DIAGNOSTYKA W MIKROBIOLOGII

ŻYWNOŚCI

PRZEWODNIK DO ĆWICZEŃ DLA STUDENTÓW II ROKU

KIERUNKU MIKROBIOLOGIA

(opracowanie: dr inż. Wioleta Chajęcka-Wierzchowska)

KATEDRA MIKROBIOLOGII PRZEMYSŁOWEJ I ŻYWNOŚCI

WYDZIAŁ NAUKI O ŻYWNOŚCI

OLSZTYN 2017

DIAGNOSTYKA W MIKROBIOLOGII ŻYWNOŚCI

KIERUNEK: MIKROBIOLOGIA ROK AKADEMICKI 2017/2018

ĆWICZENIE 1 31.10.2017r. wt. Zasady organizacji laboratorium mikrobiologicznego.

1. Zasady pracy w laboratorium mikrobiologicznym – fartuchy, obuwie, układ sali 2. Sylabus 3. Harmonogram ćwiczeń 4. Zakres kolokwium I:

Mikroflora mleka i przetworów mleczarskich (mleko surowe, mleko pasteryzowane, UHT, mleko w proszku, sery, masło, śmietana)

Rutynowe kierunki badan mikrobiologicznych mleka i produktów mlecznych

Mikroflora mięsa i przetworów mięsnych (mięso świeże, mięso mielone, przetwory: kiełbasy, w ty dojrzewające, wędliny, wyroby garmażeryjne)

Kierunki badań mikrobiologicznych mięsa i przetworów mięsnych.

Przetwory owocowe, warzywne i owocowo-warzywne (konserwy) – mikroflora, kierunki badań mikrobiologicznych

Piwo, słód, drożdże piekarskie – zanieczyszczenia mikrobiologiczne, metody badań.

5. Normy ISO, Rozporządzenie 2073

ĆWICZENIE 2 02.11.2017r. – czw. godziny rektorskie

Kryteria bezpieczeństwa żywności.

1. Pobieranie próbek do badań

Pierwszym etapem analizy mikrobiologicznej żywności jest pobranie i przygotowanie

próbki do badań. Niewłaściwe pobranie próbki może prowadzić do uzyskania wyników

fałszywie ujemnych bądź fałszywie dodatnich. Gdy mówimy o pobieraniu próbek, często

używa się terminu „próbka reprezentatywna”. Próbka powinna odzwierciedlać obraz

produktu, z którego pochodzi w sposób tak precyzyjny jak tylko jest to możliwe. Z produktów

płynnych np. mleka dość łatwo jest pobrać próbkę reprezentatywną, jeśli mleko zostało

wystarczająco wymieszane przed pobraniem próbki. Natomiast gdy jest badany produkt o

dużej lepkości, z powolnym przepływem lub o niejednorodnej strukturze wówczas

niezmiernie trudno jest ocenić jakość mikrobiologiczną całej partii (np. beczki lub ładunku

samochodu) przez zbadanie tylko jednej 25 gramowej próbki. Odpowiedź na pytanie

dotyczące wymaganej ilości próbek jednostkowych jest niezmiernie trudna. Z uwagi na

wysokie koszty badań mikrobiologicznych, liczba próbek z reguły jest ograniczona. Do

pobierania próbek w laboratorium mikrobiologicznym używa się sterylnych narzędzi np.

łyżeczek, skalpeli, noży, szpatułek, pipet. Produkty które są zamrożone najpierw należy

odmrozić w temperaturze poniżej 5°C ( nie dłużej niż 12 godzin). Jeśli próby są głęboko

mrożone do poboru stosuje się jałowe świdry.

Oznaczanie Salmonella sp. w produktach żywnościowych zawsze polega na wykryciu

obecności tych pałeczek w określonej ilości produktu (z reguły jest to 25g/ ml, bardzo rzadko

10g/ml), nie oznacza się natomiast liczby tych drobnoustrojów w żywności. Zarówno w

metodzie klasycznej jak i jej modyfikacjach pierwszym etapem oznaczenia jest etap

nieselektywnego namnażania. Jest on niezmiernie ważny ponieważ produkcja żywności wiąże

się z jej obróbką technologiczną np. ogrzewaniem co może spowodować śmierć większości

komórek lub ich subletalne uszkodzenie. Pominięcie etapu przednamnażania próbki i posiew

materiału bezpośrednio na podłoże stałe może dać wyniki fałszywie negatywne. Jeżeli w

badanym materiale jest bardzo mała liczba żywych komórek, bądź komórki zostały

subletalnie uszkodzone podczas procesów technologicznych, możemy nie otrzymać

widocznych makroskopowo koloni na podłożu stałym. W takim wypadku istnieje

niebezpieczeństwo dopuszczenia produktu do obrotu, mimo, że nie spełnia on kryteriów

bezpieczeństwa. Podczas przechowywania takiego produktu może nastąpić odbudowa

uszkodzonych komórek i namnożenie bakterii do poziomu niebezpiecznego dla konsumenta.

2. Klasyczna metoda oznaczania pałeczek Salmonella w żywności

Wykrywanie obecności pałeczek Salmonella zgodnie z Rozporządzeniem Komisji

Europejskiej 2073/2005 przeprowadza się zgodnie z normą ISO 6579 2003. Rozporządzenie

wskazuje, że wykrywanie obecności pałeczek Salmonella w żywności powinno być

przeprowadzane dla takich produktów jak: surowe mięso, produkty mięsne przeznaczone

do spożycia na surowo, żelatyna, sery, masło, śmietana, niepasteryzowane mleko, mleko

w proszku, jaja i produkty zawierające surowe jaja, skorupiaki, mięczaki, owoce i warzywa,

soki niepasteryzowane, preparaty w proszku dla niemowląt i żywność dietetyczna specjalnego

przeznaczenia medycznego. Norma ISO 6579 2003, obejmuje cztery etapy oznaczeń

i w zależności od konieczności potwierdzeń trwa od 5 do 7 dni:

1. Przednamnażania w nieselektywnej pożywce płynnej

2. Namnażanie selektywne w pożywkach płynnych

3. Różnicowanie na pożywkach stałych

4. Badania potwierdzające (biochemiczne i serologiczne)

Rys. 1 Schemat postępowania przy oznaczaniu pałeczek Salmonella w żywności wg ISO 6579.

