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Die Geschichte der Validierung des LAL-Tests

Manfred LiebschZEBET (ZentralsteIle zur Erfassung und Bewertung yon Ersatz- und Erganzungsmethoden zum Tierversuch),D-Berlin

Zusammenfassung

Unter den fiebererzeugenden Stoifen (Pyrogenen) habendie bakteriellen Endotoxine gram-negativer Bakteriendie grojJte Bedeutung. Da Endotoxine als Verunreini-gungen im Produktionsprozefi in pharmazeutischeProdukte gelangen konnen, wird als Prufung auf Rein-heit seit etwa 50 Jahren der Test auf Pyrogene (Fieber-test) am Kaninchen weltweit gesetzlicn verlangt. DerLAL-Test nutzt als in vitro Test eine Gerinnungsreaktionder Blutzellen des Pfeilschwanzkrebses Limulus polyphe-mus, die Zellen beim Kontakt mit bakteriellen Endotoxi-nen zeigen. Diese Reaktion ist der auch beim Menschenbei Belastung mit Endotoxinen auftretenden Blutgerin-nung sehr ahnlich. Obwohl der LAL-Test EndotoxineEndotoxinen sehr viel empfindlicher nachweist als derKaninchen-Test, hat der Test erst 25 Jahre nach seinerEntwicklung behordliche Akzeptan: als Ersatz desKaninchen-Tests erreicht. Verzogert wurde die rascheEinfiihrung des LAL-Tests, weil einige Stoife die LAL-Reaktion storen konnen, und weil es fiebererzeugendeStoife gibt, die keine Endotoxine sind. Der LAL-Test mujJdaher auch heute noch fiir jedes neue Produkt alsErsatzmethode for den Fiebertest am Kaninchen pro-duktbezogen validiert werden, z.B. in Deutschland nacheiner seit 1993 gultigen Richtlinie. Nach den Erfahrun-gen der Letzten 10 Jahre kann der LAL-Test etwa 95%der Kaninchen Tests ersetzen, dabei wird das Risiko furden Verbraucher nicht erhoht.

Keywords: LAL-test, bacterial endotoxin, rabbit pyroge-nicity test, validation, regulatory acceptance, productsafety, alternatives to animal testing

1 Einleitung

Summary: History of the LAL-test: validation andregulatory acceptance

Bacterial endotoxins gram-negative bacteria are themost relevant substances inducing hyperthermia inhumans(pyrogens). Since endotoxins may contaminatepharmaceutical preparations during production process,purity is assured by monitoring the increase in bodytemperatur of rabbits exposed to such preparations. Thisbioassay can be replaced by the LAL-test in which theclotting reaction of blood cells of the hordeshoe crablimulus poLyphemus is measured after contact withbacterial endotoxins. Although this reaction is signifi-cantly more sensitive to endotoxins than hyperthermia inrabbits, the LAL-test had to undergo 25-30 years ofvalidation to achieve regulatory acceptance. Althoughendotoxin induced blood clotting in Limulus is quitesimilar to the same reaction in humans, acceptance ofthe assay as an alternative to testing in rabbits wasdelayed, since chemicals present in pharmaceuticalpreparations may interfere with the LAL clotting reac-tion. In addition, fever can be induced also by sub-stances other than enodtoxins. Therefore it has to beproven for each new preparation that the LAL-test canreplace the rabbit pyrogen test in a case by case valida-tion according to guidelines, as e.g. the German guideli-ne, which was released in 1993. During the past decadesome laboratories of the pharmaceutical industry inGermany were able to, replace 95% of the rabbit pyro-gen tests by the LAL-test without increasing the riskforhumans.

