discovery of novel medicinal seeds by diversification of

Discovery of Novel Medicinal Seeds by Diversification of Natural Resources

27

(Kamauchi, Hitoshi)

1

1

1-1 E. rubrum 10

1-2 E. rubrum 11

1-3 E. rubrum

14

1-4 21

1-5 25

2

2-1 E. rubrum

26

2-2 28

2-3 Chemically engineered extract

31

2-4 34

2-5

40

2-6 45

3

3-1 46

3-2 E. rubrum 49

3-3 Diethyl 1,3-acetonedicarboxylate

51

3-4

63

3-5 70

3-6 72

3-7 73

3-8 75

76

78

103

110

1

【序論】

1981 年から 2014 年までに開発されたすべての医薬品のうち 37%は天

然由来化合物 , 植物医薬品 , 天然物誘導体 , 天然由来化合物ミミックとい

った天然資源由来のものである . 低分子医薬品に限ると 60%もの医薬品

が天然資源と関連がある . 開発された低分子医薬品において天然資源が

占める割合は , 1980 年代後半をピークに 2000 年代初頭まで減少傾向にあ

ったものの , 2010 年以降は増加傾向にある .1 したがって現在の創薬にお

いても天然資源の重要性は不変であるといえる . 天然資源からの創薬と

しては 2015 年にノーベル医学生理学賞を受賞した大村智 , W. C. Campbell

らによる ivermectin と , Y. Tu らによる artemisinin の開発が挙げられる . 大

村らは , 日本の土壌から分離された放線菌 Streptomyces avermitilis より

avermectin B1a を単離し , それが駆虫活性を示すことを見出した (Fig. 1).

その後 , 活性の増強 , 副作用の軽減を目的に合成された ivermectin がアフ

リカ等でオンコセルカ症の治療薬として用いられ , 多くの人々を失明の

危機から救ったことが知られている .2,3

一方で Tu らによって発見された artemisinin はキク科植物である

Artemisia annua より単離されたセスキテルペノイドである . Artemisinin は

強い抗マラリア活性を示し , かつ副作用が少なかったことから多くのマ

ラリア患者の治療に用いられた (Fig. 2).4 Ivermectin の複雑な環状構造や

Fig. 1 Avermectin B1a

2

artemisinin のペルオキシド構造のように , 天然資源から得られる化合物

はユニークな構造を持つことがあり , 多彩な生物活性を示してきた . こ

のような背景から , 天然由来化合物から多くの医薬品が開発されてきた .

天然資源からの成分探索研究が進められている一方で , 新規化合物の

獲得が比較的困難になりつつある . その原因の一つとして , 容易に入手

可能な天然資源は少なからず成分探索研究が行われていることが挙げら

れる . したがって , それらから新規化合物を発見できたとしても , 単離す

ることが困難であるか , あるいは含有率が極めて低いマイナー化合物で

あることが多い . それに伴い , 新たな天然資源として , 海草 , 海藻 , 海綿

といった海洋資源や東南アジアなどの未開の地にある資源の研究が進め

られた . その結果 , 群体ホヤの一種である Ecteinascidia turbinata からは

イソキノリンアルカロイドである ecteinascidin 743 が単離され , 抗腫瘍薬

YONDELIS® のリード化合物となった . また , クロイソカイメン

Halichondria okadai からは複雑に官能基化された多環性縮環構造を持つ

halichondrin B が発見され , こちらも抗腫瘍薬の eribulin のリード化合物

となった (Fig. 3).5

Fig. 2 Artemisinin

3

世界中の資源を利用した医薬品の開発が進められている中で , 1993 年

に締結した生物多様性条約 (Convention on Biological Diversity: CBD) は

天然資源からの医薬品開発に大きな影響を及ぼした . CBD によって , 遺伝

資源を利用して利益を得た国は , 遺伝資源を提供した国の資源および先

住民と地域社会の伝統的知識に対し , 利益配分することが求められるよ

うになった . そして , 生物多様性条約第 10 回締約国会議 (COP10) で「生

物の多様性を包括的に保全し , 生物資源の持続可能な利用を行うため ,

遺伝資源の利用から生ずる利益の公正な配分 (Access to genetic resources

and Benefit Sharing: ABS)」が採択された .6 ABS は基礎研究にも適用され

るため , 天然物化学において , 海外の資源に自由にアクセスすることが

困難になっているのが現状である .7

このように新たな創薬資源の開発が急務である中で , 近年では既存の

遺伝資源を活用して新規医薬品シード化合物を探索する研究が展開され

ている . 主に , 微生物をターゲットとした研究が盛んに行われており ,

Fig. 3 Structures of ectenascidin 743 and halichondrin B

4

OSMAC や , ケミカルエピジェネティクスといった手法が活用されている .

OSMAC とは One Strain MAny Compounds の略であり , 一つの生物資源か

ら多様な化合物を獲得する手法である . 微生物は同一菌種であっても地

上のみならず , 土壌中 , 水中 , 食品といった様々な環境下に生息する . ま

た , 微生物は異なる環境に適応するにあたり , 活用する生合成遺伝子を

使い分けていることが考えられている . したがって , 成分探索研究がな

された菌種でも , 培養条件を変化させることによって , 新たな二次代謝

産物の獲得が可能である .8–10 タイ薬用植物 Tiliacora triandra の根より単

離された植物内生菌 Dothideomycete sp.は Potato tuber 培地 , Potato Dextrose

Broth 培地 , Czapek malt 培地で生産する二次代謝産物が異なることが明ら

かにされた . そして , 様々な培養方法からなる抽出エキスから計 6 種の新

規ポリケチド化合物が単離されている .8

ケミカルエピジェネティクスは通常の培養では利用されていない休眠

遺伝子を活性化させる手法の一つである . 真菌類には人類が大量培養可

能な条件下では利用していない不活性状態の生合成遺伝子が存在すると

考えられている . これら不活性状態の生合成遺伝子のことを休眠遺伝子

11 と呼び , それを活性化することで新たな二次代謝産物を得ることが可

能である . 休眠遺伝子の活性化は主に DNA メチル化剤 , ヒストン脱アセ

チル化酵素 (HDAC) 阻害剤存在下で真菌類を培養することで引き起こ

され , 様々な菌種から多くの新規化合物が単離されている .11–13

本学の生薬学研究室は , 既存の薬用資源として海洋由来真菌やキノコ

子実体といった真菌類に注目して成分探索研究を行ってきた . 海洋は地

球表面積の約 70%を占める広大な面積を有しており , 塩分濃度など生息

環境が地上とは大きく異なる . そのため , 陸上に生息する同一菌種とは

異なる二次代謝産物の生産が期待される . また , キノコ子実体は菌類が

胞子形成のために作られたものであり , 菌糸そのものの二次代謝産物と

は異なる二次代謝産物が含まれていると考えられている . これまでの生

5

薬学研究室では海洋由来真菌から天然では珍しいシクロプロパン環や大

環状構造を分子内に持つジテルペノイドを得ることに成功した .14,15 ま

た最近では , チャコブタケ (Daldinia concentrica) 子実体から新規イソイ

ンドリノン , フタリド , ナフトキノン誘導体を単離した (Fig. 4).

著者は真菌類を更に活用した資源を開発するにあたり , 微生物の代謝

によって既存の天然資源を変化させる「発酵現象」に注目した . 人類は古

くから食品の製造に微生物を応用しており , 酒類 , ヨーグルト , 納豆は原

料中の成分を発酵によって変換させる過程を経て生産される . 医薬品と

しては抗血栓薬 warfarin のリード化合物となった dicoumarol が発酵され

たスイートクローバーより単離された例がある .16 著者は先行研究で

Saccharomyces 属の酵母を用いて発酵した植物ステビア (Stevia

rebaudiana) 葉から新規テルペノイドを得ることに成功した . 17,18 また ,

海洋由来真菌 Cladosporium cladosporioides で発酵させた生薬ソウジュツ

Fig. 4 Isolated new compounds from marine-derived fungi and ascomycete.

6

(Atractylodes Lancea Rhizome) より新規セスキテルペノイドを単離するこ

とに成功した (Fig. 5).19

Fig. 5 New compounds from fermented natural resources.

新しい天然資源を開発する研究と共に , 天然物誘導体の研究も広く展

開されている . 前述の 1981 年から 2014 年までに開発された天然由来の

低分子医薬品のうち一番多くを占めるのが天然物誘導体である .1 天然物

誘導体を合成する目的は , 天然から発見されたリード化合物に対する溶

解性や安定性などの物性の改善や生物活性の向上などが挙げられる . 一

方で化学構造に注目すると , 天然物誘導体は天然由来の構造が化学反応

によって変換されている . したがって , 天然物誘導体は従来の天然由来

成分よりも新規性の高い構造を有していることが期待される .

Schreiber らは新たな医薬品シード開発に向けて , Diversity-Oriented

Synthesis: DOS が有効であると提唱した .20 DOS は単一の化合物を効率よ

く得ることを目標にした従来の有機合成とは異なり , 共通中間体から基

本骨格ベースの構造多様性を生み出すことを目的とした合成法である .21

7

DOS と同様の手法として , Scaffold diversity synthesis : SDS も提唱されて

いる . ここで示す scaffold とは , 様々なターゲット分子と相互作用できる

3 次元構造のことを指す .

Liu らは DOS, SDS 法に基づき , 分子内に複数の求電子部位を持つ化合

物を共通前駆体としたさまざまなドミノ型反応を行った . そして天然由

来化合物の部分構造を持つ化合物や , 複雑な新規骨格を持つ多様な化合

物を得ることに成功している (Fig. 6).22

どちらの手法においても天然由来化合物に応用することで , 構造多様

性に富んだ前例のない構造や , 天然物に類似した新規骨格を導入するこ

とができる .23–25 このような新規性の高い構造は , 革新的な医薬リード化

合物を生み出す可能性を秘めている .

現在では DOS, SDS といった合成法を天然物抽出エキスに直接適用し

た Chemically engineered extract: CEE 法や , Diversity enhanced extract: DEE

法が開発されている . CEE 法や , DEE 法は天然物抽出エキス中の化合物を

直接誘導化する手法であり , 構造多様化が進んだ天然物誘導体を一挙に

Fig. 6 Strategy to DOS and SDS.22

8

生産することが可能である . そして , そこから新規骨格を持つ化合物や ,

生物活性を示す化合物の発見が期待できる .26–28

このような天然物抽出エキス中の様々な化合物を直接誘導化し , 新た

な化合物を獲得する手法にはいくつかの利点がある . まず , 天然物の抽

出エキス中に含まれる対象となるすべての化合物を一度に誘導化するこ

とが可能である . 次に , 誘導化した様々な化合物を単離することなくそ

のまま評価できる . したがって , 本方法論によって従来の成分探索研究

や , 天然物誘導体合成では得られなかった新規医薬品シード化合物の探

索が可能となる (Fig. 7).

以上の背景から , 新たな医薬品シード化合物探索に向けた研究に着手

した . 研究材料として , 海洋由来真菌 Eurotium rubrum を使用し , OSMAC

に基づいた培養条件を変更した成分探索と chemically engineered extract

法に基づいた天然物誘導化エキスの成分探索を行った . 以下本論におい

て，第 1 章では Czapek-Dox 寒天培地と , 麦培地の両方で培養した海洋由

来真菌 E. rubrum の生産する二次代謝産物について , 抽出エキスの含有成

分 , B16 melanoma 細胞を用いたメラニン産生抑制活性の違いを検討した .

また , 比較的強い活性を示した麦培地で培養した抽出エキスについて成

分探索を行った . そして単離された化合物の構造を明らかにするととも

にそれらと誘導体の一部のメラニン産生抑制活性を評価した . 第 2 章で

は chemically engineered extract に基づいた新規生物活性化合物の獲得を

Fig. 7 Outline of derivatization of natural extract.

9

目的に海洋由来真菌 E. rubrum 抽出エキスのクマリン化合物への誘導化

を行った . そして , メラニン産生に関わる酵素であるチロシナーゼの阻

害活性を示す化合物を探索した . 第 3 章では更に海洋由来真菌 E. rubrum

抽出エキスのクマリン二量化を行い , 同様にチロシナーゼ阻害活性を示

す化合物の探索を行った .

10

【第 1 章】培地成分を変更した海洋由来真菌からのメラニン産生抑制化

合物の探索

1-1 海洋由来真菌 E. rubrum について

本研究で用いた海洋由来真菌 MPUC136 は 2005 年 11 月千葉県長生郡

一松海岸にて採取した海草より分離 , 培養した真菌である . 本菌は DNA

塩基配列に基づく真菌同定法により E. rubrum であると同定した .29

E. rubrum は子嚢菌門 , 不整子嚢菌綱 , Eurotium 目に属する真菌類 (カ

ビ ) の一種で , Aspergillus 属の有性世代にあたる . Eurotium 属の真菌は一

般的に「カワキコウジカビ」と呼ばれる好乾性の真菌である . 一般的な真

菌類が水分活性 0.9 (相対湿度 90%) 以上の条件を好むのに対し , Eurotium

属は水分活性 0.75 程度の条件を好む .30 この特性から , Eurotium 属の真菌

は鰹節や , ジャムなどから検出されることが多い . E. rubrum の主たる二

次代謝産物として , flavoglaucin などのベンズアルデヒド誘導体や

rubrumazine A などのジケトピペラジンアルカロイド , rubrocristin などの

アントラキノン類が報告されている .31,32

このように通常の真菌類と比べて Eurotium 属は特異な生息環境を好む

ことから , 異なる条件で海洋由来真菌 E. rubrum を培養し , 生産する二次

代謝産物の違いを検討することとした .

11

1-2 異なる条件での海洋由来真菌 E. rubrum の培養

海洋由来真菌 E. rubrum を PGY (Peptone Glucose Yeast) 斜面培地にて前

培養した . そして , 海水に浸した麦培地と CD (Czapek-Dox) 寒天培地に

播種し , 26°C, 遮光条件下 14 日間それぞれ培養した . 培養後 , CHCl3 にて

抽出し , それぞれのエキスを作成した . 各抽出エキスについて , HPLC を

用いた成分分析を行ったところ , 期待した通りそれぞれに異なる化合物

が含まれることが判明した (Fig. 8).

Fig. 8 The CHCl3 ext. of E. rubrum on barley medium and Czapek-Dox agar

medium.

次に , それぞれの抽出エキスの生物活性の違いを評価するため , メラ

ニン産生抑制活性を評価した . メラニンとはアミノ酸である tyrosine から

生合成される褐色または黒色の色素のことを指し , 紫外線による生体内

の遺伝子変異を防ぐことなどを目的に合成される . Tyrosine はチロシナー

ゼによって L-DOPA, L-dopaquinone へと順次酸化され , L-dopaquinone は環

状構造を持つ dopachrome となる . Dopachrome は脱炭酸やチロシナーゼ関

連タンパク質 (Tyrosinase-related-protein: TYRP) によって 2 種類のインド

ール化合物へと誘導化される . そしてこの二つの化合物が重合すること

でメラニンの生合成が完結する (Scheme 1).33 先天的なメラニン合成の

欠損は眼皮膚白皮症を引き起こす原因となり ,過剰にメラニンが産生され

るとシミやソバカスといった色素沈着につながる .33, 34 そのため , メラニ

12

ン産生を調節する化合物はこれらの皮膚疾患に対して有用である .

Scheme 1 Biosynthesis of melanin.