W pierwszym etapie, w celu namnożenia i regeneracji komórek uszkodzonych

prowadzi się hodowlę na płynnej wodzie peptonowej w temperaturze 37°C przez 18±2godz.

Zbuforowana woda peptonowa stosowana jest w celu nieselektywnego namnażania

pałeczek Salmonella sp. Dla takich produktów jak kakao czy wyroby z czekolady stosuje się

wodę peptonową z dodatkiem kazeiny lub odtłuszczonego mleka oraz zieleni brylantowej

w celu zahamowania wzrostu bakterii Gram-dodatnich. Dla produktów żywnościowych

kwaśnych i ukwaszonych powinno się stosować wodę peptonowa o podwójnym stężeniu

składników, natomiast dla mięsa i żywności o wysokiej zawartości tłuszczów

przednamnażanie należy prowadzić w bulionie laktozowym z dodatkiem Triton X-100.

Z hodowli po etapie przednamnażania nieselektywnego pobiera się 0,1cm3 i posiewa

do 10cm3 pożywki selektywnej Rapaport-Vassiliadis z soją oraz do pożywki MKTTn w ilości

1 cm3. Pożywka Rappaport-Vassiliadis (RVS) jest płynna, silnie selektywna, zawiera

w swoim składzie zieleń malachitową i chlorek sodu (hamujące wzrost mikroflory

towarzyszącej). Pepton sojowy, pH 5,2 i podwyższona temperatura inkubacji (41,5°C)

sprzyjają wzrostowi szczepów Salmonella. sp Podłoże ma barwę ciemnoniebieską i jest

klarowne. Szczepy Salmonella sp. rosną na tym podłożu w postaci mlecznego osadu, barwa

samego podłoża nie ulega zmianie. Druga pożywka selektywna: Müllera-Kauffmana

(KKTTn), zawiera w swoim składzie tiosiarczan sodu i jodek potasu, które reagując tworzą

związek o nazwie tetrationian sodu hamujący wzrost pałeczek grupy coli. Pałeczki

Salmonella sp. mają zdolność do redukcji tego związku. W podłożu znajduje się także zieleń

brylantowa, która z kolei hamuje wzrost bakterii Gram-dodatnich.

Po inkubacji w temperaturze 37°C przez 48±3godz. hodowle posiewa się izolacyjnie

na dwie pożywki selektywne, w sposób umożliwiający otrzymanie pojedynczych kolonii.

Pierwszą z nich jest pożywka XLD (xylose lysine deoxycholate agar). Druga pozostaje do

wyboru przez laboratorium i może to być podłoże BGA (brillant green agar), Hektoen lub

Wilson-Blaira. Pożywka XLD (wg EN-ISO 6579 agar z ksylozą, lizyną i dezoksycholanem)

zawiera laktozę, ksylozę, sacharozę, L-lizynę, tiosiarczan sodu, deoksycholan sodu, cytrynian

amonowo-żelazowy (III), czerwień fenolową. Czynnikami różnicującymi pożywki są:

laktoza, sacharoza, ksyloza, lizyna oraz tiosiarczan sodu, z którego uwalniany jest

siarkowodór, tworzący w reakcji z solami żelaza (III) czarny osad siarczku żelaza w środku

kolonii. Wskaźnikiem pH jest czerwień fenolowa. Pożywka pozwala określić zdolność do

fermentacji cukrów. Inkubacja w temp. 37ºC przez 24±3 godz. Typowe kolonie mogą być

bezbarwne, bardzo jasne, lekko błyszczące i przezroczyste (kolor podłoża) z czarno

zabarwionym środkiem, otoczone jasnoczerwoną strefą i z żółtym brzegiem lub mieć

zabarwienie od różowego do czerwonego, z czarnym środkiem lub bez czarnego środka.

Szczepy Salmonella H2S-ujemne (np. S. Paratyphi A) są bezbarwne lub jasnoróżowe z

ciemniejszymi środkami. Szczepy Salmonella laktozo-dodatnie rosną na pożywce XLD w

postaci kolonii żółtych z charakterystycznym zaczernieniem lub bez takiego zaczernienia.

Podłoże BGA. Czynnikami różnicującymi podłoża są cukry: sacharoza i laktoza. Czynnikiem

selektywnym jest zieleń brylantowa Typowe kolonie są przezroczyste, bezbarwne lub lekko

różowe, a barwa wokół kolonii zmieniona z różowej na jasnoczerwoną.

Podłoże Hektoena. Czynnikiem selektywnym są sole żółci, hamujące wzrost bakterii Gram

(+). Czynnikami różnicującymi są trzy cukry: laktoza, sacharoza oraz salicyna. Podwyższona

zawartość laktozy nie pozwala na pominięcie bakterii fermentujących ten cukier z

opóźnieniem. Kolonie bakterii tworzących siarkowodór mają czarny środek wskutek reakcji

siarkowodoru z żelazem (III). Typowe kolonie pałeczek Salmonella sp. są barwy zielonej z

lub bez czarnego środka.

Podłoże Wilson-Blaira. Jest to podłoże silnie wybiórcze i różnicujące dla pałeczek

Salmonella, w tym S. Typhi izolowanych z żywności. Pałeczki Salmonella spp. w zależności

od szczepu rosną w postaci czarnych kolonii otoczonych strefą czarnego podłoża lub

ciemnobrązowych i brązowych bez strefy. Cechą charakterystyczną dla kolonii Salmonella

spp. jest metaliczna, połyskująca powierzchnia jako wynik produkcji siarkowodoru,

tworzącego metaliczno-czarny osad w reakcji z jonami żelaza. Wzrost bakterii Gram-

dodatnich i innych Enterobacteriaceae w tym Shigella spp. jest silnie hamowany przez

obecną w podłożu zieleń brylantową i siarczyn bizmutu.

Podłoże chromogenne Rambach-agar – z deoksycholanem sodu, glikolem propylenowym

i mieszanina chromogenną. Kolonie Salmonella sp. są barwy czerwonej w wyniku fermentacji

glikolu; bakterie laktozododatnie z grupy coli, dzięki działaniu galaktozydazy niszczą

wiązanie między składnikami mieszaniny chromogennej, a uwalniający się chromofor daje

niebiesko-fioletowe lub niebiesko-zielone zabarwienie ich kolonii. Salmonella Typhi i

Salmonella Paratyphi tworzą na tym podłoży kolonie bezbarwne lub żółtawe.