AIle pharmazeutischen Substanzen,Zubereitungen und biologischen Pro-dukte, die dem Menschen unter Um-gehung des Verdauungstraktes ver-abreicht werden, d.h. parenteraldurch Injektion oder Infusion (sog.Parenteralia), miissen auf Unbedenk-lichkeit hinsichtlich moglicher fie-bererzeugender (sog. pyrogener) Ei-

genschaften gepriift werden. Das giltauch fur Medizinprodukte, die direktoder indirekt mit dem Blut des Men-schen in Kontakt kommen. Die be-hordlich geforderte Priifung auf Py-rogene (d.h. auf fiebererzeugendeStoffe) erfolgt im Tierversuch amKaninchen, und zwar durch die Be-stimmung des Anstiegs der Korper-temperatur nach intravenoser Injekti-on der zu priifenden Substanz. Die

Prufung auf Pyrogene ist weltweit inArzneibiichern beschrieben, z.B. furDeutschland im Deutschen Arznei-buch (DAB), fur Europa in der EUPharmakopoe und fur die USA in derUS Pharmakopoe. Dieser biologi-sche Test wird sowohl im Rahmender Zulassung eines neuen Arznei-mittels, als auch sparer bei Chargen-kontrollen des bereits zugelassenenArzneimittels verlangt.

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~r;")~ LIEBSCH--~~~------------------------------¥v~Durch eine spezifische Reaktion

der Blutkorperchen (Amobozyten)des Pfeilschwanzkrebses (Limuluspolyphemus) konnen bakterielle En-dotoxine, die die wichtigste Gruppeder Pyrogene bilden, im sogenanntenLimulus Amobozyten Lysat (LAL)Test sehr empfindlich und spezifischnachgewiesen werden. Die Amobo-zyten werden fur diesen Test durchschonende, tierschutzgerechte Punk-tion aus Pfeilschwanzkrebsen ge-wonnen. Da die Endotoxine die ge-fahrlichsten Pyrogene sind - undin vielen Parenteralia auch als einzi-ge -, wurde der LAL-Test bereitskurz nach seinerEntwicklung vor ca.25 Jahren als in vitro Methode zumErsatz des Pyrogentests am Kanin-chen vorgeschlagen. Seit dieser Zeitwurde der LAL-Test in vielen welt-weit durchgefuhrten Studien opti-miert, seine Brauchbarkeit und Rele-vanz fur die Testung verschiedenerProdukte gepruft und fur eine standigzunehmende Anzahl yon Produktenbehordlich akzeptiert.Die Geschichte der Entwicklung

des LAL-Test ist besonders interes-sant. Einerseits hat sie zum weitge-henden Ersatz eines Tierversuches inder sicherheitstoxikologischen Risi-kobewertung gefuhrt, andererseitssind die dem Test zugrunde liegen-den Mechanismen wissenschaftlichgut untersucht und wurden fur rele-vant befunden. Sie ist weiterhin auswissensehaftlichen Grunden bei-spielhaft, da der Pyrogenitatstest amKaninchen nicht generell ersetztwerden konnte. Es muB auch heutenoch fur jedes neue Produkt durchden Hersteller belegt werden, daBder LAL-Test geeignet ist, den Testauf Pyrogene am Kaninchen voll-standig zu ersetzen. Die Validierungerfolgt also produktbezogen. Auslo-send fur Entwicklung und Validie-rung des LAL-Tests waren ursprung-lich nieht der tierschutzerische Grun-de, sondern die offenkundigen Gren-zen des Tierversuches bei der Te-stung bestimmter Produkte. Die fol-gende Ubersicht stutzt sieh zum Teilauf Gedanken, die Flint kiirzlich ineiner Ubersicht dargestellt hat(1994).

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2 Der Test auf Pyrogene amKaninchen

Naeh der Einfuhrung der Injekti-onspritze vor etwa 150 Jahren findensieh in der Literatur erste Berichteuber injektions-bedingtes Fieber,darunter auch Fieber nach Injektionyon destilliertem Wasser (Billroth,1865; Burdon-Sanderson, 1876).Spater wurde nachgewiesen, daB diePyrogenitat nicht durch Hitzesterili-sation der Injektionslosungen zu be-seitigen war und somit keine direkteFolge der Kontamination mit leben-den Keimen darstellte. Als pyrogeneKomponente wurde in Injektionslo-sungen eine "nicht-protein-artige",hitzestabile Substanz beschrieben(Centanni, 1894), mit der in mehre-ren Studien zu Beginn dieses Jahr-hunderts bei Kaninchen Fieber aus-gelost werden konnte. Die erste Be-schreibung des Pyrogenitatstests amKaninchen mit Injektion yon inakti-vierten, gram-negativen Bakterienerfolgte durch Hort & Penfold(1912). Der standardisierte Pyroge-nitatstest am Kaninchen wurde abererst Anfang der 40er Jahre in denUSA durch Ringversuehe validiert(z.B. McCloskey et aI., 1943) und indie US Pharmakopoe (USP) aufge-nommen. Zwischen den ersten Fie-bertests am Kaninchen und der Auf-nahme dieses Tests in behordlicheRichtlinien lagen also etwa 30 Jahre.Nach der im Europaischen Arznei-

