UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ – UESC

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E EXPRESSÃO DE GENES BiPs EM RESPOSTA A ESTRESSES ABIÓTICOS

EM Citrus sinensis

RONEY FONTES GUIMARÃES

ILHÉUS – BAHIA – BRASIL MAIO DE 2016

RONEY FONTES GUIMARÃES

Caracterização molecular e expressão de genes BiPs em resposta a estresses abióticos em Citrus sinensis

Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz para obtenção do título de Mestre em Produção Vegetal. Linha de pesquisa: Melhoramento de Plantas e Biotecnologia Orientador: Marcio Gilberto Cardoso Costa Co-orientador: Carlos Priminho Pirovani

ILHÉUS – BAHIA – BRASIL MAIO DE 2016

RONEY FONTES GUIMARÃES Caracterização molecular e expressão de genes BiPs em resposta

a estresses abióticos em Citrus sinensis

Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz para obtenção do título de Mestre em Produção Vegetal

Ilhéus, 30 de maio de 2016

_____ _____ Prof. Dr. Carlos Priminho Pirovani

UESC – Co-orientador

_____ _____ Dra. Claudia Fortes Ferreira

Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical

_____ _____ Prof. Dra. Virgínia Lúcia Fontes Soares

UESC – DCB

_____ _____ Prof. Dra. Fátima Cerqueira Alvim

UESC – DCB

DEDICATÓRIA

Dedico aos meus filhos Lucas e Julia. .

AGRADECIMENTOS Agradeço, primeiramente, ao Grande Arquiteto do Universo que me deu sabedoria, discernimento e perseverança para derrubar as barreiras e desafios que se desenharam durante a trajetória deste curso. Agradeço à minha companheira Marlene, por todo apoio incondicional e compreensão no decorrer deste trabalho. A meu pai Ozair pelos ensinamentos e minha mãe Rute, que na sua infinita simplicidade me ensinou que o conhecimento é a única coisa que não poderia ser despojada de mim. A Wagner e Yoná, irmãos de sangue que sempre emitiram energias positivas nos meus caminhos percorridos. Agradeço à Universidade Estadual de Santa Cruz, por ter me dado esta oportunidade como funcionário de adentrar num curso de pós-graduação. À gerência de laboratórios, na figura do gerente Fábio Alan, por ter me dado respaldo institucional no decorrer do curso. Aos meus colegas da GERLAB, que me ajudaram direta ou indiretamente, vai a minha gratidão, pelo apoio. Ao professor Luiz Mattos, pelo exemplo de vida e por todo apoio no decorrer desta jornada. Ao meu orientador, Dr. Marcio, por todos os conselhos, auxílios e paciência na condução do meu processo de aprendizagem numa área nova para mim. Agradeço ao meu co-orientador, Priminho, por ter acreditado que existia alguma potencialidade para executar este trabalho e pela ajuda incondicional. A Dr.ª Aurizangela, pela orientação. Aos colegas do CBG que me ajudaram em vários momentos, Thalline, Matheus, Edson, Luciana Camilo, Katiuscia, Olivia, Fernanda, Tainã, Natália, Jamile Azevedo, Andressa, Marcia, Thaise, Ivina, Natasha, Geise, Marília, Oscar, Diana, Carol e aos demais.

Aos professores e funcionários do CBG, não esquecendo de dona Jô, com sua alegria contagiante. A meu colega de trabalho e amigo Horlei, que sempre, solicitamente, me ajudou no laboratório de Proteômica.

À Jamille, pela ajuda em muitos momentos, principalmente dentro do laboratório e por ceder às fotos da reação histoquímica DAB. A Doutoranda Luana, que esteve me assessorando diuturnamente e que foi a mão que me auxiliou dentro do Laboratório de Cultura de Tecidos, além de ter cedido amostras do seu tratamento para meu experimento. Agradeço de coração. Ao Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal na figura de todos os membros e em especial à Carol, por tempestivamente nos auxiliar nas resoluções dos problemas administrativos deste local. A todos, que de alguma forma contribuíram para execução deste trabalho, Agradeço.

“Devemos aprender durante toda a vida, sem imaginar que a sabedoria vem com a velhice.”