Po 48godz. inkubacji w 37°C dokonuje się wstępnej identyfikacji na podstawie wyglądu

kolonii wyrosłych na podłożach selektywnych. Z każdej płytki wybiera się 5

charakterystycznych kolonii i posiewa izolacyjnie na podłoże agar odżywczy, a następnie

wykonuje się badania biochemiczne. W celu wykonania powyższych badań stosuje się testy

biochemiczne wykonywane na następujących podłożach:

Agar trójcukrowy z żelazem - podłoże TSI (Triple-sugar iron agar) z laktozą, sacharozą,

glukozą, siarczanem żelaza III i czerwienią fenolową (wskaźnik zmiany barwy), na

podłożu ocenia się zdolność do fermentacji cukrów (glukoza, laktoza, sacharoza) i

tworzenia H2S oraz gazu

Agar z mocznikiem wg Christiensena (wytwarzanie ureazy) – podłoże zawiera

ekstrakt drożdżowy, KH2PO4, Na2HPO4, mocznik, czerwień fenolową. Jeżeli po 24godz.

hodowli nastąpiła zmiana barwy na amarantowy świadczy to o rozkładzie mocznika

(obecność NH4OH)

podłoże z lizyną (dekarboksylacja lizyny) w pożywce znajduje się także ekstrakt

drożdżowy, glukoza i purpura bromokrezolową. Po zaszczepieniu podłoża, posiew należy

zalać parafiną, po czym wstawić do inkubacji. Zawsze wykonujemy próbę kontrolną.

Drobnoustroje podczas wzrostu zużywają glukozę, zakwaszając podłoże (zmiana barwy

na żółtą), następnie zachodzi rozkład aminokwasów powodujący wtórną alkalizację i

powrót do barwy fioletowej, podczas gdy próba kontrolna jest barwy żółtej.

podłoże Clarka (reakcja Vogues-Proskauera-VP ora MR) podłoże zawiera glukozę i

pepton. Celem wykonania próby VP i MR posiew wykonuje się do dwóch probówek z

podłożem Clarka. Probówki na próbę VP inkubuje się 48 h, a probówki na próbę

MR 72 h w temperaturze 37°C.

podłoże peptonowe z tryptofanem (wytwarzanie indolu) – zdolność do rozkładu

aminokwasu aromatycznego: tryptofanu- po zaszczepieniu i inkubacji należy zbadać

obecność indolu za pomocą odczynnika Kovacsa. Powstanie czerwonej obrączki świadczy

o obecności indolu.

wykrywanie β-galaktozydazy - służy do tego test krążkowy nasączony ONPG, który w

obecności ß-galaktozydazy ulega rozszczepieniu do związku o barwie żółtej. Test

wykonuje się w probówce zawierającej 0,1 cm3

sterylnej wody, którą zaszczepia się

odrobiną hodowli, a następnie umieszcza się tam krążek testowy i poddaje inkubacji. ß-

galaktozydaza jest enzymem odpowiedzialnym za rozkład laktozy do glukozy i galaktozy.

Interpretacja wyników biochemicznych:

TSI

słupek

- barwa żółta – fermentacja glukozy,

- barwa czerwona lub niezmieniona – brak fermentacji glukozy,

- barwa czarna – wytworzenie siarkowodoru (powstały w hodowli siarkowodór reaguje z

jonami Fe2+

dając siarczek żelaza, który zaczernia podłoże,

- pęcherzyki gazu lub rozerwanie słupka – wytworzenie gazu z glukozy.

skos

- barwa żółta – fermentacja laktozy i/lub sacharozy,

- barwa czerwona lub niezmieniona – brak fermentacji laktozy i/lub sacharozy

A B C D E Laktoza/sacharoza (-)

Glukoza (-)

H2S (-)

Gaz (-)

Kontrola Laktoza/sacharoza (-)

Glukoza (+)

H2S (-)

Gaz (-)

Laktoza/sacharoza (+)

Glukoza (+)

H2S (-)

Gaz (+)

Laktoza/sacharoza (-)

Glukoza (+)

H2S (+)

Gaz (-)

Posiewając na podłoże TSI nie należy wkłuwać igły do dna probówki, ponieważ

w przypadku reakcji dodatniej na siarkowodór (zaczernienie) utrudniony będzie odczyt

fermentacji laktozy i sacharozy.

Tabela. 1. Wyniki posiewów wybranych pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae

na podłoże TSI.

podłoże wg Christensena; zmiana barwy pożywki na różowoczerwony lub amarantowy

kolor świadczy o rozkładzie mocznika z uwolnieniem amoniaku,

podłoże z lizyną, zmętnienie i purpurowe zabarwienie pożywki świadczy

o dekarboksylacji lizyny – wynik dodatni,

podłoże Clarka:

próba VP, po inkubacji dodać do hodowli po 2 krople roztworu kreatyny i KOH oraz 3

krople etanolowego roztworu α-naftolu. Wytworzenie różowego lub jasnoczerwonego

zabarwienia pożywki w ciągu 15 min. w temp. pokojowej wskazuje wynik dodatni –

obecność acetoiny, która w środowisku alkalicznym, w obecności keratyny, przy dostępie

tlenu, utlenia się do diacetylu. Diacetyl w obecności α-naftolu reaguje z guanina zawarta

w peptonie , dając czerwone zabarwienie świadczące o próbie dodatniej VP.

próba MR, po inkubacji dodać kroplę czerwieni metylowej. Czerwone zabarwienie na

powierzchni świadczy o wyniku dodatnim

podłoże z tryptofanem, po inkubacji dodać 1 cm3 odczynnika Kovacsa; powstanie

czerwonej obrączki świadczy o obecności indolu,

3. Testy API 20E

Do określenia cech biochemicznych pałeczek Salmonella można także zastosować

gotowe testy biochemiczne API 20E (Biomerieux) służące do identyfikacji bakterii z rodziny

Enterobacteriaceae.

Rys. 1. Wynik testu API 20E pozytywnego dla pałeczek Salmonella.

Paski API 20 E składają się z 20 mikroprobówek zawierających odwodnione substraty.

