dirvinių asiūklių (equisetum arvense l.) žolės skystųjų ekstraktų
TRANSCRIPT
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
DMITRIJ VELIKIJ
DIRVINIŲ ASIŪKLIŲ (EQUISETUM ARVENSE L.) ŽOLĖS
SKYSTŲJŲ EKSTRAKTŲ ANTIMIKROBINIO IR PRIEŠVĖŽINIO
AKTYVUMO ĮVERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė
Doc. dr. Vilma Petrikaitė
Konsultantai
Prof. dr. Jurga Bernatonienė
Prof. dr. Alvydas Pavilonis
KAUNAS, 2015
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis
Data
DIRVINIŲ ASIŪKLIŲ (EQUISETUM ARVENSE L.) ŽOLĖS SKYSTŲJŲ EKSTRAKTŲ
ANTIMIKROBINIO IR PRIEŠVĖŽINIO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Konsultantai Darbo vadovė
Prof. dr. Alvydas Pavilonis Doc. dr. Vilma Petrikaitė
Data Data
Prof. dr. Jurga Bernatonienė
Data
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantas
Dmitrij Velikij
Data Data
KAUNAS, 2015
TURINYS
SANTRAUKA ......................................................................................................................................... 5
SUMMARY ............................................................................................................................................. 6
SANTRUMPOS ....................................................................................................................................... 7
ĮVADAS ................................................................................................................................................... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ..................................................................................................... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA .......................................................................................................... 10
1.1. Dirvinio asiūklio apibūdinimas ir fitocheminė sudėtis ................................................................ 10
1.1.1. Augalo apibūdinimas ir paplitimas ....................................................................................... 10
1.1.2. Vaistinė augalinė žaliava, jos ruošimas ir laikymas ............................................................. 11
1.1.3. Dirvinių asiūklių žolės ir jos preparatų fitocheminė sudėtis ................................................. 11
1.2. Dirvinio asiūklio ir jo preparatų biologinis aktyvumas ............................................................... 12
1.2.1. Antimikrobinis aktyvumas .................................................................................................... 12
1.2.2. Priešvėžinis aktyvumas ......................................................................................................... 13
1.2.3. Kiti biologiniai poveikiai ...................................................................................................... 14
1.3. Svarbiausių biologiškai aktyvių junginių apžvalga ..................................................................... 16
1.4. Tyrime naudotų vėžinių ląstelių linijos ir mikroorganizmų kultūros .......................................... 18
2. TYRIMŲ OBJEKTAS IR METODAI ............................................................................................... 20
2.1. Tyrimo objektas ........................................................................................................................... 20
2.2. Reagentai, priemonės ir įranga .................................................................................................... 21
2.3. Antimikrobinio aktyvumo tyrimas in vitro šulinėlių metodu ...................................................... 23
2.4. Antimikrobinio aktyvumo tyrimas in vitro skiedimo standžioje terpėje metodu ........................ 23
2.5. Priešvėžinio aktyvumo tyrimas in vitro ....................................................................................... 23
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ................................................................................ 25
3.1. Dirvinių asiūklių žolės skystųjų ekstraktų antimikrobinis aktyvumas ........................................ 25
3.2. Dirvinių asiūklių ekstraktų veikliųjų medžiagų antimikrobinis aktyvumas ................................ 27
3.3. Dirvinių asiūklių ekstraktų gamybos sąlygų įtaka antimikrobiniam aktyvumui ......................... 29
3.4. Dirvinių asiūklių žolės skystųjų ekstraktų priešvėžinis aktyvumas ............................................ 31
3.5. Dirvinių asiūklių ekstraktų veikliųjų medžiagų priešvėžinis aktyvumas .................................... 33
3.6. Dirvinių asiūklių žolės ekstraktų gamybos sąlygų įtaka priešvėžiniam aktyvumui .................... 34
4. IŠVADOS ........................................................................................................................................... 36
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ................................................................................................. 37
6. LITERATŪRA ................................................................................................................................... 38
5
SANTRAUKA
D. Velikij magistro baigiamasis darbas: Dirvinių asiūklių (Equisetum arvense L.) žolės
skystųjų ekstraktų antimikrobinio ir priešvėžinio aktyvumo įvertinimas. Mokslinė vadovė: doc. dr. V.
Petrikaitė, konsultantai: prof. dr. Jurga Bernatonienė, prof. dr. Alvydas Pavilonis. Lietuvos sveikatos
mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Vaistų chemijos katedra. Kaunas, 2015.
Darbo tikslas – įvertinti dirvinių asiūklių (Equisetum arvense L.) žolės skystųjų ekstraktų
antimikrobinį ir priešvėžinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti dirvinių asiūklių žolės skystųjų ekstraktų antimikrobinį (priešgrybelinį ir antibakterinį)
aktyvumą.
2. Nustatyti ekstraktų pagrindinių veikliųjų medžiagų antimikrobinį aktyvumą.
3. Įvertinti priklausomybę tarp ekstraktų gamybos sąlygų ir jų antimikrobinio aktyvumo.
4. Ištirti dirvinių asiūklių žolės skystųjų ekstraktų priešvėžinį aktyvumą.
5. Nustatyti ekstraktų pagrindinių veikliųjų medžiagų priešvėžinį aktyvumą.
6. Įvertinti priklausomybę tarp ekstraktų gamybos sąlygų ir jų priešvėžinio efektyvumo.
Tyrimo metodai. Ekstraktų ir pasirinktų veikliųjų medžiagų (kvercetino, apigenino ir
kemferolio) antimikrobinis aktyvumas įvertintas in vitro, skiedimo standžioje terpėje ir šulinėlių
metodais. Priešvėžinis aktyvumas nustatytas tiriant ekstraktų poveikį žmogaus vėžio ląstelių
proliferacijai in vitro MTT metodu. Remiantis gautais eksperimentiniais duomenimis, įvertinta
priklausomybė tarp ekstraktų paruošimo sąlygų ir antimikrobinio bei priešvėžinio aktyvumo.
Tyrimo rezultatai: Dirvinių asiūklių žolės skystieji ekstraktai didžiausią antibakterinį
aktyvumą turi prieš Baccillus genties bakterijas. Tirtus mikroorganizmus labiau veikė vandeniniai
ekstraktai, pagaminti ekstrakciją vykdant žemesnėje temperatūroje. Ekstraktų veikliosios medžiagos
kvercetinas, apigeninas ir kemferolis labiausiai slopino S. aureus ir B. subtilis augimą, silpnai veikia
E. faecalis ir C. albicans mikroorganizmus. Etanoliniai dirvinių asiūklių ekstraktai labiausiai slopino
melanomos (IGR39) ir plaučių karcinomos (A549) ir ląstelių proliferaciją. Ekstraktai, pagaminti
ekstrahentu naudojant 70 proc. (V/V) etanolį, yra aktyvesni už tuos, kurie pagaminti ekstrahuojant
90 proc. (V/V) etanoliu. Apigeninas ir kvercetinas slopino IGR39 ir A549 vėžinių ląstelių proliferaciją
7,5 - 34,1 µM koncentracijomis. Kemferolis tirtų vėžinių ląstelių proliferacijos beveik neslopino.
Išvados: Dirvinių asiūklių žolės ekstraktai pasižymi antimikrobiniu ir priešvėžiniu aktyvumu
ir galėtų būti panaudoti kaip pagalbinė priemonė gydant infekcinius ar onkologinius susirgimus.
6
SUMMARY
D. Velikij master’s thesis: Evaluation of antimicrobial and anticancer activity of Equisetum
arvense L. herbal liquid extracts. Scientific supervisor: Assoc. Prof. Dr. V. Petrikaitė, advisors: Prof.
dr. Jurga Bernatonienė, Prof. dr. Alvydas Pavilonis. Lithuanian University of Health Sciences, Faculty
of Pharmacy, Department of Drug chemistry. Kaunas, 2015.
The Aim of the Research: To evaluate antimicrobial and anticancer activity of Equisetum
arvense L. herbal liquid extracts.
Objectives:
1. To determine antimicrobial (antibacterial and antifungal) activity of Equisetum arvense L. herbal
liquid extracts.
2. To evaluate the relationship between the extraction conditions and antimicrobial activity of
extracts.
3. To determine antimicrobial activity of the main components of extracts.
4. To determine anticancer activity of Equisetum arvense L. herbal liquid extracts.
5. To evaluate the relationship between the extraction conditions and anticancer activity of extracts.
6. To determine anticancer activity of the main components of extracts.
Methods: Antimicrobial activity of Equisetum arvense L. herbal extracts and main
constituents (quercetin, apigenin, kaempherol) was tested in vitro by using serial dilution technique in
agar and diffusion into agar. Anticancer activity was tested by evaluating cancer cell viability by
colorimetric MTT assay. On the basis of obtained experimental data the relationship between
extraction conditions and antimicrobial and anticancer activity was established.
Results: Equisetum arvense herbal liquid extracts possess the highest activity against
Baccilus bacteria. Extracts prepared at lower temperatures are more active against majority of tested
microorganisms compared to those prepared at higher temperatures. The active compounds of extracts
quercetin, apigenin, and kaempherol were found to be effective inhibitors against S. aureus, B. subtilis
growth, but had slight effect on E. faecalis and C. albicans growth. Horsetail ethanolic extracts were
most effective on lung carcinoma (A549) and melanoma (IGR39) cell proliferation. Extracts made by
using 70 percent of ethanol were much more active than those made by using 90 percent of ethanol.
Apigenin and quercetin inhibited proliferation of IGR39 and A549 cancer cells at the concentrations
from 7.5 to 34.1 µM. Kaempherol was not active against tested cancer cell lines.
Conclusions: Field horsetail herbal extracts have antibacterial and antitumor activity and
could be used as an aids in treatment of infectious and oncological diseases.
7
SANTRUMPOS
AIDS įgytas imunodeficito sindromas (angl. acquired immune deficiency sindrome)
ATCC Amerikos ląstelių kultūrų kolekcija (angl. American type culture collection)
A549 žmogaus nesmulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelių linija
DMSO dimetilsulfoksidas
DNR deoksiribonukleorūgštis
EMA Europos vaistų agentūra (angl. European Medicines Agency)
ES Europos Sąjunga
GI50 koncentracija, slopinanti 50 proc. ląstelių augimą
HeLa žmogaus gimdos kaklelio vėžio plokščialąstelinių ląstelių linija
HT-29 žmogaus storosios žarnos adenokarcinomos ląstelių linija
IGR39 žmogaus melanomos ląstelių linija
LR laisvieji radikalai
MSK mažiausia slopinamoji koncentracija (angl. minimum inhibitory concentration)
MCF-7 žmogaus krūties adenokarcinomos ląstelių linija
MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il-)-2,5- difeniltetrazolio bromidas
PSO Pasaulio sveikatos organizacija
UV ultravioletas
U87 žmogaus glioblastomos ląstelių linija
VAŽ vaistinė augalinė žaliava
8
ĮVADAS
Remiantis 2012 metų Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis, onkologinės ir
infekcinės ligos yra viena dažniausių mirties priežasčių (po širdies ir kraujagyslių ligų) [1]. Lietuvos
sveikatos apsaugos ministerijos Higienos instituto Sveikatos informacijos centro duomenimis,
2013 metais nuo piktybinių navikų mirė 7872 žmonės. Daugiausiai iš jų mirė nuo plaučių, bronchų ir
trachėjos vėžio. Tais pačiais metais nuo infekcinių ir parazitinių ligų mirė 632 asmenys [2].
Mirštamumas ir sergamumas nuo infekcinių ligų smarkiai sumažėjo pradėjus vartoti
antimikrobinius preparatus XX a. pradžioje. Vis dėlto, dėl antibiotikų piktnaudžiavimo ar gydytojo,
vaistininko nurodymų nepaisymo mikroorganizmai dažnai tampa atsparūs antimikrobinėms
medžiagoms. Dėl to visame pasaulyje auga poreikis naujiems efektyviems preparatams infekcinėms
ligoms gydyti [3].
Pastaruoju metu daugėja mokslinių publikacijų, aprašančių vaistinių augalų preparatų
vartojimą gydyti onkologinius susirgimus, antibiotikams atsparių mikroorganizmų sukeltas infekcijas.
Vienas iš vaistinių augalų, kuris galėtų būti pritaikytas chemoterapijoje, yra dirvinis asiūklis [4,5,6].