buch (EP) und im Deutschen Arznei-buch (DAB) identischen VorsehriftV.2.1.4 (DAB 10, 1991) werden imPyrogenitatstest zunachst drei Ka-ninchen intravenos behandelt. Liegtder Anstieg der rektalen Korpertem-peratur pro Kaninchen unter O.4°C,ist die Charge unverdachtig, liegt eruber 0.9°C, ist die Charge abzuleh-nen; liegt der Wert dazwischen, istdie Prtifung mit drei weiteren Kanin-chen zu erganzen. Die Hinzunahmeyon jeweils drei weiteren Tierenkann bis zu maximal 12 Tierenerfolgen. Liegt bei 12 Tieren dieSumme der Korperternperatur-Zu-nahmen iiber 6.6°C (= 0.55°C/Tier),ist die Charge endgiiltig abzulehnen.Die Kaninchen durfen fur eine er-

neute Prufung bedingt wiederver-wendet werden.Ungeachtet der Fragen des Tier-

schutzes (z.B. Fixierung der Kanin-chen wahrend des Versuches), zeigtdiese Beschreibung, daf sich derPyrogenitatstest je nach Ausgang derersten Prufungen zu einer zeitauf-wendigen, kostenintensiven Proze-dur entwickeln kann. Ais problema-tisch hat sich aber die Tatsacheerwiesen, daB bestimmte Stoffe imPyrogenitatstest nieht prufbar sind.Dies sind z.B. Substanzen, zu derenpharmakodynamischen Eigensehaf-ten eine Senkung (z.B. Sedativa,Narkotika) oder Steigerung (z.B. Zy-tokine) der Korpertemperatur gehort,aber auch aIle Molekule, die allergi-sche Reaktionen hervorrufen kon-nen, wie Antibiotika, Plasmaproteineund Antigene. Mit der Einfuhrungder radioaktiven Arzneimittel (Ra-diopharmazeutika) urn 1970 entwik-kelte sich rasch ein dringender Be-darf zum Ersatz des Kaninchentests.Radiopharmazeutika sind Arzneimit-tel oder Zubereitungen, die Radionu-klide (radioaktive Elemente) enthal-ten und meistens zu diagnostisehenZweeken eingesetzt werden. Radio-nuklide haben oft kurze Halbwertzei-ten, sie sind also kurzlebig und in deroben beschriebenen, zeitaufwendi-gen Prozedur am Kaninchen niehttestbar. Diese Unzulanglichkeit desKaninchentests war die wesentlicheUrsache fur erste Validierungen desLAL-Tests, der zufallig zu diesemZeitpunkt als standardisierter Testzum Nachweis bakterieller Endoto-xine beschrieben wurde (Cooper etal.,1971).

3 Endotoxin

Ais Endotoxin wird ein Gemiseh ausder Wand gram-negativer Bakterienbezeichnet, das fur die Fieberreakti-on bei Infektionen mitverantwortlichist. Diese Endotoxine bestehen ubcr-wiegend aus Lipopolysaeehariden(LPS) sowie aus Proteinen und Spu-ren yon weiteren Komponenten. DieLPS-Komponente des EndotoxinsumfaBt eine groBe Zahl weiterer

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Molektile yon unterschiedlicher Gro-Be. Gelangt Endotoxin in das Blutdes Menschen, so wird abhangig yonder Menge ein klinisches Krank-heitsbild hervorgerufen, das von ein-facher Temperaturerhohung bis hinzum dramatischen Endotoxinschockmit hohem Fieber und Gerinnung desBlutes mit Todesfolge (DIC = disse-minated intravascular coagulation)reicht.Durch Endotoxin aktiviert, setzen