Integralną częścią testu API 20 E jest też test na oksydazę. Substraty zostają uwodnione

poprzez dodanie zawiesiny bakterii. Uwodnione substraty stanowią również podłoża do

hodowli bakterii. Procesy metaboliczne zachodzące podczas inkubacji powodują zmiany

koloru, które są albo spontaniczne, albo wywołane przez dodanie odczynników. Lista testów

znajdujących się na paskach API 20 E:

ONPG – test na zdolność rozkładu laktozy. Proces rozkładu laktozy wymaga kilku

enzymów, w tym β-galaktozydazy. W teście ONPG używa się molekularnego wskaźnika:

orto-nitrofenylo-β-D-Galaktopiranozydu, który w przypadku obecności β-galaktozydazy

spowoduje pojawienie się żółtego zabarwienia.

ADH, LCD, ODC - testy badające zdolność do dekarboksylacji aminokwasów (lizyny,

ornityny, argininy) w warunkach beztlenowych z wytworzeniem amin biogennych.

Bakterie hoduje się na pożywkach zawierających badany aminokwas jako substrat, oraz

barwnik wskazujący zmiany pH pożywki. Podczas hodowli drobnoustroje wykorzystują

najpierw glukozę – bardziej przyswajalne źródło węgla, a po jej zużytkowaniu, jeżeli

wytwarzają odpowiednią dekarboksylazę, rozkładają aminokwasy. Wykorzystanie

glukozy powoduje zakwaszenie hodowli i podłoże przyjmuje zabarwienie żółte, zaś

wtórna alkalizacja środowiska w wyniku dekarboksylacji aminokwasu powoduje zmianę

barwy na pomarańczowo-czerwoną. Podobny mechanizm zachodzi w przypadku testu na

dihydrolazę argininy (ADH).

CIT – test na wykorzystanie cytrynianu. Na podłożu z cytrynianem trisodowym, wyrastają

bakterie zdolne do wykorzystania tego związku jako jedynego źródła węgla oraz jako

źródła azotu – jonu amonowego. Źródłem tego jonu w podłożu jest fosforan amonowy.

Drobnoustroje poprzez uwalnianie amoniaku z fosforanu amonowego alkalizują

środowisko, co w obecności wskaźnika – błękitu btomotymolowego prowadzi do zmiany

barwy podłoża na niebieską.

H2S – wytwarzanie siarkowodoru. H2S powstaje w wyniku rozkładu aminokwasów

siarkowych. Enzym, który warunkuje ten proces – sulfhydraza, hydrolizuje wiązania

chemiczne pomiędzy grupą sulfhydrolową (- SH) a resztą aminokwasu. Uwolniona grupa

–SH zostaje zredukowana do H2S środowisku wzrostu bakterii. Wydzielany H2S

wykrywa się poprzez jego reakcję z octanem ołowiu, podczas której wydziela się siarczek

ołowiu o czarnym zabarwieniu.

URE – hydroliza mocznika. Mocznik jest rozkładany przez bakterie syntetyzujące ureazę.

Produktami końcowymi tego rozkładu są NH3 i CO2. Właściwości te u bakterii badamy

na podłożu zawierającym mocznik jako jedyne źródło azotu oraz indykator – czerwień

krezolową.

TDA – wytwarzanie amoniaku. Amoniak powstaje podczas deaminacji aminokwasów.

Amoniak wykrywa się poprzez reakcję barwną z indykatorem dodanym do pożywki np. z

odczynnikiem Nesslera (odczynnik jodowo-rtęciowy) tworzy on brunatne zabarwienie.

IND – rozkład tryptofanu – próba na indol. Bakterie syntetyzujące enzym tryptofanazę

rozkładają tryptofan z wytworzeniem indolu. Obecność indolu sprawdzamy traktując

kulturę specjalnym odczynnikiem wywołującym reakcję barwną.

VP – próba Voges-Proskauera, służy do identyfikacji bakterii z rodziny

Enterobacteriaceae, które prowadzą rozkład glukozy z wytwarzaniem wielu produktów

pośrednich i końcowych: kwasów organicznych, etanolu, gazów CO2 i H2, a także

acetoiny (produkt kondensacji dwóch cząsteczek kwasu pirogronowego) oraz 2,3

butandiolu. Produkty te są wytwarzane w różnych zestawieniach jakościowych i

ilościowych u różnych gatunków bakterii (np. u E. coli kwasy organiczne są głównymi

produktami a 2,3 butandiol wytwarzany jest w niewielkiej ilości. Obecność acetoiny

(prekursor 2,3 butandiolu) w próbce decyduje o pozytywnej reakcji VP. Acetoinę

wykrywa się poprzez dodanie alkoholowego roztworu α-naftolu, stężonego KOH i

kreatyny, co w efekcie daje czerwone zabarwienie.

GEL – upłynnianie żelatyny. Bakterie wytwarzające enzym żelatynazę hydrolizują

żelatynę z wytworzeniem rozpuszczalnych w wodzie peptydów. Upłynniona żelatyna nie

krzepnie w temperaturze pokojowej.

GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY, ARA – testy do badania zdolności

drobnoustrojów do rozkładania węglowodorów (glukozy, mannozy, inozytolu, sorbitolu,

ramnozy, sacharozy, melibiozy, amigdaliny, arabinozy). W podłoży stosuje się

dodatkowe wskaźniki powodujące zmianę zabarwienia pod wpływem produktów

rozkładu węglowodorów.

OX – test na oksydazę. Oksydaza cytochromowa jest enzymem końcowym układu

oddechowego bakterii tlenowych i przenosi elektrony na tlen atmosferyczny z

wytwarzaniem H2O. Test ten pozwala na różnicowanie bakterii na tlenowe i beztlenowe.

Obecność oksydazy w bakteriach wykrywamy za pomocą odczynnika ‘NADI’

(chlorowodorek dimetylo-p-fenylodoaminy i α-naftolu). Powstanie fioletowego

zabarwienia świadczy o dodatniej próbie.

Testy przeprowadza się na organizmach wyizolowanych bezpośrednio z badanych prób.

