die feulgensche nuklealfärbung in ihrer anwendung auf cytologische untersuchungen

(Aus dem Ins t i tu t fiir Sehiffs- und Tropenkrankhei ten zu Hamburg. Di rek tor : Professor Dr. FffLLEBORN, Abtei lungsvorsteher: Professor Dr. REICHENOW.)

DIE FEULGENSCHE NUKLEALFAI~BUNG IN IHRER ANWENDUNG AUF CVTOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN.

Von

HANS BAUER.

Mit 10 Textabbildungen.

(Eingegangen am 4. November 1931.)

Inhaltsverzeichnis. Sei te

I. Einlei tung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 225 IL Material und Fixierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 226

I I I . F~rbegrad und Hydrolysedauer in ihrer Abhangigkeit yon der Fixierungs- a r t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 228

IV. Hydrolyse und S t ruk tu re rha l tung . . . . . . . . . . . . . . . . . 232 1. Die Metaphasechromosomen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233 2. Die iibrigen Chromat ins t rukturen . . . . . . . . . . . . . . . . 236

V. Krit ische Bewertung der Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . 240 Anhang: Hinweise auf die Ausfiihrung der Nuklealf~irbung . . . . . . . . 245 Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 246 Literaturverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 247

I. Einleitung.

Obwohl schon eine Reihe yon Jahren verflossen ist, seit FEULGEN (1924 mit ROSSENBECK~ 1926) seine wertvolle Methode des mikrochemi- schen Nachweises der Thymonukleins~iure im Zellkern ausarbeitete, hat diese doch nicht allgemein Eingang in die mikroskopische Technik gefunden.

Der Grund liegt einmal darin, dal~ die FEVLGENschen Vorschriften nach umfangreichen Untersuchungen fiber die Optimalbedingungen seitens FEULGEN-BRAuNs (1924) ziemlich starr waren. Besonders hinder- lich ffir die Verbreitung war die Beschri~nkung auf Sublimatfixierung, durch die bedingt wurde, daft die Methode in der Cytologie lediglich zum best~tigenden Vergleich herangezogen wurde. Nur bei dem schwie- rigen Studium der Drosophilacytologie sah zuletzt HUETTNER (1930) sie sich als Hauptmethode bewi~hren.

15"

226 Hans Bauer: Die FEULGE.n-sche Nuklealf/~rbung

Skeptisch machte auBerdem die schon friih erhobene Kritik an den Grundlagen der FEuLGE~'schen Methode, wie sie besonders in der Dis- kussion zum Vortrag yon Voss (1925) auf der Wiener Anatomenver- sammlung zum Ausdruck kam.

SchlieBlich wurde auch die morphologische Auswertung der durch diese Methode erzielten Pr~parate, die allerdings auch von FEULGES, der ausdriicklich davor warnt, nicht beabsichtigt worden war, durch BERG (1926) mit einer genauen Untersuchung der Folgen des hydrolytischen Eingriffes in Frage gestellt, indem er zeigte, dab hierbei eine erhebliche Ver~nderung der feineren Struktur der Zellkerne eintrat. Allerdings beobachtete B~RG auch, dab die Teilungsstadien weniger stark geschiidigt werden. Die angekfindigte genauere Darstellung ist jedoch unterblieben.

Der Wunsch, die FEVLGENsche Methode trotz der genannten Hinder- nisse zu bestimmten Zelluntersuchungen zu brauehen, bei denen Sublimat- fixierung nicht angebracht ist, fiihrte mich dazu, erst einmal systema- tisch ihre AnwendungsmSglichkeiten nach verschiedenen Fixierungen zu untersuchen, einWeg, der von FEULOI~N-BRAuNS und BERG begonnen, aber nicht beendet worden ist, da sich ihnen nur nach den FEULOE~schen Vorschriften maximale Fi~rbung ergab.

II. Material und Fixierung.

Als Untersuchungsobjekt w~hlte ich Hoden yon Stenobothrus (Chort- hippus) parallelus, die die M6glichkeit bieten, das Chromatin in der ganzen Reihe der in Frage kommenden Zust/i~nde - - der gewShnlichen Mitose, den Reifeteilungen und den Verdichtungserscheinungen in der Spermatohistogenese - - oft in einem einzigen Schnitt zu studieren.

Daneben wurden Wurzelspitzen yon Allium Cepa und Vicia ]aba, sowie EirShren von Ascaris megalocephala untersucht. Die Vorversuche wurden an Lumbricus (spec. ?) durchgefiihrt.

Da es sich darum handelte, die M5glichkeiten der FsuLG~.Nf/irbung im AnschluB an cytologisch giinstige Konservierungsmethoden fest- zustellen, wurde unter diesen keine Auswahl nach ihrer (nur zu ver- mutenden) besonderen Eignung ffir die sp/itere Nuklealreaktion getroffen, sondern die ganze Reihe der in der Cytologie gebr/i, uchlichen Mittel an- gewandt. Es waren die folgenden 1:

1. Alkohol-Eisessig (3 : 1) nach C~RNOY. 2. Alkohol-Chloroform-Eisessig nach CARBOY (7 b). 3. Sublimat-Alkohol-Chloroform-Eisessig nach CARNoY-L~BRV~. 4. PE~VNKv.wrrseK (2 f). 5. Sublimat-Alkohol-Eisessig nach APXT•Y (2 e).

1 Die Zusammensetzung der Fixierungsgemische entspricht den genauen An- gaben B~nxi~ (1928b, S. 656f.), auf dessen Numerierung sich die oben in Klammern hinzugefiigten Ziffern beziehen.

in ihrer Anwendung auf cytologische Untersuchungen. 227

6. Sublimat-Eisessig (2 b). 7. Alkohol-Formalin-Eisessig nach KAHLE. 8. Pikrinessigs~ure (3a). 9. BOUIN (3c).

10. BouIN-DvBoscQ (3 d). l l. BOUIN-ALL]~ (3 e, etwas ver~ndert). ]2. BOUIN -ALLEN - Sublimat. ]3. Chromessigsiiure (10 a). 14. SAN~ELIC~ (10 b). 15. FLEMMr~G stark (1 d). 16. FL~.~VIII~G-HF~ITZ (FLEMMII~(~ ob, ne Essigs~ure). 17. CHA~rr (Sg). 18. HERI~IANN (1 e). 19. JU~.L-M~RK:~L (8 a). 20. R~G~.UD (5 e). 21. R~G~uD-Sublimat. 22. HELLY (5 c). 23. Z~K~R-Formol. 24. Z~K~R (5 b).

Gegen die Verwendung von zweien der in diesen Gemischen enthal- tenen Bestandteile ist seitens der sich bisher mit der FEcLGENf~rbung be- fassenden l%rscher Einspruch erhoben worden: einmal dureh F~ULOE~- BRAUNS gegen die Oxydantia, im besonderen das Kaliumbichromat, yon dem die Verfasserin annimmt, dai] es die Nuklealk6rper sch~digt, da sie im Vergleich zum Ausfall nach Sublimatfixierung bei der gleichen Hydrolysedauer nur eine viel schw~ichere F~rbung nach Fixierung mit solchen Gemischen I erhielt. Zum anderen verbieten BERn (1926) und Voss (1926) ziemlich kategorisch die Anwendung yon Formaldehyd, bei dessen Gebrauch auch FEULGEN (1924) gr6Bte Vorsicht empfiehlt. Leitend ffir diese Stellungnahme ist natfirlich der Gesichtspunkt, dal3 der Formaldehyd eben in seiner Eigenschaft als Aldehyd mit der fuchsinschwefligen S~ure eine Farbreaktion gibt, die sich dann als St6rung der reinen Nuklealfi~rbung ~uBern k6nnte. Ich kann abet nicht ersehen, ob der Versuch, eine derartige St6rung tats~chlich nachzuweisen, yon den genannten Autoren gemacht worden ist. Sie k6nnte, da eine rein adsorptive Haftung des Formaldehyds w~hrend der ganzen Reihe mikro- technischer Prozeduren wohl ausgeschlossen ist, nur auf chemischer Bindung unter Erhaltung der reduzierenden Gruppe beruhen. Nach BLUM (1926) verbindet sich jedoch der Formaldehyd als Methylen- gruppe mit dem Eiwei0, der derartige Eigenschaften nicht raehr zuzu- sprechen sind. Es bedeutet daher also mindestens eine unberechtigte Aussage fiber das Wesen der Formalinfixierung, wenn man sie in diesem Zusammenhange einfach ausschlieBt.

Das yon FEULG:m~-BR.~.UI~S benutzte ZENKERsche Gemisch enth~lt kein Sublimat, ist also mit Bf~LAf~ als T~LLY~SN~CZKYSche Mischung zu bezeichnen. Daraus ergeben sich die welter unten zu findenden Unterschiede gegenfiber dem eigentlichen Z~K~.Rschen Gemisch.

228 Hanu :Bauer: Die FEULG:E~SChe Nuklealffirbmlg

Eine Konzession an eine m6gliehe F6rderung der ansehlieftenden Farbreaktion habe ieh nur insofern gemaeht, als ieh die Mischungen yon BOUle-ALLEN und R~GAUD aueh unter Zusatz yon 50/0 Sublimat verwendet habe, um zu sehen, ob dieses aueh so seine yon FE~LGE~ betonte giinstige Wirkung ausiibt.

