 48
4to día 56.00% 43
5to día 37.04% 37
TE ≤ 5días 58.59% 169 * Comparado con la seroconversión de ELISA IgG
Evaluación de pruebas rápidas de detección NS1Ag, IgM e IgG
PRUEBA DIAGNÓSTICA
AgNS1 AgNS1 + IgM/IgG
Estándar Diagnostic, INC®
Sensibilidad 40.6% (31.7-49.5) 73.4% (65.4-81.5)
Especificidad 95.1% (89.8-100) 91.5% (84.8-98.1)
Pan Bio®
Sensibilidad 42.1% (31.7-49.5) 74.2% (66.1-82.3)
Especificidad 95.1% (89.8-100) 79.2% (69.9-88.6)
Detección IgA Anti-dengue
•ASSURE® Dengue IgA Rapid
99.4 sensibilidad en I. primaria
99.2 sensibilidad en I. secundaria.
99.2 Especificidad.
. INS: Evalua la utilidad de ELISA
como alternativa del Dx. Fase crítica.
Cultivo celular
C6-36 (glándulas salivales
Aedes albopictus.
LINEA C6-36 NORMAL
LINEA C6-36 CON EFECTO CITOPATICO
Aislamiento del virus Dengue
•Inmunofluorescencia Indirecta
Acs. Monoclonales específicos tipo
RT- PCR
•Diagnóstico
•Vigilancia
•Epidemiología Molecular
•Estudios etiopatogenia
•Vacunas
RT PCR Dengue Multiplex
RT-PCR EN DENGUE
Sensibilidad: 98%
Especificidad: 98%
Detecta
Cuantifica carga viral
PCR EN TIEMPO REAL
Diagnóstico Inmunohistoquímico en
muestras fallecidos FHD/SCD
Células Kupffer Necrosis Focal
CASO CONFIRMADO
•Resultado Positivo por RT-PCR.
•Resultado Positivo de aislamiento viral.
•Resultado Positivo a antígeno NS1.
•Resultado Positivo de IgM en una sola muestra
•Evidencia de seroconversión en IgG en muestras
pareadas.
INTERPRETACION DE RESULTADOS DE
LABORATORIO PARA EL DIAGNOSTICO
DE DENGUE
PRUEBA RESULTADO INTERPRETACION OBSERVACION
ELISA NS1 1 -5 DIAS
POSITIVO CASO DE DENGUE (CON
CLINICA) inespecifico: Pac. Enf. Autoinmune.
NEGATIVO NO DESCARTA CASO SE SOLICITA SEGUNDA MUESTRA
RT- PCR 1 - 5 DIAS
POSITIVO CASO DE DENGUE (CON
CLINICA) Contaminación
NEGATIVO NO DESCARTA CASO SE SOLICITA SEGUNDA MUESTRA
ELISA IGM 6 -10 DIAS
POSITIVO CASO DE DENGUE (CON
CLINICA) inespecifico: Pac. Enf. Autoinmune,
lept. Malaria
NEGATIVO NO DESCARTA CASO SE SOLICITA SEGUNDA MUESTRA
ELISA IGG 1 -5 DIAS
POSITIVO INFECCION SECUNDARIA CON LA CLINICA Y PCR Y NS1
NEGATIVO INFECCION PRIMARIA
CUADRO DE RESULTADOS
Lab. Arbovirus-INS
Ingresar el
nombre de
usuario y
contraseña.
y hacer click en
“login”
REPORTE DE RESULTADOS POR INTERNET
(NET LAB)
RED DE LABORATORIOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE DENGUE
Puerto Maldonado
Tumbes
Cajamarca
Piura
Chiclayo
La Libertad
Huaraz
Huancayo
Lima**
Huancavelica
Ayacucho
Arequipa
Bagua
Tarapoto
Pucallpa
Iquitos
Cusco
Abancay
Puno
Tacna
1 LAB. DE REFERENCIA NACIONAL
24 LAB. DE REFERENCIA REGIONAL
ELISA (IgM y Ag.NS1)
RT-PCR
4 DISAS - LIMA
LABORATORIOS
REGIONALES
CONCORDANCIA
(%) 2010
CONCORDANCIA
(%) 2011
TUMBES 85 100
PIURA 100 70
LAMBAYEQUE 90 100
LA LIBERTAD 100 95
LIMA ESTE 95 95
LIMA CIUDAD 100 95
AMAZONAS-BAGUA 100 100
LORETO 100 100
UCAYALI 100 100
MADRE DE DIOS 90 100
JUNIN 90 100
SAN MARTIN 100 90
LABORATORIOS
EVALUADOR PRUEBA
% DE
CONCORDANCIA
INSTITUTO DE MEDICINA
TROPICAL -PEDRO KOURI -
CUBA
ELISA IgM DENGUE
100
ELISA IgG DENGUE 100
RT-PCR DENGUE EN IMPLEMENTACION
INSTITUTO DE
ENFERMEDADES VIRALES
HUMANAS - ARGENTINA ELISA IGM HANTA 100
INSTTUTO ROBERT KOSH-
ALEMANIS
ELISA IgM
F.AMARILLA 100
RT-PCR F.AMARILLA
100
CDC-COLORADO
ELISA IGM -CHIK 100
RT-PCR - CHIK 100
Diversidad
Genética
Mutación
Recombinación
Flujo genético
Hospederos susceptibles
Población reservorio de
monos?