Asiūklis yra vienas seniausių žemės augalų. Pasaulyje rastos 32 asiūklių rūšys. Dirvinių
asiūklių (Equisetum arvense L.) ir jo preparatų biologinis aktyvumas pradėtas tyrinėti tik XX amžiaus
pradžioje. Europos vaistų agentūros (EMA) augalinių vaistinių preparatų komitetas pripažino dirvinį
asiūklį vaistiniu augalu remiantis jo tradiciniu vartojimu medicinoje bei ikiklinikinių tyrimų
rezultatais, kurie rodo įvairų ir didelį jo biologinį aktyvumą in vitro ir in vivo: priešmikrobinį,
priešvėžinį, diuretinį, priešuždegiminį, žaizdas gydantį, hepatoprotekcinį, analgezinį, antioksidacinį ir
kt. [4,8].
Vokietijoje ir Anglijoje vartojama daug vaistinių preparatų, kurių sudėtyje yra dirvinių
asiūklių žolės [7]. Lietuvoje vartojamos asiūklių žolės arbatos, ekstraktų yra patvirtintuose maisto
papilduose.
Magistro baigiamojo darbo tyrimams dirvinis asiūklis pasirinktas neatsitiktinai. Ši vaistinė
augalinė žaliava Lietuvoje tirta labai mažai, o jos ilga vartojimo patirtis rodo reikšmingą naudą žmonių
sveikatai. Dirvinių asiūklių žolės ekstraktai turi biologiškai aktyvių medžiagų pvz., kvercetino,
apigenino, kemferolio, kurios efektyviai veikia antibiotikams atsparias mikroorganizmų šeimas,
slopina vėžinių ląstelių augimą. Neatmetama galimybė asiūklio ekstraktus panaudoti kaip pagalbinę
priemonę gydant infekcinius, onkologinius bei kitus susirgimus.
Darbo rezultatų pristatymas:
Šio darbo rezultatai buvo pristatyti Lietuvos sveikatos mokslų universitete 2014 m. lapkričio
22 d. vykusioje 5-oje tarptautinėje farmacijos mokslų konferencijoje. Pranešimo pavadinimas
„Antimicrobial properties of Equisetum arvense herbal extracts“.
9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas
Įvertinti dirvinių asiūklių (Equisetum arvense L.) žolės skystųjų ekstraktų antimikrobinį ir priešvėžinį
aktyvumą.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti dirvinių asiūklių žolės skystųjų ekstraktų antimikrobinį (priešgrybelinį ir antibakterinį)
aktyvumą.
2. Nustatyti ekstraktų pagrindinių veikliųjų medžiagų antimikrobinį aktyvumą.
3. Įvertinti priklausomybę tarp ekstraktų gamybos sąlygų ir jų antimikrobinio aktyvumo.
4. Ištirti dirvinių asiūklių žolės skystųjų ekstraktų priešvėžinį aktyvumą.
5. Nustatyti ekstraktų pagrindinių veikliųjų medžiagų priešvėžinį aktyvumą.
6. Įvertinti priklausomybę tarp ekstraktų gamybos sąlygų ir jų priešvėžinio efektyvumo.
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Dirvinio asiūklio apibūdinimas ir fitocheminė sudėtis
1.1.1. Augalo apibūdinimas ir paplitimas
Dirvinis asiūklis yra paplitęs visoje Kanadoje, Europoje, pietų Turkijoje, Irane, Kinijoje,
Japonijoje. Tai daugiametis žolinis sporinis augalas. Iš šakniastiebio išauga dviejų rūšių stiebai:
vaisingi (pavasariniai) ir nevaisingi (vasariniai). Pavasariniai sporifikuojantieji stiebai 10-30 cm
aukščio, nešakoti, gelsvai rudi, su dantytomis piltuvėlių pavidalo makštimis, užsibaigiantys sporinėmis
varputėmis, kurioms subrendus, stiebai nudžiūsta. Sporifikuoja balandžio– gegužės mėnesį. Paskui
išauga nevaisingi (vasariniai) stiebai - jie yra aukštesni, gali siekti iki 60 cm, žali, tuščiaviduriai,
išsišakoję. Šakos nariuotos, keturbriaunės ar penkiabriaunės, lapai žvynelių pavidalo, redukuoti
[6,8,10].
1 pav. Dirvinių asiūklių žolė (paveikslas parengtas remiantis literatūros šaltiniu [6]).
11
1.1.2. Vaistinė augalinė žaliava, jos ruošimas ir laikymas
Vaistinė augalinė žaliava (VAŽ) – dirvinių asiūklių žolė (Equisetum arvense L. herba). Pagal
Europos farmakopėją, naudojami sterilūs stiebai renkami vasarą, kurie apibūdinami kaip „Equiseti
Herba”. Antžeminė dalis skleidžia silpną aromatą, skonis silpnai rūgštus arba beskonis. Surinkta VAŽ
paskleidžiama plonu sluoksniu, tamsioje gerai vėdinamoje patalpoje, kasdien kruopščiai pavartoma
[9].
1.1.3. Dirvinių asiūklių žolės ir jos preparatų fitocheminė sudėtis
Cheminės analizės tyrimų duomenimis, dirvinių asiūklių žolėje yra daugiau nei 10 proc.
neorganinių junginių (du trečdaliai jų yra silicio rūgštis ir įvairios natrio druskos), taip pat augalas
praturtintas fenolinėmis rūgštimis, flavonoidais bei steroliais (β-sitosteroliu).
Skirtingose geografinėse pasaulio vietovėse augančių asiūklių žolės flavonoidų sudėtis
skiriasi, nustatyti du chemotipai. Šiaurės Amerikoje ir Azijoje augančių asiūklių žolėje yra liuteolino
5-O-gliukozidas ir jo esteris. Tuo tarpu Europoje augančiuose asiūkliuose šių junginių yra mažai, o
daugiausiai yra kvercetino 3-O-gliukozido, apigenino 5-O-gliukozido ir dikafeil-meso-vyno rūgšties.
Medicininiam pritaikymui dažniausiai naudojami sterilūs stiebai [10].
Dirvinių asiūklių nevaisingų stiebų fitocheminė sudėtis:
Mineralai: kalis (1,8 proc.), kalcis (1,3 proc.), aliuminis, siera, magnis ir manganas.
Fenoliniai junginiai: dikafeil-mezo-vyno rūgštis, mono-O-kafeil-mezo-tartrato. Nevaisinguose
stiebuose yra nuo 0,3 proc. iki 0,9 proc. flavonoidų, didžioji dalis- kemferolio 3-O-
gliukozidas, kvercetino 3-O-gliukozidas, apigenino 5-O-gliukozidas, liuteolino 5-O-
gkliukozidas.
Triterpenoidai: ursolo rūgštis, oleanolio rūgštis, betulino rūgštis, izoborneolis, tarakserolis.
Saponinai: ekvisetoninas.
Fitosteroliai: cholesterolis, epicholestanolis, izofukosterolis (5,9 proc.), kampesterolis
(32,9 proc.) ir β-sitosterolis (60 proc.).
Kitos mežiagos: šakotosios ir ilgosios dikarboksi rūgščių grandinės, proteinai, fermentai
(pagrinde tiaminazė), silicio rūgštis (5 proc.) [6,8,11].
Vaisinguose ūgliuose nustatyti fenoliniai gliukozidai: ekvisetumozidas A, ekvisetumozidas B,
ekvisetumozidas C. Taip pat išskirti onitinas ir onitin-9-O-gliukozidas [6].
Stirilpirono gliukozidai kaupiasi šakniastiebiuose kaip dirvinių asiūklių gametofitų, sporofitų
metabolitai. Žaliuose ūgliuose stirilpirono gliukozidų kaupimasis pasireiškia esant mechaniniam
12
dirginimui ar mikrobiniam užterštumui. Šakniastiebiai kaupia: 3’-deoksiekvisetumpirono (3,4-
hidroksi-6-(4’-hidroksi-D-stiril)-2-piron-3-O-β-D-gliukopiranozidas) ir 4’-ometilekvisetumpirono
[11].
Mokslininkų Kaur S. ir Chopra D. komandos atliktame fitocheminės analizės tyrime buvo
naudojami smulkinti dirvinių asiūklių sterilių stiebų milteliai. VAŽ buvo ekstrahuojamos etanolyje,
vandenyje bei kituose ekstrahentuose. Etanoliniuose ekstraktuose (etanolio koncentracija tyrime
nenurodyta) rasta alkaloidų, karbohidratų, fitosterolių, saponinų, flavonoidų, triterpenoidų, proteinų ir
amino rūgščių. Vandeniniuose ekstraktuose nebuvo aptikta flavonoidų, triterpenoidų, saponinų,
fitosterolių [12].
Pagrindinė etanolinių ekstraktų veiklioji medžiaga yra kvercetino 3-O-gliukozidas
(izokvercetinas) (152 mg/g), o apigenino 5-O-gliukozido ir kemferolio 3-O-gliukozido buvo nustatyta
tik 22,4 mg/g ir 26,2 mg/g. Vandeniniuose ekstraktuose be di-E-kafeil-meso-vyno rūgšties (10 mg/g)
buvo nustatytos dar dvi fenolinės rūgštys (3 ir 6 mg/g). Tyrėjai padarė išvadą, kad etanoliniuose
asiūklio ekstraktuose pagrindiniai komponentai yra flavonoidai, o vandeniniuose – fenolio rūgštys
[10].
Taigi, dirvinių asiūklių ekstraktų sudėtyje yra gausu organinių ir neorganinių junginių.
Pagrindinės ekstraktų medžiagos yra flavonoidai ir fenolinės rūgštys. Dėl šių biologiškai aktyvių
medžiagų VAŽ yra plačiai pritaikoma medicinos praktikoje [6,11].
1.2. Dirvinio asiūklio ir jo preparatų biologinis aktyvumas
1.2.1. Antimikrobinis aktyvumas
Dėl piktnaudžiavimo ir neracionalaus antibiotikų vartojimo paplito jiems atsparūs
mikroorganizmai, dėl to gydymas tapo neveiksmingas, o visuomenės sveikatai sukeliamas rimtas
pavojus. Vaistiniuose augaluose randamos biologiškai aktyvios medžiagos sėkmingai veikia
antibiotikams atsparius mikroorganizmus [27].
Nustatytas įvairių koncentracijų dirvinių asiūklių žolės etanolinių ekstraktų antimikrobinis
aktyvumas prieš gramteigiamas Bacillus subtilis ir Micrococcus luteus, bei prieš gramneigiamas Vibrio
cholerae, Escherichia coli, Shigella flexneri, Shigella dysenteriae mikroorganizmų kultūras. Tyrimo
metu buvo nustatomos mikroorganizmų augimo inhibavimo zonos milimetrais. Ampicilinas buvo
naudojamas kaip teigiama kontrolė. E. coli buvo jautriausia iš visų tiriamųjų kultūrų, jos inhibavimo
zona siekė 32 mm. Gramneigiamos S. flexneri ir V.cholerae mikroorganizmų kultūros nebuvo jautrios
13
tirtų ekstraktų poveikiui. Kitos gramteigiamos ir gramneigiamos bakterijos buvo vidutiniškai jautrios
ekstraktams. Ekstraktų sudėtyje buvo rasta taninų, flavonoidų bei fenolinių rūgščių, kurie ir suteikė
jiems antibakterinį aktyvumą [23].
Kitame tyrime buvo nustatytas asiūklių žolės propilenglikolio ekstraktų (200 mg/ml),
antimikrobinis aktyvumas prieš odontologijoje dažniausiai pasitaikančias bakterijas Staphylococcus
epidermidis ir Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Candida albicans, Candida tropicalis,
Candida glabrata. Minimali slopinamoji koncentracija (MSK) buvo 50 mg/ml. S. mutans jos augimą
slopino 25 mg/ml koncentracijos ekstraktai. Nustatyta, antimikrobiniam aktyvumui svarbūs fenolio
monoterpenų junginiai [24].
Ištirta, kad Equisetum arvense ir Equisetum stevia vandeninių ekstraktų mišinys 1:1
efektyviai veikia mikotoksiškai [25]. Dirvinių asiūklių vandens ir etanolio mišinio ekstraktas slopino
grybelių Aspergillus ir Fusarium augimą, bei jų toksinų gamybą [26].