(Platão)

SUMÁRIO RESUMO.....................................................................................................................i ABSTRACT...............................................................................................................iii LISTA DE FIGURAS.................................................................................................v LISTA DE TABELAS.............................................................................................viii 1.INTRODUÇÃO........................................................................................................1 2. OBJETIVOS....................................................................................................2 2.1.1 OBJETIVO GERAL........................................................................................2 2.1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...........................................................................3 3. REVISÃO DE LITERATURA...........................................................................3 3.1 ASPECTOS GERAIS DA CITRICULTURA.....................................................3 3.2 RESPOSTAS A ESTRESSES ABIÓTICOS EM PLANTAS............................4 3.3 CHAPERONAS MOLECULARES...................................................................5 3.4 RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO....................................................................7 3.5 FATORES DE TRANSCRIÇÃO HEAT SHOCK E Cis-ELEMENTOS

RESPONSIVOS AO ESTRESSE NO RE......................................................10 3.5 IMMUNOGLOBULIN BINDING PROTEIN (BiP)............................................11 4. MATERIAL E MÉTODOS..............................................................................12 4.1 MATERIAL VEGETAL E CONDIÇÕES DE CULTIVO..................................13 4.2 IDENTIFICAÇÃO DE GENES BiPs DE CITROS..........................................15 4.3 ANÁLISES DAS PROPRIEDADES PROTÉICAS, MOTIVOS

CONSERVADOS E ALINHAMENTO DE MULTIPLAS SEQUÊNCIAS........15

4.4 LOCALIZAÇÃO CROMOSSÔMICA E ANÁLISES DE CIS-ELEMENTOS DE REGIÕES PROMOTORAS E DE EXPRESSÃO EM DIFERENTES TECIDOS.......................................................................................................16

4.5 EXTRAÇÃO DE RNA TOTAL E SÍNTESE DE CDNA...................................16 4.6 ANÁLISE DE PCR TEMPO-REAL (qRT-PCR)..............................................17 4.7 ACÚMULO DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO (H2O2).................................18 4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA...............................................................................18 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................20

5.1 IDENTIFICAÇÃO DE BIPS DE CITROS E PROPRIEDADES PROTÉICAS..................................................................................................20

5.2 ANÁLISE FILOGENÉTICA E DE DOMÍNIOS CONSERVADOS...................24 5.3 ANÁLISE DA ESTRUTURA EXON-ÍNTRON DOS GENES HSP70 EM

CITROS ........................................................................................................29 5.4 CIS-ELEMENTOS REGULATÓRIOS DE RESPOSTA A

ESTRESSES.................................................................................................31 5.5 EXPRESSÃO GÊNICA EM DIFERENTES TECIDOS...................................35 5.6 EXPRESSÃO GÊNICA (qRT-PCR)...............................................................36 5.6.1 EXPRESSÃO DOS GENES HSP70 EM CITROS SUBMETIDOS A DÉFICIT

HÍDRICO........................................................................................................36 5.6.2 EXPRESSÃO DOS GENES HSP70 EM CITROS SUBMETIDOS A FRIO,

PEG .............................................................................................................37 5.6.3 ACÚMULO DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO (H2O2)...............................41 6 CONCLUSÕES.............................................................................................42

7 ANEXOS........................................................................................................43 8 REFERÊNCIAS.............................................................................................47

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RESUMO

GUIMARÃES, Roney Fontes, M.S, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, maio de 2016. Caracterização molecular e expressão de genes BiP sem resposta a estresses abióticos em Citrus sinensis. Orientador: Dr. Marcio Gilberto Cardoso Costa. Co-orientadores: Prof. Dr. Carlos Priminho Pirovani Profa. Dra. Aurizangela Oliveira de Sousa O cultivo de citros está estabelecido em todas as regiões do território nacional, constituindo-se numa importante atividade econômica para agricultura. O Brasil desponta como o maior produtor mundial de laranja doce e maior exportador de suco de laranja concentrado, o que ressalta a importância deste setor dentro da cadeia produtiva nacional. Porém, a intensificação do déficit hídrico nas regiões produtoras vem provocando a diminuição da produtividade na lavoura. As plantas são munidas de mecanismos responsáveis por atenuar os danos causados pela deficiência hídrica por meio da indução de um conjunto de genes em resposta ao estresse, que irão proporcionar alterações bioquímicas e fisiológicas no intuito de restabelecer o padrão normal. Um dos genes envolvidos na resposta à deficiência hídrica codifica para a chaperona molecular HSP70 ‘Immunoglobulin Binding Protein’ (BiP). Essa proteína é responsável por mediar, de forma transiente, o dobramento de proteínas não nativas que apresentam desarranjo em sua estrutura tridimensional devido ao aumento do estresse. O presente estudo teve como objetivo caracterizar genes BiPs envolvidos na resposta a estresses abióticos em Citrus sinensis. Seis genes pertencentes à família de chaperonas moleculares GPR78/BiP/KAR2 foram identificados no genoma de C. sinensis, sendo que dois desses genes, CsBiP1 e CsBiP2, contêm a sequência de endereçamento para o retículo endoplasmático (RE). O alinhamento das sequências de aminoácidos deduzidas de CsBiP1 e CsBiP2 com homólogos de BiP de soja e de Arabidopsis demonstraram a existência de um padrão de conservação de resíduos, compostos por 5 motivos altamente conservados em HSP70 de plantas. A análise filogenética revelou que CsBiP1 é ortólogo das isoformas de BiP de soja e de AtBiP1 e AtBiP2 de Arabidopsis, enquanto que CsBiP2 apresenta ortologia com a isoforma AtBiP3 de Arabidopsis. A análise da região promotora de CsBiPs revelou a existência de