天然からのメラニン産生抑制化合物として kojic acid や-arbutin が単離

されている (Fig. 9). Kojic acid は銅イオンにキレート作用することでチ

ロシナーゼを不活性化し , -arbutin はチロシナーゼを競合的に阻害する

hydroquinone のプロドラッグとして作用する .35 また , より強力なメラニ

ン産生抑制活性を示す化合物として -arbutin が開発されている (Fig.

9).36

Fig. 9 Kojic acid, -arbutin and -arbutin.

メラニン産生抑制試験は B16 melanoma 細胞を用いて行った . 6-well プ

レートで培養した細胞にサンプルを添加し , 72 時間適用した . その後 , ラ

イゼートを作成し細胞が生産するメラニンを定量した (Fig. 10).

13

Czapek-Dox 寒天培地 , 麦培地で培養したそれぞれの E. rubrum CHCl3

抽出エキスについて濃度 2.5, 5.0, 10.0 g/mL で評価した . Czapek-Dox 寒

天培地で培養した抽出エキスが 10.0 g/mL でメラニン産生量を約 70%に

減少させたのに対し , 麦培地で培養した抽出エキスは 5.0 g/mL で約 75%,

10.0 g/mL で約 55%へと減少させた (Fig. 11). このことから , 麦培地で

培養することで生産された化合物がより強いメラニン産生抑制活性を示

すことが推測された . そこで , メラニン産生抑制活性を指標に麦培地で

培養した CHCl3 抽出エキスの成分探索を行った .

Fig. 10 Anti-melanogenesis assay.

Fig. 11 Melanin contents of CHCl3 ext. of E. rubrum on Barley medium and

Czapek-Dox agar medium.

14

1-3 麦培地で培養した海洋由来真菌 E. rubrum 抽出エキスの成分探索

PGY 寒天培地で前培養した海洋由来真菌 E. rubrum を麦培地に播種し ,

26°C, 14 日間培養した . その培養物を CHCl3で抽出し , 減圧下で濃縮した .

得られた CHCl3 抽出エキス (23.0 g) に EtOAc を加え , 可溶部と不溶部に

分離し , 2 (2.6 g) をその不溶部として得た . EtOAc 可溶部について silica

gel column chromatography (Si CC, CHCl3-MeOH) により 4 つの画分 (a–d)

に分離した . これらの画分のメラニン産生抑制試験を行ったところ , Fr. b

および Fr. c に活性が見られた (melanin content: 30.9 and 29.9%). このう

ち , 収量が多い Fr. c について詳細な分離を行った .

Fr. c を Si CC, octa decyl silyl silica gel (ODS CC), 分取 HPLC により分

離 , 精製し , 7 種の化合物 1 (8.1 mg), 3 (6.2 mg), 4 (40.2 mg), 5 (20.0 mg), 7

(3.2 mg), 8 (14.4 mg), 9 (1.9 mg) を単離した . また , TLC において麦培地で

培養した抽出エキスにのみ見られたスポットを含む Fr. d についても同様

に分離を行い , 6 (10.1 mg) を単離した (Fig. 12).

15

Fig. 12 Flowchart of E. rubrum CHCl3 ext.

16

化合物 1 は黄色油状物質として得られ , 高分解能 EIMS より分子式

C24H29N3O3 (m/z: 407.2207 [M]+) を与えた . UV スペクトルは 213, 233, 293,

341 nm に極大吸収を示し , IR スペクトルからは , アミノ基 (3290 cm−1) と

二つのアミド (1674, 1633 cm−1) の存在が確認された . 1H-NMR のスペク

トルデータより , 3 つのアミノ基H 8.33 (1H, brs, 1-NH), H 7.44 (1H, brs,

11-NH), H 6.66 (1H, brs, 14-NH), 3 つの芳香族プロトン H 7.12 (1H, brs,

H-4), H 7.09 (1H, dd, J = 8.2, 1.6 Hz, H-6), H 7.31 (1H, d, J = 8.2 Hz H-7),

一つのオレフィン由来のプロトン H 7.19 (1H, s, H-8), ビニル基由来のプ

ロトン H 6.07 (1H, dd, J = 17.3, 11.0 Hz, H-16), H 5.18 (1H, d, J = 17.3 Hz,

H-17), H 5.22 (1H, d, J = 11.0 Hz, H-17), 5 つのメチル基由来のプロトン H

1.52 (3H, s, H-18), H 1.52 (3H, s, H-19), H 1.40 (3H, s, H-23), H 1.32 (3H,

s, H-24), H 1.59 (3H, d, J = 7.1 Hz, H-25), 低磁場シフトしたプロトン H

4.30 (1H, q, J = 7.1 Hz, H-12), H 2.84 (1H, dd, J = 14.0, 6.0 Hz, H-20), H

3.05, (1H, dd, J = 14.0, 6.0 Hz, H-20), H 2.99 (1H, t, J = 6.0 Hz, H-21) のシ

グナルが観測された .

また , 13C-NMR のスペクトルデータからは 12 個のオレフィン由来の炭

素C 144.2 (C-2), C 102.7 (C-3), C 126.4 (C-3a), C 118.6 (C-4), C 130.6 (C-

5), C 123.4 (C-6), C 111.8 (C-7), C 133.2 (C-7a), C 111.4 (C-8), C 124.6

(C-9), C 144.2 (C-16), C 113.4 (C-17), 2 つのアミド由来の炭素 , C 159.8

(C-10), C 165.7 (C-13), 2 つのメチン C 51.6 (C-12), C 65.1 (C-21), 一つ

のメチレン C 35.6 (C-20), 2 つの第 4 級炭素 39.2 (C-15), C 58.7 (C-22),

5 つのメチル基由来の炭素C 27.3 (C-18), C 27.4 (C-19), C 19.0 (C-23), C

24.8 (C-24), C 20.8 (C-25) のシグナルが観測された (Table 1).

これらの NMR のスペクトルパターンは , すでに報告のあるジケトピペ

ラジンアルカロイドである , rubrumiline A37 のスペクトルデータと類似し

ており , 1H-1H COSY および HMBC の相関より 1 の平面構造は rubrumiline

A とほぼ同様の構造であることが明らかになった (Fig. 13, 14). 一方で , 1

17

の分子式は rubrumiline A よりも水分子一つ分少なく (1: C24H29N3O3,

rubrumiline A: C24H31N3O4), 21 位のプロトンの化学シフト (H 2.99) は

rubrumiline A のプロトン (H 3.50) よりも高磁場シフトしていた . 以上の

ことから , 1 は rubrumiline A の 21, 22 位のジオール構造がエポキシドに置

き換わったものであると決定した (Fig. 14).

1 の 8 位 , 12 位及び 21 位の立体化学を決定するため , エポキシドの開

裂反応による rubrumiline A への誘導化を行った . 1 は 20 位がメチレンで

あることから 21–22 位のエポキシドが空間的に空いている . 従って酸性

条件下でエポキシドを開裂させることで 21 位の立体化学を保持したジオ

ール誘導体を得ることが見込まれる .38 開裂反応は , 1 をメタノール中 , 塩

酸と反応させることで行い , ジオール誘導体のみを得ることに成功した

(Scheme 2). 得られたジオール誘導体の 1H-NMR, 並びに ECD のスペクト

ルデータは rubrumiline A のものと一致した . このことから , 1 の 8 位のオ

レフィンは Z 配置であり , 12 位及び 21 位の立体化学は共に S 配置である

と決定した . 本化合物は新規化合物であったため , Isoechinulin D と命名

した .

また , 8 種の既知化合物は , 1H-, 13C-NMR の各種スペクトルデータの比

較により , それぞれ , echinulin (2)39, alkaloid E-7 (3)40 , cryptoechinulin G

(4)41, isoechinulin B (5)42, rubrumiline A (6)37 , rubrumiline D (7)37,

neoechinulin A (8)43, isoechinulin C (9)42 と同定した (Fig. 15).

18

Table 1 1H- (400 MHz) and 13C- (125 MHz) NMR spectroscopic data for 1 ( in ppm, J in Hz) in CDCl3

1

Pos. H C

1-NH 8.33 (1H, brs)

2 144.2

3 102.7

3a 126.4

4 7.12 (1H, brs) 118.6

5 130.6

6 7.09 (1H, dd, 8.2, 1.6) 123.4

7 7.31 (1H, d, 8.2) 111.8

7a 133.2

8 7.19 (1H, s) 111.4

9 124.6

10 159.8

11-NH 7.44 (1H, brs)

12 4.30 (1H, q, 7.1) 51.6

13 165.7

14-NH 6.66 (1H, brs)

15 39.2

16 6.07 (1H, dd, 17.3, 11.0) 144.2

17 5.18 (1H, d, 17.3) 113.4

5.22 (1H, d, 11.0)

18 1.52 (3H, s) 27.3

19 1.52 (3H, s) 27.4

20 2.84 (1H, dd, 14.0, 6.0) 35.6 3.05 (1H, dd, 14.0, 6.0)

21 2.99 (1H, t, 6.0) 65.1

22 58.7

23 1.40 (3H, s) 19.0

24 1.32 (3H, s) 24.8

25 1.59 (3H, d, 7.1) 20.8

19

Fig. 13 HMBC and 1H-1H COSY correlations of 1.

Fig. 14 Structures of 1 and rubrumiline A.

Scheme 2 Derivatization of 1.

20

Fig. 15 Isolated compounds from E. rubrum (barley medium) .

21

1-4 メラニン産生抑制活性試験

今回 , 単離したジケトピペラジン化合物 (1–9) に対し , B16 melanoma

細胞を用いたメラニン産生抑制試験を行った . 本試験では細胞の生産す

るメラニンの量だけでなく , 細胞数も測定し , 細胞毒性の評価も同時に

行った .

また , プレニル基の有無による構造活性相関を検討するため , L-

tryptophan と L-alanine からなるジケトピペラジン化合物 (10, Fig. 16) を

別途合成 44–47 し同様にメラニン産生抑制活性を評価した .

Fig. 16 Synthesized diketopiperazine derivative (10).

試験の結果 , 2–4 は細胞毒性を示さない範囲で優位なメラニン産生抑制

活性が見られた . 特に 3 は 10 M 以下の濃度でも活性を示した . それぞ

れの IC50 は 68, 2.4, 83 M となり , ポジティブコントロールである-

arbutin (IC50 = 608 M) よりも強い活性であることが明らかになった . ま

た , 1 及び 5–9 は細胞毒性を示した . 一方で合成した 10 はメラニン産生抑

制活性及び細胞毒性を示さなかった (Fig. 17).

22

Fig. 17 Anti-melanogenesis activities of 1–10 and -arbutin.

23

これらの結果より構造活性相関を考察すると , オレフィンとプレニル基

の数および結合位置が活性発現に重要であることが判明した . プレニル

基のない 10 はメラニン産生抑制活性 , 細胞毒性を共に示さなかったのに

対し , プレニル基を 1 つ , または 2 つ有する 1, 5–9 は細胞毒性を示した .

細胞毒性を示さずメラニン産生抑制活性を示した 2–4 はプレニル基が 3

つ存在する点で共通していた . メラニン産生抑制活性を示した化合物を

比較すると , プレニル基が 2, 5, 7 位に存在する 3 の方が , 2, 4, 5 位に存在

する 4 よりも強い活性を示した . さらに 2 および 3 との比較により , 8 位 ,

12 位はオレフィンである方が強い活性を示すことが明らかになった (Fig.

18).

各化合物において HPLC による成分分析を行った結果 , ジケトピペラ

ジン化合物は CD 培地で培養した抽出エキスにはわずかにしか検出され

なかったのに対し , 麦培地で培養した抽出エキスでは生産量が増加する

ことが明らかになった (Fig. 8). このことから , 麦培地と CD 培地で培養

した抽出エキスのメラニン産生抑制活性の違いは , ジケトピペラジン化

合物の含有量の違いによるものであることが判明した .

24

<

Fig. 18 Structure-Activity-Relationships of diketopiperazine compounds.

25

1-5 小括

海洋由来真菌 E. rubrum を麦培地 , CD 寒天培地で培養し , それぞれの

CHCl3 抽出エキスを作成したところ , 含有成分 , メラニン産生抑制活性に

違いが認められた . 麦培地で培養した CHCl3 抽出エキスが比較的強いメ

ラニン産生抑制活性を示したことから , メラニン産生抑制活性を指標に

分離を行った . そして , 1 種の新規ジケトピペラジン化合物 (1) と 8 種の

既知ジケトピペラジン化合物 (2–9) を単離した . 新規化合物の構造は

MS, NMR 等の各種スペクトルデータの解析と既知化合物への誘導化によ

って決定した .

得られたジケトピペラジン化合物のメラニン産生抑制活性を検討した

結果 , プレニル基の数および結合位置 , 並びに 8, 12 位のオレフィンの存

在が重要であることが明らかになった . 得られた化合物の収量 , 及びメ

ラニン産生抑制活性から , 麦培地で培養した海洋由来真菌 E. rubrum

CHCl3 抽出エキスの活性本体はジケトピペラジン化合物 (2–4) であると

考えられた . そして , 麦培地及び CD 寒天培地を用いて培養することでジ

ケトピペラジン化合物の生産量が異なることから , 各抽出エキスのメラ

ニン産生抑制活性に違いが生じたと推測された .

ジケトピペラジン化合物はその構造から , アミノ酸である L-tryptophan

と L-alanine から生合成されることが予想される . そのためアミノ酸を含

まず , 亜硝酸ナトリウムを唯一の窒素源として含有している CD 培地で

はジケトピペラジン化合物の生産量が少なく , アミノ酸を豊富に含む麦

培地では , ジケトピペラジン化合物を多く生産したものと考えられた .

26

【第 2 章】海洋由来真菌抽出エキスの誘導化とメラニン産生抑制化合物

の探索

2-1 海洋由来真菌 E. rubrum 抽出エキス中のヒドロキノン誘導体

本論第 1 章では , 海洋由来真菌 E. rubrum 抽出エキスからメラニン産生

抑制活性を示すジケトピペラジン化合物の単離について述べた . 一方で ,

麦培地で培養した海洋由来真菌 E. rubrum 抽出エキスの 1H-, 13C-NMR ス

ペクトルデータより , ホルミル基に由来する H 10 ppm 付近のシングレッ

トを示すプロトンと , C 190 ppm 付近のメチン炭素のシグナルが観測され

た (Fig. 19).

Fig. 19 1H- and 13C-NMR of crude extract of E. rubrum .

27

このことから , 海洋由来真菌 E. rubrum 抽出エキス中には分子内にホル

ミル基を有する化合物が主成分として含まれていることが示唆された .

分子内にホルミル基を有する化合物として E. rubrum の近縁種にあたる

Aspergillus ruber からは側鎖に存在する二重結合の数及び位置が異なるヒ

ドロキノン化合物 isodihydroauroglaucin (11)48, flavoglaucin (12)49,

tetrahydroauroglaucin (13)49, auroglaucin (14)48, isotetrahydroauroglaucin

(15)48 が単離されている . ケモタキソノミーの知見から , E. rubrum 抽出

エキス中にも同様の化合物が含まれていると推定された (Fig. 20).

11–15 は分子内にヒドロキノン構造を持つ化合物であり , ヒドロキノン

化合物はメラニン産生に関わる酵素チロシナーゼを競合的に阻害するこ

とが知られている .50 したがって , 11–15 といったヒドロキノン誘導体は ,

チロシナーゼ阻害活性を示すリード化合物として期待される . また , 11–

15 はポリケチド鎖とプレニル基を置換基として有している . そのため ,

11–15 から得られる誘導体の構造は新規性が高く , より強力な生物活性の

発現が見込まれる . そこで , 海洋由来真菌 E. rubrum に含まれるヒドロキ

ノン誘導体をリード化合物とし , メラニン産生抑制活性を示す天然物誘

導体の探索を行うこととした .