Poszczególne etapy obejmują:

1. Przygotowanie komory inkubacyjnej (pokrywki i podstawki) - na podstawkę nanieść

ok. 5 ml wody destylowanej, w celu zapewnienia odpowiedniej wilgotności podczas

inkubacji

2. Wyjąć pasek z opakowania i umieścić w komorze inkubacyjnej

3. Przygotować jednorodną zawiesinę bakterii poprzez pobranie pipetą pojedynczej

kolonii i dodanie jej do probówki zawierającej 5 ml soli fizjologicznej

4. Przy pomocy tej samej pipety napełnić zawiesiną bakteryjną probówki na pasku

(unikając tworzenia się pęcherzyków przy podstawie probówki, przechylając nieco

pasek i umieszczając końcówkę pipety naprzeciw zagłębienia)dla testów CIT, VP i

GEL napełnić zarówno probówkę jak i wgłębienie mikroprobówkidla innych testów

napełnić jedynie probówkę (bez wgłębień)

5. Dla testów ADH, LCD, ODC, H2S i URE wytworzyć warunki beztlenowe poprzez

naniesienie oleju mineralnego

6. Zamknąć komorę i inkubować w 36oC przez 18-24 h

Jeśli 3 lub więcej testów (test GLU + lub -) jest pozytywnych zanotować wyniki

wszystkich reakcji spontanicznych na karcie wyników a następnie odczytać testy wymagające

dodania odczynników.

W przypadku niektórych testów wymagane jest dodanie przed odczytem odpowiednich

odczynników:

TDA: dodać 1 kroplę odczynnika TDA (chlorek żelaza). Czerwono-brązowy kolor wskazuje

na reakcję pozytywną co należy wpisać do karty wyników

VP: dodać po 1 kropli z każdego odczynnika VP1 (α-naftol) i VP2 (KOH). Odczekać

przynajmniej 10 min; różowy lub czerwony kolor wskazuje na reakcję pozytywną; jeśli po 10

min pojawi się blado różowy kolor, reakcję należy uznać za negatywną

IND: dodać 1 kroplę odczynnika JAMES; różowy kolor powstający w całej probówce

wskazuje na reakcję pozytywną

Test INDOL należy wykonać na końcu, ponieważ w trakcie jego wykonania dochodzi do

wytwarzania produktów gazowych, które wpływają na interpretację innych wyników na

pasku. Plastikowa pokrywka inkubacyjna nie powinna być podnoszona po dodaniu

odczynnika.

W celu wykonania testu na oxydazę (OX) kroplę odczynnika (oksydazy) zakroplić

bezpośrednio na kolonię na płytce Petriego; w przypadku pozytywnej reakcji nastąpi zmiana

koloru na różowy w ciągu 1 minuty, następnie na niebieski i czarny; w przypadku reakcji

negatywnej nie nastąpi zmiana zabarwienia kolonii.

Identyfikację bakterii uzyskuje się używając bazy danych z Książki Kodowej, poprzez

odszukanie właściwego profilu numerycznego, lub przy pomocy oprogramowania

komputerowego apiwebTM

.

Rys. 2. Negatywne wyniki testów API 20E

Rys. 3. Pozytywne wyniki testów API 20E

TEST Aktywne składniki Stężenie

mg

/probówk

a

Reakcje/Enzymy Wynik negatywny Wynik pozytywny

ONPG 2-nitrofenylo-βD-

galaktopiranozyd

0,223 β-galaktozydaza (orto nitrofenylo βD-

Galaktopiranozyd)

bezbarwny żółty (1)

ADH L-arginina 1,9 dihydrolaza argininy żółty czerwony / pomarańczowy (2)

LDC L-lizyna 1,9 dekarboksylaza lizyny żółty czerwono /pomarańczowy (2)

ODC L-ornityna 1,9 dekarboksylaza ornityny żółty czerwono-pomarańczowy (2)

CIT cytrynian trisodowy 0,756 wykorzystanie cytrynianu jasno szary /żółty niebiesko-zielony/niebieski (3)

H2S Tiosiarczan sodowy 0,075 wytwarzanie H2S bezbarwny / szarawy czarny osad/ rozpłynięta linia

URE Mocznik 0,76 ureaza żółty czerwono-pomarańczowy (2)

TDA L-tryptofan 0,38 dezaminaza tryptofanu TDA/żółty natychmiast,czerwono-brązowy

IND L-tryptofan 0,19 wytwarzanie indolu JAMES/bezbarwny

jasno zielony/ żółty

natychmiast, różowy

VP pirogronian sodu 1,9 wytwarzanie acetoniny (VP) VP1 + VP2/bezbarwny 10 minut różowy/czerwony (5)

GEL Żelatyna (wołowa) 0,6 żelatynaza brak dyfuzji dyfuzja czarnego pigmentu

GLU D-glukoza 1,9 fermentacja/utlenianie (glukoza) (4) niebieski/niebiesku-zielony żółty/szaro-żółty

MAN D-mannitol 1,9 fermentacja/utlenianie (mannitol) (4) niebieski/niebiesku-zielony żółty

INO Inozytol 1,9 fermentacja/utlenianie (inoytol) (4) niebieski/niebiesku-zielony żółty

SOR D-sorbitol 1,9 fermentacja/utlenianie (sorbitol) (4) niebieski/niebiesku-zielony żółty

RHA L-ramnoza 1,9 fermentacja/utlenianie (ramnoza) (4) niebieski/niebiesku-zielony żółty

SAC D sacharoza 1,9 fermentacja/utlenianie (sacharoza) (4) niebieski/niebiesku-zielony żółty

MEL D-melibioza 1,9 fermentacja/utlenianie (melibioza) (4) niebieski/niebiesku-zielony żółty

AMY Amigdalina 0,57 fermentacja/utlenianie (amigdalina) (4) niebieski/niebiesku-zielony żółty

ARA L-arabinoza 1,9 fermentacja/utlenianie (arabinoza) (4) niebieski/niebiesku-zielony żółty

OX Oksydaza oksydaza bezbarwny/żółty fioletowy

(1) Nawet bardzo blady żółty kolor należy uznać za reakcję pozytywną. (2) Pomarańczowy kolor po 36-48 h inkubacji należy uznać za negatywny. (3) Odczytu dokonać we

wgłębieniu (warunki tlenowe). (4) Fermentacja zachodzi w najniższej części probówki, utlenianie we wgłębnej. (5) Słabo różowy kolor po 10 minutach należy uznać za

negatywny.