Die iiblichen Naehbehandlungen (Jodierung, Chromierung u.a.) wurden ebenfalls ohne Riieksieht auf ihre m6gliche Schs ftir die Nuklealf/irbung vorgenommen. Ftir die Jodierung gibt bereits Voss (1926) an, daft sie ohne Einflpft ist.

DiG obengenannten Vergleiehsobjekte wurden jeweils nur mit einigen der angegebenen Fixierungen behandelt, da sich keine wesentlichen Unterschiede gegeniiber den Ergebnissen an Stenobothrus herausstellten.

IIL F~irbegrad und Hydrolysedauer in ihrer Abh~ngigkeit yon der Fixierungsart.

An verschieden fixierten Schnitten von Lumbricus war mir bei Variation der Dauer des n-HC1-Bades um 4 Minuten herum aufgefallen, daft entsprechend dem Anstieg des F/i, rbegrades nach Sublimatfixierung auch eine graduelle Verstiirkung der Farbreaktion naeh anderen Kon- servierungen zu erkennen war, wobei sich aber bei diesen kein Maximum bei 4--8 Minuten mit folgendem Abstieg, wie nach Sublimatbehandlung, ergab, vielmehr naeh l~ngerer Hydrolyse st~rkere F/irbung resultierte. Bei dem Versuch, die Dauer erheblieh zu verliingern, best/itigte sich die Vermutung, dab kr/iftige Fiirbung aueh naeh anderen als sublimat- haltigen Gemischen zu erhalten war.

Um einen genauen Einblick in die Beziehungen zwisehen der Hydro- lysedauer und dem F/irbungsgrad zu erzielen, wurden Stenobothrus- pr/iparate einer Skala yon ttydrolysezeiten zwischen 1 Minute und 2 Stunden ausgesetzt.

Die Versuche wurden so durchgeffihrt, dag auf demselben Objekttr~tger je zwei Schnitte der mit den obengenannten Fixierungen behandelten Hoden montiert wurden, so dab der Eingriff fiir alle unbedingt gleichm~13ig war. Die Pr~parate wurden der Hydrolyse einzeln unterworfen, da dutch Einstellen vieler Objekttr~ger in das gleiche Bad eine nur ungenau zu sch~tzende Abktihlung und damit eine unbestimmte Verminderung der Hydrolyse eintritt.

Eine Methode zur Messung der absoluten Farbst~rke land sich nicht. Auch der Versuch, mit Hilfe des AB~.schen Zeichenapparates einen Vergleich zwischen dem Pri~parat und Papieren, die mit Fuchsinl6sungen bestimmter Konzentrationen gefarbt waren, scheiterte. Daher mul~te ich mich mit dem unmittelbaren Vergleich der Schnitte untereinander zufrieden geben. Um noch einigermaBen sicher zu gehen, wurden die Praparate mit dem Z~.~.~schen Vergleichsokular durchgesehen. Als Fii, rbungsstufen wurden in zunehmender St~rke Schnitte mit den Fixierungen: Pikrinessigs~ure, BovI~r, PETRU~KEWITSC~, Sublimatalkoholeisessig und CAR~OY- L~.BRV~ bei 6 Minuten Hydrolyse gew~thlt. Der Vergleich wurde nur an Spermato- cyten im Pachyt~nstadium durchgeffihrt, da diese in allen Schnitten vorhanden waren und am genauesten auf die Hydrolyse reagierten. Dichtere Strukturen


zeigen schon eher und auch noch l~nger eine Fi~rbung. Immerhin bleibt diese Vergleichsmethode ziemlich willkiirlich, besonders wegen der dureh die versehie- denen Fixierungen bedingte unterschiedliche Strukturerhaltung und wegen diffe- rierender Gesamtfi~rbung (Osmiumgemische).

Die auf diese Weise erhaltenen Angaben sind in Tabelle 1 zusammen- gestellt. Aus ihr geht zun/~ehst hervor, dal3 nach einer ganzen Anzahl yon Fixierungen maximale Fi~rbung erhalten werden kann. I m einzelnen entfallen damit die oben erw/~hnten Annahmen yon FEULGEN-BRAUNS, BERG und Voss. Weder bewirken die Oxydantia im allgemeinen eine ZerstSrung der NuklealkSrper, noeh trifft den Formaldehyd der ihm gemaehte Vorwurf. Es sei betont, um yon vornherein Einw/~nden zu begegnen, dab in allen Fdllen eine reine Chromatin,,/dirbung" auftrat. Wiirde die Farbreaktion an allen Orten auftreten, an denen der Form- aldehyd chemisch gebunden is~, so miil3te mehr oder weniger starke Diffusf~irbu~)g resultieren.

Lediglich nach Fixierung mit FLV.~fLWO und verwandten Gemischen trat, aber dutch Farbton und Intensit~t vom Chromatin unterschieden, schwache F/~rbung der Cystenw~nde und eigentfimlicher knolliger Gebilde in den Zellen der Peri- tonealhiille auf. )~hnlich waren auch bei Lumbricus nach diesen Fixierungen viele Bindegewebsstrukturen gef/~rbt. Ich mull es dabei often lassen, ob diese auf adsorptive Haftung der fuchsinschwefligen SKure in den nach diesen Fixierungen besonders dicht koagulierten Strukturen unter nachtr/iglicher Farbstoffbildung im Wasser oder Alkohol, ob sie auf einer der Elastikaf/~rbung vergleichbaren lokalisierten Plasmalf/~rbung beruht oder eine Pseudoreaktion darsteIlt, wenn mir auch das letzere im Hinblick auf die unten angegebene St/irkef~rbung (S. 244) am wahr- scheinlichsten ist.

Eine genaue Analyse der Wirkung der Grundfixiermittel kann hier nicht er- folgen. Dazu miillte ein Objekt gefunden werden, dall auch eine genaue photo- metrische Farbgradbestimmung zuli~llt. Fiir die cytologische Praxis, die sich nur mit Fixiergemischen befallt, ist eine derartige Analyse auch erst in zweiter Linie wichtig. Ich habe in diesem Zusammenhang daher darauf verzichtet.

Keine maximale F/irbung ergaben nur die folgenden Gemische: Pikrinessigs/~ure, BouI~r I:)ETRUNKEWITSCH, HER1VIANN und JU~L- MERKEL. Dieses muB wohl der Salpeters/~ure, der Pikrins/iure und dem Platinchlorid zur Last gelegt werden. Denn die fibrigen Bestandteile lassen in anderen Kombinationen starke F/~rbung zu. Die Wirkung dieser farbschw/ichenden Reagentien kann nicht auf einer schon w/~hrend der Fixierung erfolgenden t tydrolyse beruhen, da dann maximale F/~r- bung sehon nach sehr kurzer Dauer des Hydrolysebades eintreten mfil3te. Vielmehr werden sie vermutlich entweder die Thymonukleins/iure nicht in unlSslicher Form ausf~llen oder sie teilweise zerstSren.

Die Farbreaktion nach den 1Y[aximalfiirbung gestattenden Fixie- rungen zeigt, in Kurvenform ffir einige typisehe F/~lle dargestellt (Abb. 1), bei den verschiedenen Methoden einen abweichenden Verlauf. In l~bereinstimmung mit den Ergebnissen FEULGE~s zeigt Kurve I den Zu- sammenhang zwischen Hydrolysezeit und Farbst/irke fiir Fixierung mit Sublimateisessig. Sie ist gekennzeichnet dutch rasehen Anstieg, kurz

9~30 Hans Bauer: Die F~VLO~sche Nuklealfiirbung

Ta-

Fixierungsmittel ~

L CARNOY (3 -* 1) . --1 sbl ]bl CARBOY ( 6 : 3 : 1) sbl +bl CAR~OY-LEBRU~ ~[ sb l+ i In PETRU~KEWITSCH --, sbl~-] b l - - APATHY I - - sbl I bl ~ublimatemesmg [--[ sbl bl KARLr . . . . ]--] sbl i bl Pikrinessigsiiure . I--[ sbl [ sbl BouI~ . . . . . ]--1 sbl I sbl BouI~-DuBoscQ. I--I s b l + l - - m BOUIN-ALLEN . . 1--] sbl ] sbl BOUIN-ALLEN- I [ I

S u b l i m a t . . . - - sbl - - b l Chromessigsiiure --I sbl bl SA~FmLICm . . . - - I b l m FL~r~I I~ . . . - - Isbl sbl-~ FLEMm~o-H~ITZ --1 sbl sbl-~ CH~MP~ . . . . - - sbl sbl HERMANN . . . - - - - sbl JUSL-M:ZSKSL . --] sbl sbl R~AU~ .... --I sbl bl Rf~AuD-Sublimat --I sbl m HmLLs ..... --[ bl --m Z~KmR-Formol . -- sbl bl ZZ~KSR .... --! bl m