Makrophagen Botenstoffe frei, ne-ben andern Interleukin-l (IL-I) undTumor-Nekrose-Faktor (TNF). Wah-rend IL-I Reaktionen verschiedenerOrgane hervorruft (u.a. Fieber durchden Hypothalamus), leitet TNF inden Endothelzellen der Gefalse denProzef der Blutgerinnung ein. Dane-ben kann Endotoxin uber die Akti-vierung des Gerinnungsfaktors XIIdirekt die Blutgerinnung auslosen.Die zuletzt genannte, direkte Wir-kung ahnelt in iiberraschender Weisedem Ablauf der Gerinnung des Blu-tes des Pfeilschwanzkrebses, der dieGrundlage des LAL- Tests bildet(Flint, 1994).

4 Der LAL- Test auf bakterielleEndotoxine

Durch die Untersuchungen yonHowell (1885) waren schon Endedes vorigen Jahrhunderts die Ahn-lichkeiten zwischen der Gerinnungdes Blutes beim Menschen und derGerinnung der Harnolymphe("Blut") beim Limulus nachgewie-sen worden. Diese Untersuchungenwurden dann iiber 70 Jahre nichtweiter verfolgt, bis Bang (1956) einebakterielle Infektion in einer Pfeil-schwanzkrebs-Population beschrieb,die zur Gerinnung (= Koagulation)des Blutes der Pfeilschwanzkrebsefuhrte. Untersuchungen der Ursa-chen fur diese Reaktion brachten dieErkenntnis, daB die Koagulation desLimulus-Blutes eine Reaktion derAmobozyten auf bakterielle Endoto-xine darstellte (Levin und Bang,1964). Nach griind1ichen Untersu-chungen dieses Phanomens wurdeeine standardisierte Methode zum

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Nachweis von Endotoxinen be-schrieben (Levin & Bang, 1968), dieauf dem Prinzip beruhte, daB einLysat (= gewaschene Zellen des Blu-tes) von Amobozyten des Pfeil-schwanzkrebses bei Kontakt mit En-dotoxinen gerinnt und ein Gel bildet.Zu dieser urspriinglichen Testvarian-te, die auf einer qualitativen End-punktbesimmung der Gelbildungnach 60 Minuten beruhte, wurdenspater noch sensitivere Methodenentwickelt.Obwohl die an der Blutgerinnung

beteiligten Mechanismen beim Men-schen komplizierter sind als beimPfeilschwanzkrebs, sind sie prinzipi-ell ahnlich (Reaktionskaskade mitVerstarkungsfunktion) und habenahnliche funktionelle Komponenten.So miissen die Gerinnungsfaktoren Cund 0 bei Limulus zum Auslosen derKaskade ebenso aktiviert werden wieder Faktor XII bei der Blutgerinnungdes Menschen. Die Blutgerinnungbei Limulus und beim Menschenkann mit den gleichen Enzym-inhibi-toren gehemmt werden und syntheti-sche Substrate zum Nachweis derGerinnungsfaktoren des Menschenbilden ebenso Substrate fur die Kom-ponenten des Gerinnungssystemsvon Limulus (Flint, 1994).Selbstverstandlich gibt es auch

Substanzen, die den LAL- Test sto-ren. Nach Pericin (1986) sind diewichtigsten Stoffgruppen, die sichnicht im LAL- Test priifen lassen,Antikoagulantien (EDT A, Citrat,Heparin, u.a.), Enzym-Inhibitoren(SH Gruppen), einige Plasmaprotei-ne (z.B. g-Globuline, Albumin undalle Gerinnungsfaktoren), RauwolfiaAlkaloide, und Zubereitungen, dieeinen Gehalt von mehr als 2% Etha-nol aufweisen. AIle heute gtiltigenRichtlinien fur die Validierung desLAL- Tests beinhalten daher einePrufung der moglichen Interferenzendes LAL Tests mit Bestandteilen desPriifproduktes in Form einer gleich-zeitigen Prutung (sog. .spiken") desProduktes mit Zugabe einer definier-ten Menge internen Endotoxin-Stan-dards.