Buvo atliktas bandymas norint įvertinti etanolinių dirvinių asiūklių ekstraktų priešgrybelinį
aktyvumą prieš Candida albicans, Candida tropicalis, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Mucor
spp ir Penicilium marneffei. Disko difuzijos metodu milimetrų tikslumu buvo vertinamos grybelių
augimo inhibavimo zonos. Ektraktai pasižymėjo dideliu priešgrybeliniu aktyvumu prieš Aspergillus
niger ir Aspergillus fumigatus. Jų inhibavimo zonos – nuo 18 mm iki 19 mm esant 1000 µg
ekstrakto/diske. Šio tyrimo rezultatai parodė, kad mažomis koncentracijomis ekstraktai veikia silpnai
arba išvis neveikia, tačiau koncentracijai didėjant pasireiškia aktyvumas prieš visas grybelių šeimas
[5].
Daugelyje tyrimų nustatyta, kad dirvinių asiūklių ekstraktai aktyvūs prieš gramneigiamas ir
gramteigiamas bakterijas bei grybelius. Šį biologinį aktyvumą suteikia ekstraktų sudėtyje rastos
fenolinės rūgštys, flavonoidai, fenolio monoterpenų dariniai ir taninai.
1.2.2. Priešvėžinis aktyvumas
Sėkmingi vaistai nuo vėžio turėtų sunaikinti ar išvesti iš rikiuotės vėžines ląsteles, nesukeliant
pernelyg didelės žalos sveikoms ląstelėms. Ši ideali situacija yra pasiekiama sukeliant apoptozę vėžio
ląstelėms. Taigi, tyrėjai pasirinko dirvinių asiūklių žolę, siekdami ištirti jos preparatų poveikį
leukemijos ląstelėms. Iš vaistinės augalinės žaliavos sterilių stiebų buvo gaminami vandeniniai
ekstraktai. Gauti duomenys parodė, kad ekstraktai mažomis koncentracijomis (124 µg/ml) slopina
vėžinių ląstelių augimą G0-G1 fazėse. Naudojant didesnes koncentracijas (248 ir 496 µg/ml), sumažėjo
vėžinių ląstelių populiacija G2-M fazėse, lyginant su kontrole. Tie patys mokslininkai siekė nustatyti,
ar ląstelių mirtis buvo sukelta apoptozės. Rezultatai parodė, kad ekstraktai mažomis koncentracijomis
14
(124 ir 248 µg/ml) neturi įtakos apoptozės procesui, o didėlė jų koncentracija (496 µg/ml) sukelia
apoptozę [35].
Kito eksperimento metu buvo tiriamos dirvinių asiūklių vandeninių, metanolinių, etilo
acetato, chloroformo ir n-butanolinių ekstraktų antiproliferacinės savybės prieš žmogaus vėžines
ląsteles: HeLa (gimdos kaklelio plokščialąstelinės ląstelės), HT-29 (storosios žarnos adenokarcinoma)
ir MCF-7 (krūties adenokarcinoma). Buvo nustatyta, kad HeLa ląstelės labiausiai jautrios ekstraktų
poveikiui. Chloroformo ir etilo acetato ekstraktai labiausiai slopino HeLa ląstelių proliferaciją nuo
0,125 iki 1 mg/ml koncentracijomis (GI50 yra nuo 0,23 iki 0,76 mg/ml). Visi ekstraktai, išskyrus n-
butanolio, visomis tirtomis koncentracijomis mažino MCF-7 ląstelių augimą, lyginant su kontrole.
Taip pat pastebėta, kad mažos asiūklių ekstraktų koncentracijos (mažiau nei 0,25 mg/ml) netgi skatina
HeLa ir HT-29 ląstelių augimą. Esant mažai koncentracijai, natūralūs izoflavonų fitoestrogenai augalo
ekstraktuose stimuliuoja nuo estrogenų priklausomų ląstelių augimą, bet turi priešingą poveikį,
naudojant dideles ekstraktų koncentracijas [36].
Dirvinių asiūklių stiebų vandeninis ekstraktas parodė nuo dozės priklausomą citotoksinį
poveikį leukemijos U937 ląstelėms. 48 val. laikotarpiu buvo stebimi ekstrakto sukelti pokyčiai
ląstelėse: mitochondrijų membranų irimas, DNR fragmentacija. Aiškinama, kad šiuos pokyčius sukėlė
apoptozė. Eksperimentiškai nustatyta, kad neapdoroti baltymai, esantys asiūklių žolėje, slopina vėžinių
ląstelių proliferaciją [6].
Etilo acetato ekstraktas pasižymėjo priešvėžiniu aktyvumu prieš HeLa, HT-29 ir MCF7
ląstelių linijas ir neskatino šių vėžinių ląstelių augti [6].
Taigi, asiūklių preparatai slopina įvairių vėžio ląstelių proliferaciją, o slopinamasis poveikis
priklauso nuo ekstrakto koncentracijos.
1.2.3. Kiti biologiniai poveikiai
Asiūklių preparatai nuo seno plačiai naudojami liaudies medicinoje, o šiuolaikinėje
medicinoje jie taip pat yra laikomi svarbūs gydant osteoporozę, šlapimo takų infekcijas ir kitus
susirgimus [14,17].
Senovės graikai asiūklį naudojo kraujavimui stabdyti taip pat esant gausioms menstruacijoms,
paskatinti ilgai negyjančių žaizdų, lūžusių kaulų gyjimą [8].
Augalo ekstraktų gausu kosmetikos produktuose. Jis mažina raukšlių, spuogų atsiradimą
veikia drėkinančiai, sustiprina plaukus, stimuliuoja augimą [8].
Plačiai vartojamas nuo uždegimo. Priešuždegiminis hidroalkoholinių ekstraktų aktyvumas
buvo nustatytas, atliekant su pelėmis padų edemos testą. Dėl šio poveikio dirvinių asiūklių preparatai
15
vartojami gydyti artritą, cistitą, podagrą. Arbatos vartojamos burnos skalavimui, mažina burnos ir
dantenų uždegimą [4,6,8].
Mokslininkai nustatė asiūklių žolės ekstraktų antidiabetinį poveikį žiurkėms, jas kasdien
girdant ekstraktais 50 ir 250 mg/kg dozėmis [4,8].
Fenolinė rūgštis onitinas ir flavonoidas liuteolinas, išskirti iš asiūklių ekstraktų, pasižymėjo
hepatoprotekcinėmis savybėmis prieš takrinu paveiktas žmogaus kepenų Hep G2 ląsteles. Šie abu
komponentai buvo aktyvesni už silimariną. Liuteolino hepatoprotekcinis aktyvumas buvo stipresnis
nei onitino [4,8].
Asiūklių preparatai nuo senų laikų vartojami osteoporozės gydymui, nes šis augalas savo
sudėtyje turi didžiausią silicio kiekį visoje augalų karalystėje. Silicis padeda kaulams absorbuoti ir
panaudoti kalcį, dalyvauja kolageno susidaryme. Asiūklių sudėtyje esantys flavonoidai: kvercetinas ir
kemferolis - skatina osteoblastų proliferaciją, veikia anaboliškai [14,15]. Izokvercetinas ir kvercetino
glikozidas pasižymi terapiniu aktyvumu in vivo [16]. Triterpenoidų, flavonoidų, silicio kompleksą
turinti VAŽ gali padėti išvengti osteoporozės ir ją gydyti. Mokslininkai teigia, kad dirvinių asiūklių
preparatų apsauginių savybių nuo osteoporozės tyrimai galėtų prisidėti kuriant naujus vaistus nuo šios
ir panašių ligų [14].
Dirvinių asiūklių žolės preparatai veiksmingi, gydant šlapimo takų infekcijas [17]. Tyrimais
įrodyta, kad asiūklių vandeniniai ir etanoliniai ekstraktai aktyvūs prieš šlapimo takų infekciją
sukeliančius (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia
coli) mikroorganizmus [19]. Asiūklių preparatai turi sutraukiantį, diuretinį ir gydomąjį poveikį.
Ekvisetumozidai ir flavonai skatina diurezę, o dėl padidėjusio šlapinimosi sumažėja šlapimo takų
infekcijos simptomai, pacientai lengviau pašalina inkstų akmenis. Tyrime su 25 sveikais savanoriais
asiūklių preparatų infuzijos (10,7 mg/kg kūno svorio) sukėlė švelnų diuretinį poveikį ir nesukėlė
nepageidaujamų reakcijų [17].
Tik nedaugelis iš išvardintų dirvinių asiūklių preparatų pritaikymo būdų buvo įtraukti į
Europos šalių farmakopėjas. Lietuvoje ir Kroatijoje reglamentuojamas asiūklio žolės ir jos preparatų
vartojimas norint paskatinti diurezę. Čekijos Respublikoje ir Vokietijoje asiūklių arbata vartojama kaip
pagalbinė priemonė gydant inkstų ir šlapimo takų uždegimus [4,13]. Vietiškai vartojami asiūklių
kompresai, siekiant apiplauti paviršines žaizdas, bei blogai gyjančioms žaizdoms gydyti [13].
Europos farmakopėja, kaip ir daugelis kitų šalių farmakopėjų, augalo tradiciškumą grindžia
šiomis indikacijomis:
Naudojama paskatinti diurezę.
Potrauminei edemai gydyti.
Esant šlapimo takų infekcijai, šlapimo pūslės ir inkstų akmenims [13].
16
Remiantis naujausiais tyrimais ir tradiciniu šio augalo panaudojimu, mes nutarėme atlikti
tyrimą ir išsiaiškinti dirvinių asiūklių žolės ekstraktų antimikrobinį ir priešvėžinį aktyvumą. Taip pat
išsikėlėme tikslą įvertinti, kokios ekstraktų gamybos sąlygos ir veikliosios medžiagos suteikia
preparatams tokį biologinį poveikį.
1.3. Svarbiausių biologiškai aktyvių junginių apžvalga
Dirvinių asiūklių skystuosiuose ekstraktuose yra gausu fenolinių rūgščių ir flavonoidų, tai
svarbiausios šioje žaliavoje aptinkamos fenolinių junginių grupės [10], dėl to jos aptartos detaliau.
Fenoliniai junginiai plačiai paplitę augaluose, jie pasižymi antioksidaciniu, antimikrobiniu,
priešvėžiniu aktyvumu. Pagal cheminę struktūrą fenoliniai junginiai skirstomi į flavonoidus, fenolines
rūgštis, stilbenus, ligninus ir kt. Fenolinės rūgštys ir flavonoidai yra labiausiai ištirtos ir svarbiausios iš
polifenolinių junginių [37, 58]. Pastaraisiais metais natūralūs ir sintetiniai flavonoidų dariniai
naudojami kiaušidžių, krūties, gimdos kaklelio, kasos ir prostatos vėžio gydymui. Flavonoidai
askvercetinas (natūralus), flavopiridolis (sintetinis) tiriami trečioje klinikinių tyrimų stadijoje kaip
vaistai nuo vėžio [40].
Flavonoidų pagrindą sudaro flavanas (2-fenilbenzo-γ-pirono žiedas). Jų struktūroje yra du
benzeno žiedai (A ir B), kurie tarpusavyje sujungti heterocikliniu pirono žiedu (C). Izoflavonoide
fenilo grupė yra 3-oje pirono žiedo padėtyje, kitose flavonoiduose fenilo grupė yra 2-oje pirono žiedo
padėtyje. [41,42].
2 pav. Flavonoidų struktūra (paveikslas parengtas remiantis literatūros šaltiniu [41]).
17
B žiedo hidroksilo grupių konfigūracijos atlieka svarbų vaidmenį reaktyviosios deguonies ir
azoto formos antioksidaciniam aktyvumui. Hidroksilo grupė, esanti B žiede, atiduoda elektronus
hidroksilo, peroksilo, peroksinitrilo radikalams ir stabilizuoja juos. Lyginant flavonolius kvercetiną ir
kemferolį su flavonu liuteolinu, flavonoliai pasižymi didesne radikalų surišimo geba. Taip yra dėl to,
kad flavonai (liuteolinas) neturi trečioje padėtyje hidroksilo funkcinės grupės, kuri turi didelę įtaką
laisvųjų radikalų (LR) surišimo gebai. Kuomet flavonuodų struktūroje nėra 2–3 dvigubojo ryšio ar 4–
okso funkcinės grupės, sumažėja jų antioksidacinis aktyvumas [43].