以下 , 第 2 章では誘導化の指標として行ったドッキングスタディーに

よるタンパク -リガンドの結合安定性評価 , chemically engineered extract に

基づいた E. rubrum 抽出エキスの誘導化と化合物の単離 , チロシナーゼ阻

害活性及びメラニン産生抑制活性について述べる .

Fig. 20 Structures of reported hydroquinone compounds.

28

2-2 ドッキングスタディーを用いた誘導体デザイン

海洋由来真菌 E. rubrum 抽出エキスに存在していると考えられるヒド

ロキノン誘導体の構造はヒドロキノン骨格 , プレニル基 , ホルミル基 , 側

鎖から構成されている . そのため , 誘導化の反応点として , ヒドロキノン

の水酸基やホルミル基などが挙げられる . これらの反応点を用いて比較

的容易に誘導化が可能な構造をデザインするにあたり , 水酸基 , ホルミ

ル基の構造変換と , 新たな環状構造の導入をターゲットとした . 水酸基

をターゲットとした構造変換として , モノメチル化誘導体 (a), ジメチル

化誘導体 (b), モノアセチル化誘導体 (c), ジアセチル化誘導体 (d), 及

びキノン誘導体 (e) を , ホルミル基をターゲットとした構造変換として

アルコール誘導体 (f), カルボン酸誘導体 (g), オキシム誘導体 (h) 及び

ヒドラジン誘導体 (i) を , 新たな環状構造を導入した構造変換としてプ

レニル基と水酸基によるフラン環誘導体 (j, k), ピラン環誘導体 (l) 及び

Knoevenagel 縮合によるクマリン誘導体 (m) をそれぞれデザインした

(Fig. 21). また , それぞれの誘導体における 11–15 の側鎖に対応した計 70

種の化合物 (11–15, 11a–15a, 11b–15b, 11c–15c, 11d–15d, 11e–15e, 11f–15f,

11g–15g, 11h–15h, 11i–15i, 11j–15j, 11k–15k , 11l–15l, 11m–15m) について

ドッキングスタディーを行った .

ドッキングスタディーは auto dock 4.2 を用いて行い , 酵素チロシナー

ゼ (結晶構造 : PDB 4P6S51) L-DOPA 結合領域と各誘導体の結合親和性

(Binding energy: kcal/mol) について評価した . 各誘導体における最安定ポ

ーズから上位 3 つのドッキングポーズの結合親和性より結合スコアを算

出した .

29

得られたスコアをデザインした誘導体の構造 (a–m) で分類したとこ

ろヒドロキノン化合物 (11–15) の平均スコアは−5.28±0.29 kJ/mol となっ

た . それに対して , キノン (e), フラン環 (j, k), ピラン環 (l) 及びクマリ

ン誘導体 (m) の平均スコアはそれぞれ − 5.78±0.65, − 5.95±0.38, −

5.71±0.63, −5.95±0.44, −5.98±0.67 kJ/mol となり , ヒドロキノン化合物に

比べてチロシナーゼとより安定に結合する傾向が見られた . デザインし

た誘導体の中でも , 新たな環状構造を形成した誘導体はすべて安定なエ

ネルギーを示した (Fig. 22).

Fig. 21 Structures of designed derivatives.

30

Fig. 22 Docking scores of designed derivatives (median, box: 25 and 75

percentile, whisker: 10 and 90 percentile).

31

2-3 Chemically engineered extract 法に基づいたクマリン誘導化エキスの作

成

海洋由来真菌 E. rubrum 抽出エキス中のヒドロキノン化合物に新たな

環状構造を導入することは , チロシナーゼとの結合親和性を増加させる

ことが , ドッキングスタディーの結果より判明した . そして , その誘導体

が強力なチロシナーゼ阻害活性を示すことが期待された . 新たな環状構

造を持つ誘導体を得る方法として , 反応が容易と考えられる Knoevenagel

縮合によるクマリン誘導化が挙げられる . 海洋由来真菌 E. rubrum 抽出

エキスには側鎖構造の異なる多様なヒドロキノン誘導体が含まれている

と考えられる . そこで , 一度に複数のクマリン誘導体を合成できる

Chemically engineering extract に基づいた方法でエキス中のヒドロキノン

化合物を変換した後に , チロシナーゼ阻害活性を示す化合物の分離を行

うこととした (Fig. 23).

麦培地で培養した海洋由来真菌 E. rubrum CHCl3 抽出エキス中のヒドロ

キノン化合物に対し , Knoevenagel 縮合を行った . 反応は , CHCl3 中 , ピペ

リジン存在下で CHCl3 抽出エキスとマロン酸ジエチルを加熱還流するこ

とで行い , 溶媒を濃縮した反応混合物を誘導化エキス (Chemically

engineered extract) とした . 含有成分の違いを HPLC で分析した結果 ,

Chemically engineered extract からは tR: 40–50 min に新たな化合物由来の

ピークが確認された (Fig. 24).

Fig. 23 Outline of chemically engineered extract of E. rubrum CHCl3 ext.

32

さらに , 両エキスについて , チロシナーゼ阻害活性を評価した . 試験は

マッシュルーム由来チロシナーゼを用いて基質である L-DOPA の酸化を

行い , dopachrome の生産量を吸光度で定量することで , 阻害活性を評価し

た . その結果 , 原料である CHCl3 抽出エキスはほとんど阻害活性を示さ

なかったのに対し , Chemically engineered extract は濃度依存的に優位な阻

害活性を示した (Table 2). また , B16 melanoma 細胞を用いたメラニン産

生抑制試験を行った結果 , 5, 10 g/mL の濃度で Chemically engineered

extract は原料である CHCl3 抽出エキスよりも優位にメラニン産生量を減

少させた (Table 3).

以上の結果より , Knoevenagel 縮合によって新たに合成された成分がチ

ロシナーゼ阻害活性及びメラニン産生抑制活性を示すことが示唆された .

Fig. 24 HPLC profiles of the CEE of the E. rubrum CHCl3 extract and of

the E. rubrum CHCl3 extract.

33

Table 2 Tyrosinase inhibitory activities of the E. rubrum CHCl3 extract and

the CEE of the E. rubrum CHCl3 extract.

Table 3 Anti-melanogenesis activities of the E. rubrum CHCl3 extract and the

CEE of the E. rubrum CHCl3 extract.

Inhibition of tyrosinase activity (%, mean ± SD, n=3)

conc. (g/mL)

0.78 1.56 3.12 6.25

Chemically engineered extract 5.0±0.5** 9.1±0.9** 20.8±4.4** 31.1±6.1**

E. rubrum CHCl3 ext. —0.5±0.8 —0.9±3.6 0.0±2.5 6.0±1.9

*, P <0.05; **, P <0.01 vs. E. rubrum CHCl3 ext.

Melanogenesis activity (% melanin content, mean ± SD, n=3)

conc. (g/mL)

0.0 2.5 5.0 10.0

Chemically engineered extract 100.0±4.2 84.2±3.4 67.4±3.3* 35.6±0.8**

E. rubrum CHCl3 ext. 100.0±3.0 84.2±5.1 76.0±3.5 54.7±3.7

*, P <0.05; **, P <0.01 vs. E. rubrum CHCl3 ext.

34

2-4 誘導化エキスの成分探索

作成した誘導化エキス (5.7 g) について , Si CC (n-Hex-EtOAc) により 4

つの画分 (Fr. a–d) に分画した . これらの画分について , TLC を用いた成

分分析により , Fr. b 並びに Fr. c に誘導化によって新たに合成された化合

物が含まれていることが判明した .

Fr. c をゲルろ過 (sephadex LH-20) CC, 分取 HPLC により分離 , 精製し ,

16 (3.6 mg), 17 (7.1 mg) を得た . また Fr. b について Si CC, 分取 HPLC で

分離 , 精製を行い , 18 (1.5 mg) を単離した (Fig. 25).

Fig. 25 Flowchart of chemically engineered extract (1).

35

化合物 16 は黄色油状物質として得られ , 高分解能 EIMS より分子式

C24H28O5 (m/z: 396.1936 [M]+) を与えた . IR スペクトルより水酸基 (3316

cm -1) と 2 つのカルボニル基 (1749 and 1717 cm -1) の存在が確認された .

1H-NMR のスペクトルデータより , 2 つの芳香族プロトン H 7.03 (s, H-4),

H 8.68 (s, H-7), 5 つのオレフィン由来のプロトン H 5.58 (dq, J = 13.5, 7.6

Hz, H-3’), H 5.59 (dq, J = 13.5, 6.6 Hz, H-6’), H 6.00 (t, J = 13.5 Hz, H-

4’),H 5.97 (t, J = 13.5 Hz, H-5’), H 5.27 (t, J = 7.3 Hz, H-2’’), 1 つの低磁

場シフトしたものを含む 4 つのメチレンプロトン H 4.42 (q, J = 7.1 Hz, H-

11), H 2.95 (t, J = 7.6 Hz, H-1’), H 2.33 (q, J = 7.6 Hz, H-2’) H 3.47 (d, J =

7.3 Hz, H-1’’), そして , 4 つのメチルプロトンのシグナル H 1.41 (t, J = 7.1

Hz, H-12), H 1.73 (d, J = 6.6 Hz, H-7’), H 1.72 (s, H-4’’), H 1.73 (s, H-5’’)

が確認された . さらに 13C-NMR のスペクトルデータからは 2 つのカルボ

ニル基C 157.1 (C-9), C 163.8 (C-10), 1 つのベンゼン環C 117.0 (C-1), C

123.4 (C-2), C 149.8 (C-3), C 122.7 (C-4),C 128.4 (C-5), C 148.0 (C-6), 8

つのオレフィン由来の炭素C 146.2 (C-7), C 117.1 (C-8), C 129.5 (C-3’),

C 132.0 (C-4’), C 131.0 (C-5’), C 128.2 (C-6’), C 120.3 (C-2’’), C 134.6

(C-3’’), 4 つのメチレンC 61.9 (C-11), C 25.3 (C-1’), C 33.2 (C-2’), C 27.3

(C-1’’), そして 4 つのメチル基C 14.2 (C-12), C 17.9 (C-7’), C 25.8 (C-

4’’), C 18.0 (C-5’’) のシグナルが確認された (Table 4).

これらのスペクトルパターンは Eurotium 属の主成分として報告されて

いるヒドロキノン化合物の isodihydroauroglaucin (11)48 のスペクトルパタ

ーンと類似していた . また , 2D-NMR を用いた詳細な構造解析により , 16

も 11 と共通のプレニル基と側鎖をもつ芳香族化合物であることが明らか

になった . しかし , 16 には 11 に存在するホルミル基由来のプロトンと炭

素のスペクトルが確認されず , カルボニル基と水素結合した 6 位の水酸

基のスペクトルも消失していた . 一方で , 16 には 11 では観測されなかっ

た新たな 1 つのオレフィン , 2 つのカルボニル基 , 1 つのエチル基由来のシ

36

グナル (C-7–C-12) が観測された . HMBC の相関より 11 位のプロトンか

ら 10 位のカルボニル基への相関が確認されたため , エチル基はエステル

として分子内に存在することが明らかになった . 7 位のプロトンから 1 位 ,

6 位 , 8 位 , 9 位 , 10 位の炭素に相関が見られたことと , MS で得られた分子

式を踏まえ , 16 を 8 位にエチルエステルが結合したクマリン誘導体であ

ると決定した . オレフィン部位の立体化学については , 各オレフィン由

来のプロトン (H-3’–H-6’) におけるカップリング定数より trans 体である

と決定した (Fig. 26).

化合物 17 は黄色油状物質として得られ , 高分解能 FABMS より分子式

C24H32O5 (m/z: 401.2325 [M+H]+) を与えた . 1H-, 13C-NMR のスペクトルパ

ターンは 16 と類似しており C-1’–C-7’で構成される側鎖の構造が異なる

化合物であると推測した (Table 4). 17 と 16 の違いは側鎖におけるオレフ

ィン由来のプロトン及び炭素のシグナルが観測されなかったことに加え ,

新たに 4 つのメチレンプロトン及び炭素のシグナル H 1.35 (overlapped,

H-3’ and H-4’), H 1.26 (overlapped, H-5’), H 1.28 (overlapped, H-6’); C 29.1

(C-3’), C 29.5 (C-4’), C 31.8 (C-5’), C 22.7 (C-6’) が観測された点であっ

た (Table 4). 2D-NMR を用いた詳細な構造解析の結果から , 側鎖以外の構

造は 16 と同じ構造であることが明らかになった . 以上より , 17 は側鎖に

二重結合をもたないクマリン誘導体であると決定した (Fig. 27).

Fig. 26 Structure and 2D-NMR correlations of 16.

37


C24H30O5 (m/z: 399.2169 [M+H]+) を与えた . 同様に構造解析を行ったとこ

ろ , 1H-, 13C-NMR のスペクトルパターンは 16 および 17 と類似していたた

め , 同様に側鎖の構造が異なる化合物であると推定した (Table 4). 18 に

は一つのオレフィン由来のプロトン及び炭素のシグナル H 6.45 (d, J =

16.3 Hz, H-1’), H 6.09 (dt, J = 16.3, 7.0 Hz H-2’); C 120.2 (C-1’), C 142.6

(C-2’) が確認された (Table 4). HMBC より , 1’位のオレフィンプロトンか

ら 1 位及び 3 位の炭素に相関が確認されたことに加え , H-1’, H-2’のカッ

プリング定数より , オレフィンは trans 体として側鎖の 1’位に存在するこ

とが明らかになった . また , その他 2D-NMR を用いた詳細な構造解析の

結果から , 側鎖以外の構造は 16 と同じ構造であることが判明した . 以上

より , 18 を側鎖に二重結合を一つ持つクマリン誘導体であると決定した

(Fig. 28).



38

得られた化合物 (16–18) は新規クマリン誘導体であり , 海洋由来真菌

E. rubrum 抽出エキスの誘導化によって生産されたものと考えられた . 各

クマリン誘導体の原料は海洋由来真菌 E. rubrum が産生するヒドロキノ

ン化合物で , それぞれ共通の部分構造を持つ , isodihydroauroglaucin (11)48,

tetrahydroauroglaucin (12)49, flavoglaucin (13)49 であると推定した . 11–13 を

培養抽出エキスから別途単離し , HPLC による成分分析を行った結果 , 誘

導化によって減少した化合物は 11–13 であった . そして , 16–18 は新たに

生産された化合物由来のピークを与えた . 以上のことから 11–13 を原料

としてクマリン誘導体 (16–18) が合成されたことが明らかになった

(Fig. 24).

クマリン誘導体 (16–18) の推定合成経路はヒドロキノン化合物 (11–

13) のホルミル基とマロン酸ジエチルが Knoevenagel 縮合によって中間

体を形成し , さらに 6 位水酸基と , 9 位のエチルエステル部位のラクトン

化によって得られたものであると考えられた (Scheme 3).

Scheme 3 Proposed synthetic pathway of coumarin derivatives .

39

Table 4 1H- (400 MHz) and 13C- (100 MHz) NMR spectroscopic data for 16–

18 ( in ppm, J in Hz) in CDCl3.