Itydrolysedauer

3 / 4 1 1 0 1 1 2 14

- - s t ~st I n

st st st sbl b l + - - s t b l +

st

ss--t st In st st st sbl bl st - - m

I n

m + sst m I n

- -m sbl bl ---st st-k st-b st st

i n

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st - - I n

- - m - - m sbl - - b l m + st st st st

P

st m-~ ---m b l + st m + ~ - - m bl st-[- st m + m ---m bl - - b l sbl st m , - - m - - m st m - - m - - m st t m-{- st sbl sbl ! sbl ]sbl bl sb l+ sbl ' sbl - - s t - - s t m l m - - m m-t- m--t- m

m + m + - - s t +st m + mq-I ra- t - st sst sst sst sat m-b m-t- m + - - s t m m m + !mq- - - m - - m ~m m + sbl sbl sbl sbl bl bl I blq - b l + - - s t - - s t I - - s t st sst s t + ]sst sst s sst s t - ~ - - - s s - - s l

st st st st st - - s t - - s t m-I-

stark; davorgese tz tes -

m - -s t m I - - s t st I st

-st in - -s t m m + sbl sbl sblJr ]--bl m + / in+ bl / b l +

bl~- / m bl~- m st st bl bl sb l+ bl sbl bl sbl sbl bl sbl

m-F - -

m + - - s t m + ---st

sbl sehr blaB; bl blal]; m mittelstark; st stark; s st sehr

daue rndes M a x i m u m 1 u n d ziemlich schnel l e i n t r e t e n d e n Abfall . Schon nach ha lbs t i ind ige r Hydro lyse ist ke ine F a r b r e a k t i o n m e h r zu erzielen. Dieser Ver lauf gi l t auch fiir die CAR~oYgemische u n d Sub l ima ta lkoho l - eisessig. .~hnlich ist K u r v e I I fiir t tELLY-Fixierung, die auch d e n e n ffir die ZE~XER-Gemische, Bour~ -DuBoscQ u n d K ~ L E entspr ich t . Gegeni iber K u r v e I f i nden wir abe r viel l~nger anha l t endes M a x i m u m u n d erhebl ich v e r l a n g s a m t e n Abst ieg, so d a b ers t nach e iner Hydro lyse yon 1 S t u n d e ke ine F ~ r b u n g m e h r auf t r i t t . K u r v e I I I ( F L ] ~ I N O - HEITZ), die ffir alle Chromosmiumgemische , sowie Ahnlich BOUIN-ALL~N u n d R~GAUD typ i sch ist, zeigt im Vergleich zu den b isher igen e inen v e r l a n g s a m t e n Anst ieg , der erst n a c h 2 0 - - 3 0 M i n u t e n z u m M a x i m u m fi ihrt . Wesen t l i ch versch ieden ver l~uf t der zweite Tei l der K u r v e , der n u t eine ger inge I n t e n s i t ~ t s v e r m i n d e r u n g der FArbung anzeigt , so daft selbst nach zweis t i indiger Hydro lyse r e l a t i v kr~ft ige F ~ r b u n g zu erzielen ist. K u r v e I V endl ich zeigt in U b e r e i n s t i m m u n g mir I u n d I I r aschen Anst ieg,

i Nach FEVL~ml~-BRAvNS nimmt die Farbsti~rke erst bei 15 Minuten merkbar ab. Bei mir war dies schon friiher feststellbar.

in ihrer Anwendung auf cytologische Untersuchungen. 9,3]

belle 1.

Optimaldauer der Hydrolyse

in Minuten 29 34 40 48 60 90

in l~Iinuten

1~ I--bl l--sbl sbl sbl+ I sbl sbl

J b l + ]sbl sbl I sbl l sb l sbl

b l + sbl sbl b l + sbl sbl - - s t - - s t - - s t sbl sbl sbl sbl sbl sbl m + m - - m m + - - s t st

--st st st - - s t - - s t m + sst sst sst s t - - s t - - s t - - s t ~ s t -- st

I - - s t - - s t - - s t sbl sbl sbl b l + b l + - - m st - - s t - - s t sst st [st m --st m+ m+ m

st s t + - - m b l + m + m bl bl

bedeutet etwas geringere;

sbl - s t - s t m-t- m +

- s t -st , m + m

- s t m + m + - s t - s t m + m +

- - s t - - s t mb~bl mm_~l 1

- - s t - - s t - - s t - - s t st-[- s t ---st m + bl sbl sbl - -

sbl sbl -- sbl sbl sbl - -

b l + b l + m + - - m

I l l

r a + b l +

1'20

4 - - 6 - - 8 4 - -8

3 - - 6 - - 8 (3--6)

4 - - 5 - - 8 4---5--8

5- -10

5 - - 6 - - 1 0 19--22--40

I 2 - - H ~O 14--19

3---6--60 14- -16- -40 16- -25- -40 1 6 ~ 2 5 - - 4 0

(3O--40--9O) 6 - -14 - -60 4 - 8 - - 4 8 4---8--16 4 - -~ - -16 4 - -5 - -12

dahintergesetztes + etwas st~rkere F~rbung.

d a n n a b e r s e h r l a n g a n h a l t e n d e s M a x i m u m u n d wie K u r v e I I I n u r ge-

r i n g e V e r m i n d e r u n g d e r F a r b s t ~ r k e b is z u m E n d e d e r g e w ~ h l t e n H y d r o -

l y s e z e i t e n . Sie g i l t ffir SA~FELICE u n d i s t ~ h n l i c h be i R g G A v D - S u b l i m a t .

,~F ~ ' x \ ................... x ~ - . . ~ - I l l \ ..... ~"~"~ '~ ~' "~" . . . . .~- ~ ' ~ . l - / ~ + ' ; ' ,";: ~ \ ..-V~ ,~ ',,,. '~, .......... ~ . . . . . . . . . . . . . . ~ - . ~ . . - - . ~

:l?// \ ' - , . tfti \ "-4 + Ilia \ z ".~.

~ o \ o �9 ~ . . . ~ .

#/~o/I~edaueJ" /z ~ufen Abb. 1. Zusammenhang-zwischen Hydrolysedauer und F~rbungsgvad. Kurve I O O Sublimateisessigfixierung; Kurve II �9 ....... �9 HELLY-Fixierung; Kurve III /~ . . . . . . A

FLEMMING-HEITZ-FIxierUng; Kurve IV [] ......... [] SANFELICE-FIxterung.

232 Hans Bauer: Die FEUL(~E~sche Nuklealf~rbung

Bei der Deutung dieser Verh~ltnis~e ist es wichtig, das Zustande- kommen der Kurve ins Auge zu fassen. Der aufsteigende Ast wird bedingt durch die mit der Hydrolyse vorgenommene Abspaltung der Purine. Der Abstieg der Kurve wird durch Ver~nderung des reagierenden Systems an anderer Stelle (entweder durch weiteren Abbau des Thymin- s~uremolekfils oder durch ZerstSrung der Bindung zwischen Nuklein- siiure und EiweiBkomponente des Nukleoproteids) bewirkt.

Die Unterschiede in der Wirkung der einzelnen Fixierungsmittel kSnnen nicht allein in ihrer differenten chemischen Wirkung auf die Nukleinsaure bestehen. Die verschieden schnelle Abspaltung der Purine auf eine Festigung der Bindung zwischen diesen und den Kohlehydrat- komplexer~ der Nukleins~ure zurfickzuffihren, ist chemisch natiirlich nicht mSglich. So kann die HinauszSgerung der Maximalf~rbung z. B. nach Chromosmiums~urefixierung nur durch die relative Unzug~nglich- keit der Nukleins~ure infolge besonders dichter F~llung der Kern- proteide bedingt sein, ein Faktor, der sicher auch ffir die lange Erhal- tung der Fi~rbbarkeit yon Bedeutung ist. Da die im Gegensatz zur gerinnseligen Koagulation als Gelatinierung bezeichnete homogene Fixie- rung charakteristisch ffir Osmiums~ure- und Formaldehydfixierung ist, erkl~rt sich wohl so ihr gfinstiger EinfluB auf die langanhaltende Reak- tionsf~higkeit des Chromatins. Ob aueh die gleiehsinnige Wirkung der Chromverbindungen ebenso zu erkl~ren ist, oder ob hierffir ein spezi- fischer chemischer Faktor wirksam ist, muB dahingestellt bleiben.

Jedenfalls lgl~t diese Sachlage ein Werturteil zu fiber die Gfite der einzelnen Fixierverfahren; denn man wird die als besser bezeiehnen miissen, die die Zellstrukturen derart fixieren (d. h. festigen), dab sie dem seh~digenden Einflul~ der Hydrolyse mSgliehst lange widerstehen. So kommen wir gegenfiber den bisher allein entscheidenden Argu- menten der Naturtreue der Strukturerhaltung von dem ganz anderen Standpunkt der Erfassung ihrer Resistenz ebenfalls dazu, den Osmium. chrom- und Formolchromgemischen ihre Sonderstellung /i~r die Chromatin- ]ixierung einzur~iumen.

Das Sublimat bewirkt auch in Gemischen rascheres Auftreten und Verschwinden der F~rbb~rkeit, was mit einer weniger festen F~llung der Zellstrukturen erklart werden kann. Es ist also wesentlich ungeeigneter als die obengenann~n Fixierungs- mittel.

Iu IIydrolyse und Strukturerhaltung.

Unerl~Blich ffir die Anwendung der Nuklealf~rbung als morphologische Methode ist die Kenntnis der durch sie bewirkten Struktur- seh~digungen, deren teflweise sehr hoher Grad von BERG (1926) ein- gehend beschrieben worden ist. Zwei Wege zu ihrer Feststellung sind yon ihm gewiesen. Einmal die Kontrolle des gleichen Kerns vor und nach der Hydrolyse, erst mit basischem Fuchsin, dann nach FEULGE~


gef~rbt, und zweitens der Vergleich yon Pr/~paraten gleicher Herkunft , die mit den beiden verschiedenen Methoden gef~rbt waren.