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sequências cis-regulatórias envolvidas em resposta a choque térmico e ao estresse no RE. Análises de expressão gênica por PCR em tempo real em folhas de plantas de laranjeira ‘Westin’ enxertadas em limoeiro ‘Cravo’ (C. limonia Osb.) e trifoliata ‘Flying Dragon’ (Poncirus trifoliata L.), porta enxertos tolerante e susceptível à seca, revelaram que CsBiP1 teve a sua expressão induzida sob condições de deficiência hídrica em plantas sobre ‘Cravo’, mas reprimida em plantas sobre ‘Flying Dragon’. CsBiP1 também teve a sua expressão induzida em plântulas nucelares de laranjeira ‘Valência’ submetidas ao tratamento com PEG, mas reprimida quando essas plântulas foram ‘Valência’ submetidas a baixa temperatura. Por outro lado, os níveis de expressão de CsBiP2 aumentaram em plântulas de ‘Valência’ submetidas aos tratamentos com PEG e baixa temperatura. CsBiP2 também teve a sua expressão reprimida em resposta à deficiência hídrica em folhas de laranjeira ‘Westin’ enxertadas em ‘Flying Dragon’, sendo que em plantas enxertadas em ‘Cravo’ não foram detectadas alterações significativas de expressão nessas mesmas condições. Palavras-chave: citros, deficiência hídrica, estresse, BiP, Retículo Endoplasmático, Immunoglobulin Binding Protein

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ABSTRACT GUIMARÃES, Roney Fontes, M.S, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, May 2016. Molecular characterization and expression of BiP genes in response to abiotic stresses in Citrus sinensis. Advisor: Prof. Dr. Marcio Gilberto Cardoso Costa. Committee Members: Prof. Dr. Carlos Priminho Pirovani and Prof. Dr. Aurizangela Oliveira de Sousa

The citrus crop is established in all regions of the national territory,

constituting an important economic activity for Brazilian agriculture. Brazil has emerged as the world's largest producer of sweet orange and largest exporter of concentrated orange juice, which underscores the importance of this sector within the national production chain. However, the intensification of drought in the producing regions has led to a decreased productivity in agriculture. The plants have mechanisms responsible for attenuating the damage caused by water stress by inducing a set of genes in response to stress that will provide biochemical and physiological changes in order to restore the cellular homeostasis. One of the genes involved in the response to water stress encodes the molecular chaperone HSP70 'Immunoglobulin Binding Protein' (BiP). This protein is responsible for mediating, transiently, the folding of non-native proteins that have their three-dimensional structure disrupted due to the increased stress. This study aimed to characterize BiPs genes involved in response to abiotic stresses in Citrus sinensis. Six genes belonging to the family of molecular chaperones GPR78 / BiP / KAR2 were identified in the genome of C. sinensis, two of these genes, CsBiP1 and CsBiP2, contain an addressing sequence for the endoplasmic reticulum (ER). Alignment of the deduced amino acid sequences of CsBiP1 and CsBiP2 with those homolog BiPs of soybean and Arabidopsis has demonstrated the existence of sequence patterns composed of five highly conserved motifs from plant HSP70. Phylogenetic analysis revealed that CsBiP1 is an orthologous isoformof soybean BiPs and