16

17 18

Pos. H C H C H C

1 117.0 117.2 116.3

2 123.4 124.6 120.2

3 149.8 149.8 149.1

4 7.03 (s) 122.7 7.01 (s) 122.6 7.09 (s) 122.4

5 128.4 128.1 129.8

6 148.0 148.1 148.0

7 8.68 (s) 146.2 8.71 (s) 146.2 8.65 (s) 146.1

8 117.1 117.0 117.4

9 157.1 157.1 156.8

10 163.8 163.9 163.8

11 4.42 (q, 7.1) 61.9 4.43 (q, 7.2) 62.0 4.41 (q, 7.2) 61.9

12 1.41 (t, 7.1) 14.2 1.42 (t, 7.2) 14.2 1.40 (t, 7.2) 14.2

1' 2.95 (t, 7.6) 25.3 2.85 (t, 7.7) 25.1 6.45 (d, 16.3) 120.2

2' 2.33 (q, 7.6) 33.2 1.56 (m) 30.8 6.09 (dt, 16.3, 7.0) 142.6

3' 5.58 (dt, 13.5, 7.6) 129.5 1.35 (overlapped) 29.1 2.36 (q, 7.0) 33.6

4' 6.00 (t, 13.5) 132.0 1.35 (overlapped) 29.5 1.54 (m) 28.8

5' 5.97 (t, 13.5) 131.0 1.26 (overlapped) 31.8 1.33 (overlapped) 31.5

6' 5.59 (dq, 13.5, 6.6) 128.2 1.28 (overlapped) 22.7 1.34 (overlapped) 22.5

7' 1.73 (d, 6.6) 17.9 0.88 (t, 6.4) 14.1 0.93 (t, 7.0) 14.0

1" 3.47 (d, 7.3) 27.3 3.47 (d, 7.6) 27.3 3.50 (d, 7.5) 27.5

2" 5.27 (t, 7.3) 120.3 5.27 (t, 7.6) 120.4 5.29 (t, 7.5) 120.2

3" 134.6 134.5 134.8

4" 1.72 (s) 25.8 1.72 (s) 25.8 1.75 (s) 25.8

5" 1.73 (s) 18.0 1.73 (s) 17.9 1.73 (s) 17.9

40

2-5 チロシナーゼ阻害活性試験およびメラニン産生抑制活性試験

得られたクマリン誘導体 (16–18), 原料であるヒドロキノン化合物

(11–13) と既知の方法で合成した側鎖及びプレニル基を持たないクマリ

ン誘導体 (1952, Fig. 29) についてチロシナーゼ阻害活性試験 , B16

melanoma 細胞を用いたメラニン産生抑制活性試験を行った . 試験は抽出

エキスの評価と同様の方法で行った .

Fig. 29 Structure of 19.

チロシナーゼ阻害活性試験では , クマリン誘導体 (16–18) はすべて濃

度依存的に阻害活性を示し , それぞれの IC50 は , 7.7, 13.3, 9.5 M であっ

た . また , ヒドロキノン化合物 (11–13) の IC50 は , 31.3, 21.7, 9.9 M とな

りクマリン誘導体の方が強い阻害活性を示すことが明らかになった . 一

方で , 側鎖及びプレニル基を持たないクマリン誘導体 (19) は阻害活性

を示さなかった (Fig. 30, 31, Table 5).

B16 melanoma 細胞を用いたメラニン産生抑制活性試験においても , ク

マリン誘導体 (16–18) はすべて濃度依存的に阻害活性を示し , それぞれ

の IC50 は , 6.6, 7.2, 6.6 M となった . また , 細胞毒性 (cell number <80%)

を示す濃度は , 12.5 M 以上であった . 以上より , 16–18 は濃度 6.25 µM で

細胞毒性を示さず優位なメラニン産生抑制活性を示すことが明らかにな

った . 一方で , ヒドロキノン化合物 (11–13) のメラニン産生抑制活性は

すべてクマリン誘導体よりも弱いことが明らかになった . また , 側鎖及

41

びプレニル基を持たないクマリン誘導体 (19) は阻害活性を示さなかっ

た (Fig. 30, 31, Table 5).

Fig. 30 Tyrosinase inhibitory activity and anti -melanogenesis activity of 16–

18 (*, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001 vs. control).

42

Fig. 31 Tyrosinase inhibitory activity and anti -melanogenesis activity of 11–

13 (*, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001 vs. control).

43

Table 5 Tyrosinase inhibitory activity and anti-melanogenesis activity of 11–

13 and 16–19.

Comp. Tyrosinase activity

(IC50, M)

Anti-melanogenesis activity

(IC50 , M)

11 31.3 51.2

12 21.7 46.6

13 9.9 >100

16 7.7 6.6

17 13.3 7.2

18 9.5 6.6

19 >100 >100

-arbutin n.d. 608

kojic acid 30.3 n.d.

n.d., no data.

44

チロシナーゼ阻害活性試験 , メラニン産生抑制試験の結果を踏まえ ,

構造活性相関を検討した . ヒドロキノン化合物 (11–13) とそれぞれに対

応するクマリン誘導体 (16–18) を比較すると , クマリン誘導体の方が強

い阻害活性を示す傾向にあった . このことからクマリン化合物への誘導

化が活性を増強させたと考えられた . 一方で , 13 から 18 への誘導化では

チロシナーゼ阻害活性の増強が少なかったにもかかわらず , 細胞を使っ

たメラニン産生抑制活性の増強が確認された . このことから , クマリン

誘導化はチロシナーゼ阻害活性以外のメラニン産生経路に寄与すること

が示唆された . 側鎖に関しては , オレフィンの数および場所では活性に

大きな差が認められなかったものの , プレニル基 , 及び側鎖のないクマ

リン誘導体 (19) が活性を示さなかったことから , プレニル基 , 及び側鎖

の存在は活性発現に必須であると言える (Fig. 32).

Fig. 32 Structure activity relationships of hydroquinones and coumarin

compounds.

45

2-6 小括

本章では Chemically engineered extract の手法に基づき , 海洋由来真菌

E. rubrum 抽出エキスの誘導化及びクマリン誘導体の成分探索について

記述した . 誘導化エキスは原料である E. rubrum 抽出エキスよりも強いチ

ロシナーゼ阻害活性 , メラニン産生抑制活性を示した . さらに誘導化エ

キスの詳細な成分探索を行った結果 , 3 種のクマリン誘導体 (16–18) を単

離した . クマリン誘導体 (16–19) 及びヒドロキノン (11–13) のチロシナ

ーゼ阻害活性 , メラニン産生抑制活性を評価したところ , クマリン骨格

と , 側鎖及びプレニル基の存在が活性発現に重要であることが明らかに

なった .

得られたクマリン誘導体は分子内に合成されたクマリン骨格と天然由

来の酢酸 -マロン酸経路によって生合成された側鎖を有している . 天然か

らのクマリン誘導体はシキミ酸経路によって生合成されるため , 今回単

離されたクマリン誘導体は天然では存在しない . したがって chemically

engineered extract 法に倣った天然物誘導体の探索によって , 構造新規性の

ある生物活性化合物を見出すことに成功した (Fig. 33).

Fig. 33 Summary of chapter 2.

46

【第 3 章】海洋由来真菌抽出エキスのクマリン二量化とチロシナーゼ阻

害活性化合物の探索

3-1 天然物二量体の利用

本論第 2 章では , chemically engineered extract 法に基づいた海洋由来真

菌 E. rubrum 抽出エキスのクマリン誘導化により , メラニン産生抑制活性

を示す新規クマリン誘導体を得ることに成功した . 第 3 章ではより強力

な生物活性天然物誘導体を得るため , 更なる chemically engineered extract

の作成及び成分探索を行った .

新しい天然物誘導体のターゲットとして , 天然物二量体が挙げられた .

カルコン二量体の carthamin はキク科の植物 Carthamus tinctorius より得

られた天然の赤色色素である . Carthamin は C. tinctorius 中の safflor yellow

A から生合成され , 二量化による共役系の伸長によって , 黄色から赤色に

変化した化合物である .53 また , クマリン二量体の dicoumarol は発酵した

マメ科植物 Melilotus sp. より単離され , 抗血栓薬 warfarin のリード化合

物となった .54 Dicoumarol の生合成は発酵による coumarin の酸化と , 2 つ

の 3-hydroxycoumarin が formaldehyde で架橋されることで完結する . 現在 ,

dicoumarol は強い溶血作用以外に , がん細胞に対する増殖抑制作用も報

告されている .55

Carthamin や dicoumarol 以外にも , 駆虫活性を示すインドールアルカロ

イド二量体の hunterizeyline A や細胞毒性を示すキサントン二量体の

ascherxanthone A などが天然から単離されている .56,57 また , 本学の生薬

学研究室はフラボノイド二量体であるビフラボノイドの抗アルツハイマ

ー活性について研究を行っている . そして , sciadopitysin などのビフラボ

ノイドがフラボノイド単量体よりも強い神経細胞保護作用を示すことを

報告している .58,59 以上のことから , 天然物二量体は医薬品シード化合物

として期待される (Fig. 34).

47

本論第 2 章では Knoevenagel 縮合を用いて diethyl malonate と抽出エキ

ス中のホルミル基を持つヒドロキノン誘導体を反応させ , クマリン化合

物へと誘導した .この反応を応用し , 2 つの活性メチレンが存在する diethyl

1,3-acetonedicarboxylate とホルミル基を持つヒドロキノン誘導体を縮合

させると , クマリンの二量体への誘導化が可能である . 天然からのクマ

リン二量体の報告例は少なく , 合成研究においても医薬品開発を目標と

したクマリン二量体の研究は積極的に展開されていない .

そこで , クマリン二量化をターゲットとした chemically engineered

extract を作成し , 成分探索することでより強力なチロシナーゼ阻害活性

を示す天然物誘導体が得られると考えた (Fig. 35).

Fig. 34 Natural product dimers.

48

Fig. 35 Dimerization of hydroquinones in the crude extract of E. rubrum .

49

3-2 海洋由来真菌 E. rubrum 抽出エキスのクマリン二量化

海洋由来真菌 E. rubrum CHCl3 抽出エキスをピペリジン存在下 , diethyl

1,3-acetonedicarboxylate と反応させ , 誘導化エキスを作成した . チロシナ

ーゼ阻害活性試験を行ったところ , 誘導化エキスは濃度依存的に阻害活

性を示した . また , 0.78–6.25 mg/mL の各濃度において , 原料である海洋由

来真菌 E. rubrum 抽出エキスや , 第 2 章で作成した誘導化エキスよりも優

位に阻害することが明らかになった (Fig. 36).

今回得られた誘導化エキスについて HPLC を用いた成分分析を行った

結果 , E. rubrum 抽出エキス中のヒドロキノン誘導体 (11–13) の濃度が減

少し , 誘導化エキス中に新たな化合物のピークが検出された (Fig. 37).

したがって , 新しく検出された化合物が強いチロシナーゼ阻害活性を示

すことが推測された .

Fig. 36 Tyrosinase activity of E. rubrum CHCl3 ext. and chemically

engineered extracts.

50

Fig. 37 HPLC profiles of chemically engineered extract and E. rubrum CHCl3

ext.

51

3-3 Diethyl 1,3-acetonedicarboxylate を用いた誘導化エキスの成分探索

作成した誘導化エキス (4.6 g) について , TLC で新たに検出された化合

物を指標に Si CC, ODS CC, 分取 HPLC で化合物の分離を行った . その結

果 , 5 つの化合物 20 (27.4 mg), 21 (4.9 mg), 22 (27.4 mg), 23 (7.9 mg), 24

(10.7 mg) を得ることに成功した (Fig. 38).

Fig. 38 Flowchart of chemically engineered extract (2).

化合物 20 は黄色粉末として得られ , 高分解能 FABMS より分子式

C43H54O7 (m/z: 683.3949 [M+H]+) が明らかとなった . IR スペクトルより水

酸基 (3410 cm−1) とカルボニル基 (1688 cm−1) の存在が確認された . 1H-

および 13C-NMR のスペクトルデータはクマリン骨格を示すシグナル H

6.95 (s, H-4),H 8.45 (s, H-7); C 117.5 (C-1), C 124.8 (C-2), C 149.9 (C-3),

C 122.2 (C-4), C 128.1 (C-5), C 147.7 (C-6), C 143.4 (C-7), C 126.1 (C-8),

C 159.7 (C-9), 側鎖由来のシグナル H 2.78 (brs, H-1’),H 1.54 (overlapped,

H-2’), H 1.38 (overlapped, H-3’), H 1.38 (overlapped, H-4’), H 1.29

(overlapped, H-5’), H 1.31 (overlapped, H-6’), H 0.88 (t, J = 6.9 Hz, H-7’);

C 25.2 (C-1’), C 30.9 (C-2’), C 29.2 (C-3’), C 29.6 (C-4’), C 31.8 (C-

5’), C 22.7 (C-6’), C 14.1 (C-7’), プレニル基由来のシグナル H 3.45 (d, J

52

= 7.3 Hz, H-1’’), H 5.27 (t, J = 7.3 Hz, H-2’’),H 1.76 (s, H-4’’), H 1.74 (s,

H-5’’); C 27.2 (C-1’’), C 120.4 (C-2’’), C 134.6 (C-3’’), C 25.8 (C-4’’), C

17.9 (C-5’’), 水酸基由来のシグナル H 6.15 (s, 3-OH) を示した . これらの

シグナルは第 2 章で得られた 17 のスペクトルパターンとよく類似してい

た (Table 6). また , 17 のカルボン酸エチルのシグナルに代わり , カルボニ

ル基由来のシグナル (C 188.8) が新たに確認された . さらに , 20 は MS で

与えられた炭素数 43 と , 13C-NMR のスペクトルデータから観測された炭

素数 22 が異なっていた . 以上のことから 20 を対称型のクマリン二量体

であると推定した . 各種 2D-NMR を用いた詳細な構造解析より , 20 を 10

位カルボニル基で架橋した対称型のクマリン二量体であると決定した

(Fig. 39).

Fig. 39 Structure of 20 and 2D-NMR correlations.


C43H50O7 (m/z: 679.3627 [M+H]+) が明らかとなった . 化合物 20 と同様に

構造解析を行ったところ , 1H-および 13C-NMR の各種スペクトルパターン

が 20 と類似していたため , 21 は対称型のクマリン二量体であると推定さ

れた (Table 6). 21 からは新たにオレフィン由来のシグナル H 6.46 (d, J =

16.3 Hz, H-1’), H 6.12 (dt, J = 16.3, 6.9 Hz, H-2’); C 120.3 (C-1’), C 142.4

53

(C-2’) が確認され , HMBC の相関から側鎖の 1’位にオレフィンが存在す

ることが明らかになった . また , 1’–2’位のカップリング定数 (J = 16.3 Hz)

よりオレフィンの立体化学を trans 配置であると決定した . さらに各種

2D-NMR を用いた詳細な構造解析から , 21 の構造を Fig. 40 に示す構造で

あると決定した .


黄色油状物質として得られた化合物 22 は高分解能 FABMS より分子式

C43H52O7 (m/z: 681.3797 [M+H]+) が明らかとなった . 22 の 1H-および 13C-

NMR の各種スペクトルデータは 20 および 21 の両方のシグナルを示し ,

MS で得られた 2 つのフラグメントピーク (m/z: 355, 353) を考慮すると ,

22 は側鎖の異なる非対称型のクマリン二量体であると考えられた (Table

6). 各種 2D-NMR を用いた詳細な構造解析から , 22 の構造を Fig. 41 に示

す構造であると決定した .