5 Grenzen beim Nachweis yonPyrogen en, die keine Endotoxinesind (sog. nieht-endotoxinPyrogene), im LAL- Test

Der LAL- Test erfaBt Pyrogenitat, dieauf einer Kontamination mit Endoto-xinen beruht, mit viel hoherer Sensi-tivitat als der Kaninchentest. Anders-artige fiebererzeugende Stoffe wer-den jedoch nicht erkannt. Zu diesenStoffen zahlen Alkaloide, Steroide,Redoxfarbstoffe, kolloide Metalle,Weichmacher, Antigen-Antikorper-komplexe und Botenstoffe, wie dasCytokin Interleukin-I (selbst endo-genes Pyrogen). Sofern solche Stoffeals geplante Bestandteile eines Pro-dukts Pyrogenitat erwarten lassen,sollten uber einen Zeitrum beideTests (Kaninchentest und LAL- Test)parallel durchgefiihrt werden. Be-sondere Vorsicht ist geboten, wennnicht der Hauptwirkstoff, sondernproduktionsbedingte Verunreinigun-gen Pyrogene enthalten, die keineEndotoxine sind (sog. nicht-endoto-xin Pyrogene), wie z.B. Weichma-cher. Die heute vorgeschriebene Si-cherung der Qualitat der Produktionnach den Richtlinien der "good manu-factoring practice" (GMP) schlieBtdiese Faile allerdings nahezu aus. Soberichtet Muller-Calgan (1993), daBbei 29 000 Priifungen in den Labora-torien der Firma Merck nur bei 2Produkten mit je einer Rohstoffchar-ge Pyrogenitat auftrat, die durch denEndotoxingehalt nicht erklarbar war.Es ist dabei zu unterstreichen, daf

Produkte, die nicht-endotoxin-Pyro-gene enthalten, als unerwunschteNebenwirkung beim Menschen zwarFieber erzeugen konnten, nicht aberden gefurchteten Endotoxin Schock.Wie bereits dargestellt, wurde urndie Jahrhundertwende das Endotoxingramnegativer Bakterien als Auslo-ser yon Fieber und sehr viel schwere-rer Symptome bis hin zum LPS-Schock entdeckt. Historisch gesehendiente dcr Pyrogen test am Kanin-chen in erster Linie dem Schutz desMenschen vor endotoxin-kontami-nierten Produkten und weniger voranderen, moglicherweise Fieber er-zeugenden Substanzen.

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¥0~Der LAL-Test kann nach den vor-

angehenden Ausfuhrungen sicherden Pyrogentest am Kaninchen nichtvollstandig ersetzen. Umgekehrt istder Pyrogentest am Kaninchen zumNachweis bakterieller Endotoxineunempfindlicher als der LAL-Test.Nach Flint (1994) erfassen beideTests jeweils ein Teilgeschehen desgefurchteten Endotoxin-Schocks. Soist die Blutgerinnung (DIC) nicht dieeinzige Reaktion auf Endotoxine, sietritt jedoch bei jeder hohen Bela-stung mit Endotoxinen auf. 1m LAL-Test wird diese spezifische Reaktionzum aufierst empfindlichen Nach-weis yon Endotoxinen verwendet,und zwar bis hinunter in den pg-Bereich, in dem Endotoxine fur denMenschen noch vollig ungefahrlichsind. Die im Kaninchentest erfaBteFieberreaktion ist ebenso nur einewichtige Reaktion auf Endotoxine,die bei jeder Belastung mit Endoto-xinen auftritt. Betrachtet man alsodie Empfindlichkeit beider Tests, sowird deutlich, daB sich beide Tests inder Hinsicht gleichen, daB sie we-sentliche Teilreaktionen (Fieber undBlutgerinnung) der komplexen Re-aktion des Korpers auf Endotoxinerfassen.