Die erste Methode habe ich nur seltener benutzen brauchen. Denn wir haben es bei den im folgenden allein behandeRen Zellstrukturen yon Stenobothrus vorwiegend mit nicht sehr polymorphen, gestaltlich gut definierten Gebilden zu tun. Nur fiir die Entscheidung, ob Struktur- und Formver~nderungen an den In terphasekernen vorkommen, habe ich dieses Verfahren trotz seiner Umst~ndlichkeit nicht umgehen k6nnen. Fiir den Vergleich zwischen nuklealgef/~rbten und nichthydrolysier ten Pr/~paratea habe ich im Gegensatz zu B~.Rc die Eisenh/~matoxylin- f~rbung benutzt .

Dieso wurde einer basischen Anilinf/~rbung vorgezogen, da sie verli~lllicher und, wie ich im Gegensatz zu vielen absprechenden ~uBerungen mit M. und W. v. M6LLV,~DORFF (1924) feststellen m6chte, strukturgetreuer arbeite~, da sie ,,im grol3en und ganzen zum Tatsachenbereich der Durchtri~nkungsfarbung" gehOrt und bei ihr die Entstehung yon strukturfremden Niederschli~gen nicht so sehr zu beftirchten ist.

Will man die totale Schwarzung der Tetraden vermeiden, so kann man durch Beizung (1~ Alaun) yon 5 Minuten und Farbung (0,05% Hamatoxylin) yon einer halben Stunde eine typische Chromosomenrindenfitrbung erzielen, bei der die Chromosomen im tibrigen sehr durchsichtig bleiben. Will man die m6glichen Fehlerquellen der Differenzierung ausschalten, so kann man progressiv mit extrem verdfinnten L6sungen arbeiten (Beize 0,05~ mit Zusatz yon 0,05G/o Schwefel- s~ure zur Verhiitung der hydrolytischen Spaltung des Alauns: 1--20 Stunden, Hamatoxylin 0,05--0,0004G/oig 1--20 Stunden). Man erh~lt so ohne Differen- zierung eine durchsichtige graue Chromosomenfgrbung.

1. Die Metaphasenchromosomen. Als Priifstein fiir den Grad der evtl. Sch/~digung der Zellstrukturen

kann man zun/~chst mit Vorteil die Tetraden der ersten Reifeteflung benutzen. Sie sind dichte Gebilde, deren Widerstandsf/~higkeit gegen zerstSrende Eingriffe bei der Fixierung oder bei experimenteller Behand- lung zur Geniige bekannt ist. Wenn sich an ihnen morphologische Ver- /~nderungen im Zusammenhang mit der Hydrolyse zeigen, so ist die Methode auch fiir alle weniger resistenten St rukturen zu verwerfen.

Die M6glichkeit, die Tetraden mit bestimmten Methoden lebensgetreu zu erhalten, hat B~LAf~ (1928a, 1929) in seinen ausgezeichneten Arbeiten an Stenobothrus selbst gezeigt. Die einzige Ver/tnderung gegenfiber dem Zustand intra vitam besteht in einer GrOBenverminderung yon etwa 15~ (gemessen an episkopischen Projektionen der B~LAf~schen Photographien). Gegentiber dieser sehr schonenden Fixierung mit Osmiumsiture und ihren Gemischen finder man nach den meisten iibrigen Fixie- rungsverfahren Formver~,nderungen der Tetraden, die man allgemein als Quellung bezeichnet, auch wenn gegenfiber den lebenden Chromosomen eine Gr6ilenabnahme eintritt. Aus diesem Grunde ist es n6tig, die nach der F~ULCE~schen Methode erhaltenen Pr/iparate nicht mit den bestfixierten, sondern mit gleichfixierten Strukturen zu vergleichen.

Die Sch/~digung durch die Hydrolyse /~ul~ert sich am auff/~lligsten in einer in verschiedenem lV[al3e auf t re tenden Vakuolisierung der Tetraden.

234 Hans Bauer: Die FEULGENsche Nuklealf~trbung

Den schwersten Grad der Vers sieht man in den Hoden, die mit PETRUNKEWITSCH fixiert worden sind. Das Innere der Tetraden zeigt ein grobsehaumiges Aussehen (Abb. 2a). Ahnlich, wenn auch nicht ganz so schwer gesch~digt, sehen die Tetraden in mit Sublimateisessig fixierten Schnitten aus (Abb. 2b). Die noeh recht groBen Vakuolen linden sich vorwiegend, doch nicht ausschlieBlich, in den axialen Teilen

der Gemini. Nur kleine Vakuolen finder man in den nach FLEMMINC fixierten Pr~paraten (Abb. 2c). Wenn sie auch hier die Chromosomenachsen be- vorzugen, so finder man sie doch aueh in den Rand- partien. Die Vakuolisation ist also nicht auf die Gren- zen zwischen den Chroma- tiden der Gemini beschr~nkt, sondern diese selbst werden, wenn aueh in geringerem MaBe, von der Strukturver~nderung betroffen. Keine Vakuo- lisation zeigen die Tetraden z. B. nach ZSNZER-Fixie- rung (Abb. 2d).

Abb. 2a--d. Tetradenstrukturerhaltung. Bezeichnet man dic a fixiert in PETRUNKEWITSCH ; b in Sublimateisessig;

c in FI, E~IMXNO; d in ZENKER. Vergr. 1680. vier verschiedenen Grade der Strukturerhaltung mit

den Kategorien 1--4, so kann man die einzelnen Fixierungsmethoden ihrer Wirkung naeh folgendermal]en in sie einordnen:

] : PETRUNKEWITSCH. 1---2: Die C~.sNor-Gemische.

2: Sublimateisessig, Sublimatalkoholeisessig, K~.HLE, Pikrinessigs~ure, BOUIN.

2- -3 : BouIN-DuBoscQ. 3: ZENKER-Formol, Chromessigs~ure, H~I~ANN, FLEMMING.

3- -4 : R~GAUD, BOUIS-ALLES, BouIs -ALL~-Subl imat . 4: ZENK~R, MERK~L-JUEL, H~.LLY, SASFELm~, R~GxumSublimat, CHAMPY,

FLEMMING-HEITZ. Es muB aber angemerkt werden, dab die Sch~digungen bei den Gruppen 3

und 3--4 nicht vt~Ilig der Hydrolyse zur Last gelegt werden k6nnen; denn ich habe geringe Vakuolisation auch nach BOUIN-ALLEN-, Z~.NS_ER-Formo1- und FLEMMING- Fixierung in mit anderen Methoden gef~rbten Prt~paraten beobachtet.

Die Veriinderungez~ der Tetraden]orm gehen parallel mit den Struktur- ver/inderungen und werden wahrscheinlieh in erster Linie durch die mit


der Vakuolisation eintretende Aufbl~hung bewirkt. Nach Fixierung mit den Gemischen der vierten Gruppe erfahren die Tetraden durch die Hydrolyse keine Formver/~nderungen mehr, wie es fiir CH~PY-Fixierung aus der Abb. 3 hervorgeht, die dieselben Gemini einmal vor der Hydrolyse nur mit Fuchsin gef/irbt, und einmal nach der FEvLGENmethode zeigt.

J b

Abb. 3 a und b. Te t raden , f ix ier t in CHA.~n~Y. a Fuchsinf/~rbung; b l~uklealf~trbung. Vergr . 1680.

Die Unterschiede zwisehen den einzelnen Fixierungen der vierten Gruppe bestehen in einer speziellen Fixierungswirkung, die sich vor allem in den formalinhaltigen Gemischen in einer Quellung hubert. Besonders deutlich zeigt dies Abb. 4, die Aquatorialplatten yon Spermatogonien darste]lt. In Abb. 4a ist eine Platte nach Fixierung mit FLEMMING-I-IEITZ abgebildet, die die Chromosomen in ihrer typischen schlanken Form zeigt.

Abb. 4 a--c. ~ q u a t o r i a l p l a t t e n yon Spermatogonien . a FLEMMING-HEITZ, Nuklealf~trbung; b HELLY, Nuklealf~irbung; c dieselbe P l a t t e vor der Hydro lyse , Fuehsinf/~rbung. Vergr. 1680.

Nach HELLY sind diese viel dicker geworden (Abb. 4b). DaI] diese Unter- schiede nur zum geringsten Tell dutch die Hydrolyse bewirkt werden, ist aus Abb. 4c ersichtlich, die die g]eiche Plat te wie Abb. 4b, aber vor der Hydrolyse darstellt.

An diesen beiden Bildern kann man gut den Wesensunterschied zwischen der Nuklealf/~rbung und der Anilinf/~rbung erkennen. W/~hrend das (im Bild unten liegende) Monosom sich bei dieser yon den Autosomen infolge seiner geringeren Dichte unterscheidet, gleicht es ihnen nach der F~vLG~N-Methode mehr. Hier ist eben die gleiche stoffliche gusammensetzung entscheidencl.

286 Hans Bauer: Die ]~EULGE.N'sche Nuklealfi~rbung

Um einen Begriff yon der Farbreinheit und Spezifit/~t der Nukleal- f~rbung zu geben, ist Abb. 5 farbig reproduziert. Die violetten Tetraden heben sich ganz scharf von dem durch die Osmiums/~ure gelbgetSnten Untergrund 1 ab. Die Nukleolen f/~rben sich, wie man sehr schSn z. B. an Alliumwurzelschnitten feststellen kann, ebenfalls gelbbraun, so dag man auf diese einfache, aber unbedingt sichere Weise eine ebenso klare Unterscheidung zwischen diesen und den Chromosomen erreicht, wie nach den komplizierten, aber in ihrem Ausfall unsicheren Methoden der FLEMMINoschen Dreifachf~rbung und ahnlicher.