Tabela 2. Tabela odczytu testu API 20 E (w oparciu o ulotkę informacyjną API 20E)

W przypadkach wątpliwych prowadzi się testy dodatkowe:

Redukcja azotanów do azotynów (NO2) i gazowego azotu (N2): dodać po 1 kropli z

każdego odczynnika NIT 1 i NIT 2 do probówki GLU. Odczekać 2-5 minut. Czerwony

kolor wskazuje na reakcję pozytywną (NO2); reakcja negatywna (żółty) może być

spowodowana redukcją do azotu (co czasami jest uwidaczniane przez pęcherzyki gazu); w

celu weryfikacji należy dodać 2-3 mg odczynnika Zn do probówki GLU; po 5 min jeśli

probówka pozostaje żółta wskazuje to na reakcję pozytywną (N2), co należy zanotować w

karcie wyników; jeżeli pojawia się kolor pomarańczowo-czerwony jest to wynik

negatywny: azotany nadal występujące w probówce zostały zredukowane przez cynk.

Serotypowanie Salmonella

Dla szczepów bakterii, które na podstawie cech biochemicznych zostały

zakwalifikowane do rodzaju Salmonella przeprowadza się testy serologiczne w celu wykrycia

obecności antygenów somatycznych O, otoczkowych Vi i rzęskowych H. Badania wykonuje

się metoda aglutynacji szkiełkowej na podstawie schematu antygenowego Kauffmanna-

White’a. Do oznaczania antygenów somatycznych powinno się stosować surowice

poliwalentne i monowalentne, natomiast do wykrywania obecności antygenu Vi i H –

surowice anty-Vi i anty – H. Oznaczenie antygenów rzęskowych umożliwia określenie typu

serologicznego badanych bakterii.

Alternatywne metody oznaczania obecności Salmonella w żywności

PCR – łańcuchowa reakcja polimerazy (polimerase chain reaction) – to enzymatyczna

reakcja powielania cząsteczki DNA. Warunkiem krytycznym przebiegu PCR jest obecność

enzymu, termostabilnej polimerazy DNA. Substratami reakcji są deoksyrybonukleotydy

(cegiełki budujące nowo syntetyzowane cząsteczki DNA) oraz oligonukleotydy (startery),

które komplementarnie przyłączają się do powielanej nici DNA. Reakcja łańcuchowa

polimerazy jest procesem termicznym, z cyklicznie zmieniającymi się temperaturami. Na

jeden cykl prowadzący do syntezy jednej kopii DNA z jednej cząsteczki matrycowej składają

się etapy: denaturacji DNA (90-95°C), przyłączenia starterów (tzw. annealingu, 50-65°C) i

wydłużania nici. Reakcja w warunkach laboratoryjnych przeprowadzana jest w urządzaniu

zwanym termocyklerem. Zazwyczaj w jednej reakcji PCR przeprowadza się 35-40 cykli,

których rezultatem jest powstanie kilku miliardów kopii pojedynczej cząsteczki DNA (w

każdym cyklu ilość produktu przyrasta logarytmicznie).

REAL-TIME PCR Ulepszeniem klasycznej metody PCR jest real-time PCR, czyli reakcja

PCR obserwowana w czasie rzeczywistym. Termocykler realtime PCR posiada system

optyczny, który cykl po cyklu zbiera informacje o przebiegu reakcji. Dodatkowym

składnikiem reakcji real-time PCR są sondy TaqMan® wyznakowane barwnikami

fluorescencyjnymi. Sonda to oligonukleotyd zaprojektowany tak, aby wiązał się wysoce

specyficznie z powielanym fragmentem DNA, a więc – w przypadku omawianego

zastosowania w mikrobiologii żywności – „wykrywał” charakterystyczną dla szukanego

patogenu sekwencję. Sonda powinna wiązać się specyficznie i silnie, co mogą zapewnić jej

specjalne cząsteczki białkowe (cząsteczka MGB w sondach TaqMan® Applied Biosystems).

Polimeraza, syntetyzując nową nić, przesuwa się po matrycy, napotykając na swojej drodze

sondę. Dzięki aktywności egzonukleolitycznej enzym zaczyna „odlepiać” sondę od matrycy,

a następnie ją niszczyć, uwalniając barwnik fluorescencyjny. System optyczny termocyklera

wzbudza, a następnie odbiera świecenie barwnika, które z każdym cyklem staje się coraz

intensywniejsze (logarytmiczny przyrost ilości produktu oznacza logarytmiczny przyrost

stężenia uwalnianego barwnika). W efekcie jesteśmy w stanie w czasie rzeczywistym

monitorować, czy mamy produkt reakcji.

Czterdziestocyklowa reakcja real-time PCR trwa około 1,5 godziny, po dodaniu do tego czasu

potrzebnego na wyizolowanie DNA z analizowanej próbki (do 30 minut) całość oznaczenia

obecności bądź braku patogenu trwa 2 godziny (przy użyciu systemu Applied Biosystems

TaqMan® Pathogen Detection System). Próby do oznaczenia pobiera się z hodowli

przednamnażających na zbuforowanej wodzie peptonowej po 18 godzinach inkubacji w temp.

37°C, tak więc sumarycznie czas od pobrania próbki do gotowego wyniku zamyka się w 24

godzinach.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ FISH

Technika FISH polega na hybrydyzacji sekwencji rRNA unieruchomionych komórek

sondą oligonukleotydową 16S rRNA znakowaną fluorescencyjnie. Sondy oligonukleotydowe

SA krotkimi fragmentami kwasu deoksyrybonukleinowego, które hybrydyzuja, czy paruja się

z komplementarnymi sekwencjami DNA lub RNA ekstrahowanymi z badanych

drobnoustrojow. Paruja się one w ten sam sposób, jak formy dwuniciowego DNA (adenina z

tymina i guanina z cytozyna). Jeżeli sekwencja zasad w sondzie DNA jest komplementarna

do sekwencji charakterystycznej dla oznaczanego mikroorganizmu, sonda wiąże się jedynie z

DNA identyfikowanego mikroorganizmu. Sondy najczęściej znakowane są na jednym bądź

na obu końcach znacznikiem fluorescencyjnym. Sondy molekularne specyficznie wiążą się z

rRNA w rybosomach komórek docelowych, identyfikując je na różnych poziomach

taksonomicznych. Rozwiązanie takie znacznie zwiększa czułość oznaczenia, gdyż rRNA jest

integralną częścią bakteryjnego rybosomu, wiec występuje w komórce w dużej liczbie kopii

(od 1000 do 10000). Inną zaleta tego rozwiązania jest dostępność obszernej informacji

odnośnie sekwencji rRNA pochodzących od różnych często bardzo blisko genetycznie

spokrewnionych mikroorganizmów, dzięki czemu możliwe jest otrzymywanie sond o bardzo

wysokiej specyficzności. Ze względu na zakres specyficzności sondy wyróżnia się: sondy

uniwersalne np. EUB338 (GCTGCCTCCCGTAGGAGT), nonsensowne, np. NON388

(CGACGGAGGGCATCCTCA) do wykrywania niespecyficznego wiązania sondy oraz sondy

specyficzne, np. Sal3 (5’-AATCACTTCACCTACGTG-3’)dla Salmonella sp..