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Arabidopsis AtBiP1 and AtBiP2, while CsBiP2 has orthology with AtBiP3 isoform from Arabidopsis. Analysis of the promoter regions of CsBiPs revealed the presence of cis-regulatory sequences involved in response to heat shock and stress in the ER. Analysis of gene expression by real-time PCR in leaves of sweet orange 'Westin' grafted on Rangpur lime (C. limonia Osb.) and trifoliate 'Flying Dragon' (Poncirus trifoliata L.), rootstocks drought-tolerant and sensitive, respectively, revealed that CsBiP1 was upregulated by water deficit treatment in plants grafted on ‘Rangpur’, but downregulated in plants grafted on ‘Flying Dragon’. CsBiP1 expression was also upregulated in seedlings of ‘Valencia’ sweet orange subjected to treatment with PEG, but downregulated by cold treatment. The CsBiP2 expression increased in seedlings of "Valencia" subjected to PEG and cold treatments. On the other hand, the CsBiP2 expression was downregulated by water deficit treatment in 'Westin' sweet orange grafted on ‘Flying Dragon’, but in plants grafted on ‘Rangpur’ no significant changes were detected in its expression between the control and water deficit treatments.

Keywords: citrus, water deficiency, stress, BiP, Endoplasmic Reticulum, Immunoglobulin Binding Protein

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LISTA DE FIGURAS FIGURA 1: EXPLANTES DE LARANJA ‘VALENCIA’ SUBMETIDOS AOS TRATAMENTOS DE PEG E FRIO. FIGURA 2: PLANTAS DE LARANJEIRA ‘WESTIN’ ENXERTADAS EM LIMÃO ‘CRAVO’, E TRIFOLIATA ‘FLYING DRAGON’ MANTIDAS EM CASA DE VEGETAÇÃO, PARA A IMPLEMENTAÇÃO DO EXPERIMENTO DE DEFICIÊNCIA HÍDRICA. FIGURA 3: ANÁLISE FILOGENÉTICA DE MEMBROS DE BIPS DE SOJA E ARABIDOPSIS E HSP70 DE CITROS. FIGURA 4: ALINHAMENTO DE SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DE BIPS. SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDO DEDUZIDAS DE CITROS CSBIP1, CSBIP2 (RETÂNGULO) COM ISOFORMAS DE SOJA E ARABIDOPSIS. DOMÍNIOS Β E Γ PHOSPHATE-BINDING, ADENOSINE-BINDING (RETÂNGULOS VERDE, VERMELHO E MARROM). SITIO PUTATIVE CALMODULIN-BINDING (RETÂNGULO AMARELO), DOMÍNIO ΑB (RETÂNGULO AZUL), SINAL DE RETENÇÃO HDEL (RETÂNGULO CINZA) E 5 RESÍDUOS DE AMINOÁCIDOS FORMANDO O NÚCLEO DO SUBSTRATO ENVOLVIDO NA FORMAÇÃO DE LIGAÇÕES DE HIDROGÊNIO NA ESTRUTURA DO SUBSTRATO (LILÁS). FIGURA 5: ANÁLISE DA ESTRUTURA EXON-INTRON DOS GENES HSP70 DE LARANJA DOCE. FIGURA 6: (HEATMAP) PERFIL DE EXPRESSÃO EM FOLHA, FLOR, CALO E FRUTO NO DE GENES HSP70. FIGURA 7: ANÁLISE DA EXPRESSÃO RELATIVA DO GENES CSBIP1 E CSBIP2 EM FOLHAS DE PLANTAS DE LARANJEIRA ‘WESTIN’ ENXERTADAS SOBRE LIMOEIRO ‘CRAVO’, SOB CONDIÇÕES CONTROLE (POTENCIAL HÍDRICO