Priešmikrobiniam flavonoidų aktyvumui svarbus struktūroje esantis B žiedas ir antroje
padėtyje esanti hidroksilo grupė. A žiedas pasižymi silpnesniu aktyvumu nei B žiedas. Alifatinės
grupės, esančios 6 ar 8 padėtyse, neturi įtakos priešmikrobiniam aktyvumui [44]. Tyrime nustatyta,
kad liuteolinas selektyviai veikia Staphylococcus aureus, įskaitant ir meticilinui atsparius mikrobus.
Aktyvumui svarbios B žiede 2 ir 6 padėtyse esančios hidroksigrupės bei A žiede 5 ir 7 padėtyse
esančios hidroksigrupės [45].
Apigeninas efektyviai stabdo vėžinių ląstelių proliferaciją. Šio junginio citotoksinis
aktyvumas prieš HeLa, KB, MCF-7 ir LP07 yra didelis dėl hidroksilo grupės, esančios 4-oje fenilo
žiedo padėtyje [46]. Kvercetinas blokuoja vėžinių ląstelės dalijimąsi G1 stadijoje, taip pat slopina PI3
kinazę. Šis poveikis yra dėl 2,3-oje fenilo žiedo padėtyse esančio dvigubojo ryšio ir dėl hidroksigrupės
4-oje fenilo žiedo padėtyje. Kemferolis blokuoja mitozę G2 stadijoje, slopina topoizomerazę II.
Aktyvumas pasireiškia dėl dvigubojo ryšio tarp 2 ir 3 anglies atomų, laisvų hidroksigrupių [41].
Fenolinių rūgščių struktūros pagrindą sudaro hidroksibenzoinės rūgšties dariniai, turintys C6-
C1 fragmentą, ir hidroksicinamo rūgšties junginiai, turintys C6-C3 fragmentą [58]. Jų struktūros ir
aktyvumo palyginimai rodo, kad antioksidacinis jų aktyvumas priklauso nuo hidroksilo pakaitų
skaičiaus, padėties ir elektronų surišančių funkcinių grupių (CO2H, CH2CO2H, (CH)2CO2CH) [47].
Antra hidroksilo grupė, esanti kavos rūgšties para padėtyje padidina antioksidacinį aktyvumą. Fenolio
žiede esanti –C=C–CO2H grandinė vaidina svarbią rolę surišant laisvuosius radikalus. Monofenolių
antioksidacinis aktyvumas padidinamas įtraukiant metoksi pakaitalą į orto padėtį vietoje OH grupės
taip kaip yra ferulo rūgštyje [1]. Didžiausia LR surišimo geba (mažėjimo tvarka) pasižymi kavos
rūgštis > ferulo rūgštis > p-kumaro rūgštis [48].
Flavonoidai (kvercetinas, apigeninas, kemferolis) dėl savo unikalios struktūros pasižymi
stipriu priešmikrobiniu ir priešvėžiniu aktyvumu. Taip pat jie yra vieni iš svarbiausių junginių
ekstraktuose.
18
1.4. Tyrime naudotų vėžinių ląstelių linijos ir mikroorganizmų kultūros
Biologinio aktyvumo tyrimas, panaudojant įvairiomis savybėmis pasižyminčius
mikoorganizmus ar vėžines ląsteles, gali padėti teisingiau suprasti tiriamojo objekto poveikį ir jį
tinkamai interpretuoti. Dėl to dirvinių asiūklių antimikrobinio ir priešvėžinio aktyvumo tyrimams
pasirinkome skirtingas mikroorganizmų rūšis bei vėžio ląstelių linijas, kurios tarpusavyje skiriasi
sandara, savybėmis, atsparumu vaistams ir kt.
Sergančių navikais skaičius pasaulyje didėja, suserga visų amžiaus grupių žmonės. Negydoma
liga tampa žmogaus mirties priežastimi [39]. Lietuvos sveikatos apsaugos ministerijos Higienos
instituto Sveikatos informacijos centro duomenimis, 2013 metais iš visų piktybinių navikų vyrauja
plaučių vėžys [2]. PSO prognozuoja, kad iki 2030 metų globaliai plaučių vėžys užims šeštą vietą pagal
mirties priežastį. Jis skirstomas į dvi grupes: nesmulkialąstelinis ir smulkialąstelinis vėžys. Dauguma
piktybinių plaučių navikų yra išsivystę iš epitelių ląstelių. Pagrindinis nesmulkialąstelinio plaučio
naviko gydymas yra chirurginis. Po atliktos intervencijos pacientas gydomas chemoterapija ir
spinduline terapija. Plaučių vėžio išgyvenamumo rodikliai yra labai maži- tik 7,8 – 16,5 proc. pacientų
išgyvena ilgiau nei penkis metus [28].
Pacientams, kuriems yra diagnozuota glioblastoma, išgyvenamumas per 5 metus siekia tik
apie 5 proc., nepaisant naudojamo agresyvaus multimodalinio (chirurginės intervencijos,
radioterapijos, chemoterapijos) gydymo. Sergamumas šia liga dažniausiai būdingas suaugusiems nei
vaikams, ji turi savybę greitai plisti į gretimus sveikus audinius [30,31,32].
Sergamumas melanoma sparčiai didėja visame pasaulyje. Ši tendencija pastebima ir
Lietuvoje, pagrindinė priežastis – vėlyva diagnostika, tik 35 proc. atvejų diagnozuojama esant I odos
naviko stadijoje, kai jis dar nėra išplitęs į aplinkinius audinius ir lengvai išgydomas. Užtat šios ligos 5
metų išgyvenamumas siekia net 85 proc. ir daugiau [2,33]. Naviko taikinys yra pigmentinės odos
melanocitų ląstelės, kurios dar sintezuoja melaniną [34].
PSO duomenis dėl netinkamo antibiotikų vartojimo išplito jiems antsparūs mikroorganizmai:
Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa [18]. Šios
bakterijos naudojamos tyrime.
Pseudomonaceae šeimai priklauso gramneigiamos aerobinės bakterijos. Teigiama, kad
Pseudomonas aeruginsa yra normalios žmogaus žarnyno mikrofloros dalis. Ši bakterija išsiskiria
atsparumu antibiotikams. Dažniausiai sukelia šlapimo ir kvėpavimo sistemos, minkštųjų audinių,
virškinamojo trakto infekcijas. Labai pavojinga pacientams, kurie yra hospitalizuoti dėl navikinių
susirgimų, AIDS. Šių pacientų mirtingumas gali siekti 50% [20].
Enterobacteriaceae šeimai priklauso Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Proteus
mirabilis ir kitos gramneigiamos bakterijos. Didžioji dalis jų yra normalios žmogaus mikrofloros
19
dalis. Šios bakterijos sukelia šlapimo takų, minkštųjų audinių infekcijas, sepsį, pneumoniją [21]. Pagal
PSO duomenis ES šalyse bei Norvegijoje, Islandijoje E. coli ir K. pneumoniae yra selektyviai atsparios
3 kartos cefalosporinams [18].
Micrococcaceae šeimai priklauso Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis ir kitos
32 stafilokokų rūšys. Tai gramteigiamos bakterijos, randamos žmogaus odos mikrofloroje, kurios
sukelia šlapimo takų, odos infekcijas, plaučių uždegimą, audinių nekrozę.
Bacillaceae šeimai priklauso Bacillus subtilis, Bacillus cereus ir kitos 48 bacilų rūšys. Tai
gramteigiamos bakterijos. Šie mikroorganizmai sukelia su maisto apsinuodijimu susijusias
intoksikacijas. Sukelia pykinimą, vėmimą, viduriavimą, o silpnesnio imuniteto pacientams gali sukelti
sunkią raumenų infekciją.
Streptococcaceae šeima susideda iš 7 mikroorganizmų genčių. Jai priklauso apvalios formos
Enterococcus faecalis, kuris yra normalios žmogaus žarnyno mikrofloros dalis bei kiti gramteigiami
sukelėjai [21]. Sutrikus šių mikroorganizmų ir šeiminių simbiozės ryšiams, gali sukelti meningitą,
bakteremiją, šlapimo takų ir žaizdų infekcijas. E. faecalis sukelia apie 80% enterokokinių infekcijų, jas
sunku gydyti ir jos lengvai plinta ligoninėse [22].
Grybeliai yra plačiai paplitę pasaulyje. Pagal pažeidimo pobūdį grybelių sukeltos ligos gali
būti paviršinės, poodžio ir sisteminės. Candida albicans – natūralios nosiaryklės ir virškinamojo trakto
mikrofloros atstovas. Dažniausiai sukelia cistitą, kandidomikozes, stomatitą, vaginozę, kolitą, odos ir
nagų kandidozę [21].
Šių mikroorganizmų ir vėžinių ląstelių sukeliamos ligos negydomos gali pakenkti
žmogaus sveikatai. Tai ne tik medicininė bet ir socialinė problema, nes pacientai tampa nedarbingi,
kenčia jų gyvenimo kokybė, o valstybė patiria milijoninius nuostolius dėl prasto produktyvumo. Todėl
svarbu rasti efektyvią priemonę, kuri veiksmingai kovotų su ligų sukėlėjais. Dirvinių asiūklių
ekstraktai galėtų būti kaip natūrali, palyginti mažai toksiška pagalbinė priemonė, gydant infekcinius ar
onkologinius susirgimus.
20
2. TYRIMŲ OBJEKTAS IR METODAI
2.1. Tyrimo objektas
Tyrimo objektas – natūraliai augančių dirvinių asiūklių (Equisetum arvense L.) žolės
ekstraktai, pagaminti doktorantės Ugnės Čižauskaitės. Vaistinis augalas gautas iš Jadvygos
Balvočiūtės ekologinio vaistažolių ūkio „Jadvygos Žolės”, esantis Mažeikių rajone Gyvolių kaime.
Surinkta VAŽ džiovinta sausoje, tamsioje gerai vėdinamoje patalpoje, apsaugota nuo tiesioginių saulės
spindulių. Žaliava buvo supakuota į popierių ir laikyta sausai, tamsiai.
Etanoliniai ir vandeniniai ekstraktai paruošti iš vaistinės augalinės žaliavos santykiais 1:5,
1:10, 1:15, 1:20. VAŽ sumalama elektriniu malūnėliu iki miltelių, sijojama per sietą (5 mm), užpilama
70 proc. arba 90 proc. V/V etanoliu, gaminant vandeninius ekstraktus, užpilama steriliu vandeniu.
Ekstraktai ruošiami tikslaus tūrio kolbose ir užpylus ekstrahentu suplakama, kad vaistinės augalinės
žaliavos milteliai gerai pasiskirstytų ekstrahente. Skystieji ekstraktai ekstrahuojami ultragarsu 10 min,
15 min, 30 min, 50 min. Temperatūra reguliuojama ultragarsinėje vonelėje. Gauti ekstraktai filtruojami
per popieriaus filtrą. Išpilstomi į buteliukus, sandariai užkemšami ir laikomi tamsioje šaltoje vietoje.
Siekiant gauti didesnį bandymų patikimumą buvo atliekami trys pakartojimai. Iš vaistinės augalinės
žaliavos pagaminti 3 vienodomis sąlygomis ekstraktai. Gamybos sąlygos pateiktos 1 ir 2 lentelėse.
1 lentelė. Priešvėžinio aktyvumo tyrimuose naudotų ekstraktų gamybos sąlygos
Ekstrakto
kodas
Ekstrahento (etanolio)
koncentracija(proc. V/V)
Žaliavos-
ekstrahento
santykis
Ekstrahavimo
temperatūra (°C)
Ekstrakcijos
laikas (min)
D1 90 1:15 60 10
D2 90 1:15 50 10
D3 90 1:15 40 10
D4 90 1:15 30 30
D5 90 1:15 50 15
D6 90 1:15 30 10
D7 90 1:15 50 30
21
D8 70 1:15 40 10
D9 70 1:15 30 10
D10 70 1:5 40 10
D11 70 1:20 50 10
D12 70 1:15 60 10
D13 70 1:10 50 10
D14 70 1:15 50 10
2 lentelė. Priešmikrobinio aktyvumo tyrimuose naudotų ekstraktų gamybos sąlygos
Ekstrakto kodas Žaliavos-ekstrahento
santykis
Ekstrahavimo
temperatūra (°C)
Ekstrakcijos
laikas (min.)