Sondy oligonukleotydowe 16S (23S) specyficzne dla Salmonella sp. m.in. można

wyszukać w bazie danych probeBase (www.microbial-ecology.de/probebase/index.html) i

literaturze. Wysoko specyficzne sondy można zaprojektować samodzielnie wykorzystując

oprogramowanie ARB (www.arb-home.de), oraz bazy danych: Ribosomal Database Project

II (www.rdp.cme.msu.edu) oraz probeBase (www.microbial

ecology.de/probebase/index.html). Specyficzność wybranych sekwencji względem gatunków

bakterii z rodzaju Salmonella można sprawdzić in silico przy użyciu PROBE MATCH

(www.rdp.cme.msu.edu) lub probeCheck (www.microbial-ecology.de/probebase/index.html).

Metodą FISH z zastosowaniem fluorescencyjnie znakowanych sond oligonukleotydowych

16S rRNA oznacza się liczbę tylko fizjologicznie aktywnych komórek, ponieważ okres

półtrwania rRNA jest krótszy niż DNA, co czyni rRNA potencjalnie lepszym wskaźnikiem

ich aktywności. W rybosomach szybko rosnących komórek znajduje się liczba kopii rRNA,

zwykle ponad 1000 co wystarcza do indukcji sygnału świetlnego po związaniu wyznakowanej

sondy. Po śmierci komórki następuje rozpad rRNA, a jego szybkość zależy, między innymi,

od koncentracji enzymów - RNAz, a także od ciągłości błony cytoplazmatycznej. Komórki

wolno rosnące lub metabolicznie nieaktywne, zawierające niewielką liczbę kopii rybosomów,

emitują światło o słabym natężeniu. Nowe czulsze modyfikacje techniki FISH powodują

amplifikację sygnału (TSA-FISH znany również jako CARD-FISH) stając się użytecznym

narzędziem w rękach współczesnej mikrobiologii. Sondy oligonukleotydowe 16S rRNA

znakowane fluoroforami o zróżnicowanej masie cząsteczkowej (np. peroksydazą chrzanową –

44 kDa, fluoresceiną – 330 kDa) pozwalają na wizualną ocenę stopnia permeabilizacji ściany

komórkowej na zasadzie różnicy w przenikaniu barwników do wnętrza komórki. Niezmiernie

dużą zaletą techniki FISH jest możliwość wykrycia komórek VBNC (viable but not

culturable), które nie dają wzrostu na podłożach stałych co powoduje, że metoda ta jest

czulsza od metod płytkowych.

Standardowa metodyka FISH obejmuje przygotowanie i permeabilizację komórek,

hybrydyzację, wymywanie nadmiaru niezwiązanej sondy oraz detekcję sygnału z

zastosowaniem mikroskopii fluorescencyjnej.

Doniesienia na temat zastosowania techniki fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w

badaniach żywności informują o możliwości jej aplikacji w tej dziedzinie i wskazują na tę

metodę jako bardzo czułą, szybką i tanią. Jednak wnioski płynące z badań wskazują na

konieczność ciągłego doskonalenia metodyki i doboru i/lub projektowania bardziej

specyficznych sond. Związane to jest z różnorodnym składem chemicznym i

mikrobiologicznym żywności (tzw. matrycą), który może prowadzić do błędów w odczycie.

Dlatego dla stosunkowo szybkiej oceny jakości i bezpieczeństwa żywności potrzebny jest

dobór nie tylko sond dla poszczególnych gatunków drobnoustrojów ale przede wszystkim

zoptymalizowanie przygotowania prób żywności do badań w zależności od matrycy. Poprzez

przygotowanie prób rozumie się odpowiednią filtrację i wirowanie przy różnych parametrach

celem wyeliminowania dużych cząstek, a także dobór optymalnych warunków trawienia lub

permeabilizacji ściany komórkowej drobnoustrojów (np. lizozymem, proteinazą K,

achromopeptydazą, paraformaldehydem, etanolem itp.) występujących w badanej żywności.

Właściwe przygotowanie próby i komórek uniemożliwia niespecyficzną absorpcję sondy do

elementów komórkowych, oraz łatwiejszą penetrację cytoplazmy komórek.

ĆWICZENIE 3 07.11.2017r. - wt. Projektowanie analizy produktu z uwzględnieniem obowiązujących wymagań. Studium przypadków. Cz. I.

Studium przypadków: 1. Mięso mielone, w toku produkcji

Pałeczki Salmonella nieobecne w 25g (kryterium higieny)

E. coli 3,2x102jtk/g (wytyczne branżowe)

Liczba bakterii tlenowych mezofilnych: 6,7x107jtk/g (wymagane – przekroczony parametr)

Proteus sp. 1,7x104jtk/g (wytyczne branżowe)

Gronkowce koagulazo-dodatnie: 4,3x107jtk/g (trzeba zrobić enterotoksynę)

Liczba grzybów: 2,3x102jtk/g (zbędne oznaczenie)

2. Mięso mielone, pakowane próżniowo:

Pałeczki Salmonella nieobecne w 10g (błąd, powinno być w 25g)

E. coli 5,4x102jtk/g (zbędne oznaczenie)

Liczba bakterii tlenowych mezofilnych: 5,7x106jtk/g (zbędne)

Proteus sp. 2,7x104jtk/g (wytyczne branżowe)

Gronkowce koagulazo-dodatnie: 4,9x103jtk/g

Liczba grzybów: 2,3x102jtk/g (Brak Listeria monocytogenes)

3. Mleko w proszku dla niemowląt na końcu procesu produkcyjnego

Pałeczki Salmonella nieobecne w 10g (błąd, powinno być w 25g)

E. Coli 5,2x102jtk/g (zbędne oznaczenie)

Rodzina Enterobacteriaeae 5,2x102jtk/g (wyróżnik higieny)