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FOLIAR DE -0,1 À -0,5 MPA) OU DE DEFICIÊNCIA HÍDRICA (POTENCIAL HÍDRICO FOLIAR DE -1,5 À -2,0 MPA). A EXPRESSÃO DO GENE GAPC2 FOI USADA COMO NORMALIZADOR ENDÓGENO. OS DADOS REPRESENTAM A MÉDIA DE TRÊS RÉPLICAS EXPERIMENTAIS. *DIFERENÇAS SIGNIFICATIVAS PELO TESTE T AO NÍVEL DE 5% DE PROBABILIDADE. FIGURA 8: ANÁLISE DA EXPRESSÃO RELATIVA DO GENES CSBIP1 E CSBIP2 EM FOLHAS DE PLANTAS DE LARANJA ‘VALÊNCIA’, SOB CONDIÇÕES CONTROLE. SUBMETIDOS A ESTRESSE COM PEG NOS TEMPOS DE 6, 12, 24 E 48 HORAS E CONTROLE. A EXPRESSÃO DO GENE GAPC2 FOI USADA COMO NORMALIZADOR ENDÓGENO. OS DADOS REPRESENTAM A MÉDIA DE TRÊS RÉPLICAS EXPERIMENTAIS. *DIFERENÇAS SIGNIFICATIVAS PELO TESTE T AO NÍVEL DE 5% DE PROBABILIDADE. FIGURA 9: ANÁLISE DA EXPRESSÃO RELATIVA DO GENES CSBIP1 E CSBIP2 EM FOLHAS DE PLANTAS DE LARANJA ‘VALÊNCIA’, SOB CONDIÇÕES CONTROLE. SUBMETIDOS A ESTRESSE COM FRIO NOS TEMPOS DE 6, 12, 24 E 48 HORAS E CONTROLE. A EXPRESSÃO DO GENE GAPC2 FOI USADA COMO NORMALIZADOR ENDÓGENO. OS DADOS REPRESENTAM A MÉDIA DE DUAS OU TRÊS RÉPLICAS EXPERIMENTAIS. *DIFERENÇAS SIGNIFICATIVAS PELO TESTE T AO NÍVEL DE 5% DE PROBABILIDADE. FIGURA 10: DETECÇÃO DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO EM DISCOS FOLIARES DE CITROS TRATADOS COM HCL-DAB (1 MG ML-1 ). TECIDOS FOLIARES FORAM SUBMETIDOS A ESTRESSE POR DESIDRATAÇÃO NOS TEMPOS DE 6, 12, 24 E 48 HORAS E A PRODUÇÃO DE H2O2 FOI VISUALIZADA POR MEIO DA COLORAÇÃO COM DAB. A) PLANTA CONTROLE; B-E) PLANTAS SUBMETIDAS AO TRATAMENTO COM PEG; F-I) PLANTAS SUBMETIDAS AO TRATAMENTO COM FRIO.

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FIGURA 11: PCR QUANTITATIVO EM TEMPO-REAL (QRT-PCR) DE MUDAS DE LARANJA WESTIN ENXERTADAS SOBRE “FLYING DRAGON” (PONCIRUS TRIFOLIATA) E LIMOEIRO “CRAVO” (C. LIMONIA OSB.) FIGURA 12: PCR QUANTITATIVO EM TEMPO-REAL (QRT-PCR) DE FOLHAS DE LARANJA VALÊNCIA (CITRUS SINENSIS L. OSBECK) NOS TRATAMENTOS DE PEG E FRIO FIGURA 13: PEPTÍDEO SINAL DO ACESSO XP_006476337.1 (LUMINAL BINDING PROTEIN 5) DE CITRUS SINENSIS (NCBI).

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LISTA DE TABELAS TABELA 1: OLIGONUCLEOTÍDEOS EMPREGADOS NAS ANÁLISES DE qRT-PCR. TABELA 2: CARACTERIZAÇÃO DE SEQUÊNCIAS HSP70 DE CITRUS SINENSIS TABELA 3: CIS-ELEMENTOS REGULATÓRIOS PUTATIVOS EM 1500 KB NA REGIÃO PROMOTORA QUE ANTECEDE O INÍCIO DA TRADUÇÃO EM GENES DE HSP70 DE LARANJA DOCE. TABELA 4: PONTO ISOELÉTRICO (PI) DE PROTEÍNAS BIP EM PLANTAS TABELA 5: ORTÓLOGOS COM MAIOR SIMILARIDADE PARA A CONFECÇÃO DO HEATMAP. BLAST UTILIZANDO AS SEQUÊNCIAS DE CITROS DO BANCO DE DADOS DO PHYTOZOME GPR78/BIP/KAR2/HSP70 NO CAP. TABELA 6: PROTEÍNAS BIP EM PLANTAS. BLAST CONTRA O BANCO DE DADOS NÃO REDUNDANTE DO NCBI UTILIZANDO A SEQUÊNCIA CSBIP1.

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1. INTRODUÇÃO

A citricultura brasileira é responsável pela produção de mais de 16 milhões

de toneladas de laranja doce, resultado este que coloca o país como maior produtor de laranja doce e exportador de suco de laranja concentrado do mundo (USDA, 2015). O maior produtor nacional é o estado de São Paulo, com 70,22% da produção total, seguido respectivamente por Minas Gerais (6,48%), Bahia (6,40%), Paraná (6,36%), Sergipe (3,83%), Rio Grande do Sul (2,35%) e Pará (1,28%) (AGRIANUAL, 2016).