D15 1:15 25 10
D16 1:10 60 10
D17 1:15 60 10
D18 1:10 30 10
D19 1:10 40 10
D20 1:10 50 50
D21 1:5 50 50
D22 1:15 50 50
D23 1:20 50 50
2.2. Reagentai, priemonės ir įranga
Reagentai:
Apigeninas ≥ 97 proc., Sigma-Aldrich
Dimetilsulfoksidas (DMSO) ≥ 99,5 proc., Sigma-Aldrich
22
Dulbecc‘o modifikuota Eagle ląstelių mitybinė terpė (DMEM), Gibco
Fetalinis veršiukų serumas (FBS), Gibco
Fosfatinis druskų tirpalas, pH 7,4 (PBS), Gibco
Kemferolis ≥ 97 proc., Sigma-Aldrich
Kvercetinas ≥ 95 proc., Sigma-Aldrich
Luminespibas (NVP-AUY922) > 99 proc., Selleckchem
Tripsino tirpalas TrypLE™ Express, Gibco
1 proc. antibiotikų tirpalas (10000 vienetų/ml penicilino ir 10 mg/ml streptomicino), Gibco
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il-)-2,5-difeniltetrazolio bromidas (MTT) ≥ 97 proc., Sigma-Aldrich
Vėžinių ląstelių linijos:
Žmogaus glioblastomos vėžio ląstelių linija (U87), Amerikos ląstelių kultūrų kolekcija (ATCC,
angl. American Type Culture Collection)
Žmogaus melanomos vėžio ląstelių linija (IGR39), ATCC
Žmogaus nesmulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelių linija (A549), ATCC
Mikroorganizmų kultūros:
Bacillus cereus, 8035 ATCC
Bacillus subtilis, 6633 ATCC
Candida albicans, 60193 ATCC
Escherichia coli, 25922 ATCC
Enterococcus faecalis, 29212 ATCC
Klebsiella pneumoniae, 33499 ATCC
Proteus mirabilis, 12459 ATCC
Pseudomonas aeruginosa, 27853 ATCC
Staphylococcus aureus, 25923 ATCC
Staphylococcus epidermidis, 12228 ATCC
Įranga:
Densitometras, DEN-1 McFarland, BIOSAN
Elektroninis fazinio kontrasto mikroskopas Olympus TH4-200
Laminarinė traukos spinta Thermo scientific Hera safe KS, Thermo Scientific
Mėgintuvėlių purtyklė, IKA Lab Dancer, GRIDA
Mikroplokštelių spektrofotometras Thermo scientific Multiskan go, Thermo Scientific
Termokamera, Heracell 150i, Thermo Scientific
23
2.3. Antimikrobinio aktyvumo tyrimas in vitro šulinėlių metodu
Mikroorganizmų kultūros buvo auginamos 5 ml tūrio mėgintuvėliuose ant Miulerio–Hintono
terpės, po 7 dienų persėjamos į šviežią Miulerio–Hintono agarą. Buvo tiriamas dešimties ekstraktų,
pagamintų skirtingomis sąlygomis (2 lentelė), antimikrobinis aktyvumas. Aseptinėmis sąlygomis į
sterilų matavimo cilindrą perkeliama 15 ml išlydytos Miulerio–Hintono agaro terpės, sumaišytos su
1 ml mikroorganizmo suspensijos (1 ml suspensijoje – 1,5 × 108
ląstelių). Šis mišinys pilamas į
sterilias Petri lėkšteles. Kiekvienoje Petri lėkšelėje ant sukietėjusio agaro paviršiaus uždedama po
penkis sterilius Peni cilindrus ir į kiekvieną cilindrą įpilama po 0,1 ml ekstrakto. Petri lėkštelės
dedamos į termostatą, kuriame palaikoma 37 °C temperatūra. Po 24 val. buvo vertinamas bakterijų
augimas, o po 48 val – grybelio. Tokiu būdu nustatomos mikroorganizmų augimo inhibavimo zonos
milimetrais. Eksperimentas kartojamas tris kartus, apskaičiuojami matematiniai vidurkiai ir
standartiniai nuokrypiai.
2.4. Antimikrobinio aktyvumo tyrimas in vitro skiedimo standžioje terpėje metodu
Veikliųjų medžiagų mikrobinio aktyvumo tyrimas buvo atliktas in vitro skiedimo standžioje
terpėje metodu prieš tas pačias mikroorganizmų kultūras, kurios naudotos ekstraktų tyrime.
Mikroorganizmai suspenduojami fiziologiniame natrio chlorido (0,9 proc.) tirpale. Suspensijos
drumstumas matuojamas standartiniu McFarland indikatoriumi, ir jis turi būti apie 0,5 (tai atitinka 1,5
× 108
ląstelių 1 ml suspensijos). Aseptinėmis sąlygomis veikliųjų medžiagų tirpalai DMSO skiedžiami
su 10 ml išlydyto Miulerio-Hintono agaro matavimo cilindre, gaunant skirtingos koncentracijos
junginių tirpalus terpėje. Mišinys perkeliamas į sterilią Petri lėkštelę. Sustingus terpei,
mikroorganizmų suspensijos kilpelėmis po 1 µl sėjamos ant terpės paviršiaus. Paruošiama kontrolinės
Petri lėkštelės su skirtingomis DMSO koncentracijomis agare.
Bakterijų augimas vertinamas po 24 val., o grybelio – po 48 val. Nustatoma junginių
mažiausia slopinamoji koncentracija, kurioje mikroorganizmai nebeauga (MSK).
2.5. Priešvėžinio aktyvumo tyrimas in vitro
Priešvėžinis aktyvumas nustatytas in vitro trims žmogaus vėžio ląstelių linijoms:
nesmulkialąstelinio plaučių vėžio (A549), glioblastomos (U87) ir melanomos (IGR39). Ląstelės
auginamos DMEM Glutamax mitybinėje terpėje su 1 proc. antibiotikų ir 10 proc. FBS.
24
Ląstelių suspensijos augimo fazėje išpilstomos į 96 šulinėlių plokšteles taip, kad viename
šulinėlyje būtų atitinkamai po 3000 U87, bei 2000 A549 ir IGR39 ląstelių. Po paros į šulinėlius
supilami tiriamieji asiūklių žolės ekstraktai, praskiesti su ląstelių auginimo terpe. Ląstelės su tiriamais
ekstraktais inkubuojamos 37 °C temperatūroje 5% CO2 atmosferoje 72 val. Kiekvieno eksperimento
metu naudojamos teigiamos ir neigiamos kontrolės. Neigiama kontrolė: ląstelės su atitinkama 90 proc.
arba 70 proc. etanolio koncentracija, kuri buvo visuose tiriamo ekstrakto skiedimuose. Teigiama
kontrolė – ląstelės, paveiktos 25 proc. DMSO, t.y. tokia DMSO koncentracija, kuri nužudo ląsteles.
Ląstelių gyvybingumui nustatyti buvo naudojamas MTT metodas. Tyrimo metu
augančios ląstelės paveikiamos MTT, kuris yra nuo NAD(P)H priklausomos oksidoreduktazės
substratas. Susidariusio netirpaus metabolito (formazano) kristalų kiekis yra tiesiogiai proporcingas
gyvų ląstelių skaičiui [49]. Metabolito kiekis nustatomas spektrofotometriškai 560 ir 630 nm bangų
ilgiuose, kristalus ištirpinus DMSO.
Gauti duomenys apdoroti „MS Excel 2010“ programa, įvertinant santykinį standartinį
nuokrypį ir matavimų vidurkį.
25
3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Dirvinių asiūklių žolės skystųjų ekstraktų antimikrobinis aktyvumas
Dirvinių asiūklių žolės skystųjų ekstraktų aktyvumas prieš skirtingus mikroorganizmus
skyrėsi. Visi tirti ekstraktai, pasižymėjo antibakteriniu aktyvumu, o priešgrybeliniu aktyvumu
pasižymėjo tik keli ekstraktai. Tyrimų rezultatai pateikti 3 lentelėje.
3 lentelė. Dirvinių asiūklių žolės vandeninių ekstraktų antimikrobinis aktyvumas
Inhibavimo zona > 9 mm; Inhibavimo zona 7-9 mm; Inhibavimo zona < 7 mm
Ek
stra
kto
kod
as Inhibavimo zona (mm)
K. pn
eum
on
iae
P. m
irabil
is
E. co
li
P. aer
ugin
osa
S. au
reu
s
S.
epid
erm
idis
B. su
bti
lis
B. ce
reu
s
E. fa
ecali
s
C. alb
ican
s
D15 10.8±
1.3
0.0 7.6±
0.55
0 8.8±
0.84
7.6±
0.55
10.8±
0.84
9.8±
0.84
7.0 9.4±
1.52
D16 0.0 7.0 7.2±
0.45
0 7.6±
0.55
0 7.6±
0.55
7.8±
0.45
0 0
D17 0.0 0.0 7.0 7.0 7.4±
0.55
0 7.6±
0.55
7.4±
0.55
0 0
D18 8.2±
0.84
8.0±
0.71
7.6±
0.55
7.2±
0.45
8.4±
0.55
7.6±
0.55
8.8±
0.84
8.6±
0.89
0 0
D19 7.4±
0.55
8.0±
0.71
7.4±
0.55
7.0 7.6±
0.55
7.4±
0.55
8.6±
0.89
8.0±
0.71
0 0
D20 7.4±
0.55
7.4±
0.55
7.4±
0.55
7.2±
0.45
7.2±
0.45
7.6±
0.55
7.4±
0.55
7.6±
0.55
0 0
D21 7.4±
0.55
7.8±
0.45
7.4±
0.55
7.4±
0.55
7.8±
0.84
8.2±
0.45
8.4±
0.55
8.6±
0.89
0 7.0
D22 7.2±
0.45
7.4±
0.55
7.0 7.0 7.2±
0.45
7.2±
0.45
7.6±
0.55
7.6±
0.55
0 0
D23 0 7.4±
0.55
0.0 0 0 7.0 7.6±
0.55
7.6±
0.55
0 0
Šiame tyrime buvo tiriamos: 4 gramneigiamos (P. aeruginosa, K. pneumoniae, E. coli,
P. mirabilis) ir 5 gramteigiamos (S. epidermidis, S. aureus, E. faecalis, B. cereus, B. subtilis)
bakterijos. Ekstraktai labiau veikė gramteigiamas bakterijas nei gramneigiamas (3 pav.). Labiausiai iš
gramteigiamų bakterijų ekstraktai slopino Bacillus subtilis ir B. cereus augimą (vidutinė visų ekstraktų
inhibavimo zona buvo atitinkamai 8,37 ± 0,99 mm ir 8,1 ± 0,73 mm), mažiau veikė S. aureus
(inhibavimo zona buvo 7,7 ± 0,54 mm), iš gramneigiamų bakterijų – Proteus mirabilis (inhibavimo
26
zona siekė 7,57 ± 0,37 mm). Kitas bakterijas ekstraktai veikė panašiai (inhibavimo zona svyravo tarp
7,0 – 7,5 mm).
3 pav. Gramneigiamų ir gramteigiamų mikroorganizmų inhibavimo zonų palyginimas
Geriausiai dirvinių asiūklių vandeniniai ekstraktai veikia: Bacillus cereus, Bacillus subtilis,
Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis mikroorganizmus. Didžiausią antimikrobinį aktyvumą
ekstraktai turėjo prieš Baccillus genties bakterijas, jas abi veikė labai panašiai ( 4 pav.).
4 pav. Ekstraktų aktyvumas prieš B. cereus ir B. subtilis
Labiausiai mikroorganizmų augimą slopino ekstraktas D15, kuris buvo pagamintas žemesnėje
temperatūroje (25 °C), lyginant su kitais ekstraktais (visi kiti pagaminti ekstrakciją vykdant ≥ 30 °C
temperatūroje). Šio ekstrakto B. subtilis augimo inhibavimo zona buvo apie10,8 mm, o B. cereus –
6
6,5
7
7,5
8
8,5
9
9,5
Inh
ibavim
o z
on
a (
mm
)
Gramneigiamos bakterijos Gramteigiamos bakterijos
6
7
8
9
10
11
12
D15 D16 D17 D18 D19 D20 D21 D22 D23
Inh
ibavim
o z
on
a (
mm
)
Ekstraktų kodai
B. cereus
B. subtilis
27
apie 9,8 mm. Kiti ekstraktai šias bakterijas veikė silpniau (inhibavimo zonos buvo nuo 7,4 iki 8,6 mm).