6 Produktbezogene Validierungdes LAL- Tests - Unterschiedezwischen den USA (FDA) undEuropa (EP)

Gemaf den derzeit gultigen Richtli-nien zur Validierung des LAL-Testsrnuf sichergestellt werden, daB sichder LAL-Test fur die Testung einesProduktes eignet. Dies gilt fur neuar-tige Produkte ebenso wie fur dieUmstellung der regelrnafsigen Char-genkontrollen eines im Verkehr be-findlichen Produktes vom KaninchenTest auf den LAL-Test. Die Validie-rung ist also fur jedes Produkt vomjeweiligen Hersteller einzeln durch-zufuhren und nicht in Ringversuchenwie in der Toxikologie. Weiterhin istzu beriicksichtigen, daB nach denbisherigen Erfahrungen mit Paren-teralia Endotoxine grampositiverBakterien und anderer Keime prak-

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tisch nicht mehr vorkommen unddaher kein Sicherheitsrisiko fur denMenschen darstellen (Muller-Cal-gan, 1993). Somit ist der LAL-Testin der Lage, bei voller Wahrung derPrinzipien des maximalen Verbrau-cherschutzes den Test auf Pyrogeni-tat schrittweise zu ersetzen.Es gibt einen grundsatzlichen Un-

terschied bei der Validierung desLAL-Test zum Ersatz des Tests aufPyrogenitat am Kaninchen in denUSA und in Deutschland. Nach derheute gultigen FDA Richtlinie(FDA, 1987) rnussen fur das zuprufende Produkt folgende Nachwei-se experimentell gefuhrt werden:1. Es muB die Sensitivitat des ver-

wendeten LA-Lysates und derverwendeten Testvariante (Gel-bildung, Turbidimetrie oder"Chormogen-Substrat-Methode")durch mehrfache Testung einerVerdunnungsreihe eines Endoto-xin Standards nachgewiesen wer-den.

2. Es ist nachzuweisen, daB in demPraparat keine Storfaktoren ent-halten sind, die das Ergebnis desLAL-Tests positiv oder negativverfalschen konnen. Dies ge-schieht durch gleichzeitige Te-stung des fertigen Produktes miteiner bekannten Menge an Endo-toxin (engl. "spiken").In Deutschland muB entsprechendder derzeit gultigen Richtlinie zurValidierung des LAL-Tests (Bun-desanzeiger 2: 6.01.1993, Seite67) zusatzlich zu diesen zweiNachweisen experimentell nach-gewiesen werden, daB

3. das Produkt keine nicht-endoto-xin-Pyrogene enthalt. Auch wenndie pharmakologisch-toxikologi-sche Charakterisierung des Pro-duktes solche Pyrogene nicht er-warten laBt, muB dieser Nachweisdurch Paralleltestung im Kanin-chen-Test und LAL-Test erbrachtwerden. Vorgeschrieben sind da-bei drei verschiedene Produkti-onschar-gen, wenn aus der Ent-wicklung des Produktes keine Da-ten mit Paralleltestung vorliegen,oder an mindestens einer Produkt-ionscharge, wenn schon wahrend

der Produktentwicklung parallelgetestet wurde.

4. Bei jeder wesentlichen Anderungdes Herstellungsverfahrens muBdie Validierung des LAL-Testsgemali Punkt 1-3 nochmals erfol-gen (sog. Revalidierung).

7 Behordliche Akzeptierung desLAL-Test

AuslandIn den USA begann das Bureau ofBiologics der FDA erstmalig 1973den Gebrauch des LAL-Tests zuregulieren (Federal Register, 1973)und propagierte den Test fur dieAnwendung bei Radiopharmazeutikaim Jahr 1976. Zwar wurde der LAL-Test als Methode in die US Pharma-copoe (USP XX) bereits 1980 aufge-nommen, aber erst 1987 wurde dieendgiiltige Richtlinie der FDA furdie Anwendung das LAL-Tests an-stelle des Tests auf Pyrogenitat ver-offentlicht (FDA, 1987). Seit Verof-fentlichung des 5. Nachtrages derUSP XXII am 15.11.1991 ist dieZahl der Beschreibungen der Her-stellung einzelner Arzneimittel insog. "Monographien" auf uber 200angestiegen, in denen der "BET' (=Bacterial Endotoxin Test = LAL-Test) den Test auf Pyrogene amKaninchen ersetzt hat.