A produção de citros no Nordeste brasileiro se concentra na região dos Tabuleiros Costeiros, que apresenta como características preponderantes solos com baixa profundidade, compactos e coesos, influenciando diretamente na formação de plantas cítricas, que desenvolvem um sistema radicular pouco profundo, tornando-as mais susceptíveis ao déficit hídrico (CINTRA; LIBARDI; SAAD, 2000). Além disso, essa região muitas vezes apresenta água disponível com elevadas concentrações de sais, o que potencializa os efeitos da escassez hídrica (CRUZ et al., 2003). As mudanças climáticas desencadeadas pelo aquecimento global irão agravar este cenário no futuro (COP21/2015). Portanto, a tolerância à seca é o mais importante atributo agronômico para o cultivo dos citros na região Nordeste.

O limoeiro ‘Cravo’ é o porta enxerto que confere elevada tolerância à seca em variedades nele enxertadas, sendo usado amplamente na citricultura brasileira (SCHAFER; BASTIANEL; DORNELLES, 2001). Em contrapartida, a alta demanda concentrada na utilização de um único porta enxerto confere suscetibilidade à doenças, como a Morte Súbita dos Citros (MSC). Buscar alternativas que venham a substituir o limoeiro ‘Cravo’ esbarra na necessidade de disponibilizar porta enxertos que além de resistente a doenças, apresentem tolerância à deficiência hídrica (POMPEU JUNIOR, 2005).

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O entendimento dos mecanismos de tolerância à seca do limoeiro ‘Cravo’ passou a ser uma prioridade em muitos estudos, visando o emprego desse conhecimento no desenvolvimento de novas variedades porta enxertos adaptadas ao convívio com a deficiência hídrica. A chaperona molecular BiP (“Immunoglobulin Binding Protein”) tem sido demonstrada atuar em resposta à deficiência hídrica em plantas, conferindo tolerância ao estresse quando superexpressa em plantas de tabaco e soja (ALVIM et al., 2001; VALENTE et al., 2009). Genes BiP já foram caracterizados em diversas espécies vegetais, como soja, tabaco, arroz, Arabidopsis, etc (CASCARDO et al., 2000; DENECKE et al., 1991; KOIZUMI, 1996; MUENCH et al., 1997). No presente estudo foi realizada a identificação e caracterização molecular e de expressão de genes HSP70 de citros, explorando-se as informações do genoma de referência de Citrus sinensis (http://phytozome.jgi.doe.gov/; http://citrus.hzau.edu.cn/). Por intermédio das ferramentas de busca, identificou-se no genoma de citros a presença de seis genes da família de chaperonas moleculares GPR78/BiP/KAR2, pertencentes a superfamília HSP70. Análises in silico das sequências preditas de aminoácidos demonstraram que dois desses genes apresentam endereçamento para o reticulo endoplasmático, sendo um deles composto do tetrapeptídeo HDEL na região carboxi-terminal, sequência esta característica de genes BiPs funcionais, e outro gene que apresenta o tetrapeptídeo NDEL. Análises de expressão gênica em mudas de laranja doce enxertadas sobre limoeiro ‘Cravo’, submetidas à condições de deficiência hídrica, bem como em plântulas de laranja doce submetidas a estresses induzidos por PEG e baixa temperatura revelaram a relativa contribuição de cada um desses genes na resposta aos diferentes estresses abióticos testados. Coletivamente, esses resultados permitiram ampliar a atual base de conhecimento sobre os genes BiPs em citros e revelar genes candidatos de tolerância à seca a serem futuramente explorados em estudos funcionais e no desenvolvimento de novas variedades de porta enxerto de citros tolerantes à seca.

2. OBJETIVOS

Geral:

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Caracterizar a família gênica BiP em citros por meio de análises in silico e moleculares.

Específicos: 1. Identificar membros da família BiP em bancos de informação genômica de

citros; 2. Analisar as relações filogenéticas dos membros da família BiP de citros

com aqueles de outras espécies vegetais; 3.Caracterizar as sequências de DNA das regiões promotora e codante, bem

como as propriedades das sequências deduzidas de aminoácidos, empregando-se ferramentas de bioinformática;

4. Caracterizar a expressão gênica, em nível de mRNA (PCR em tempo real), em folhas e plântulas de laranja submetidas à diferentes estresses abióticos.

3. REVISÃO DE LITERATURA

3.1 ASPECTOS GERAIS DA CITRICULTURA

Os citros pertencem à família Rutaceae, subfamília Aurantioideae,

apresentando como principais gêneros Poncirus, Fortunella e Citrus.Esse grupo de plantas tem como centro de origem o sudeste do continente asiático, propagando-se filogeneticamente do centro da China ao Japão, do Leste da Índia à Nova Guiné, Austrália e África Tropical(SWINGLE; REECE, 1967).