54


55

Table 6 1H- (400 MHz) and 13C- (100 MHz) NMR spectroscopic data for 20–22 ( in ppm, J in Hz) in CDCl3.

20 21 22

H C H C H C

1 117.5 116.9 116.9

2 124.8 120.5 120.6

3 149.9 149.3 149.5*

4 6.95 (s) 122.2 7.07 (s) 122.0 7.06 (s) 122.1

5 128.1 129.7 129.5

6 147.7 147.7 147.6*

7 8.45 (s) 143.4 8.44 (s) 143.9 8.44 (s) 144.2

8 126.1 126.3 126.2*

9 159.7 159.4 159.6*

10 188.8 188.8 188.7

1' 2.78 (brs) 25.2 6.46 (d, 16.3) 120.3 6.44 (d, 16.3) 120.2

2' 1.54 (overlapped) 30.9 6.12 (dt, 16.3, 6.9) 142.4 6.12 (dt, 16.3, 6.8) 142.3

3' 1.38 (overlapped) 29.2 2.36 (q, 6.9) 33.7 2.36 (q, 6.8) 33.7

4' 1.38 (overlapped) 29.6 1.56 (overlapped) 28.7 1.58 (overlapped) 28.8



7' 0.88 (t, 6.9) 14.1 0.93 (t, 7.1) 14.1 0.94 (t, 6.9) 14.1

1" 3.45 (d, 7.3) 27.2 3.49 (d, 7.3) 27.4 3.48 (d, 7.3) 27.4

2" 5.27 (t, 7.3) 120.4 5.29 (t, 7.3) 120.2 5.29 (t, 7.3) 120.3*

3" 134.6 134.8 134.8

4" 1.76 (s) 25.8 1.76 (s) 25.8 1.76 (s)* 25.8*

5" 1.74 (s) 17.9 1.74 (s) 17.9 1.73 (s)* 17.9*

3-OH 6.15 (s) 5.64 (brs) 5.91 (s)

1''' 117.4

2''' 124.9

3''' 150.0*

4''' 6.94 (s) 122.3

5''' 127.9

6''' 147.6*

7''' 8.46 (s) 143.6

8''' 125.8*

9''' 159.8*

1'''' 2.75 (t, 7.6) 25.2

2'''' 1.51 (m) 30.9

3'''' 1.34 (overlapped) 29.2

4'''' 1.34 (overlapped) 29.6

5'''' 1.29 (overlapped) 31.8

6'''' 1.32 (overlapped) 22.7

7'''' 0.88 (t, 6.9) 14.1

1"''' 3.42 (d, 7.3) 27.2

2"''' 5.25 (t, 7.3) 120.4*

3"''' 134.6

4"''' 1.74 (s)* 25.8*

5"''' 1.74 (s)* 17.9*

3'''-OH 5.90 (s)

*, May be interchanged between two moieties.

56


C43H50O7 (m/z: 679.3640 [M+H]+) が明らかとなった . FABMS からは 2 種

のフラグメントピーク (m/z: 355, 338) が得られ , 1H-および 13C-NMR の各

種スペクトルデータからプレニル基 (C-1’’–C-5’’’) とクマリン骨格を構

成するベンゼン環 (C-1–C-6, C-1’’’–C-6’’’), カルボニル基 (C-9, C-9’’’)

と考えられるシグナルが 2 種類ずつ観測された . したがって , 23 を 22 と

同様の非対称型のクマリン二量体であると推定した . そこで , 構成され

るクマリン骨格に準じて 23 を 2 つの画分 (moiety I and II) に分け , 構造

解析を行った .

Moiety I において , 1H-および 13C-NMR の各種スペクトルデータより 20–

23 に共通するベンゼン環 (C-1–C-6), およびプレニル基 (C-1’’–C-6’’) の

シグナルが確認された . 一方で , クマリン骨格の 7 位に相当する H 8.50

付近のシグナルと 7–8 位に相当するオレフィン由来の炭素のシグナルが

確認されなかった . また , 新たに非等価なメチレン H 2.55 (overlapped, H-

1’), H 3.06 (ddd, J = 17.0, 10.4, 4.4 Hz, H-1’), H 1.76 (m, H-2’), H 2.12

(m, H-2’); C 19.4 (C-1’), C 25.1 (C-2’) , 3 つのメチン H 2.75 (d, J = 9.4

Hz, H-7), H 1.94 (m, H-3’), H 2.57 (overlapped, H-6’); C 44.1 (C-7), C 39.6

(C-3’), C 36.0 (C-6’), cis 配置を示すオレフィン H 5.72 (dt, J = 8.8, 2.9 Hz,

H-4’), H 6.22 (dt, J = 8.8, 3.4 Hz, H-5’); C 127.1 (C-4’), C 139.9 (C-5’) 低

磁場シフトした第 4 級炭素 C 63.7 (C-8) のシグナルが観測された (Table

7). これらのスペクトルより moiety I を , 20–23 を構成するクマリン誘導

体の側鎖及び 7, 8 位の構造が異なった構造であると推測した .

1H-1H COSY より , H-1’と H-2’, H-2’と H-3’, H-7 と H-3’, H-4’と H-5’, H-

6’と H-7’のプロトンに相関が見られ , HMBC では H-7 から C-1, C-2’, C-8,

H-5’から C-3’, H-4’から C-6’, H-7’から C-8 位に相関が見られた (Fig. 42).

また , 8 位の化学シフト (C 63.7) は , Chukrasia tabularis より単離された

chukfuransin D60 の 15 位の化学シフト (C 62.4) と類似していた .

57

Chukfuransin D の 15 位は二つのカルボニル基が両隣に存在しているため ,

低磁場シフトしたものであり , 23 の 8 位も同様の構造であると考えられ

た (Fig. 43). 以上のデータは , moiety I が Fig. 43 に示す四環性のクマリン

骨格を含む構造であることを支持していた .

Moiety I に存在する 7 位 , 3’位 , 6’位の不斉炭素の相対立体配置は 1H-

NMR のカップリング定数及び NOESY スペクトルより決定された . 7 位と

3’位の 1H-NMR におけるカップリング定数は 9.4 Hz であり両プロトンは

アンチ配座をとっていることが示唆された . また , 3’位と 6’位に NOESY

相関が確認されたことから 6’位の相対立体配置を決定した (Fig. 42). な

お , 8 位の立体化学は NMR を用いた方法では決定できなかった .

Moiety II は 1H-および 13C-NMR の各種スペクトルデータが 20 と類似し

Fig. 43 13C-NMR of C-8 of 23 and C-15 of chukfuransin D.

Fig. 42 2D-NMR correlations of moiety I.

58

ており , 同様の構造であることが示唆された . そして , 各種 2D-NMR の相

関から , Moiety II の構造を Fig. 44 に示す通りに推定した . また , H-7 及び

H-7’’’から C-10 に HMBC 相関が確認されたことから , moiety I と moiety II

は 10 位のカルボニル基で架橋していることが明らかになった . 23 には分

子内に 4 つの不斉炭素が存在するが , 比旋光度及び ECD スペクトルを測

定した結果 , 旋光性を示さなかった . そのため , 23 はラセミ体であること

が明らかになった . キラルカラムを用いた分取 HPLC により 23 の光学分

割を行い , 正の旋光性を示す (+)-23 と負の旋光性を示す (−)-23 をそれぞ

れ得ることに成功した .


C43H48O7 (m/z: 677.3482 [M+H+]) が明らかとなった . 24 の 1H-および 13C-

NMR の各種スペクトルデータは 23 と類似していた (Table 7). そのため ,

24 の構造を 23 と同様に moiety I, および moiety II の二つのクマリン誘導

体から構成されるクマリン二量体と推定した . 24 と 23 の違いは moiety II

に新たにオレフィン由来のシグナル H 6.46 (d, J=16.3 Hz, H-1’’’’), H 6.11

(dt, J=16.3, 7.1 Hz, H-2’’’’); C 119.9 (C-1’’’’), C 142.7 (C-2’’’’) が確認され

た点である . 1H-1H COSY 相関と HMBC 相関及び 1H-NMR のカップリング

Fig. 44 2D-NMR correlations of moiety II and structure of 23.

59

定数よりオレフィンは moiety II の 1’’’’位に trans 配置で存在することが

明らかになった . 他の構造に関しては各種 2D-NMR より 23 と同じである

と決定した . Moiety I における相対立体配置の決定は 1H-NMR のカップリ

ング定数 , NOESY 相関によって行った (Fig. 45). また , 24 も 23 と同様に

旋光性を示さなかったため , ラセミ体であることが判明した . キラルカ

ラムを用いた分取 HPLC によって 24 の光学分割を行い , 正の旋光性を示

す (+)-24 と負の旋光性を示す (−)-24 をそれぞれ得ることに成功した .

Fig. 45 2D-NMR correlations of 24.

60

Table 7 1H- (500 MHz) and 13C- (125 MHz) NMR spectroscopic data for 23 and 24 ( in ppm, J in Hz) in CDCl3.

23

24

H C H C

1 125.2 125.1 2 119.9 119.3* 3 149.2 149.2* 4 6.54 (s) 114.3 6.54 (s) 114.3 5 126.8 126.8 6 140.8 140.8 7 2.75 (d, 9.4) 44.1 2.76 (d, 9 .3) 44.1 8 63.7 63.7 9 166.4 166.1 10 190.0 190.1 1 ' 2 .55 (overlapped) 19.4 2 .55 (overlapped) 19.4 3.06 (ddd, 17.0, 10.4, 4 .4) 3.07 (ddd, 17.3, 10.5, 4.2) 2 ' 1 .76 (m) 25.1 1 .69 (m) 25.2 2.12 (m) 2.13 (m) 3 ' 1.94 (m) 39.6 1.94 (m) 39.6 4 ' 5.72 (dt, 8.8, 2 .9) 127.1 5.71 (dt , 8 .8 , 3.0) 127.0 5 ' 6.22 (dt, 8.8, 3 .4) 139.9 6.21 (dt , 8 .8 , 3.4) 140.3 6 ' 2.57 (overlapped) 36.0 2.55 (overlapped) 36.0 7 ' 1.46 (t , 7.1) 16.1 1.45 (t , 7.1) 16.0 1" 3.41 (dd, 16.2, 7.4) 27.2 3.39 (overlapped)* 27.0* 3.48 (dd, 16.2, 7.4) 3.43 (overlapped)* 2" 5.34 (t , 7.4) 121.6 5.25 (t , 7.4)* 120.1* 3" 133.5 133.4* 4" 1.77 (s) 25.8 1.75 (s)* 25.7* 5" 1.72 (s) 17.8 1.72 (s)* 17.8* 3-OH 4.52 (s) 4.54 (s) 1 ' ' ' 117.5 116.9 2 ' ' ' 125.2 119.9* 3' ' ' 149.8 149.2* 4' ' ' 6.90 (s) 123.0 7.07 (s) 122.9 5 ' ' ' 128.0 129.6 6 ' ' ' 148.2 148.2 7 ' ' ' 8.91 (s) 149.3 8.91 (s) 150.0 8 ' ' ' 119.7 120.5 9 ' ' ' 159.6 159.6 1 ' ' ' ' 2.82 (overlapped) 25.1 6.46 (d, 16.3) 119.9 2 ' ' ' ' 1.53 (m) 30.9 6.11 (dt, 16.3, 7 .1) 142.7 3 ' ' ' ' 1.34 (overlapped) 29.1 2.35 (q, 7 .1) 39.5 4 ' ' ' ' 1.38 (overlapped) 29.6 1.55 (overlapped) 33.7 5 ' ' ' ' 1.29 (overlapped) 31.8 1.39 (overlapped) 31.5 6 ' ' ' ' 1.32 (overlapped) 22.6 1.40 (overlapped) 22.5 7 ' ' ' ' 0.89 (t , 7.0) 14.1 0.95 (t , 7.1) 14.0 1 ' ' ' ' ' 3.36 (d, 7.4) 26.7 3.41 (overlapped)* 27.2* 3.45 (overlapped)* 2 ' ' ' ' ' 5.22 (t , 7.4) 120.1 5.34 (t , 7.4)* 121.6* 3' ' ' ' ' 134.8 134.9* 4' ' ' ' ' 1.74 (s) 25.7 1.74 (s)* 25.8* 5' ' ' ' ' 1.63 (s) 17.9 1.64 (s)* 17.9* 3' ' ' -OH 5.23 (s) 5.45 (s)

*, May be interchanged between two moieties .

61

23 および 24 の四環性クマリン構造は NMR を用いた構造解析では決定

することができなかったため , それぞれの半合成を行った . まず ,

Knoevenagel 縮合を用いて , 海洋由来真菌 E. rubrum から単離したヒドロ

キノン誘導体 (12) と , diethyl 1,3-acetonedicarboxylate を縮合させ , クマ

リン誘導体 (25) を合成した . 次に , 25 と側鎖に共役ジエンを持つヒドロ

キノン誘導体 (11) を同様に縮合し , クマリン二量体 (26) と四環性クマ

リン誘導体 (23) を混合物として得た . この混合物に対し , 分子内 Diels-

Alder 反応を行い , 26 を (±)-23 へと変換することに成功した (Scheme 4).

24 の半合成についても同様の方法で行った . ヒドロキノン誘導体 (13)

と diethyl 1,3-acetonedicarboxylate を縮合し , クマリン誘導体 (27) を合成

した . 27 と 11 をさらに縮合させ , クマリン二量体 (28) と 24 の混合物を

得た . この混合物に対し , 分子内 Diels-Alder 反応を行い , 28 を (±)-24 へ

と変換することに成功した (Scheme 4).

以上のことから , 23 および 24 を分子内に四環性クマリン骨格を有する

化合物であると決定した .

62

Scheme 4 Semi-synthesis of 23 and 24.

63

3-4 計算科学に基づく四環性クマリン誘導体の絶対立体配置の決定

(+)-23 の絶対立体配置は計算科学に基づく ECD スペクトルの比較によ

って決定した . ECD スペクトルを比較するにあたり , (+)-23 の構造を簡略

化した 29a (7R,8R,3’R,6’S), 及び 29b (7R,8S,3’R,6’S) をデザインした (Fig.

46). そして , それぞれの構造について , 安定配座 , UV, ECD スペクトルを

計算した .

29a について , MMFF94S (Merck Molecular Force Field)61,62 による安定

配座を , CONFLEX63–65ソフトウェアを用いて探索した . 次に , 得られた安

定配座に対して半経験的分子軌道法 (PM666) に基づいた再安定化を

Gaussian 0967 プログラムを用いて行った . ここで得られた安定配座より ,

29a の配座パターンを解析したところ , 29a は C-9–C-8–C-10–O, C-9’’’–C-

8’’’–C-10–O, C-2–C-3–O–H 及び C-2’’’–C-3’’’–O–H の二面角によって分類

された (Fig. 47). 配座パターンの不足分はマニュアルで作成し , 同様に

PM666 に基づいた安定化を行った .

Fig. 46 Structure of 29a and 29b.

64

それぞれの安定配座について , B3LYP/6-31G (d) を用いた密度汎関数法

(DFT) による再安定化を行った .68–71 その結果 , 再安定化によって導かれ

た 38 配座のうち , 4 つの配座 (29a-a–d) がボルツマン分布に基づく存在

比が 1%以上となった (Fig. 48).