Virus con amplio rango de
propiedades patogénicas?
Selección de cepas para
incrementar
transmisibilidad (alta
viremia) y virulencia?
Factores que contribuyen a la diversidad genética del virus dengue
y dos consecuencias evolutivas posibles (Holmes y Burch, 2000)
DENV-1, 5 genotipos (I, II, III, IV y V).
DENV-2, 5 genotipos (América, América/Asia, Asiático I, Asiático II y Selvático, el cual es exclusivo de primates no humanos).
DENV-3, 4 genotipos (I, II, III, IV); algunas clasificaciones incluyen el genotipo V.
DENV- 4, 4 genotipos (I, II, III y Selvático, también exclusivo de primates no humanos)
Genotipos del DENV-2
Leroy EM, Nkoghe D, Ollomo B, Nze-Nkogue C, Becquart P, Grard G, Pourrut X, et al. Concurrent
chikungunya and dengue virus infections during simultaneous outbreaks, Gabon, 2007. Emerg Infect Dis
Vol. 15, No. 4, April 2009. Disponible en: http://www.cdc.gov/EID/content/15/4/591.htm
GENOTIPO
SELVÁTICO
GENOTIPO
ASIA I
GENOTIPO
ASIA II
GENOTIPO
AMÉRICA/ASIA
GENOTIPO
AMÉRICA
GENOTIPO
COSMOPÓLITA
Cepa Asia P4-1407
Cepas Africanas
0,02
Cepas Asiáticas
Cepa Australiana Cepa Asiática
Cepa Libreville 2007
100
100
100
96
100
100 100
Las secuencias que obtuvimos se agrupan con el
genotipo América-África, siendo el primer serotipo
que reingreso al Perú en 1,990
Se mantiene la circulación del mismo genotipo
desde su ingreso en el año 1,990.
Aunque se han establecidos clados distintos que
tienen correlación con el tiempo y espacio, se
puede observar la circulación de tres linajes.
Las secuencias que obtuvimos hasta el presente corresponden a los genotipos América que ingresó a Perú en 1,995 y al genotipo América-Asia que ingreso en el 2,001. Se evidencia la relación del genotipo América Asia con la presencia de dengue grave.
Árbol filogenético obtenido para la cepa DENV-2 Perú/ 121776510/ 2010
mediante el método de Maximum Likelihood
Se generó un árbol filogenético considerando las secuencias obtenidas en el presente estudio y algunas secuencias reportadas por otros países. Las secuencias que obtuvimos corresponden al DENV-3 genotipo III o INDIA. Se observa que desde su ingreso a Perú, este genotipo presenta alta dispersión, formando linajes que se agrupan según los años y área geográfica, respectivamente. La presencia de este genotipo ha sido permanente a la fecha y esta relacionado con casos de DH.
Para el análisis también se consideraron secuencias reportadas al GENBANK por diferentes países a fin de establecer la distribución filogenética descritos por Rico-Hesse et. al. También se generó un árbol filogenético considerando las secuencias obtenidas en el presente estudio y algunas secuencias reportadas por otros países. Las secuencias que obtuvimos corresponden al DENV-4 genotipo II o INDONESIA.
Genotipos circulantes en Perú SEROTIPO GENOTIPO AÑO DE INGRESO PERÚ
DENV-1 AMERICA-AFRICA 1990
DENV-2 AMERICA 1995
AMERICA-ASIA 2001
DENV-3 INDIA 2001
DENV-4 INDONESIA 2001
Den 4
Den 3
Den 2
Den 1
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
100 110
90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 00 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11
Tasa de incidencia acumulada de dengue y serotipos. Perú 1990-2011*
Año
TIA
x 1
00
00
0
LINEAS DE INVESTIGACION EN DENGUE
• Prevalencia de serotipos en la población
• Identificación de genotipos
• Diseño y estandarización de nuevas herramientas
diagnosticas
• Implementación del diagnóstico diferencial
• Dinámica de transmisión del dengue en las diferentes
regiones.
• Evaluar e incorporar la IgA anti-dengue en suero saliva y
orina y comparar con la IgM.
• Aplicar la relación entre IgM/IgG específica para la proteína
E/M del virus del dengue para distinguir las infecciones
primarias de las secundarias.
• Vigilancia de virus en vectores.
Laboratorio de Microbiología y Biomedicina
Chorrillos, Lima
Investigar para proteger la salud
PREMIO A LA CREATIVIDAD EMPRESARIAL
Marco
Miguel Dina
Tomas Enrique
Susy Paquita Dana Noelia
MIEMBROS DEL LABORATORIO DE
METAXENICAS VIRALES