De acordo com suas características, as laranjas doces estão subdividas em grupos originados de mutações somáticas: As comuns (‘Natal’, ‘Hamlin’, ‘Pêra ’ e ‘Valência’), e sanguíneas que apresentam baixa acidez (‘Lima’, e ‘Piralima’, ‘Serra’ ‘D’água’) e umbigo (‘Baia’ Baianinha) (MOURÃO FILHO et al., 2008).

A muda de citros é formada pela copa e o porta enxerto. A sua inter-relação é crucial para induzir alterações na variedade copa, proporcionando uma série de respostas fisiológicas, favorecendo a produção de frutos de melhor qualidade e

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ampliando respostas a estresses bióticos e abióticos (SCHAFER et al, 2001; POMPEU JUNIOR, 2005).

A maior parte da produção brasileira de citros encontra-se enxertada em um número reduzido de porta enxertos. O limoeiro ‘Cravo’ é o porta enxerto de maior abrangência nacional, bem adaptado às regiões Sudeste e Nordeste do país. No Sul do Brasil, é predominante o uso do porta enxerto Poncirus trifoliata (OLIVEIRA, 2008).

O limoeiro ‘Cravo’ apresenta um amplo número de características fisiológicas e agronômicas importantes, como tolerância à seca, facilidade na obtenção de sementes, tolerância a tristeza dos citros (CTV), compatibilidade com todas as variedades copa, indução de produção precoce e alta produtividade (SOARES FILHO et al., 2008).

A espécie Poncirus trifoliata (L.) Raf. apresenta como características principais a indução de resistência à uma série de doenças, apresentando boa produtividade, proporcionando a produção de plantas de pequeno porte, favorecendo o adensamento de plantio. Um exemplo desta espécie é o cultivar ‘Flying Dragon’, que apresenta como desvantagem a intolerância à seca (POMPEU JUNIOR, 2005).

3.2 RESPOSTAS A ESTRESSES ABIÓTICOS EM PLANTAS

As plantas estão sujeitas a estresses ambientais que interagem com a bioquímica, fisiologia e morfologia, impossibilitando que as mesmas atinjam seu potencial genético total, agravando a produtividade das culturas (BUCHANAN; GRUISSEM; JONES, 2015). Estresses primários, tais como seca ou altas temperaturas, apresentam uma interconexão em seus efeitos no que se refere às plantas. Tais danos podem causar prejuízos em nível celular, levando a estresses secundários como o oxidativo e osmótico (WANG; et al., 2003).

Os fatores de estresse não interagem de maneira isolada. Porém, estudos experimentais demonstram que a planta pode responder a um único fator. Contudo, os mecanismos do estresse agem por meio de um complexo intricado de

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interações em resposta a ação do ambiente em diferentes níveis sobre o conjunto do fenótipo que está sofrendo a influência do mesmo (SHAO et al., 2007).

O déficit hídrico se inicia com a percepção do estresse, culminando com mudanças na estrutura celular, fisiologia da planta e desenvolvimento. Sob tais circunstâncias, as mesmas ativam um conjunto de respostas adaptativas, tanto em nível celular como molecular, relacionados à tolerância ao estresse, desencadeando a ação de um conjunto de genes específicos (SHINOZAKI et al., 2003).

Os mensageiros secundários fosfato inositol e espécies de oxigênio reativo ROS são acionados após a percepção do estresse. Os mesmos modulam os níveis de Ca2+ intracelular dando início à fosforilação em cascata pela ação das quinases, como também ativando fatores de transcrição (AP2/ERF, bZIPs, NACs, MYBs, MYCs, WRKYs e NF-Ys ) que controlam a expressão de um conjunto de genes específicos e regulados pelo estresse (SHAO et al., 2007).

Análises moleculares dos produtos gênicos codificando para fatores de transcrição e proteínas quinases demonstram que alguns sistemas regulatórios de transcrição e transdução de sinais são controlados por ABA, enquanto outros não, indicando o envolvimento de vias de sinalização tanto dependentes como independentes de ABA (SHINOZAKI; YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2007). 3.3 CHAPERONAS MOLECULARES

As chaperonas moleculares são proteínas que apresentam alto nível de conservação entre plantas e animais, exibindo a propriedade de se ligar a substratos protéicos instáveis, permitindo os organismos sobreviverem em condições de estresse (WINTER; JAKOB, 2004). As chaperonas atuam no funcionamento normal das células e sobrevivência, mediando o carregamento conformacional das proteínas e evitando a formação de grandes complexos de agregados que poderão ser citotóxicos (MEIMARIDOU et al, 2009).