Diese Ergebnisse der Strukturuntersuchung" stehen im Einklang mi~ den schon oben festgestellten Tatsachen iiber die zeitliche Erhaltung der Reaktionsf/ihigkeit des Chromatins bei verl~ngerter Hydrolyse.

Die Gemische, nach deren Anwendung sich schon bei ktirzerer Hydrolyse die F/~rbungs- mSglichkeit vertiert, die also die Zellstrukturen nicht fest genug fixieren, zeigen auch die schwersten morphologischen Sch/iden. Damit kommen wir, im Gegensatz zu den Vorschriften FEULGE~s, dazu, gerade das Sublimat in seiner Anwendung

Abb. 5. ~Ietaphase der ersten vor der Nuklealfi~rbung ]iir schdidlich zu halten. Reifeteilung. CHA~Pr, Als fiir Untersuchungen mit der FEULGEN-1V[e-

Nuklealffirbung. Vergr. 1680. rhode wirklich brauehbar bleiben somit nur

die Gemische der Gruppe 4, und auch unter diesen wird man zu den besten greifen kSnnen, zu CHAMrY und FLEMMING- HEITZ. (Xhnlich wird vermutlich auch das yon mir nicht bemltzte ALTMANNsche Gemisch zu brauchen sein.) Nut wenn es sich um Objekte handelt, die fiir diese schlecht eindringenden Gemische zu groB oder impermeabel sind, wird man eine der anderen Mischungen unter 4 nehmen mfissen, wobei man die fixierungsbedingten Ver/inderungen in den Kauf nehmen mug. Auszuschliellen ist die MERKEL-JunL-Fixierung, da sie nur geschw/ichte F/~rbung erlaubt.

2. Die iibrigen Chromatinstrukturen.

Gegeniiber den an den Tetraden gewonnenen Schlfissen kann man einwenden, daf~ deren unbesch/idigte Erhaltung eben auf ihrer Wider- standsf/~higkeit beruhe. Es ist daher nStig, auch die Prophase- und Interphasekerne, deren groBe Empfindlichkeit von BERG festgestellt worden ist, zu untersuchen. Natiirlich brauche ich mich nut mehr mit den Fixierungsmitteln der 4. Gruppe zu befassen.

Fiir die anderen Methoden kann ich die den BERGschen Angaben entspreehenden weitgehenden Strukturveri~nderungen best~tigen. Doch kommt es hier nicht

1 Wegen dieses Farbungseffektes ist es vorteilhaft, die sonst iibliche Bleichung der Praparate zu unterlassen.


darauf an, diese in ihrer regellosen Bedingung durch Quellung, Vakuolisation und Zerfliel3en zu schildern, sondern die unver/tnderte Erhaltung nach guter Fixierung zu demonstrieren.

Von den Interphasekernen wurden die Zellkerne der Peritonealhiille ausgew/ihlt, die ein sehr charakteristisches, balkiges bis grobscholliges

A b b . 6 a - - d . K c r n e y o n Peritonca,lhii l lT, c l lcn , a , b FLEhI3|ING-HE1TE; (~, d CITAI~IPI', a, c F u c h s J n f i i r b u n g ; b, d Nuk lea . l f i i rbnng . Verg'r. 1680.

Chromatingerfist enthalten. Abb. 6 zeigt zwei soleher Kerne aus mit FLEMMING-HEITZ (63~, b) und CgAMeY (6c, d) fixierten Hoden, einmal vor der Hydrolyse mit basischem Fuchsin gef~rbt (6a, e) und das andere Mal nach der F]~VLGENschen Methode dargestellt (6b, d). Es f/illt die weitgehende l~bereinstimmung sowohl der Anordnung, wie der Form der

A1)I). 7 n - -d . :Kcrno v a n P c r i t o n e n l h i i l l z c l l e n . a, 1) FLEM3HNG-tt Eg['Z, C, d l~.~;:GAul)-Snblinm.t ; a,. e FuehMnf f i rbnng ' ; b, d Nuk leMf f i r lmn~ . Verg'r. 99t~. N i e h t r e t u s c h i e r t .

Chromatinbrocken auf. Geringc Abweichungen kSnnen mit dem bei der starken Vergr60erung nicht zu umgehenden Zeichenfehler erkl/irt werden, (lie A1)weiehungen des Umrisses mit der Sehwicrigkeit, bei einer Dar- stelhmg mehrerer optischer Ebenen (tie gleiehe Kontur wiederzugeben; denn eine Kontrolle des erstgezeielmeten Bihles wurde natiirlich ver- mieden. Um ,~uch hier sicher zu gehen, wurde die Mikrophotographie herangezogen. Abt). 7a und b zeigen zwei diehtaneinander gelagerte

238 Hans Bauer: Die FEULGEssehe Nuklealf~rbung

Peritonealzellkerne einer mit FLEMMING-HEITZ fixierten Gonade vor (a) und nach (b) der Hydrolyse. Man kann die vSllige Identit~t der chromatischen Strukturen gut erkennen. Alle von BERC angegebenen Ver- ~inderungen: VolumvergrSl~erung der Kerne, Quellung und Vakuoli- sierung und ZerflieBen des Chromatins zu einheitlichen Bel~gen sind ausgebli~ben. Der einzige Unterschied zwischen beiden Bildern liegt darin, dab der F~.cLG]~Ngef~rbte Kern klarer und seine Struktur zarter ist. Von den zwei mSglichen Erkl~rungen halte ich die der Bedingung dieses Unterschiedes durch Substanzverlust fiir unrichtig; denn dann wiiren in erster Linie die feinen Verbindungsfi~den zwischen benachbarten Chromatinschollen aufgel6st worden. Vielmehr scheint mir dicse Differenz

bedingt durch die Verschiedenheit der Entstehung der F~rbung. Die FEULGEN- Methode kann keine Kunstprodukte her- stellen, w~hrend eine basische Anilin- f~rbung durch Farbniederschl~ge an der Oberfl~che der gef~rbten Strukturen diese vergrSl~ert (v. MOLLENDORFF 1924). So halte ich das nach der Nuklealf~,rbung wiedergegebene Bild fiir das struktur-

2~bb. 8 a u n 4 b. K e r n e v o n S p e r m a t o - getreue und das nach der Fuchsinfi~rbung c y s t e n m e m b r a n e n , f ix ie r t m i t FLE,~L- fiir artefiT;ell vergrSbert. Dieselben Er-

MING-HI~ITZ. a F u c h s i n f ~ r b u n g ; b Nuklealffirbung. Vergr. 1680. gebnisse kann man auch an andersfixier-

ten Hoden feststellen. Abb. 7c, d zeigen zwei Kerne nach R~GAvD-Sublimatfixierung. Auch in diesem Falle finden wir (bei Berficksichtigung einer geringen Einstellungsdifferenz) identische Strukturen, an denen Ver~nderungen nicht zu erkennen sind. Das gleiche gilt ffir die anderen Methoden der Gruppe 4 (auBer MERXEL- JUEL und vielleicht ZENKER) bei denen ich reich auf den Vergleich ~hnlieher Kerne beschr~nkt babe.

Auch Kerne aus den Cystenw'~nden mit einer andersartigen, fein- retikul~ren Struktur weisen keine Vers auf, wie ein Vergleich zweier verschieden gef~rbter Kerne (Abb. 8) ergibt. Diese Abbildung, wie auch die vorhergehenden, zeigt den Unterschied im f~rberischen Verhalten der Nukleolen, die nach der FEuicE~schen Methode ungef~rbt bleiben.

Nach diesen Ergebnissen fiir die somatischen Kerne, bei denen sich die sicher zum groBen Teil Fixierungsartefakte darstellenden Chro- matinstrukturen bis in die Einzelheiten hinein erhalten, kann ieh mich fiir die Prophasestadien kurz fassen.

Abb. 9 zeigt einige Stadien aus der Pr~meiose nach nuklealgef~rbten FLEMMING-HEITz-Pr~,paraten. Abb. 9a l i~t erkennen, da~ selbst das sehr empfindliche Leptots dureh die Hydrolyse nicht geseh~digt wird. Die feinen Chromosomenf~den fiillen den Kern ebenso gleiehmiiBig aus


wie im Eisenh/~matoxylinpr/iparat. Die im Vergleich zu den Abbildungen "con B~LAI~ (1929) gr5llere Unregelm/i$igkeit liegt wohl daran, dab ich mich genau auf einen optischen Schnitt beschr/inkt babe. Der friihe PachytKnkern (Abb. 9b, c) wurde unter m5gliehst genauer Beachtung der Chromiolen vor und naeh der Hydrolyse dargestellt. Man erkennt, dab selbst derartig subtile Gebilde die FEVL(~E~-Methode ohne Ver- /inderungen fiberstehen. Da{l die Chromosomen im iibrigen blab ge- f/~rbt sind, ist keine Folge der Hydrolyse, sondern kommt ebenso i m

Abb. 9 a - e . Wachs tumss t ad i en der Spe rma tocy ten . FLE~)IMING-I"IEITZ, Nukleal f t t rbung (b Fuehsinft trbung). a Lep to tan , b, c Pachyt t tn , derselbo K e r n vor un4 nach der Hydro ly se ;

d Strepsitttn, e Diakinese. Vergr . 1680.