Tokiam skirtingam aktyvumui galėjo turėti įtakos dirvinių asiūklių vaistinės žaliavos ekstrakcijos
sąlygos, nulėmusios skirtingą veikliųjų medžiagų pobūdį ir kiekį pagamintuose ekstraktuose.
Stipriausiu atsparumu asiūklio vandeniniams ekstraktams pasižymėjo E. faecalis. Šį
mikroorganizmą veikė tik ekstraktas D15, ir jo aktyvumas buvo gana silpnas.
Asiūklių žolės ekstraktai silpnai veikė arba visai neveikė grybelio C. albicans augimo,
priešgrybeliniu aktyvumu pasižymėjo tik du ekstraktai. Kitų mokslinių tyrimų metu pastebėta, kad
C. albicans pasižymi dideliu atsparumu asiūklių ekstraktams. Esant mažoms ekstraktų
koncentracijoms, jų poveikis yra silpnas arba išvis nepasireiškia, bet koncentracijai didėjant veikiamos
visos grybelių šeimos [5,24].
Literatūroje daugiausia mokslinių publikacijų yra apie asiūklių ekstraktų poveikį
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli mikroorganizmams bei
Candida grybeliui [24,50,51,52]. Dažniausiai ekstraktai iš gramneigiamų bakterijų buvo aktyviausi
prieš E. coli. Mūsų tirti asiūklių žolės ekstraktai taip pat labiausiai slopino E. coli augimą. Tyrėjų
nuomone, antimikrobiniam ekstraktų aktyvumui įtakos turi fenoliniai junginiai: flavonoidai, fenolinės
rūgštys [23,50]. Mokslininkai Uslu ME, Erdogan I, Bayraktar O. vertino skirtingomis sąlygomis
pagamintų asiūklių antibakterinį ir priešgrybelinį aktyvumą. Ekstraktai C. albicans grybelio neveikė.
Panašiai, kaip ir mūsų eksperimentuose, S. epidermidis ir E. coli bakterijas labiau veikė žemesnėje
temperatūroje (24,5°C) ir esant mažesniam žaliavos-ekstrahento santykiui pagaminti ekstraktai [53].
Šie rezultatai parodė ekstrakcijos parametrų svarbą antimikrobiniam aktyvumui. Kiti mokslininkai tyrė
šlapimo takų ligas sukeliančias (P. aeruginosa, K. pneumoniae, S. aureus, E. faecalis, E. coli, P.
mirabilis) bakterijas, visos jos buvo tiriamos ir mūsų darbe. Tiek vandeniniai, tiek etanoliniai
ekstraktai pasižymėjo antimikrobiniu poveikiu prieš visus tirtus mikrobus. Remdamiesi gautais
rezultatais, tyrėjai siūlo dirvinių asiūklių žolės preparatus vartoti prieš šlapimo takų infekciją
sukeliančius patogenus [19].
Apibendrinus gautus antimikrobinio tyrimo rezultatus galima daryti išvadą, kad dirvinių
asiūklių žolės ekstraktai pasižymi skirtingu antimikrobiniu aktyvumu. Didžiausią antimikrobinį
aktyvumą ekstraktai turi prieš Baccillus genties bakterijas, silpniausiai veikė E. faecalis ir grybelį
C. albicans.
3.2. Dirvinių asiūklių ekstraktų veikliųjų medžiagų antimikrobinis aktyvumas
Mokslinės literatūros duomenimis, dirvinių asiūklių ekstraktuose iš fenolinių junginių
dominuoja kvercetinas, apigeninas, kemferolis [8,10,11,12]. Šie junginiai turi stiprų antibakterinį
28
poveikį [23,54]. Dėl to šios buvo nutarta ištirti šių veikliųjų medžiagų antimikrobinį aktyvumą,
tikintis, kad gauti rezultatai padės geriau suprasti ir paaiškinti skirtingą įvairiomis sąlygomis
pagamintų ekstraktų aktyvumą.
Tirtų junginių aktyvumas prieš skirtingus mikroorganizmus skyrėsi (4 lentelė). Jie slopino
daugelio tirtų bakterijų augimą, nebuvo aktyvūs prieš E. faecalis ir C. albicans.
4 lentelė. Dirvinių asiūklių pagrindinių komponentų MSK (µM)
MSK = 200 µM; MSK = 400 µM; MSK > 400 µM
Junginys
S.
au
reu
s
S.
epid
erm
idis
E. co
li
P. aer
ugin
osa
K. pn
eum
on
iae
P. m
irabil
is
B. su
bti
lis
B. ce
reu
s
E. fa
ecali
s
C. alb
ican
s
Kvercetinas 200 400 400 400 >400 400 200 400 >400 >400
Apigeninas >400 400 400 >400 >400 >400 400 400 >400 >400
Kemferolis 400 >400 >400 >400 400 >400 400 >400 >400 >400
Labiausiai jautrūs tirtiems ekstraktų komponentams buvo mikroorganizmai S. aureus ir
B. subtilis. Kvercetinas šias abi bakterijas veikė 200 µM koncentracija. Kiti mokslininkai, tyrę
kvercetino aktyvumą bakterijoms, gavo panašius rezultatus: kvercetinas K. pneumoniae veikė 427 µM
koncentracija, o S. aureus augimą slopino net 53 µM koncentracija, ir tai buvo jautriausia šiam
junginiui eksperimente naudota bakterija [55].
Silpnesniu antibakteriniu aktyvumu už kvercetiną pasižymėjo apigeninas, dar mažiau aktyvus
buvo kemferolis. Abu junginiai bakterijas veikė tik 400 µM koncentracija, daugelio mikroorganizmų
augimo neslopino tirtomis koncentracijomis. Kitų mokslininkų duomenimis, apigeninas E. coli
bakterijas slopino taip pat tik labai artima – 427 µM koncentracija [55].
Junginiams, kaip ir asiūklių ekstraktams, labiau jautrios buvo gramteigiamos nei
gramneigiamos bakterijos, o grybelio C. albicans augimo neslopino nei vienas tirtų junginių.
Mokslininkai Rauha JP, Remes S. ir kt. nustatė, kad kvercetinas ir kemferolis 1667 µM koncentracija
neslopino C. albicans grybelio augimo [38].
29
Kaip ir dirvinių asiūklių žolės ekstrakai, taip ir tirti junginiai, labiausiai veikė B. subtilis. Naz
ir kiti mokslininkai nustatė, kad kvercetinas stipriausiai veikė B. subtilis mikrobus, jo inhibavimo zona
buvo 19,0 mm [56].
E. faecalis ir grybelis C. albicans buvo atspariausi tiek ekstraktų, tiek tirtų jų
komponentų poveikiui. Nei viena tirtų veikliųjų medžiagų neveikė šių mikoorganizmų net 400 µM
koncentracijomis, ir tik keli ekstraktai slopino jų augimą.
Tokį junginių ir ekstraktų poveikio panašumą lėmė ekstraktų fitocheminė sudėtis. Iš flavonoidų
grupės pagrindinė asiūklio ekstraktų veiklioji medžiaga yra kvercetinas, jo yra penkis kartus daugiau
nei apigenino ar kemferolio [10]. Dėl didelio kvercetino (ir kitų komponentų) kiekio ekstraktuose,
asiūklio ekstraktai pasižymėjo antibakteriniu poveikiu prieš 10 mikroorganizmų šeimų.
3.3. Dirvinių asiūklių ekstraktų gamybos sąlygų įtaka antimikrobiniam aktyvumui
Ekstrakcijos temperatūra buvo svarbi sąlyga ekstraktų aktyvumui. Palyginus skirtingose
temperatūrose (25°C ir 60°C) pagamintų ekstraktų D15 ir D17 antimikrobinį aktyvumą (5 pav.),
nustatyta, kad aktyvesnis yra ekstraktas D15, pagamintas ekstrakciją vykdant 25°C temperatūroje
(visos kitos abiejų ekstraktų gamybos sąlygos buvo vienodos). Aukštesnėje temperatūroje pagamintas
ekstraktas D17 veikė silpniau ir mažiau mikroorganizmų.
5 pav. Ekstraktų D15 ir D17 priešmikrobinio aktyvumo palyginimas
D15: žaliavos-ekstrahento santykis 1:15, temp. 25°C, ekstrakcijos laikas 10 min.
D17: žaliavos-ekstrahento santykis 1:15, temp. 60°C, ekstrakcijos laikas 10 min.
0
2
4
6
8
10
12
14
Inh
ibavim
o z
on
a (
mm
)
D15
D17
30
Žaliavos-ekstrahento santykis taip pat yra svarbus ekstraktų aktyvumui. Palyginus keturis
ekstraktus (D20, D21, D22, D23), pagamintus skirtingu žaliavos-ekstrahento santykiu, kitas sąlygas
išlaikant tas pačias, nustatyta, kad jų aktyvumas skiriasi prieš skirtingas bakterijas (6 pav.). Ekstraktas
D23, kurio žaliavos-ekstrahento santykis yra 1:20, veikė tik keturis (S. epidermidis, B.cereus, B.
subtilis, P. mirabilis) mikroorganizmus. Tuo tarpu ekstraktas D21, kurio žaliavos-ekstrahento santykis
yra 1:5, slopino visų išskyrus E. faecalis mikroorganizmų augimą. Aplamai, E. faecalis buvo labai
nejautrus asiūklių žolės ekstraktų poveikiui.
6 pav. Ekstraktų D20, D21, D22 ir D23 priešmikrobinio aktyvumo palyginimas
D20: žaliavos-ekstrahento santykis 1:10, temp. 50°C, ekstrakcijos laikas 50 min.
D21: žaliavos-ekstrahento santykis 1:5, temp. 50°C, ekstrakcijos laikas 50 min.
D22: žaliavos-ekstrahento santykis 1:15, temp. 50°C, ekstrakcijos laikas 50 min.
D23: žaliavos-ekstrahento santykis 1:20, temp. 50°C, ekstrakcijos laikas 50 min.
Šio magistrinio baigiamojo darbo aprašyti antimikrobinio aktyvumo rezultatai yra
panašūs į daugelį mokslinių publikacijų. Galima teigti, kad žemesnėje temperatūroje esant mažesniam
žaliavos-ekstrahento santykiui, pagaminti ekstraktai yra efektyvūs prieš įvairias ligas sukeliančiuos
mikrobus. Asiūklių žolės preparatai galėtų padidinti chemopreparatų efektyvumą, kovojant prieš
antibiotikams atsparius mikroorganizmus.
6
6,5
7
7,5
8
8,5
9
9,5
10
Inh
ibavim
o z
on
a (
mm
)
D20
D21
D22
D23
31
3.4. Dirvinių asiūklių žolės skystųjų ekstraktų priešvėžinis aktyvumas
Iš keturiolikos tyrimuose naudotų etanolinių ekstraktų priešvėžinį aktyvumą pasirinktoms
ląstelių linijoms turėjo tik šeši (5 lentelė), visi jie pagaminti, ekstrahuojant veikliąsias medžiagas
70 proc. (V/V) etanoliu.
Dirvinių asiūklių žolės etanoliniai ekstraktai labiausiai slopino A549 ir IGR39 ląstelių
proliferaciją. Tik vienas ekstraktas D10 tirtomis koncentracijomis mažino ir U87 ląstelių
gyvybingumą.
5 lentelė. Asiūklių žolės etanolinių ekstraktų priešvėžinis aktyvumas
Ekstrakto
kodas
GI50 (mg/ml)
A549 IGR39 U87
D1 >20 >20 >20
D2 >20 >20 >20
D3 >20 >20 >20
D4 >20 >20 >20
D5 >20 >20 >20
D6 >20 >20 >20
D7 >20 >20 >20
D8 5,6 11,7 >20
D9 14,4 13,3 >20
D10 5,0 5,0 18,0
D11 8,0 >20 >20
D12 7,9 8,6 >20
D13 11,8 11,0 >20
D14 >20 >20 >20
32
Aktyviausiai ekstraktai slopino IGR39 ląstelių gyvybingumą (jų GI50 buvo 5,0–13,3 mg/ml).