38 種の安定配座について B3LYP/6-31 (d) を用いた TDDFT 法による UV

スペクトルの計算 72,73 を行った . その結果 , 29a の算出された UV スペク

トルは σ = 0.37 eV において , (+)-23 の実測値に似たスペクトルを示した

(Fig. 49). 続いて , ECD スペクトルについて , 同様に B3LYP/6-31G (d) の

レベルで計算したところ , Fig. 50 に示すスペクトルが得られた .

Fig. 47 Dihedral angles of 29a.

Fig. 48 Lower energy (Boltzmann distribution >1%) conformers of 29a.

65

Fig. 49 Experimental UV spectrum of (+)-23 and calculated UV spectrum

of 29a.

Fig. 50 Experimental ECD spectrum of (+)-23 and calculated ECD

spectrum of 29a.

66

29b についても同様に配座解析を行った . その結果 29a と同一の配座パ

ターンが得られ , 9 つの配座 (29b-a–i) がボルツマン分布に基づく存在比

が 1%以上となった (Fig. 51).

得られた安定配座の UV スペクトルを計算したところ , 29b の算出され

た UV スペクトルは 29a と同様に σ = 0.37 eV において , (+)-23 の実測値

に似たスペクトルを示した (Fig. 52). 続いて , ECD スペクトルについて ,

同様に計算し , Fig. 53 に示すスペクトルを得た .

Fig. 51 Lower energy (Boltzmann distribution >1%) conformers of 29b

67

Fig. 52 Experimental UV spectrum of (+)-23 and calculated UV spectrum

of 29b.

Fig. 53 Experimental ECD spectrum of (+)-23 and calculated ECD

spectrum of 29b.

68

29a (7R,8R,3’R,6’S), 及び 29b (7R,8S,3’R,6’S) の計算された ECD スペク

トルは主に長波長側に異なるコットンカーブを示し , 330, 380 nm 付近で

は正負が逆のスペクトルとなった . この結果から , 四環性クマリン誘導

体 (23) は 8 位の絶対立体配置によって ECD スペクトルが異なることが

示された . (+)-23 の ECD スペクトルと計算された 29a 及び 29b の ECD ス

ペクトルを比較した結果 , 29a のスペクトルと類似していた . したがって ,

(+)-23 の絶対立体配置を 7R,8R,3’R,6’S であると決定した . また , (+)-23 の

エナンチオマーである (−)-23 の絶対立体配置を 7S,8S,3'R,6'S と決定した .

(+)-24 及び (−)-24 の絶対立体配置の決定は (+)-23, (−)-23 との ECD ス

ペクトルの比較により行った . (+)-24 の ECD スペクトルは (+)-23 のスペ

クトルと , (−)-24 の ECD スペクトルは (−)-23 のスペクトルとそれぞれ類

似していた . したがって (+)-24 の絶対立体配置を 7R,8R,3'R,6'S と , (−)-24

の絶対立体配置を 7S,8S,3'S,6'R と決定した (Fig. 54, 55).

Fig. 54 ECD spectra of (+)-23, (−)-23, (+)-24 and (−)-24.

69

Fig. 55 Structures of (+)-23, (−)-23, (+)-24 and (−)-24.

70

3-5 推定合成経路

誘導化エキスより単離した化合物は海洋由来真菌 E. rubrum 抽出エキ

ス中のヒドロキノン誘導体 (11–13) から得られたものと考えられた . 各

化合物の合成経路は以下のように推測された .

クマリン二量体 (20–22) は予想通り抽出エキス中のヒドロキノン誘導

体 (12, 13) と diethyl 1,3-acetonedicarboxylate の Knoevenagel 縮合とそれ

に続くラクトン形成が進行して得られたものと考えられた .

一方で , 四環性クマリン誘導体 (23, 24) は Knoevenagel 縮合と Diels-

Alder 反応のドミノ型反応 74 によって得られたと推定された . ヒドロキノ

ン誘導体 11 から得られるクマリン二量体 (26, 28) は側鎖の C-3’–C-6’か

らなる共役ジエン部分と , C-7–C-8 からなるジエノフィルとで Diels-Alder

反応が進行可能である . そして , 四環性クマリン誘導体 (23, 24) へと変

換される (Scheme 5).

本反応で得られた四環性クマリン誘導体は 7R,8R ,3'R,6'S 体と

7S,8S,3'S,6'R 体のみであり , 他のジアステレオマーは得られていない . こ

のことから , 本反応はジアステレオ選択的に反応が進んだことを示して

いた .

71

Scheme 5 Plausible synthetic pathway of coumarin dimers.

72

3-6 チロシナーゼ阻害活性試験

得られたクマリン誘導体 (20–24) についてチロシナーゼ阻害活性試験

を行った . その結果 , クマリン誘導体はすべて濃度依存的に阻害活性を

示し , それぞれの IC50 は , 4.9, 1.8, 2.9, 1.7, 1.2 M となった . また , ポジテ

ィブコントロールである kojic acid (IC50 = 30.3 M) よりも強い阻害活性

を示すことが明らかになった .

これらの阻害活性は原料であるヒドロキノン誘導体 (11–13) や , 第 2

章で得られたクマリン誘導体 (16–18) よりも強い活性であった (Table 8).

Table 8 Tyrosinase inhibitory activitiy of coumarin dimers .

Comp. Tyrosinase activity (IC50 , M)

20 4.9

21 1.8

22 2.9

23 1.7

24 1.2

kojic acid 30.3

23 and 24 were tested as racemic mixture.

73

3-7 ドッキングスタディー

第 2 章の方法に準じてクマリン二量体 (20–24) とチロシナーゼ L-

DOPA 結合領域の親和性を計算した . その結果 , クマリン二量体 (20–24)

のスコアは−6.81–−7.05 kJ/mol となった . これらのエネルギーは第 2 章で

得られたヒドロキノン化合物 (11–13) やクマリン誘導体 (16–18) よりも

安定であることを示していた . このことから , チロシナーゼ阻害活性の

増強は , クマリン二量体とチロシナーゼ L-DOPA 結合領域の結合親和性

の増加によるものと考えられた (Table 9).

Table 9 Binding scores of hydroquinones and coumarin derivatives (kJ/mol mean ± SD).

加えて , ドッキングスタディーの結果から , クマリン二量体とチロシ

ナーゼとの高い結合親和性は , チロシナーゼ L-DOPA 結合領域のみなら

ず , その周辺のアロステリック領域への結合が関与するものと推測され

た . チロシナーゼの L-DOPA 結合領域は His 204–Val 218 周辺であること

が判明されている .51 第 2 章で得られたヒドロキノン誘導体 (11–13) や

クマリン誘導体 (16–18) は L-DOPA 結合領域内で結合可能であると考え

られる (Fig. 56). しかし , クマリン二量体は分子が大きく , L-DOPA 結合

領域内に分子すべてが結合することは困難である . 一方で , チロシナー

ゼの L-DOPA 結合領域周辺部は浅くへこんだ構造をとっており , チロシ

ナーゼ阻害活性におけるアロステリック領域になり得る . ドッキングシ

ミュレーションの結果 , クマリン二量体は一方のクマリン部でバインデ

Hydroquinones Coumarin derivatives Coumarin dimers

Comp. Score (kJ/mol) Comp. Score (kJ/mol) Comp. Score (kJ/mol)

11 −5.51±0.17 16 −6.37±0.57 20 −6.83±0.10

12 −5.49±0.31 17 −5.68±0.33 21 −7.05±0.08

13 −5.05±0.13 18 −5.29±0.16 22 −7.05±0.11

23 −7.04±0.61

24 −6.81±0.25

Scores of 23 and 24 were averages of each enantiomers.

74

ィングポケットに結合し , もう一方のクマリン部でアロステリック部位

に結合することが示された (Fig. 57). そして , クマリン二量体は二つの

クマリン部がそれぞれチロシナーゼと結合することでより安定なスコア

を示したと考えられた .

Fig. 56 Binding mode of L-DOPA with tyrosinase.

Fig. 57 Binding mode of coumarin dimer 20 with tyrosinase.

75

3-8 小括

Chemically engineered extract 法に基づき , 海洋由来真菌 E. rubrum 抽出

エキス中のヒドロキノン誘導体に対し , Knoevenagel 縮合によるクマリン

二量化反応を行った . 作成した誘導化エキスは , 原料である抽出エキス

や , 第 2 章で作成したクマリン誘導化エキスよりも強いチロシナーゼ阻

害活性を示した . 詳細な成分探索を行った結果 , 5 種のクマリン二量体

(20–24) が単離された . 20–24 はすべてチロシナーゼ阻害活性を示し , そ

の阻害活性は第 2 章で報告したクマリン誘導体よりも強いことが明らか

になった . ドッキングスタディーの結果より , 20–24 はチロシナーゼとよ

り強く結合することで , 阻害活性が増強したと考えられた .

23, 24 の四環性クマリン構造は天然資源によって生合成された共役ジ

エンと化学変換によって得られたジエノフィルの Diels-Alder 反応によっ

て得られたものである . そのため , 本反応で得られた四環性クマリン構

造は天然物に存在しない新規性の高い構造である . したがって , 新規四

環性クマリン誘導体 , 並びにそのチロシナーゼ阻害活性は本研究結果が

初の報告となる (Fig. 58).

Fig. 58 Summary of chapter 3.

76

【総括】

本論文は , 既存の天然資源の多様性を応用した新たな資源の開発と ,

その資源の成分探索で , 得られた化合物の構造とメラニン産生抑制活性

について述べたものである .

本論第 1 章では異なる培地で海洋由来真菌 E. rubrum を培養し , 各々の

抽出エキスに含まれる二次代謝産物とメラニン産生抑制活性が異なるこ

とを見出した . 詳細な成分探索及びメラニン産生抑制活性試験を行った

結果 , ジケトピペラジン化合物の含有量が抽出エキスの活性に影響する

ことを明らかにした . 従来の真菌を使った成分探索では真菌に適した培

養条件が使用される . しかし , 容易に入手できる異なった培地を使用す

ることで生物活性を示す化合物や , 新規化合物が得られたことは真菌類

を使用した成分探索研究を展開する上で興味深い結果である .

本論第 2 章ではドッキングスタディーと chemically engineered extract 法

に基づいた天然物誘導体探索について述べた . 天然物抽出エキス中のヒ

ドロキノン誘導体をクマリン誘導体へ変換することで , チロシナーゼ阻

害活性の増強が確認された . 詳細な成分探索の結果 , チロシナーゼ阻害

活性を示すクマリン誘導体 (16–18) が単離された . したがって , 天然物

誘導体探索を展開するにあたり , ドッキングスタディーと chemically

engineered extract 法を組み合わせることは医薬品シード化合物を得る上

で画期的な手法となり得る .

本論第 3 章ではクマリン二量体をターゲットとした chemically

engineered extract からチロシナーゼ阻害活性化合物の探索を行った . 単離

された 5 種の化合物は期待されたクマリン二量体 (20–22) と予想外の四

環性クマリン骨格を持つクマリン二量体 (23, 24) であった . 四環性クマ

リン骨格は天然資源によって生合成された共役ジエン部分と化学変換で

誘導されたジエノフィルによる Diels-Alder 反応で合成された非常に稀な

構造である . このような新規性のある構造を持つ化合物が生物活性を示

77

したという結果は , 天然物誘導体の探索研究を展開する上で興味深い結

果である .

近年では , 天然資源の枯渇や , 生物多様性条約によって天然由来の新

規化合物の発見が困難になりつつある . しかし , 培養条件を変更した天

然物抽出エキス並びに chemically engineered extract 法に基づいた成分探

索は既存の天然資源を応用する手法である . そして , 本研究は成分探索

研究が行われた既存の資源でさえも新たな創薬資源になり得ることを示

している . したがって , 本研究は近年直面している創薬資源の枯渇を解

決し , 更に医薬品開発に向けた低分子化合物ライブラリーの充実を図る

新しいアプローチとなるものである .

78

【実験の部】

General experimental procedures

Melting points: Yanaco MP apparatus (Yanaco, Kyoto, Japan) .

Optical rotation: Horiba SEPA-300 polarimeter (Horiba, Kyoto, Japan).

IR: FT-IR Nicolet iS5 spectrophotometer (ATR, Thermo Fisher Scientific,

Waltham, MA).

UV: GENESYS 10S UV-Vis spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific).

Electronic circular dichroism (ECD): Jasco 820 spectropolarimeter (Jasco,

Tokyo, Japan) .

1H-and 13C-NMR: JNM-AL400 MHz spectrometer (JEOL, Tokyo, Japan) and

JNM-AL500MHz spectrometer (JEOL), using tetramethylsilane as the internal

standard.

Low- and high-resolution FAB and EIMS: JMS-700 spectrometer (JEOL).

Column chromatography: silica gel 60N (63-210 m, Kanto Chemical, Tokyo,

Japan); ODS silica gel YMC-GEL ODS-A (YMC YMC, Kyoto, Japan);

Sephadex LH-20 (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK).

Preparative HPLC-1

Pump: SSC-3461 (2.5 mL/min, Senshu Scientific, Tokyo, Japan )

Detector: SSC-5410 UV detector (254 nm, Senshu Scientific)

Column: Inertsustain C18 (10 × 250 mm, GL Sciences, Tokyo, Japan)

Preparative HPLC-2

Pump: Jasco PU-2080 Plus (2.5 mL/min, Jasco, Tokyo, Japan)

Detector: SSC-5410 UV detector (254 nm, Jasco)

Column: Senshu Pak PEGASIL Silica SP-100 (10 × 250 mm, Senshu

Scientific).

Preparative HPLC-3

Pump: SSC-3461 (2.5 mL/min, Senshu Scientific)

79


Column: Senshu Pak PEGASIL Silica SP-100 (10 × 250 mm, Senshu

Scientific)

Preparative HPLC-4

Pump: SSC-3461 (2.5 mL/min, Senshu Scientific)


Column: CHIRALPAK IE 85335 (10 × 250 mm, DAICEL, Osaka, Japan).

Fungal material

The marine-derived fungus E. rubrum (MPUC136) was isolated from seaweed

obtained in Chosei-mura, Chosei-gun, Chiba Prefecture, Japan, in December,

2005. The isolate was speciated by rDNA sequence analysis. T he internal

transcribed spacer regions 1 and 2 and the 5.8S rDNA in the rRNA gene of the

isolate were identical to those of an epitype strain of E. rubrum . A voucher

specimen (MPUC136) was deposited at the department of Pharmacognosy and

Phytochemistry, Meiji Pharmaceutical University.

80

【第 1 章】培地成分を変更した海洋由来真菌からのメラニン産生抑制化

合物の探索

Fermentation and extraction

E. rubrum was pre-incubated on PGY (peptone: Kyokuto Pharmaceutical

Industrial, Tokyo, Japan; glucose: Iwaki Seiyaku, Tokyo, Japan; yeast extract:

Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) slant medium. Wheat

medium: After pre-incubation, E. rubrum was inoculated into 500-mL Roux

flasks (16 flasks) containing wheat (Hakubaku, Yamanashi, Japan, 150 g per

flask) immersed in artificial sea water (Instant Ocean, NAPQO, Concord, Ohio).

Flasks were statically incubated at 26°C in the dark for 14 days. Czapek-Dox

medium: After pre-incubation E. rubrum was inoculated into Czapek-Dox

(Becton, Dickinson) agar medium and incubated at 26°C in the dark for 14 days.

Each fermented substrate was extracted with CHCl 3 .