DeutschlandSeit Erscheinen des DAB 9,2. Nach-trag im Jahre 1991, darf jeder Her-steller gemaf dcr allgcmcincn Mo-nographie .Parenteralia" den LAL-Test anstelle der Prufung auf Pyroge-ne am Kaninchen anwenden "...wenndies in einer Monographie des Arz-neibuches vorgeschrieben oder vander zustdndigen Behorde zugelassenist", In Fallen der Neuzulassung oderNachzulassung war dies unproble-matisch, da die zustandige BehordenBGA und PEl (Paul Ehrlich Institut)nut der Beurteilung von Zulassungs-unterlagen nach dem neuesten Standwissenschaftlicher Erkenntnis gemafs§2 AMG vertraut waren. Ftir Her-steller, die jedoch die regelmalsiggeforderten Qualitatskontrollen eines

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~~~~.zugelassenen, bereits im Verkehr be-findlichen Produktes vom Kanin-chentest auf den LAL-Test umstellenwollten, waren die Uberwachungs-behorden der Lander zwar zustandig,aber mit der Beurteilung derartigerUnterlagen nicht vertraut. 1m DAB10 wurde daher Anfang 1992 derTerminus .zustandige Behorde"durch .zustandige Bundesoberbehor-de" ausgetauscht, d.h. seit dieser Zeitwerden die im Zuge yon Anderungs-anzeigen eingereichten Unterlagender Hersteller im BGA und seit dem1.7 .1994 im NachfolgeinstitutBfArM (Bundesinstitut fur Arznei-mittel und Medizinalprodukte), so-wie im PEl im Rahmen der Amtshil-fe beurteilt. Es solI in diesem Zusam-menhang nicht unerwahnt bleiben,daB diese Tatigkeit trotz der Ande-rung im DAB 10 nicht ganz unpro-blematisch ist, da die oberen Bun-desbehorden formaljuristisch nichtzustandig sind fur die Zulassung yonTestverfahren, sondern fur die Zulas-sung yon Produkten.Die Anderung des DAB war fur

viele Hersteller van Parenteralianoch nicht befriedigend, da gleich-zeitig in Deutschland noch keineoffizielle Richtlinie veroffenlichtvorlag, in der der Umfang und dieArt der Untersuchungen fur die Vali-dierung des LAL- Tests als Ersatzzum Pyrogen test am Kaninchen ge-nau definiert war. Basierend auf derim Bundesverband der Pharmazeuti-schen lndustrie erarbeiteten Richtli-nie zur Validierung des LAL- Tests(Kiltz-Schwalm et aI., 1991) verof-fentlichten daher die beiden zustan-digen Bundesoberbehorden BGAund PEl (Bundesanzeiger 2:6.01.1993, Seite 67) eine .Bekannt-machung zur Moglichkeit des Ersat-zes der Priifung auf Pyrogene durchdie Prufung auf Bakterien Endotoxi-ne nach DAB 10 (Parenteralia; Prii-fung auf Reinheit)", Aus dieserRichtlinie kann seitdem jeder Her-steller entnehmen, wie er den LAL-Test fur sein Produkt validierenkann.Bei der abschlieBenden Wertung

ist festzuhalten, daB zwar das DABdie Umstellung vom Test auf Pyro-

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gene auf den LAL Test nicht zwin-gend verlangt, daB aber das Tier-schutzgesetz immer dann die An-wendung einer versuchstierfreienMethode zwingend vorschreibt,wenn mit ihr das gleiche Ziel erreichtwerden kann. Bei sorgfaltiger, pro-duktbezogener Validierung trifft dasfur den Ersatz des Pyrogen test amKaninchen durch den LAL- Test inden meisten Fallen zu.

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KontaktadresseManfred LiebschZEBET, Zentralstelle zur Erfassungund Bewertung von Ersatz- undErganzungsmethoden zum Tier-versuch, Bundesinstitut furgesundheitlichen Verbraucher-schutz (BgVV)Diedersdorfer Weg 1, 12277 Berlin

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