Silpniau ekstraktai slopino A549 ląstelių proliferaciją (GI50 = 5,0–14,4 mg/ml), mažiausiai - U87
ląstelių proliferaciją.
Ekstraktas D10 (7 pav.) buvo pats aktyviausias, veikė visų trijų tyrime naudotų ląstelių
augimą. Tokį aktyvumą galėjo nulemti ekstrakto gamybos sąlygos: ekstrahavimo santykis 1:5, bei
ekstrahavimui naudota temperatūra 40°C.
A549 ląstelių proliferaciją veikė net šeši ekstraktai. Nustatytas selektyvus D11 ekstrakto
aktyvumas prieš A549 ląsteles (7 pav.).
IGR39 ląstelių proliferaciją ekstraktai veikė panašiai, kaip A549, tik dažniausiai šiek tiek
silpniau. Aktyviausias iš tirtų ekstraktų buvo D10. Manoma, kad tokį jo aktyvumą lėmė tinkama
ektrahavimo temperatūra (40°C) ir ekstrahento ir žaliavos satykis. Mažiausiai melanomos ląseteles
veikė ekstraktas D9, kurio ekstrahavimo temperatūra buvo 30°C, o žaliavos ir ekstrahento santykis
buvo 1:15.
7 pav. Aktyviausių ekstraktų aktyvumo palyginimas skirtingoms vėžinių ląstelių linijoms
Kiti mokslininkai nustatė dirvinių asiūklių mišinio su kitais augalais citostatinį poveikį
plaučių adenokarcinomai (A549) [57]. Mokslinėje literatūroje daugiau nepavyko rasti dirvinių asiūklių
ekstraktų priešvėžinio poveikio tyrimo duomenų prieš A549, IGR39 ir U87 ląstelių linijas, todėl tai
gali būti pirmasis tokio pobūdžio tyrimas.
0
5
10
15
20
D8 D9 D10 D11 D12 D13
GI 5
0 (
mg/m
l)
Ekstraktų kodai
A549
IGR39
U87
33
3.5. Dirvinių asiūklių ekstraktų veikliųjų medžiagų priešvėžinis aktyvumas
Priešvėžiniam poveikiui įvertinti buvo pasirinktos dirvinių asiūklių žolės ekstraktuose
esančios veikliosios medžiagos (kvercetinas, apigeninas, kemferolis). Jų priešvėžinio aktyvumo tyrimų
rezultatai pateikti 6 lentelėje.
Aktyviausias iš tirtų junginys buvo kvercetinas, jis slopino visų vėžinių ląstelių proliferaciją,
ir aktyviausiai veikė dvi ląstelių linijas (IGR39 ir U87). Mažiausiai aktyvus junginys – kemferolis,
ląstelių gyvybingumo neveikė net 50 µM koncentracija. Pastebėjome, kad kemferolis taip pat
silpniausiai veikė mikroorganizmus ir antimikrobinio aktyvumo tyrime.
6 lentelė 6. Dirvinių asiūklių ekstraktų veikliųjų medžaigų priešvėžinis aktyvumas
Skirtingų junginių aktyvumas prieš atskiras vėžio ląsteles labai skyrėsi. Apigeninas
aktyviausiai slopino A549 ląstelių augimą, net apie 3 kartus geriau nei kvercetinas, tačiau kvercetinas
buvo maždaug 2 kartus aktyvesnis už apigeniną prieš IGR39 ląsteles.
Palyginus junginių gautus rezultatus su ekstraktų duomenimis pastebime, kad tiek ekstraktai,
tiek jų veikliosios medžiagos labiausiai slopino IGR39 ląstelių proliferaciją. U87 ląstelių liniją
ekstraktai veikė silpnai (GI50 18,0 mg/ml) arba visai neveikė, tuo tarpu ekstraktų pagrindiniai
komponentai šias ląsteles veikė panašiai aktyviai kaip ir IGR39 ląsteles.
Mokslinėje literatūroje nepavyko rasti ekstraktų veikliųjų medžiagų (apigenino, kvercetino
kemferolio) priešvėžinio poveikio prieš A549, IGR39, U87 ląstelių linijas, todėl tai gali būti pirmasis
tokio pobūdžio tyrimas. (informacija nesikartoja)
Junginys
GI50 (µM)
A549 IGR39 U87
Kvercetinas 34,1 ± 0,1 7,5 ± 0,3 11,3 ± 0,3
Apigeninas 11,9 ± 0,4 17,5 ± 0,1 19,0 ± 0,2
Kemferolis > 50 > 50 > 50
34
3.6. Dirvinių asiūklių žolės ekstraktų gamybos sąlygų įtaka priešvėžiniam
aktyvumui
Priešvėžiniam dirvinių asiūklių žolės ekstraktų aktyvumui svarbus yra žaliavos-ekstrahento
santykis. Palyginus dviejų ekstraktų D8 ir D10 (8 pav.), pagamintų skirtingu žaliavos-ekstrahento
santykiu (visos kitos abiejų ekstraktų gamybos sąlygos buvo vienodos), nustatyta, kad jų aktyvumas
skiriasi prieš žmogaus vėžinių ląstelių linijas. Ekstraktas D10, kurio žaliavos-ekstrahento santykis yra
1:5, plaučių vėžio ir melanomos ląsteles veikė 5 mg/ml koncentracija. Tuo tarpu ekstraktas D8, kurio
žaliavos-ekstrahento santykis 1:15, melanomos ląstelių gyvybingumą slopino didesne nei 11,7 mg/ml
koncentracija, o glioblastomos ląstelių augimo neveikė. Pastebėjome, kad didėjant žaliavos ir
ekstrahento santykiui, ekstraktai silpniau veikia IGR39 ląstelių proliferaciją. O didžiausiu (1:20)
žaliavos-ekstrahento santykiu pagamintas ekstraktas D11, neturėjo priešvėžinio aktyvumo.
8 pav. Ekstraktų D8 ir D10 priešvėžinio aktyvumo palyginimas
D8: žaliavos-ekstrahento santykis 1:15, temp. 40°C, ekstrakcijos laikas 10 min.
D10: žaliavos-ekstrahento santykis 1:5, temp. 40°C, ekstrakcijos laikas 10 min.
Ekstraktai, pagaminti ekstrahentu naudojant 90 proc. (V/V) etanolį, aktyvumu prieš
vėžines ląsteles nepasižymėjo. Jų aktyvumas nepadidėjo nei keičiant ekstrahavimo temperatūrą (nuo
30 iki 60°C), nei ilginant ekstrakcijos laiką (nuo 10 iki 30 min). Galime padaryti išvadą, kad 90 proc.
(V/V) etanolis nėra naudingas norint pagaminti priešvėžiniu aktyvumu pasižyminčius asiūklių žolės
ekstraktus. Tuo tarpu VAŽ, ekstrahuota 70 proc. (V/V) etanoliu, pasižymėjo priešvėžiniu poveikiu.
Ekstrahavimo temperatūra taip pat yra svarbi ekstraktų priešvėžiniam aktyvumui.
Palyginus tris ekstraktus (D8, D9, D12), pagamintus skirtingoje temperatūroje, kitas sąlygas išlaikant
tas pačias, nustatyta, kad jų aktyvumas skiriasi prieš skirtingas vėžinių ląstelių linijas (9 pav.).
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
A549 IGR39 U87
GI 5
0 (
mg/m
l)
D8
D10
35
Aukštesnėje temperatrooje pagaminti ekstraktai labiau slopina IGR39 ląstelių proliferaciją. Antai,
ekstraktas D12, kuris pagamintas akščiausioje temperatūroje (60°C), buvo aktyviausias prieš IGR39
ląsteles. Panaši tendencija pastebėta ir analizuojant temperatūros įtaką ekstraktų aktyvumui prieš A549
ląsteles: žemesnėje temperatūroje pagaminti ekstraktai (pvz., D9) veikė silpniau nei pagaminti
aukštesnėje (pvz., D8, D12).
9 pav. Ekstraktų D8, D9 ir D12 priešvėžinio aktyvumo palyginimas.
D8: žaliavos-ekstrahento santykis 1:15, temp. 40°C, ekstrakcijos laikas 10 min.
D9: žaliavos-ekstrahento santykis 1:15, temp. 30°C, ekstrakcijos laikas 10 min.
D12: žaliavos-ekstrahento santykis 1:15, temp. 60°C, ekstrakcijos laikas 10 min.
Iš to galima spręsti, kad ekstrahuojant skirtingoje temperatūroje išsiekstraguoja skirtingi
kiekiai veikliųjų medžiagų, kurių kompleksas nevienodai slopina ląstelių augimą. Tai įrodo Mehmet E.
U., Ipek E. mokslininkų tyrimas, kurio metu buvo vertinamas fenolinių junginių kiekis skirtingomis
sąlygomis pagamintuose asiūklių ekstraktuose [53].
Šiame tyrime aktyviausias iš dirvinių asiūklių žolės ekstraktų fenolinių junginių – kvercetinas.
Jis aktyviausiai slopino tiek mikroorganizmų augimą mikrobiologiniame tyrime, tiek aktyviausias
buvo priešvėžinio aktyvumo tyrime. Silpniausias junginys – kemferolis, kuris neslopino vėžinių
ląstelių proliferacijos, taip pat silpniausiai iš tirtų junginių veikė mikroorganizmus. Galime padaryti
išvadą, kad antibakterinis ir priešvėžinis dirvinių asiūklių žolės ekstraktų aktyvumas galėtų priklausyti
nuo kvercetino ir apigenino koncentracijos.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
A549 IGR39
GI 5
0 (
mg/m
l)
D9
D8
D12
36
4. IŠVADOS
1. Dirvinių asiūklių žolės ekstraktai pasižymi skirtingu antimikrobiniu aktyvumu. Didžiausią
antimikrobinį aktyvumą ekstraktai turi prieš Baccillus genties bakterijas, mažiausiai veikia
E. faecalis ir grybelį C. albicans.
2. Labiau aktyvūs prieš mikroorganizmus yra vandeniniai ekstraktai, pagaminti ekstrakciją
vykdant žemesnėje temperatūroje ir esant mažesniam žaliavos-ekstrahento santykiui.
3. Ekstraktų veikliosios medžiagos kvercetinas, apigeninas ir kemferolis labiausiai slopina
S.aureus ir B.subtilis augimą, beveik neveikia mikroorganizmų E. faecalis ir C. albicans.
4. Dirvinių asiūklių etanoliniai ekstraktai labiausiai slopina melanomos (IGR39) ir plaučių
karcinomos (A549) vėžinių ląstelių proliferaciją, beveik neveikia glioblastomos (U87) ląstelių
gyvybingumo.
5. Ekstraktai, pagaminti ekstrahentu naudojant 70 proc. (V/V) etanolį, yra aktyvesni už tuos, kurie
pagaminti ekstrahuojant 90 proc. (V/V) etanoliu.
6. Ekstraktų veikliosios medžiagos turi skirtingą poveikį vėžio ląstelių proliferacijai. Apigeninas
3 kartus labiau slopina A549 ląstelių augimą nei kvercetinas, o kvercetinas yra maždaug 2
kartus aktyvesnis už apigeniną prieš IGR39 ląsteles. Kemferolis vėžio ląstelių proliferacijos
beveik neslopina.
37
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Dirvinių asiūklių ekstraktai galėtų būti pritaikomi kaip pagalbinė priemonė gydyti infekcinius
ar onkologinius susirgimus.
Siekiant pagaminti didesniu antimikrobiniu aktyvumu pasižyminčius dirvinių asiūklių žolės
skystuosius ekstraktus, patartina ekstrakciją vykdyti žemesnėje temperatūroje (25°C), naudoti mažesnį
žaliavos-ekstrahento santykį (1:5).
Norint pagaminti priešvėžiniu aktyvumu pasižyminčius ekstraktus, nepatartina naudoti 90 proc.
(V/V) etanolio. Labiau tinka naudoti 70 proc. (V/V) etanolį, o ekstrakciją vykdyti aukštesnėje nei 30°C
temperatūroje – tokie ekstraktai efektyviau slopina plaučių vėžio ir melanomos vėžio ląstelių
proliferaciją.
38
6. LITERATŪRA
1. World Health Organization. The 10 leading causes of death in the world, 2000 and 2012.
[Žiūrėta 2015-02-05]. Prieiga per Internetą:
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/.