Fuchsin- und Eisenh/~matoxylinpr/~parat zum Ausdruck. Pri~parate vom friihen Strepsit/in (Abb. 9d) zeigen klar den Verlauf der Chromatiden, Chiasmata und/ihnliches. Die Diakineseehromosomen (Abb. 9e) weisen alle Einzelheiten (Trennungsspalte, chromomerenartige Gliederung) auf, wie sie auch nach anderen Methoden dargestellt werden kSnnen. Irgend- welche ~nderungen der Struktur lassen sich nicht beobachten.

Nach anderen Fixierungsverfahren der vierten Gruppe kann man allgemein feststellen, dab gegeniiber dem gleichfixierten, nicht hydroly- sierten Pri~parat Ver/inderungen nicht auftreten. Doch sind die Ent- stellungen aller feinen Strukturen der Waehstumsstadien durch die Fixierung derart, da$ man sieh in ihrer Anwendung zuriickhalten wird.

In einigen sehr dichten Strukmren (den noch nicht fertigen SpermienkSpfen und dem Monosom der Wachstumsperiode) fiel mir mitunter eine geringe Vakuoli- sierung auf, die ich zuniichst doch auf die Hydrolyse zuriickfiihren zu mtissen glaubte. Aber auch hier zeigte die genaue Beobachtung, da$ sie schon vorher in den fixierten Strukturen vorhanden waren.

Z. f. Zellforschung u. mik r . Ana tomie . Bd. 15. 16

240 Hans Bauer: Die :FEuLOENsehe Nuklealfarbung

Absehliel3end 16st sieh also feststellen, dag aueh fiir feinere Struk- turen die aus der Tetradenbeobachtung gezogenen Sehltisse gelten und daft allgemein die in der vierten Gruppe vereinigten Fixierungsmittel alle Chromatinstrukturen derart koagulieren, dab selbst der sehwere Ein- griff der Hydrolyse yon ihnen ohne siehtbare Ver~nderung iiberstanden wird.

V. Kritische Bewertung der Methode.

Der yon FEULGEN selbst gegen die Anwendung der Nuklealfs ats morpholOgische Methode gemaehte Einwand grfindet sieh darauf, daft zur Erzielung der F/~rbung eine Molekiilspaltung unter Substanz- verminderung eintreten muB. In der Tat macht nach einer Angabe bei STEUDEL (1910) der bei der Abspaltung der Purine eintretende Gewiehts- verlust 20,60/0 der Nukleins/~ure aus. So schwer dies auch auf den ersten Blick erseheint, verringert sieh der Wert wesentlich, wenn man beriiek- sichtigt, daB die Nukleins~ure stets mit einem ebenfalls hochmoleku- laren Eiweiganteil zum Nukleoproteid gepaart ist und dab augerdem der Hauptanteil der Chromatinstrukturen wie aller organischer Substanzen aus Wasser besteht. Andererseits ist e'~ stetes Vorkommen in der Mikro- teehnik, dab betr/iehtliche Stoffmengen (Fette, Salze u.a.) en~fernt werden, ohne daf bei geeigneter Wahl der Methode eine Struktur- ver~tnderung mikroskopiseher GrSgenordnung dabei einzutreten braucht. Wesentliehe Vorbedingung fiir die Strukturerhaltung ist es nut, dab das Objekt so vorbereitet wird, dag es die betreffende Manipulation - - in unserem Fall die Hydrolyse - - ohne Sehaden iiberstehen kann.

Wit haben in den vorigen Absehnitten gesehen, dab diese Bedingung fiir die Nuklealf~rbung dutch eine Anzahl yon Fixierungen erfiillt wird. Diese beeinflussen die Chromatinstrukturen derart, dag sie zwar die Abspaltung der Puringruppen zulassen, gegen weitere Eingriffe aber resistent bleiben. Dadureh werden die Bedenken gegen die Verwendung der Nuklealfitrbung als eytomorphologisehe Methode hinfi~llig.

Die Vorteile dieses Verfahrens gegeniiber allen anderen vorwiegend physikalisehen Fitrbungsmethoden liegen in der spezifisehen Darstellung des Chromatins, dessen Abgrenzung gegen Nukleolen und plasmatisehe Strukturen mit keiner anderen Methode so einleuehtend und dabei einfaeh gelingt. Gegeniiber der fiir feinste Strukturen immer noeh vor- herrsehenden H~IDENHAIN-Fgrbung hat sie das Plus, auch dort deut- liehe Bilder zu geben, wo diese nieht ganz ausreieht, n/tmlieh gerade nach den besten Fixierungen, deren bedauertiehe Eigensehaft ja in der I-Ierabsetzung der F/irbbarkeit der Chromatinstrnkturen im Gegensatze zur ziemlieh starken F/i, rbung des Cytoplasmas besteht.

Der Sehwerpunkt der FEULGENsehen Methode liegt naeh ihrem Ent- decker in ihrer Anwendung als mikroskopisch-chemieche Reaktion. Gegen

in ihrer Anwendung auf cytologische Untersuchungen. 0,41

die tats/ichliche Leistung in dieser Hinsicht ist vielfache Kritik erhoben worden. Der wichtigste Einwand ist yon PRATJ~ (Diskussion zu Voss 1925) dahingehend gemacht worden, dab mit der fuchsinschwefligen S~ure nur eine allgemeine Aldehydreaktion zu erhalten ist und dab dureh die voraufgehende ttydrolyse bei tier groBen Anzahl der in der Zelle vorhandenen organischen Verbindungen ,,sich aus einigen yon ihnen" ,,Aldehydgruppen abspalten kSnnen" Will man diesen Einwand, der ja wohl nur in den wenigsten F~llen mikrochemiseh zu widerlegen ist, auf seine Stichhaltigkeit priifen, so bleibt~ nur der Weg, du[ch Vergleich der reagierenden Strukturen ihre morphogenetische Beziehung zum Chromatin zu untersuchen.

Im Kern gibt nach allen gemachten Erfahrungen nur das Chromatin eine positive Reaktion. Der yon Voss (1925) erhobene Befund, auch Nukleolen kSnnen die F~rbung geben, ist schon in der an seinen Vortrag anschlieBenden Ausspraehe richtig als F~rbung yon Chromatinnukleolen bezeichnet worden. G. I-IERTWIG (1929) glaubt, daB allgemein manche basophilen Nukleolen (z. B. im waehsenden Ei) positive Nuklealf~rbung geben kSnnen, wie er es fiir zwei in den Sertolizellen des Maushodens vorhandene gefunden hat. Er h/~lt es ffir mSglich, dal~ solche Gebilde keine Chromatinnukleoli ( : umgewandelte heteropyknotisehe Chromo- somen) sind, sondern mit diesen nur die Nukleins/~ure als ergas~isehes Material gemeinsam haben. Dazu mfiBten erst positive Befunde soleher ,,Nukleinnukleoli" vorliegen. Es ist mir wahrscheinlieh, dab die Gebilde in den SE~TOLischen Zellen echte Chromatinnukleolen sind, wenn auch der Nachweis schwierig sein wird. Freie Nukleins/~ure in Nukleolen wiirde sich bei der Hydrolyse wohl 15sen. Der einzige anscheinend sichere Fall einer positiven Reaktion an einem nukleolenartigen Gebilde ist der von R~ICHE~OW (1928) erhobene Befund am Makronukleus yon Chilodon eucullulus, bei dem der BinnenkSrper eine sehwaehe Reaktion gibt und stark sich f/~rbende ChromatinkSrnchen erzeugen soll. Wenn auch diese Erseheinung an einem so speziellen Gebilde wie dem Makronukleus Verallgemeinerungen nieht befiirchten 1/~13t, bedarf sie doeh wegen ihrer Isoliertheit und wegen der Schwierigkeit, sich eine Chroma~in- bildung ohne Zusammenhang mit den Chromosomen vorzustellen, noch genauerer Untersuchung. Positive Reaktion am Kernsaft ist mi rn ie zu Gesieht gekommen. Ieh halte reich fiir bereehtigt, derartige Angaben tells auf sekund~re F/~rbung nach hydrolytischer ZerstSrung der Chroma- tinstrukturen, tells auf optische Tguschung (W~RMr.L 1927) zurfiek- zufiihren.

Ein Einwand gegen die Sicherheit der F~.vLG~Nschen Reaktion ist ihr durch BSLAft (1926) bUS der Tatsaehe gemacht worden, dab die Kerne wachsender Chilopodeneier keine Nukiealf~trbung geben (naeh KOCH 1925). Diese Erseheinung kann ieh fiir mehrere Tierarten (So/aster papposus, Astropeeten miilleri, Stenobothrus parallelus, Phyllodromia

16"

242 Hans Bauer: Die FEULOF.Nsche Nuklealf~rbung

germanica, Dytiscus marginalis, Ephestia kiihniella) best/~tigen 1. Es fragt sich nur, ob man sie so wie Bi~LA~ bewerten soll. Mir best~Ltigt dieses Ergebnis den auch von K o c g gezogenen Schlul~, dab die Chromo- somensubstanz, das Karyot in der botanischen Autoren, sich im wachsenden Ei chemisch ver/~ndert, wie es auch aus anderen F/irbungs- und Verdauungsversuchen bisher schon hervorgeht. Die Nukleal- reaktion errant eben nur die nukleins/~urehaltige Komponente des Karyotins und nur insofern, als diese in den meisten F/~llen (aber in der Regel nicht odor nur in ver/~ndertem Mengenverh/~ltnis im wachsenden Oocytenkern) mit dem pemanen ten Chromosomenteil (der ,,achromatischen" Komponente) vereinigt ist, ist die Methode als Chromatin- reaktion zu bezeichnen.