Liczba bakterii tlenowych mezofilnych: 3,7x105jtk/g (niewymagane)

Gronkowce koagulazo-dodatnie: 1,3x103jtk/g (niewymagane)

Liczba grzybów: 1,3x103jtk/g (brak Cronobacter sakazakii)

4. Ser z mleka niepasteryzowanego gotowy do spożycia

Pałeczki Salmonella nieobecne w 25g (kryterium higieny)

E. coli 1,2x102jtk/g (zbędne oznaczenie, wyróżnik higieny)

Rodzina Enterobacteriaceae 3,2x102jtk/g (zbędne oznaczenie)

Liczba bakterii tlenowych mezofilnych: 6,8x105jtk/g (niewymagane)

Gronkowce koagulazo-dodatnie: 6,3x106jtk/g (powinna być oznaczona enterotoksyna)

Liczba grzybów: 7,1x103jtk/g (wymagania branżowe)

Listeria monocytogenes nieobecna w 10g (błąd, powinno być w 25g)

5. Ser z mleka niepasteryzowanego

Pałeczki Salmonella nieobecne w 25g (kryterium bezpieczeństwa)

E. coli 1,2x102jtk/g (wyróżnik higieny)

Rodzina Enterobacteriaceae 3,2x102jtk/g (zbędne oznaczenie)

Liczba bakterii tlenowych mezofilnych: 4,7x106jtk/g (niewymagane)

Gronkowce koagulazo-dodatnie: 6,3x106jtk/g (powinna być oznaczona enterotoksyna, nie spełnia kryterium higieny)

Liczba grzybów: 7,1x103jtk/g (wymagania branżowe)

Listeria monocytogenes nieobecna w 25g (niewymagane)

6. Lody w toku produkcji

Pałeczki Salmonella nieobecne w 10g (niewymagane)

Rodzina Enterobacteriaceae 5,8x103jtk/g (wyróżnik higieny – nie spełnia wymogów)

Liczba bakterii tlenowych mezofilnych: 6,2x105jtk/g

Gronkowce koagulazo-dodatnie: 2,1x103jtk/g

Listeria monocytogenes nieobecna w 25g (niewymagane)

7. Owoce morza, żywe

Pałeczki Salmonella nieobecne w 10g (błąd, powinno być w 25g)

E. coli 2,2x102jtk/g (kryterium bezpieczeństwa)

Rodzina Enterobacteriaceae 3,5x102jtk/g (niewymagane)

Liczba bakterii tlenowych mezofilnych: 3,2x105jtk/g (niewymagane)

Gronkowce koagulazo-dodatnie: 3,8x103jtk/g Student ma za zadanie:

Określić czy odpowiednio dobrane są analizy mikrobiologiczne

Czy poprawnie uwzględniono kryteria higieny lub/i kryteria bezpieczeństwa

Czy nie brakuje jakichś analiz lub któreś są zbędne

Czy produkt spełnia wymagania ustalone w Rozporządzeniu 2073 Przypadki do podziału dla zespołów 2 – osobowych na kolejnych zajęciach głoszą seminarium)

1. Ser dojrzewający - wzdęty z białym nalotem (możliwe kierunki badań: Clostridia sacharolityczne, grupa coli - wzdęcie, pleśnie, drożdże - nalot)

2. Sałatka warzywna z majonezem w opakowaniu plastikowym – wypukłe wieczko (możliwe kierunki badań: heterofermentatywne mlekowe, grupa coli, Clostridia sacharolityczne)

3. Mleko skondensowane, niesłodzone, UHT – słodki skrzep (możliwe kierunki badań: Bacillus)

4. Masło - zjełczałe z czarnymi plamami (możliwe kierunki badań: Clostridia sacharolityczne pleśnie)

5. Wędlina pakowana próżniowo - kwaśny posmak i lekko wzdęte opakowanie (możliwe kierunki badań: mlekowe heterofermentatywne)

6. Sok jabłkowy pasteryzowany - zmętnienie, medyczny dezynfekcyjny zapach (możliwe kierunki badań: Alicyclobacillus)

7. Pieczywo - ciągliwość miękiszu, nitki śluzu o nieprzyjemnym zapachu (możliwe kierunki badań: Bacillus )

Student ma za zadanie:

- rozpatrzyć przyczyny powstałych wad z uwzględnieniem poszczególnych etapów produkcji na których mogło dojść do powstania wad

- wymienić grupy drobnoustrojów, które zamierza oznaczyć celem stwierdzenia przyczyny wad

- podczas odczytu wyników muszą zwrócić uwagę na fakt, że może zachodzić potrzeba wykonania schematycznego drzewka decyzyjnego (np. barwienie metodą grama, test na katalazę, oksydazę itd.)

- zaprojektować tok przebiegu analizy z uwzględnieniem poboru prób, użytych podłoży, warunków inkubacji, sposobu odczytu i ewentualnych posiewów potwierdzających

ĆWICZENIE 4 09.11.2017r. – czw. Projektowanie analizy produktu z uwzględnieniem obowiązujących wymagań. Studium przypadków. Cz. II – seminarium. ĆWICZENIE 5 14.11.2017r. - wt. Analiza mikrobiologiczna przetworów owocowych, warzywnych i warzywno-mięsnych. Cz. I Kolokwium I. ĆWICZENIE 6 16.11.2017r. – czw. Analiza mikrobiologiczna przetworów owocowych, warzywnych i warzywno-mięsnych. Cz. II – odczyt wyników i posiewy potwierdzające. Poprawa kolokwium I. ĆWICZENIE 7 21.11.2017r. - wt. Analiza mikrobiologiczna mięsa i przetworów mięsnych. Cz. I. Kolokwium II. ĆWICZENIE 8 23.11.2017r. – czw. Analiza mikrobiologiczna mięsa i przetworów mięsnych. Cz. II – odczyt wyników i posiewy potwierdzające. Poprawa kolokwium II. ĆWICZENIE 9 28.11.2017r. - wt. Analiza mikrobiologiczna mleka i produktów mlecznych. Cz. I. ĆWICZENIE 10 30.11.2017r. – czw. Analiza mikrobiologiczna mleka i produktów mlecznych. Cz. II – odczyt wyników i posiewy potwierdzające ĆWICZENIE 10 28.11.2017r. - wt. Raport końcowy z wyników badań. Zaliczenie końcowe.