2. Lietuvos sveikatos apsaugos ministerija Higienos instituto Sveikatos informacijos centras.
Gyventojų mirtingumas pagal priežastis. [Žiūrėta 2015.02.05]. Prieiga per Internetą:
http://sic.hi.lt/data/la2013.pdf.
3. Leung E, Weil ED et al.The WHO policy package to combat antimicrobial resistance. The World
Health Organization. 2011; 89: 390–392.
4. Carneiro DM, Cunha LC et al. Equisetum arvense: scientific evidences of clinical use.
International Journal of Biology, Pharmacy and Allied Sciences. 2013; 2: 1579–1596.
5. Geetha RV, Lakshmi T et al. In vitro evaluation of anti mycotic activity of ethanolic extract of
Equisetum arvense Linn. International Journal of Pharmaceutical Sciences. 2011; 1338– 1341.
6. Asgarpanah J, Roohi E. Phytochemistry and pharmacological properties of Equisetum arvense L.
Journal of Medicinal Plants Research. 2012; 6: 3689 – 3693.
7. Community herbal monograph on Equisetum arvense L., herba. European Medicines Agency.
[Žiūrėta 2015-01-16]. Prieiga per Internetą:
http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Herbal_-
. _HMPC_assessment_report/2009/12/WC500018418.pdf
8. Sandhu NS, Kaur S, Chopra D. Equisetum arvense: pharmacology and phytochemistry – a
review. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research. 2010; 3: 131–141.
9. Europos farmakopėja. European Pharmacopoeia 8.0. Equisetum Stem, Equiseti Herba.
01/2008:1825.
10. Mimica-Dukic N, Simin N et al. Phenolic compounds in field horsetail (Equisetum arvense L.)
as natural antioxidants. Molecules. 2008; 13: 1455–1464.
11. Badole S, Kotwal S. Equisetum arvense: ethanopharmacological and phytochemical review with
refrence to osteoporosis. International Journal of Pharmaceutical Science and Health Care.
2014; 4: 2249–5738.
12. Sandhu NS, Kaur S, Chopra D. Phamacognostic evaluation of Equisetum arvense Linn.
International Journal of PharmTech Reaserch. 2010; 2: 1460–1464.
13. European Medicines Agancy. Equisetum arvense L., herba monograph. [Žiūrėta 2014-11-05].
Prieiga per Internetą: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Herbal_-
_HMPC_assessment_report/2009/12/WC500018418.pdf.
39
14. Badole S, Kotwal S. Equisetum arvense: ethanopharmacological and phytochemical review with
reference to osteoporosis. International Journal of Pharmaceutical Science and Health Care.
2014; 4: 131–141.
15. Guo AJ, Choi RC, Zheng KY, Chen VP et al. Kaempferol as a flavonoid induces osteoblastic
differentiation via estrogen receptor signaling. Chinese Medicine. 2012; 7:10
16. Natural Medicine Journal. Evaluating the bioavailability of isoquercetin. [Žiūrėta 2015.02.06].
Prieiga per Internetą: http://naturalmedicinejournal.com/journal/2010-01/evaluating-
bioavailability-isoquercetin/.
17. Geetha RV, Roy A et al. Nature’s weapon against urinary tract infections. International journal
of drug development and research. 2011; 3: 85–100.
18. WHO Library Cataloguing in Oublication Data. The evolving threat of antimicrobial resistance:
options for action. [Žiūrėta 2015-01-20] Prieiga per Internetą:
http://whqlibdoc.who.int/publications/2012/9789241503181_eng.pdf.
19. Geetha R.V, Lakshni T et al. In vitro evaluation of anti bacterial activity of Equisetum arvense
Linn on urinary tract pathogenes. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical
Sciences. 2011; 5: 323–325.
20. Breidenstein EBM, Hancock REW et al. Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance.
Trends in Microbiology. 2011; 19: 419–426.
21. Pavilonis A. Lasinskaitė-Čerkašina A. Vaičiuvėnas V. Akramas L. Medicinos mikrobiologijos
pagrindai. Kaunas: KMU spaudos ir leidybos centro leidykla, 2000, p. 47 – 197.
22. Čaplinskas S, Andziukevičiūtė J. Mikroorganizmų atsparumas ir infekcijos. Tyla prieš audrą. Iš
Lietuvos bendrosios praktikos gydytojas [interaktyvus]. 2012 spalis [Žiūrėta 2015-01-10].
Prieiga per Internetą: http://www.sauliuscaplinskas.lt/wp-content/uploads/2012/10/2012-LBPG-
Nr8-Caplinskas.pdf.
23. Sinha SN. In vitro Antibacterial Activity of Ethanolic Extract of Equisetum arvense L.
International Journal of Pharmaceutical and Biological Research . 2012, 0976–285.
24. Oliveira de JR, Camargo A et al. Cytotoxicity of Brazilian plant extracts against oral
microorganisms of interest to dentistry. BMC Complementary and Alternative Medicine 2013;
13:208.
25. Garcia D, Ramos AJ et al. Effect of Equisetum arvense and Stevia rebaudiana extracts on growth
and mycotoxin production by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides in maize seeds as
affected by water activity. Int J Food Microbiol. 2012; 153:21–7.
26. Ramos AJ, Sanchis V et al. Equisetum arvense hydro-alcoholic extract: phenolic composition
and antifungal and antimycotoxigenic effect against Aspergillus flavus and Fusarium
verticillioides in stored maize. Journal Science Food Agric. 2013; 93: 2248–2253.
40
27. Anupam G, Bidus KD, Arup R, Biplab M et al. Antibacterial activity of some medicinal plant
extracts. Journal of Natural Medicines. 2008; 62: 259–262.
28. Vilniaus universitetas, Lietuvos pulmonologų draugija, Lietuvos chemoterapeutų draugija,
Lietuvos onkologų draugija, Valstybinis patologijos centras. Plaučių vėžio diagnostikos ir
gydymo gairės (metodinės rekomendacijos) [Žiūrėta 2015.02.17]. Prieiga per Internetą:
http://www.chest.lt/uploads/pdf/PV%20gaires%20galutinis.pdf#page
29. Yin SY, Wei WC, Jian FY, Yang NS. Therapeutic applications of herbal medicines for cancer
patients. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2013; 128: 1–15.
30. Ahmadloo N, Kani AA, Mahammadianpanah M. et al. Treatment outcome and prognostic
factors of adult glioblastoma multiforme. Journal of the Egyptian National Cancer Institute.
2013; 25: 21–25.
31. Batich KA, Swartz AM, Sampson JH. Enhancing dendritic cell-based vaccination for highly
aggressive glioblastoma. Expert Opinion on Biological Therapy. 2014; 15: 1–16.
32. Bunevičius A, Deltuva VP, Deltuvienė D, Tamašauskas A, Bunevičius R. Sunkumai
diagnozuojant smegenų naviką: schizoafektinio sutrikimo ir astrocitomos klinikinis atvejis.
Biologinė Psichiatrija ir Psichofarmakologija. 2011; 13: 10–12.
33. Vaišnorienė I, Didžiapetrienė J, Smailytė G, Valuckas KP. Odos melanomos ankstyvoji
diagnostika. Medicinos teorija ir praktika. 2013; 19: 366–372.
34. Valčiukaitė S, Norkutė R, Daveckaitė A. Melanomos diagnostika ir gydymo principų aptarimas.
Internistas. 2010; 4: 87–90.
35. Alexandru V, Gille E et al. Investigation of pro-apoptotic activity of Equisetum arvense L. water
extract on human leukemia U9 cells.. 2007 March [online]. From National Institute R&D for
Biological Sciences [cited 2015.01.15]. Available from Internet
http://www.rombio.eu/lucr_3_valentina%20BT.htm.
36. Dragana D, Tumbas TV, Djilas MS et al. Antioxidative and antiproliferative activities of diffrent
horsetail (Equisetum arvense L.) Extracts. Journal of Medicinal Food. 2010; 13: 452–459.
37. Romano B, Pagano E, Montanaro V et al. Novel insights into pharmacology of flavonoids.
Phytotherapy Researh. 2013; 11: 1588–1596.
38. Rauha JP, Remes S, Heinonen M, Hopia A et al. Antimicrobial effects of Finnish plant extracts
containing flavanoids and other phenolic compouds. International Journal of Food
Microbiology. 2000; 56: 3–12.
39. Eheman C, Henley J et al. Annual report to the nation on the status of cancer, 1975-2008,
featuring cancers associated with excess weight and lack of sufficient physical activity. Cancer.
2012; 27: 2338–2366.
41
40. Lazarevic B, Boezelijn G, Diep LM, Kvernrod K et al. Efficacy and safety of short-term
genistein intervention in patients with localized prostatecancer prior to radical prostatectomy: a
randomized, placebo-controlled,double-blind phase 2 clinical trial. Nutrition Cancer. 2011; 63:
889–898.
41. Ravishankar D, Rajora AK, Greco F et al. Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer
therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2013; 41: 1–11.
42. Cushnie TPT, Lamb AJ. Antimicrobial activity of flavonoids. International Journal of
Antimicrobial Agents 2005; 26: 343–356.
43. Heim KE, Tagliaferro AR, Bobilya DJ. Flavonoid antioxidants: chemistry, metabolism and
structure–activity relationships. Journal of Nutritional Biochemistry. 2002; 13: 572–584.
44. Tsuchiya H, Sato M, Miyazaki T. et al. Comparative study on the antibacterial activity of
phytochemical flavanones against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Journal of
Ethnopharmacology. 1996; 50: 27–34.
45. Cushnie TPT, Lamb AJ. Antimicrobial activity of flavonoids. International Journal of
Antimicrobial Agents. 2005; 26: 343–356.
46. Cárdenas M, Marder M. Antitumor activity of some natural flavonoids and synthetic
derivatives on various human and murine cancer cell lines. Bioorganic and Medicinal Chemistry.
2006; 14: 2966–2971.
47. Heim KE, Tagliaferro AR, Bobilya DJ. Flavonoid antioxidants: chemistry, metabolism and
structure–activity relationships. Journal of Nutritional Biochemistry. 2002; 13: 572–584.
48. Noipa T, Srijaranai S, Tuntulani T. et al. New approach for evaluation of the antioxidant capacity
based on scavenging DPPH free radical in micelle systems. Food Research International. 2011;
44: 798–806.
49. Baltriukienė D, Jankevičius K, Paunksnytė I et al. Balinio ajero (Acorus calamus) šaknų
ekstrakto poveikio vėžinių ląstelių proliferacijai tyrimas. Darnaus vystymosi strategija ir
praktika/mokslo darbai. 2011; 5: 114–119.
50. Jasna M, Gordana S. et al. Radical scavenging and antimicrobial activity of horsetail (Equisetum
arvense) extracts. International Journal of Science and Technology. 2009; 44: 269–278.
51. Radulovic N, Stojanovic G. et al. Composition and antimicrobial activity of Equisetum arvense
L. essential oil. Phytotherapy Research. 2006; 20: 85–88.
52. Suciu M, Ardelean A. Review: hepatoprotective and microbiological studines of three genera:
Equisetum, Lycopodiem and Gentiana. Analele Universitatii din Oradea – Fascicula Biologie.
2012; 2: 116–122.
42
53. Uslu ME, Erdogan I, Bayraktar O et al. Optimization of extraction conditions for active
components in Equisetum arvense extract. Romanian Biotechnological Letters. 2013; 2: 8115–
8131.
54. Milovanovic V, Radulovic N, Todorovic Z. Et al. Antioxidant, antimicrobial and genotoxicity
screening of hydro-alcoholic extracts of five serbian Equisetum species. Plant Foods Hum Nutr.
2007; 62: 113–119.
55. Basile A, Sorbo S et al. Antibacterial and allelopathic activity of extract from Castanea sativa
leaves. Fitoterapia. 2000; 71: 110–116.
56. S. Naz, R. Siddiqi et al. Antibacterial activity directed isolations of compounds from Punica
granatum. Institute of Food Technologists. 2007; 72: 341–345.
57. Tepkeeva II, Aushev VN, Zborovskaya IB et al. Cytostatic activity of peptide extracts of
medicinal plants on transformed A549, H1299, and HeLa cells. Bulletin of Experimental Biology
and Medicine. 2009; 147: 48–51.
58. Prenzelr PD, Robards K et al. Phenolic compounds and their role in oxidative processes in fruits.
Food Chemistry. 1999 66: 401–436.