Isolation

CHCl3 extract (23.0 g) from cultivation on wheat medium was dissolved with

EtOAc, affording 2 (2.6 g). EtOAc soluble part (20.2 g) was fractionated by

silica-gel column chromatography with CHCl 3-MeOH (100:1, 50:1, 25:1, 10:1,

5:1, 0:100) to yield four fractions (a–d). Fraction c (12.3 g) showed anti -

melanogenesis activity (melanin content, 29.9% at 10 g/mL) and was

fractionated by silica gel column chromatography with CHCl3-MeOH (50:1,

30:1, 15:1, 7:1, 0:100) to yield six fractions (ca–cf). Fraction cb (3.0 g) was

fractionated by ODS column chromatography with MeCN-H2O (7:3, 10:0) to

yield four fractions (cba–cbd). Fraction cbb (422.7 mg) was subjected to two

chromatography steps: (1) silica-gel column chromatography with CHCl3-

MeOH (30:1), followed by (2) preparative HPLC (CHCl 3-MeOH 50:1) to afford

5 (20.0 mg, tR 8 min). Fraction cbd (1.2 g) was fractionated by ODS column

81

chromatography with MeCN-H2O (8:2, 10:0) to yield six fractions (cbda-cbdf),

4 (40.2 mg) was isolated from fraction cbdb. Fraction cbdd (138.2 mg) was

subjected to two chromatography steps: (1) Sephadex LH-20 column

chromatography with MeOH, followed by (2) preparative HPLC (MeCN -H2O

8:2) yielded 3 (6.2 mg, tR 22 min).

Fraction ce (1.4 g) was subjected to two chromatography steps: (1) ODS

column chromatography with MeCN-H2O (8:2, 10:0), followed by (2)

preparative HPLC (MeCN-H2O 8:2) to yield 1 (8.1 mg, tR 17 min), 8 (14.4 mg,

tR 14 min), and 9 (1.9 mg, tR 21 min).

Fraction cf (186.3 mg) was subjected to two chromatography steps: (1) ODS

column chromatography with MeCN-H2O (5:5), followed by (2) preparative

HPLC (MeCN-H2O 5:5) to yield 7 (3.2 mg, tR 9 min).

Fraction d (0.3 g) was subjected to three chromatography steps: (1) silica -gel

column chromatography with CHCl3-MeOH (30:1, 20:1, 0:100), followed by (2)

ODS column chromatography with MeCN-H2O (5:5, 10:0) and (3) preparative

HPLC (MeCN-H2O 5:5) to yield 6 (10.1 mg, tR 6 min).

Isoechinulin D (1)

yellow oil; []D26 +38 (c 0.45, MeOH); UV (MeOH) max (log ): 213 (4.77),

233 (4.84), 293 (4.32), 341 (4.39) nm; IR (ATR) max: 3290, 2966, 1674, 1633

cm -1; 1H- and 13C- NMR see Table 1; EIMS m/z (rel. int., %): 407 [M]+ (100),

336 (86), 268 (17), 194 (18); HREIMS m/z: 407.2207 [M]+ (calculated for

C24H29N3O3 , 407.2209).

Semi-synthesis of 6 from 1

A solution of 1 (5.0 mg) in MeOH (200 L) and 0.6 N HCl (140 L) were

stirred at room temperature for 5 minutes. The reaction mixture was

82

concentrated in vacuo . The residue was purified by ODS column

chromatography (MeOH-H2O 7:3) to give 6 (1.2 mg). The ECD spectra of 6

showed the same curve as that of from natural extract (Fig. 59).

HPLC analysis

HPLC profiles of the CHCl3 extracts of marine-derived fungus E. rubrum

(MPUC136) cultured on Czapek-Dox agar medium and wheat medium are shown

in Fig. 8; HPLC spectra were detected by UV (254 nm). Extracts were analyzed

by reverse-phase HPLC on a CAPCELL PAK C18 MGII column ( 4.6 mm × 250

mm, OSAKA SODA, Osaka, Japan). Solvent conditions were MeCN and H2O

(0–10 min: 20:80, 10–50 min: from 20:80 to 100:0, 50–60 min: 100:0) and flow

rate was 1.0 mL/min (Fig. 60).

Fig. 59 ECD spectra for natural and derivatized rubrumiline A.

83

Fig. 60 HPLC profiles of the CHCl3 ext. and isolated compounds.

84

Synthesis of Cyclo-L-Trp-L-Ala (10)

Boc anhydride (842 mg, Tokyo Chemical Industry, Tokyo, Japan) was added

to the solution of L-tryptophan (500 mg, Wako Pure Chemical Industries, Osaka,

Japan) and sodium bicarbonate (410 mg Tokyo Chemical Industry) in H 2O-1, 2-

dioxane 1:1 (5 mL). The reaction mixture was stirred for 16 h at room

temperature. The residue was dissolved with 5% HCl and then extracted with

EtOAc. Boc-L-Trp (583 mg 76%) was obtained from organic layer.44

Boc-L-Trp (100 mg) was added to the solution of L-Ala methyl ester

hydrochloride (66 mg, Tokyo Chemical Industry) in CHCl 3 (1 mL). Et3N (70

L, Wako Pure Chemical Industries) and 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-

ethylcarbodiimide hydrochloride (EDCI, 81.8 mL, Tokyo Chemical Industry)

were added and stirred 17 h at 0℃ to room temperature. The reaction mixture

was washed by 1N NaOH, H2O, 5%HCl and H2O. The organic layer was dried

over Na2SO4 and purified by silica-gel column chromatography (n-Hex-EtOAc

1:2) yielded Boc-L-Trp-L-Ala-methyl ester (56 mg 48%).45

Boc-L-Trp-L-Ala-methyl ester (30 mg) was dissolved by CH 2Cl2 (2 mL) and

added TFA (150 L Wako Pure Chemical Industries). The reaction was stirred

for 2 h at room temperature and concentrated in vacuo . After concentration

reaction mixture was added cooled MeOH (1mL) and NH 4OH (200 L,

25%NH3aq Wako Pure Chemical Industries) in H2O (1 mL). The reaction

mixture was stirred for 24 h at room temperature. 46 The reaction mixture was

concentrated in vacuo and purified by silica-gel column chromatography

(CHCl3-MeOH 10:1). Cyclo-L-Trp-L-Ala (10, 11 mg, 55%) was identified by

comparison of NMR data with those reported in the literature. 47

85

Cell culture

B16 melanoma 4A5 cells (RCB 0557) were purchased from RIKEN Cell Bank

and were cultured using Dulbecco’s Modified Eagle’s medium (DMEM; Wako

Pure Chemical Industries) with 10% fetal bovine serum (FBS; Wako Pure

Chemical Industries) at 37°C in 5% CO2 .

Melanin synthesis inhibitory assay

The melanin content was determined by a slightly modified method. 75 Each

compounds were dissolved in DMSO. The final DMSO concentration in the

medium was 0.1%.

The assay was performed in 6-well clear polystyrene microplates (Corning,

Corning, NY). B16 melanoma cells were seeded into each well as 9.6 × 10 4 cells

in a 2-mL volume. After incubation for 24 h at 37°C in 5% CO 2, test compounds

and theophylline (to a final concentration in the medium of 1 mM; Sigma-

Aldrich, St. Louis, MO) were added. After incubation for 72 h, cells were

washed with phosphate-buffered saline (PBS; Wako Pure Chemical Industries)

and harvested using 0.25% trypsin. The cell suspension was first washed with

PBS, and then the cells were counted using a Scepter™ 2.0 Handheld Automated

Cell Counter (Merck Darmstadt, Germany). Cells were solubilized in 1 mL of 1

N NaOH for 60 min at 80°C. Lysates were transferred to a 96 -well microplate

(Corning). Absorbance was measured at 475 nm (reference wavelength: 650 nm)

using an Immuno Mini NJ-2300 (BIOTEC, Tokyo, Japan) microplate reader;

melanin concentrations were extrapolated from a standard curve of known

concentrations of synthetic melanin (Sigma-Aldrich). Alpha-arbutin (Glico,

Osaka, Japan) was used as a positive control. Statistical differences among the

treatment groups were compared using one-way ANOVA with Dunnet’s

86

multiple comparisons tests. The IC50 values were estimated using Prism

software (version 5.02; GraphPad, San Diego, CA).

87

【第 2 章】海洋由来真菌抽出エキスの誘導化とメラニン産生抑制化合物

の探索

Coumarin derivatization

Small-scale derivatization: E. rubrum CHCl3 extract (100 mg) and diethyl

malonate (20 L, Tokyo Chemical Industry) were dissolved with piperidine (50

L; Wako Pure Chemical Industries) in ethanol (1 mL). The solution was stirred

at reflux for 15 min and then concentrated in vacuo to yield a coumarin

derivatization reaction mixture. This reaction mixture was used for each anti -

melanogenesis assay.

Large-scale derivatization: E. rubrum CHCl3 extract (2.0 g) and diethyl

malonate (4 mL) were dissolved with piperidine (1 mL) in ethanol (10 mL). The

solution was stirred at reflux for 15 min and then concentrated in vacuo to yield

a coumarin-derivatized reaction mixture. The components of this reaction

mixture were shown to match those of the small -scale derivatization. This

reaction mixture was used for isolation for compounds.

Analytical HPLC conditions

Analytical HPLC was performed as the same as chapter 1. The E. rubrum

CHCl3 extract was dissolved at a concentration of 1 mg/mL (10 L charged).

The coumarin-derivatized reaction mixture was dissolved at a concentration of

4 mg/mL (10 L charged). Following purification, the isolated compounds were

each dissolved at concentrations of 1 mg/mL (10 L charged) (Fig. 61).

88

Fig. 61 HPLC profiles of E. rubrum CHCl3 extract and chemically

engineered extract and isolated compounds.

89

Isolation of coumarin compounds (14–16)

The coumarin derivatized reaction mixture (5.7 g) was fractionated by silica -

gel column chromatography with n-Hex/EtOAc (2:1) to yield four fractions (a–

d). Fraction c (529.0 mg) was subjected to two chromatography steps: (1)

Sephadex LH-20 column chromatography with MeOH, and (2) ODS column

chromatography with MeCN/H2O (8:2), yielding 16 (13.4 mg) from fraction c1.

Fraction b (3.8 g) was subjected to two chromatography steps: (1) silica-gel

column chromatography with n-Hex/Acetone (10:1, 7:1, 1:1), and (2)

preparative HPLC with n-Hex/Acetone (4:1), yielded two fractions (b1 and b2).

17 (7.1 mg, tR 11 min) was obtained as fraction b1. 18 (1.5 mg) was obtained

from fraction b2 by preparative HPLC with MeCN/H 2O (8:2, tR 20 min).

Compound 16

Yellow oil; UV (MeOH) max (log ): 217 (4.81), 318 (4.35), 391 (3.75); IR

max (ATR): 3316, 1749, 1717 cm -1; EIMS m/z (rel. int., %): 396 [M]+ (48) 323

(100), 315 (56), 267 (30); HREIMS m/z: 396.1936 [M]+ (calculated for

C24H28O5, 396.1937); 1H- and 13C-NMR, see Table 4.

Compound 17


max (ATR): 3401, 1755, 1721 cm -1; FABMS m/z: 401 [M+H]+ 355; HRFABMS

m/z: 401.2325 [M+H]+ (calculated for C24H33O5, 401.2328); 1H- and 13C-NMR,

see Table 4.

Compound 18


max (ATR): 3373, 1741 cm -1; FABMS m/z: 399 [M+H]+ 353; HRFABMS m/z:

90

399.2169 [M+H]+ (calculated for C24H31O5 , 399.2171); 1H- and 13C-NMR, see

Table 4.

Isolation of hydroquinone compounds (11–13)

E. rubrum CHCl3 extract (23.0 g) was dissolved with EtOAc. The EtOAc-

soluble portion (20.2 g) was fractionated by silica gel column chromatography

with CHCl3-MeOH (100:1, 50:1, 25:1, 10:1, 5:1, 0:100) to yield four fractions

(a-d). Fraction a (3.5 g) was subjected to silica-gel column chromatography

with n-hexane-acetone (4:1) to yield three fractions (aa–ac). 11 was obtained

as fraction ac (673.5 mg). Fraction aa (774.0 mg) was subjected to silica-gel

column chromatography with n-hexane-CHCl3 (1:2) yielded 12 (406.2 mg) and

13 (219.7 mg).

Synthesis of 19

2,5-Dihydroxybenzaldehyde (100 mg, 0.72 mmol; Sigma-Aldrich) and diethyl

malonate (900 L, 5.96 mmol) were dissolved with piperidine (100 L) in

ethanol (1.5 mL). The solution was stirred under reflux for 15 min and then

concentrated in vacuo . The reaction mixture was distributed with by EtOAc and

H2O. The organic layer was dried over MgSO4 and purified by silica-gel column

chromatography (n-Hex-EtOAc 2:1 to 1:1), yielding 1752 (78.3 mg, 0.33 mmol,

46%).

Cell culture

Melanin synthesis inhibitory assay

These scheme were the same as chapter 1.

91

Tyrosinase inhibition assay

Tyrosinase inhibitory activity was assayed as described previously with slight

modifications76, using a 96-well clear polystyrene microplate (Corning). Each

of the test compounds was dissolved in DMSO. The final DMSO concentration

was 10%; validation experiments demonstrated that this concentration of DMSO

did not interfere with the detection of dopachrome. Mushroom tyrosinase

(T3824, Sigma-Aldrich) was formulated in phosphate buffer (0.1 mol/L

phosphate buffer, pH 6.8; Wako Pure Chemical Industries). L-DOPA (Sigma-

Aldrich) was dissolved in phosphate buffer immediately before use in the assay.

Phosphate buffer (100 L) was combined with mushroom tyrosinase (30 µL of

a dilution sufficient to yield a final assay concentration of 1.44 U/well) and

DMSO-dissolved test sample (20 L). Freshly prepared L-DOPA (50 L) was

added to yield a final assay concentration of 625 M. After incubation for 15

min at room temperature, dopachrome formation was measured at an absorbance

(Abs) at 475 nm using an Immuno Mini NJ-2300 microplate reader (BIOTEC).

DMSO without test compound was used as the negative control; kojic acid

(Tokyo Chemical Industry) was used as a positive control. The inhibitory

activity was calculated as follows: % inhibition = [(Abs cont rol −

Abssample)/Abscont rol] × 100. Statistical differences among the treatment groups

were compared using one-way ANOVA with Dunnet’s multiple comparisons

tests. The IC50 values were estimated using Prism software (GraphPad).

Docking study

The tyrosinase crystal structure in complex with L-DOPA was retrieved from

the Protein Data Bank (PDB code: 4P6S 51) and imported into Auto-Dock

program (Version 4.2).77 The structures of each compounds were drawn with

92

ChemBioDrawUltra 11.0. and subjected to energy minimization using molecular

mechanics (MM2).

AutoGrid was used for calculating the grid maps and centered on the ligand

binding site of tyrosinase, in such a way that it would totally cover the ligand

molecule. The centroid of the Grid Map was set to X: −21, Y: 0, Z: −11 with a

grid spacing 0.375 Å. The maximum number of energy evaluation was set to

250,000. Both ligand and receptor docking were performed using the

Lamarckian Genetic Algorithm (Runs 20) after the default parameter settings

generated by the AutoDockTools were used for docking. The binding mode was

visualized by Molegro Molecular Viewer 2.5 .

Three stable poses and energies were calculated for each compound. The

scores of each categories (a–i) were calculated as average of all energies (mean

± SD). The binding mode was visualized by Molegro Molecular Viewer 2.5.