Diego Auffassung entspricht in manchem der mit der Abkehr yon der ehemischen Theorie der F~rbung grollenteils verlassenen Hv.ID~.~H~Nschen Anschauung yon der Dualit~t des Chromatins in Form yon Oxy- und Basichromatin, die neben- einander im Kerngerfist vorhanden sein sollen. Doch wird man das Gewicht auf die ,,aehromatische" Komponente legen miissen und die allerdings h~ufigste Situ- ation der Durchtr~nkung (?) des Karyotins mit einer nukleingauren Komponente als besonderen physiologischen Zustand auffassen, dernur graduell, nieht alternativ yore oxyphilen Zustand unterschieden ist. Dabei bleibt sehon die Frage, ob in jedom Interphasekern ,,Oxychromatin" neben dem basophilen Chromatin vorhanden ist, often, noch mehr natiirlich die weiteren Vorstellungen fiber die granul~re Form usw.

Deutungsvorsuche fiber die Art der phygiologischen Abhgngigkeit der nuklein- sAurehaltigen yon der achromatischen Komponente und ihre spezielle Leistung als Schutzkolloid (HAAsX-BEss~,LL) oder spezifigches Adsorbens fiir die Gone (GOLD- SCHmDT) sind natiirlieh noah vSllig hypothetigch.

Eine Chromatinreaktion im Sinne BI~LA~S, die auch odor nur den permanenten Chromosomenanteil mikrochemisch erfaBt, wird es nie geben, da dieser im Gegensatz zu der Einheitlichkeit der nukleinsi~ure- haltigen Komponente sich gerade durch groBe chemische Mannigfaltigkeit auszeichnet.

Die yon FEULG~.Ir (1926) gegebene Erkl/~rung, dal~ die fehlende F/~r- bung der wachsenden Eikerne einzig durch die Unterschwelligkeit der an sich vorhandenen Reaktion bedingt wird, scheint mir nicht zuzutreffen. I m Ovar yon Dytiscus miiflte der Eikern, in dem noch dazu der ganze RingkSrper (s. unten) eingegangen ist, im Vergleich zu den auch stark vergrSllerten, kr~ftig gef/~rbten Iqs eine diesen mindestens /~hnliche Reaktion geben, wenn diese v o n d e r Quantit~t des in den Kern aufgenommenen Chromatins abhinge. Er bleibt aber ungef~rbt 2.

Dagegen k6nnte diese Deutung FEULGENs fiir sehr kleine Kerne gelten, bei denen bisher keine Fgrbung erhalten wurde (Plasraodium

x Ob stets v611ige Entf~rbung eintritt, wie Koch es ffir die Chilopoden angibt, mull im einzelnen untersueht werden. Bei Stenobothrus land ich wg, hrend der ganzen Wachstumsperiodo feinste gef~rbte Struktttren.

s Es spielen bier allerdings die noch ungeklgrten Fragen der sekundaren Chromatinvermehrung eine Rolle, doeh kann auf sio nicht eingegangen werden.

in ihrer Anwendung auf eytologische Untersuchungen. 243

/atciparum und Pl. vivax nach PAW.~ 19311). Fiir Bakterien ha l ja bereits Vol t (1925) gezeigt, dab sie erst in dicker Schicht eine positive Reaktion geben. Sehr einfach kann man dieses auch an den Nahrungs- vakuolen von Bakterienfressern unter den Ciliaten, z .B. Colpldium campylum, erkennen, in denen die dichtgedr~ngten Bakterienmengen deutliche Rosafi~rbung zeigen. Bei den intrazellul~ren Symbionten yon Phyllodromia germanica erhielt ich schwaehe, aber deutliche Reaktion am einzelnen Symbiontenindividuum.

Es muB abet Skeptikern zugegeben werden, dab diese positive F~rbung bei Bakterien im Sinne PRA.TJEs nicht eindeutig als Nachweis ftir das Vorkommen von Chromatin gewertet werden kann. Es kSnnte sieh, aueh unter Beriieksichtigung dessen, dab die Reaktion erst nach der Hydrolyse auftritt, um eine Reaktion anderer Stoffe handeln.

Einigermal3en sicher bleibt die Aussage fiber die Chromatinnatur extranukledrer Strulcturen, wenn sich ffir sie der morphogenetische Zu- sammenhang mit den Chromosomen feststellen l~flt. So ist es nicht erstaunlich, dab mir die bei der Diminution abgestoBenen Chromo- somenenden yon Ascaris megalocephala positive Reaktion ergaben. Sehr klare F~rbung erhielt ich bei dem chromatischen Ring in den Oogonien von Dytiscus marginalis. Damit wird die yon FI~]~DERIXS~ (1922) aus anderen chemischen und f~rberischen Reaktionen erschlossene Chrom~tin- natur entgegen der yon DEBAISIV.UX (1909) und, ihm folgend, B~LA~ (1928C) behaupteten Nukleolennatur besti~tigt.

Dagegen konnte ich keine positive Reaktion des Eliminationsehroma- tins von Ephestia kighniella erzielen. Es best~tigt sich hiermit der yon W.~GNER (1931) auf Grund vom f~rberischen Verhalten erschlossene Unterschied vom Chromatin. Jedoch glaube ich nieht an Beziehungen zu Spindelstrukturen, da FOGG (1930) gezeigt hat, dab aueh bei Ephestia die eliminierte Substanz zwischen den Tetradenh~lften abgeschieden wird. Es ist wahrscheinlich, d~B es sich um Absonderung einer sehr nukleinsi~urearmen Substanz seitens der Chromosomen handelt. Dies mfissen weitere Versuche entscheiden 2.

Nichtlc'aryogene Strukturen, die eine positive F~rbung ergeben, wird man trennen mfissen in solche, die erst mit der W~rmehydrolyse die Nuklealf~rbung zeigen, und andere, bei denen diese schon ohne das Salzsi~urebad eintritt.

Zu den ersteren gehSrt die Reaktion der Blepharoplasten bei Trypano- somen und Bodo (RoBEI~TSON 1927), sowie die am ehromatischen

1 Bei clem nahestehenden Proteosomu praecox gaben die Kerne der Sporo- goniestadien mir positive Reaktion, die besonders deutlieh in reifen Ooeysten ausfiel, in denen bei der regelm~fligen Anordnung der Sporozoiten die Kerne sich h~ufig decken. Dadurch summiert sich der F~rbeeffekt.

Auf die hier mitgeteilten Befunde an waehsenden Eikernen und an der Chro- elimination bei Ephestia komme ich ausftihrlich zuriick.

244 Hans Bauer: Die F~ULG~Nsche Nuklealfarbung

Netzwerk in den Lymphocystiszellen 1. Es mul3 in diesen F~llen der persSnlichen Entseheidung des einzelnen iiberlassen bleiben, ob ibm die positive F~rbung als Ind iz ium fiir die Chromat innatur geniigt. Andere mikrochemische EntscheidungsmSglichkeiten wird es, wenigstens fiir die winzigen Blepharoplasten, nicht geben.

Ein Weg, der manehmal noeh zum Ziel fiihren wird, ist der der Aufstellung einer F~irbbarkeits-Hydrolysezeit-Kurw (Abb, 1). Findet man fiir die untersuchten Strukturen den gleiehen Verlauf wie ftir die Kernfarbung, so wird dies stark fiir ihre Chromatinnatur sprechen. Zweckmal]ig wi~hlt man in diesem Fall Sublimat- fixierung, um das fragliche Intervall der Hydrolysedauer einzuschr~nken. Treten Untersehiede im Kurvenverlauf auf, wie sie z.B. bei den NIssL-Schollen nach R]~D~.~Z (1924) erheblieh sind, bei denen sehon bei viel sehw~cherer Hydrolyse

Abb. 10 a und b. Starkef~irbung. a Vicia narbonensis, DermatogenzeIle FLEMMING-tIEITZ, Nuldealf~trbung; b Allium Cepa, Kalyptrazelle FLEMMING-BENDA, Fuchsinschweflige Sfiure

ohne vorhergehende Hydrolyse. a Vergr. 1680, b 1120.

als bei den Kernen Maximalf~rbung erhalten wird, so beweist dies, dab kein echtes Chromatin vorliegt. Es ist dann eine Frage fiir sich, ob nukleins~urehaltige Stoffe oder andere in dem Fall die Reaktion bedingen.

Zur Gruppe der Strukturen, die schon ohne Hydrolyse 2 eine Farb- reakt ion ergeben, gehSrt die Elast ikaf~rbung (FEuLGE~) und die yon mir in Keimwurzeln gefundene Reakt ion der St~rke.

Diese Fi~rbung hat sich als sehr elektiv erwiesen. Abb. 10a stellt eine Derma- togenzelle aus der Keimwurzel yon Vicia narbonensis nach F~vLo~.~-F~rbung (Hydrolysedauer 15 Minuten) dar. Neben der sehr klaren Chromatinf~rbung findet man die Proplastiden in ihren angesehwollenen Teilen deutlich rosa gefarbt. Diese Reaktion tritt schon ohne die Wiirmehydrolyse auf, wie aus Abb. 10b hervorgeht, die eine Zelle der Kalyptra yon AUium Cepa darstellt. Man sieht die lebhaft rotgef~rbten StatolithenstitrkekSrner basal gelagert, w~hrend der am oberen Pol

1 Ich kann dies fiir die Lymphocystiszellen yon der Flunder und vom Knurrhahn best~tigen. Die F~rbung tritt erst naeh der Hydrolyse ein.

Ob in diesen FMlen die geringe hydrolytische Wirkung der fuchsinschwefligen S~ure eine Rolle spielt, wie fiir das Zustandekommen der Volutinf~rbung (R~Ic~- Now), ist im Einzelfall dutch Verkiirzung der F~,rbezeit zu kl~ren, ftir die Unter- seheidung dieser Strukturen vom Chromatin aber natiirlieh unwiehtig.


gelegene Kern vSllig ungef~rbt geblieben ist. Die Reaktion tritt nur an mit Chrom- siture fixierten Zellen auf. Ob wir eine echte Aldehydreaktion, die auf chemischer Ver~nderung der St~rke durch die auch sonst als Aldehyderzeuger in der Chemie verwandte Chroms~iure beruhen kSnnte, oder eine Pseudoreaktion infolge Impreg- nation der sehr dichten St~rke durch die Chromsaure vor uns haben, muB ich often lassen (vgh S. 229).

Neben der Tatsache, dal3 diese Strukturen schon ohne die Hydrolyse mit der fuchsinschwefligen S~ture eine Reaktion geben, unterscheiden sie sich im Farbton yon dem stets mehr blaustichig gef~rbten Chromatin. Verwechslungen der St~rke mit Chromatin werden noch dadurch ausgeschlossen, da~ sie w~hrend der Hydrolyse sich unter Auftreten yon stark lichtbrechenden Vakuolen allm~hlich auflSst.

DaB es schlieBlieh noch Gebilde gibt, die nur ohne Hydrolyse 1 eine Reaktion ergeben, wie das Volutin (REICI~ENOW), sei bier nur noch erw~hnt. Verwechslungen mit dem Chromatin sincl bei ihnen natiirlieh ebenso ausgeschlossen, wie bei der diffusen Plasmareaktion.

Im ganzen kommt der FEvLG~schen Methode bei der nStigen Kritik in der Analyse die ihr zugesprochene Bedeutung als mikroskopisch- chemische Reaktion auf (nukleinss Chromatin zu. Gegeniiber dem Einwand PRATJ~s ist ZU verlangen, dab das Vorhandensein von organischen Verbindungen, aus denen sieh bei gleicher Behandlung wie ffir chromatische Strukturen Aldehydgruppen freimachen lassen, die aber strukturgebunden bleiben, erst einmal nachgewiesen wird. Bedenkt man, welehe besonderen Eigensehaften der Thymonukleins~ure die Reaktion ermSgliehen: leichte Abspaltung bestimmter Gruppen, die Anwesenheit des bisher chemiseh ganz isoliert stehenden Kohlen- hydratkomplexes, der auch in saurer Reaktion freie Aldehydgruppen tr~gt, und sehlieBlich relative Labilit~tt des restlichen Molekiils, so wird der Naehweis bestimmt nicht an sehr vielen der zahlreichen organisehen Stoffe der Zelle zu fiihren sein.

Anhang: IIinweise auf die Ausfiihrung der Nuklealf~irbung. In Ergiinzung zu den technischen Vorschriften yon F ] ~ L G ~ (1926)

kann ich folgende Fingcrzeige geben. Bei der Vorbereitung des Schnittmaterials sind keine irgendwelchen Anderungen

der iiblichen Veffahren nStig. Die Methylbenzoat-Zelloidin-Paraffineinbettung nach PkTERFZ ist in keiner Weise stSrend. Beim Aufkleben der beliebig dicken Schnitte verwende man etwas mehr Eiweiflglyzerin als gewShnlich (1---2 Tropfen auf 1 ccm Wasser). Die Schnitte miissen gut antrocknen, gegebenenfalls angeschmolzen werden. L~ngerer Aufenthalt in starkem Alkohol ist iiberfliissig, da das evil. vorhandene Plasmalogen schon bei der Alkoholh~rtung gel0st worden ist. Die Hydrolyse nehme man zweckm~13ig im Wasserbad vor (z. B. einer Porzellanschale mit flachem Boden). Man kann dann die Temperatur genauer konstant halten und braueht nicht so oft zu kontrollieren. Sehwankungen zwischen 59--61 ~ schaden nichts. Es kSnnen mehrere Pr~parate gleiehzeitig hydrolysiert werden

z Vgl. 2ram. 2 S. 244.

246 Hans Bauer: Die FEULGENsche Nuklealfarbung

(ieh nehme bis zu 8), nur mull man dann ffir etwas erh6hte W/~rmezufuhr sorgen, um die Abkfihlung der Salzs~ure auszugleichen. Da doch eine Temperatursenkung um einige Grad eintritt, verl~ngere man die Hydrolyse um kurze Zeit. Die Dauer braucht nicht so i~ngstlich eingehalten zu werden. Geringe Verl/~ngerung fiber die Optimaldauer sehaden in der Regel nichts. Den Aufenthalt in der fuchsinschwefligen S~ure bemesso man auf ungefi~hr 1 Stunde. Auch pflanzliche Objekte land ich dann gut gef~rbt. Jedoeh sehadet erhebliehe Verlangerung gar nichts. Die W/~sserung in sehwefeldioxydhaltigem Wasser ist nur nStig, wenn man ganz exakte Farbreaktionen erzielen will. Ffir einfaehe Chromosomenuntersuchungen genfigt Abspfilen der fuehsinschwefligen S~ure unter dem kr~ftigen Strahl der Wasserleitung. Gesamt- f~rbung mit dem Fuchsin ist dabei nicht zu beffirchten "und wird, selbst weim sie eingetreten ist, im Wasser und Alkohol bis auf eine geringe Blauung, die gut als Plasmaf~rbung dient, wieder ausgezogen. L/~ngeres W~ssern in fliellendem Wasser gibt erheblieh sattere F~rbung (Erkl~rung ?). Zur Naehfiirbung (nur nach osmium- saurefreien Fixierungsmitteln) verwende ich ganz sehwache, hellgrfine Liehtgrfin- 15sung, mit der man eben deutliche Hervorhebung der Konturen erreicht. Bei kr~ftiger Grtinf~rbung wird eine schwache Nuklealf~rbung substanzarmer Kerne leicht verdeckt.

Wertvoll ist es noch besonders, dab man diese Methode auch noeh nach einer Eisenh~matoxylinfiirbung am gleichen Pr~parat anwenden kann. Zwar farbt sich dann das Plasma gelbliehrosa (Pseudoreaktion ?), abet die Unterschiede zwischen nukleolarem und ehromatischem Material kommen klar zum Ausdruck. Bei besonders wertvollen Objekten kann man also drei Methoden nacheinander gebrauchen: erst Anilinf~rbung (etwa GI~MsA-G~LEI oder GRAM), dann H~I])E~ArN-Fgrbung und zuletzt die Nuklealfi~rbung.

Um ffir Kurszwecke mSglichst einfaeh nuklealgef~rbte Pr/~parate zu erzielen, versuche man den yon Voss (1926) angegebenen Weg der Totalbehandlung der Organe. Bei mit FLEMiNG-HErtz fixierten Heuschreekenhoden habe ieh mit den yon Voss angegebenen Zeiten ganz gute Resultate bekommen.

I m ganzen ist die H a n d h a b u n g der FEVLG~N-Fs derar t ig einfach und im Hinbl ick darauf , daI~ man nie irgendwelche Verluste du tch falsche Differenzierung u . a . hat , 5konomisch, dal~ ihr eine ganz andere Verbre i tung als sie heute noch ha t zukommt .

Zum SchluB ist es mir eine angenehme Pfl icht , He r rn Professor Dr. R~ICH~OW meinen ~iefen D a n k dafi i r auszusprechen, daft er mir du tch ~be r l a s sung eines Arbe i t sp la tzes und Unters t f i tzung mi t allen Hi l f smi t te ln es ermSglicht hat , auch in dieser wir tschaf t l ich schweren ZeR wissenschaft l ich wei ter zu arbei ten.

Zusammenfassung. 1. Bes t immte Verl/ ingerung der Hydro lysedaue r ergibt maximale

Nuklealf/~rbung nach den meis ten Fixierungsverfahren. 2. I )er Grad der St ruktursch/ id igung dutch die Hydro lyse ist yon der

F ix ie rungsa r t abhi~ngig. Eine Reihe yon Methoden, besonders Chrom- osmium- und Chromformolgemische, f ixier t die Chromat ins t ruk turen derar t , dab keine Ver~nderungen an ihnen eintreten. D a m i t is t die Verwendung der Nukleal f~rbung a]s morphologische Methode gcsichert.


3. Die Auswer tung als mikroskopisch-chemische Reak t ion 1/iBt in der Mehrzahl tier F/file sichere Entsche idung fiber die Chromat inna tu r der un te r such ten S t ruk tur zu.

4. Chromat inreakt ion wurde am Diminu t ionschromat in yon Ascaris megalocephala u n d am ehromatischen Ring in den Oogonien yon Dytiscus marginalis festgestellt.

5. Waehsende Eikerne mehrerer Tierar ten u n d das El iminat ionschromat in yon Ephestia kiihniella gaben keine Reakt ion.

6. Die fuchsinschweflige S~ure bewirkt Rot f~rbung der St~rke in mit Chroms~ure f ixier ten Keimwurzeln .

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die feulgensche nuklealfärbung in ihrer anwendung auf cytologische untersuchungen

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