93

【第 3 章】海洋由来真菌抽出エキスのクマリン二量化とチロシナーゼ阻

害活性化合物の探索

Fermentation and extraction


Chemically engineered extract

E. rubrum CHCl3 extract (1 g) and diethyl 1,3-acetone-dicarboxylate (200 L,

Tokyo Chemical Industry) were dissolved with piperidine (600 L; Wako Pure

Chemical Industries) in CHCl3 (10 mL). Stirring under reflux for 15 min E.

rubrum CHCl3 extract (400 mg) in CHCl3 (2 mL) was added. The CHCl 3 extract

was added every 15 min for a total of 6 times and then stirred under r eflux for

30 min. The reaction mixture was concentrated in vacuo to yield the CEE.

Analytical HPLC conditions


The E. rubrum CHCl3 extract was dissolved with CHCl3 at a concentration of

1 mg/mL (10 L charged). The coumarin-derivatized reaction mixture was

dissolved with CHCl3 at a concentration of 5 mg/mL (10 L charged). Following

purification, the isolated compounds were each dissolved with CHCl3 at

concentrations of 1 mg/mL (10 L charged) (Fig. 62).

94

Fig. 62 HPLC profiles of each extract and isolated compound .

95

Isolation of coumarin derivatives

CEE (4.6 g) was fractionated by silica-gel column chromatography with n-

Hex/EtOAc (2:1, 1:2 followed by MeOH) to yield four fractions (a –d). Fraction

b (525.4 mg) was subjected to ODS column chromatography with MeCN/H 2O

(8:2, 9:1, 19:1), yielding six fractions ba–bf. 23 (7.9 mg, tR 8 min) and 2 (10.7

mg, tR 6 min) were obtained from fraction bc (76.1 mg) by preparative HPLC

with n-Hex/CHCl3 (1:4). 23 (7.0 mg) was subjected to preparative chiral phase

HPLC with MeOH yielding (+)-23 (2.1 mg, tR 9 min) and (−)-23 (1.7 mg, tR 8

min). 24 (10.7 mg) was subjected to preparative chiral phase HPLC with MeOH

yielding (+)-24 (2.1 mg, tR 11 min) and (−)-24 (1.9 mg, tR 10 min).

Fraction bf (81.9 mg) was subjected to preparative HPLC with n-Hex/CHCl3

(1:4) yielding 20 (4.9 mg, tR 6 min), 21 (22.2 mg, tR 7 min) and 22 (27.4 mg, tR

6.5 min).

Compound 20

Yellow powder; UV (MeOH) max (log ): 207 (4.77), 253 (sh, 4.20), 343

(4.41), 404 (sh, 3.92); IR max (ATR): 3410, 1688 cm−1; FABMS m/z: 683 [M]+,

355; HRFABMS m/z: 683.3949 [M+H]+ (calculated for C43H55O7 , 683.3948);

1H- and 13C-NMR, see Table 6.

Compound 21

Yellow oil; UV (MeOH) max (log ): 211 (4.31), 253 (sh, 4.20), 337 (3.98),

403 (sh, 3.67); IR max (ATR): 3358, 1724 cm−1; FABMS m/z: 679 [M]+, 353;

HRFABMS m/z: 679.3627 [M+H]+ (calculated for C43H51O7 , 679.3635); 1H- and

13C-NMR, see Table 6.

96

Compound 22

Yellow oil; UV (MeOH) max (log ): 207 (4.66), 246 (sh, 4.42), 346 (4.41),

407 (sh, 3.92); IR max (ATR): 3399, 1693 cm−1; FABMS m/z: 681 [M]+, 355,

353; HRFABMS m/z: 681.3797 [M+H]+ (calculated for C43H53O7 , 681.3791);

1H- and 13C-NMR, see Table 6.

Compound 23

Yellow powder; []D25 ±0 (c 0.7 CHCl3); UV (MeOH) max (log ): 205 (4.29),

250 (sh, 3.60), 334 (3.95), 415 (sh, 3.17); ECD (MeOH) max (Δ): ±0; IR max

(ATR): 3366, 1715 cm -1; FABMS m/z: 679 [M+H]+, 355, 338; HRFABMS m/z:


Table 7. (+)-23 (8R): []D25 +34 (c 0.1, CHCl3); ECD (MeOH) max (Δ): 221

(±0), 230 (+7.32), 238 (±0), 249 (−4.45), 293 (−1.38), 310 (−2.42), 339 (±0),

360 (+1.68). (−)-23 (8S): []D25 −31 (c 0.1, CHCl3); ECD (MeOH) max (Δ):

231 (−9.11), 239 (±0), 249 (+6.40), 294 (+2.88), 311 (+3.85), 344 (±0), 360 (−

1.47).

Compound 24

Yellow powder; []D25 −4 (c 0.5 CHCl3); UV (MeOH) max (log ): 205 (5.04),

253 (sh, 4.20), 334 (4.01), 413 (sh, 3.45); ECD (MeOH) max (Δ): ±0; IR max

(ATR): 3384, 1696 cm−1; FABMS m/z: 677 [M]+, 353, 323; HRFABMS m/z:


Table 7. (+)-24 (8R): []D25 +36 (c 0.1, CHCl3); ECD (MeOH) max (Δ): 220

(+9.25), 229 (+10.74), 243 (±0), 254 (−4.12), 286 (+0.48), 309 (−0.47), 327

(±0), 364 (+3.98). (−)-24 (8S): []D25 −39 (c 0.1, CHCl3); ECD (MeOH) max

(Δ): 223 (−6.76), 228 (−7.14), 241 (±0), 254 (+4.32), 290 (+0.47), 314 (+1.07),

344 (±0), 364 (−1.50).

97

Semi-synthesis of (±)-23

Condensation of 12

12 (90 mg, 300 mol) and diethyl 1,3-acetone-dicarboxylate (54 L, 300

mol) were dissolved with piperidine (50 L) in CHCl3 (1.0 mL). The solution

was stirred at reflux for 20 min and then concentrated in vacuo . The reaction

mixture was purified by ODS column chromatography (MeOH), yielding 25 (66

mg, 160 mol, 53%). 1H- and 13C-NMR of 25 showed as a mixture of keto and

enol form. Enol form was not assigned due to the weak peak in 1H- and 13C-

NMR spectra.

Compound 25

Orange powder; UV (MeOH) max (log ): 209 (4.63), 246 (sh, 4.22), 336

(4.42), 405 (sh, 3.75); IR max (ATR): 3326, 1688, 1608 cm -1; FABMS m/z: 443

[M]+, 397, 355; HRFABMS m/z: 443.2440 [M+H]+ (calculated for C26H35O6,

443.2434); 1H- and 13C-NMR, see Table 10.

Condensation of 25

25 (45 mg, 109 mol) was dissolved with piperidine (45 L) in CHCl3 (0.9

mL) and then 11 (33 mg, 110 mol) in CHCl3 (0.6 mL) was added. The solution

was stirred at reflux for 60 min and then concentrated in vacuo . The reaction

mixture was purified by ODS column chromatography (MeOH -H2O 95:5),

yielding the mixture of coumarin dimer intermediate 26 and (±)-23 (35 mg 52

mol, 47%).

The presence of coumarin dimer intermediate 26 was confirmed by 1H-NMR

spectrum of the derivatization reaction mixture . Two aromatic protons (H 8.42

and 8.45, each s) were similar to those of coumarin dimer ( 20–22) at H-7 and

98

H-7’. Four olefin signals were presented at H 5.60 and 6.02 and were suggested

the presence of diene at C-3’ to C-6’.

Diels-Alder reaction of 26

The reaction mixture of (±)-23 and 26 (30.0 mg, 44 mol) was dissolved with

CHCl3 (3.0 mL) and stirred at room temperature for 60h and purified by

preparative HPLC (n-Hex-CHCl3 1:4) yielding (±)-23 (11 mg, 16 mol, 36%).

Semi-synthesis of (±)-24

Condensation of 13

Semi-synthesis of (±)-24 was performed as the same procedure as Semi -

synthesis of (±)-23. Condensation of 13 (90 mg, 298 mol) and diethyl-1,3-

acetone-dicarboxylate (54 L, 300 mol) yielded the coumarin derivative 27

(91 mg, 220 mol, 74%). 1H- and 13C-NMR of 27 showed as a mixture of keto

and enol form. Enol form was not assigned due to the weak peak in 1H- and 13C-

NMR spectra.

Compound 27

Orange powder; UV (MeOH) max (log ): 238 (4.29), 347 (4.20), 414 (sh,

3.53); IR max (ATR): 3294, 1688, 1605 cm -1; FABMS m/z: 441 [M]+, 395, 353;

HRFABMS m/z: 441.2269 [M+H]+ (calculated for C26H33O6 , 443.2277); 1H- and

13C-NMR, see Table 10.

Condensation of 27

27 (40 mg, 97 mol) was condensed with 11 (30 mg, 100 mol) yielding the

mixture of (±)-24 and 28 (29 mg, 43 mol, 44%). The presence of coumarin

dimer intermediate 28 was confirmed by 1H-NMR spectrum of the derivatization

99

reaction mixture; two aromatic protons (H 8.42 and 8.45, each s, H-7 and H-

7’) and four olefin signals at H 5.60 and 6.02.

The mixture of (±)-24 and 28 (29 mg, 43 mol) in CHCl3 solution was stirred

at room temperature for 60h. (±)-24 (9.3 mg, 14 mol, 33%) was obtained after

purifying by preparative HPLC (n-Hex-CHCl3 1:4).

100

Table 10 1H- (400 MHz) and 13C- (100 MHz) NMR spectroscopic data for 25

and 27 ( in ppm, J in Hz) in CDCl3.

25

27

H C H C

1 117.2 116.7

2 125.8 121.0

3 150.4 149.3

4 7.00 (s) 123.4 7.09 (s) 123.1

5 127.8 129.6

6 148.0 148.3

7 8.69 (s) 146.4 8.73 (s) 146.8

8 121.2 121.9

9 159.7 159.4

10 190.4 190.6

11 4.16 (s) 48.9 4.13 (s) 48.9

12 169.0 168.2

13 4.26 (q, 7.3) 61.6 4.22 (q, 7.2) 61.3

14 1.32 (t, 7.3) 14.0 1.29 (t 7.2) 14.0

1' 2.77 (t, 7.6) 25.0 6.45 (d, 16.3) 120.0

2' 1.49 (m) 30.9 6.09 (dt, 16.3, 6.8) 142.7

3' 1.38 (overlapped) 29.1 2.35 (t, 6.8) 33.7

4' 1.38 (overlapped) 29.5 1.55 (m) 28.7

5' 1.27 (overlapped) 31.7 1.38 (overlapped) 31.5

6' 1.28 (overlapped) 22.6 1.38 (overlapped) 22.5

7' 0.86 (t, 6.9) 14.0 0.93 (t, 7.1) 14.1

1" 3.42 (d, 7.5) 27.2 3.49 (d, 7.0) 27.4

2" 5.26 (t, 7.5) 120.3 5.28 (t, 7.0) 120.0

3" 134.4 134.8

4" 1.72 (s) 25.7 1.76 (s) 25.8

5" 1.72 (s) 17.8 1.74 (s) 17.9

101

Computational Details.

Conformational analyses of 29a and 29b were carried out in the MMFF94S61,62

molecular mechanics force field by CONFLEX software.63–65 These geometries,

within a 8.4 kcal/mol energy range, were further optimized using the semi -

empirical PM666 method available in Gaussian 09 program.67 Additional

possible conformers around the C-8–C-10 bond rotation were generated

manually.

All possible conformers were re-optimized using DFT at the B3LYP/6-31G

(d)68–71 level of theory within a MeOH solvent simulated using the polarizable

continuum model (PCM78). Harmonic vibrational frequencies were also

computed at the same level of theory. Thermal Gibbs free energy was used for

the calculation of equilibrium Boltzmann distribution at 298 K. Excitation

energies, rotatory strengths and oscillator strengths for each transition were

calculated for the first 40 electronic states at the TDDFT /B3LYP/6-31G (d)

level of theory72,73 (a half band width: σ = 0.37 eV).

The UV spectrum was simulated by overlapping Gaussian functions 79 for each

transition formulated as:

ε (𝜈)= 1.3062974×10

8

σ∑𝑓

n

𝑖=1

exp [− (𝜈 − 𝜈𝑖σ

)2

]

Where ν̃ is the wavenumber (in cm -1), σ is defined as half the bandwidth at 1/e

peak height, 𝜈i is the excitation energy (in wavenumber), f is the oscillator

strength for transition respectively. The σ value evaluated from the

corresponding UV spectrum, and a value of 0.37 eV was chosen in good

agreement with the resolution of the experimental UV bandwidths. Total UV

spectrum was obtained according to the Boltzmann-averaged contribution of

each conformer and the total was multiplied by 0.7.

102

The ECD spectra were simulated by overlapping Gaussian functions 79 for each

transition formulated as:

∆ε (ν̃)= 1

(2.296×10-39

)σ√π∑𝜈𝑖𝑅𝑖

n

i=1

exp [− (𝜈 − 𝜈𝑖𝜎

)2

]

Where 𝜈 is the central wavenumber of the Cotton effect, and σ is half the

bandwidth at 1/e peak height, 𝜈i and R i is the excitation energy (in wavenumber)

and rotatory strength for transition i, respectively. The σ value was evaluated

from the corresponding UV spectrum, and a value of 0.37 eV was chosen in

good agreement with the resolution of the experimental UV bandwidths. Total

ECD spectrum was obtained according to the Boltzmann-averaged contribution

of each conformer.

Tyrosinase inhibition assay

These scheme were the same as chapter 2. Compounds 23 and 24 were tested

as racemic mixture.

Docking study

These scheme were the same as chapter 2. The scores of 23 and 24 were

averages of each enantiomer.

103

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【謝辞】

本研究を行うにあたり , 終始熱心なご指導を頂いた明治薬科大学生薬

学研究室 , 小山清隆教授に厚く感謝の意を表します .

本論文作成にあたり , ご指導ならびにご助言を頂きました明治薬科大

学機能分子化学研究室 , 杉山重夫教授 , 明治薬科大学薬品製造化学研究

室 , 齋藤望教授に深く感謝致します . また , 本研究にあたり , ご指導いた

だいた明治薬科大学生薬学研究室高橋邦夫名誉教授 , 高取薫准教授に厚

く御礼申し上げます .

本研究中 , 海洋由来真菌を鑑定していただきました明治薬科大学微生

物学研究室 , 杉田隆教授 , 計算科学を使った構造解析のご指導をいただ

きました明治薬科大学薬品物理化学研究室 , 高波利克教授 , 野地匡裕准

教授に感謝いたします .

共に研究を行った明治薬科大学生薬学研究室 , 石野雅弘博士 , 藤原恒

司修士 , 小島映世修士 , 中島由貴修士 , 川添直輝修士 , 藤井万里奈氏 , 大

坂瑠璃子氏 , 白石祐樹氏 , 増田優紀氏に感謝の意を表します .

また , MS ならびに NMR スペクトルを測定していただきました明治薬

科大学機器分析センターの小関珠美助教 , 山田聖子助手に感謝致します .

最後に , 本研究中私を励まし支えてくださいました明治薬科大学生薬

学研究室の皆様に感謝致します .

なお , 本研究は「日本薬学会長井記念薬学研究奨励金」の助成を受けた

ものです .

平成 30 年 3 月

鎌内等

discovery of novel medicinal seeds by diversification of

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