Os membros da família das chaperonas moleculares acompanham as proteínas do início até o fim de seu ciclo. Estas se ligam aos peptídeos nascentes

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que partem do túnel de saída do ribossomo, unindo-se a polipeptídios não dobrados ou mal dobrados (OSTANKOVITCH; BUCHNER, 2015). Auxiliam no restabelecimento do estado nativo correto, sequestrando os mesmos ou facilitando sua degradação e protegendo subunidades nascentes durante o seu processo de montagem ou proporcionando sua renaturação (BOSTON et al.,1996).

Devido ao fato de algumas funções celulares estarem relacionadas a alta temperatura e ao estresse, muitas chaperonas moleculares foram primeiro identificadas em vários organismos como Heat Shock Protein (HSPs) (BOSTON; et al., 1996). Estas proteínas estão arranjadas em cinco classes de acordo com seu peso molecular aproximado: HSP100, HSP90, HSP70, HSP60 e pequenas proteínas heat-shock (AL-WHAIBI, 2010).

O conjunto de chaperonas moleculares HSP70 é o sistema mais bem caracterizado em nível de organismos procarióticos e eucarióticos, localizando-se em todos compartimentos celulares (BOSTON et al., 1996; SAIBIL, 2015). A chaperona HSP70 exerce sua influência em vários processos dentro célula, utilizando a ligação de resíduos hidrofóbicos expostos de proteínas não nativas durante o dobramento e translocação entre compartimento subcelulares (MIERNYK, 1997; BOSTON et al., 1996).

Os dois principais domínios funcionais encontrados nas chaperonas HSP70 são ATPase, de aproximadamente 40 kDa, que se apresenta altamente conservado na porção N-terminal da proteína, e um domínio de ligação peptídica na porção C-terminal da mesma, com aproximadamente 25 kDa, e são separados por uma região principal que é susceptível à clivagem proteolítica (SUNG et al., 2001; FIETTO et al., 2007).

A maior parte da diversidade funcional das HSP70 é coordenada por classes de cofatores chamados de proteínas J, também conhecida como HSP40. A ação de múltiplas proteínas J realizam a função de uma única HSP70 (KAMPINGA, et al., 2010). As proteínas J estão localizadas no citoplasma, mitocôndria e retículo endoplasmático, ligando-se diretamente a proteínas ou em cooperação com as HSP70. A agregação de proteínas J e BiP estimulam a atividade ATPase, auxiliando no dobramento correto de proteínas (MISSELWITZ, 1998; OHTA, 2014).

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Chaperonas de diversos pesos moleculares estão envolvidas em deslocamentos maciços de domínios de 20 a 30 kDa em distâncias de até 20 a 50 Å e rotação de até 100º (SAIBIL, 2013). As HSPs exercem influência no controle do ciclo celular, metabolismo dos carboidratos e aminoácidos, sinalização e proteção contra o estresse ou apoptose, como também transporte ou triagem de proteínas nos seus devidos compartimentos em nível subcelular (USMAN et al., 2014).

3.4 RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO

O Retículo endoplasmático (RE) auxilia no processo de dobramento e modificação de proteínas no lúmen, síntese de fosfolipídios e esteróides, armazenamento de íons de cálcio e no controle de qualidade das proteínas (VOELTZ et al., 2002). No lúmen do RE uma rede complexa de chaperonas, foldases e cofatores garantem o dobramento correto das proteínas. Após passarem pelo controle de qualidade do RE, proteínas dobradas corretamente são transportadas, via tráfego vesicular, para outras organelas ou membrana plasmática (WOEHLBIER; HETZ, 2011).

A via UPR (Unfolded Protein Response) é um sistema citoprotetor do RE que dispara a transcrição de um conjunto de genes responsáveis por detectar e mitigar danos causados em resposta à formação de proteínas que sofreram desestruturação tridimensional (KORENNYKH; WALTER, 2012; LIN et al., 2007). Visando regular as funções fisiológicas da proteína, a UPR inicia um conjunto de respostas continuadas com a finalidade de restabelecer o equilíbrio celular por meio da homeostase no RE (WU et al., 2006).

O estresse no RE provoca a formação de proteínas mal dobradas, acionando a via UPR, ativando a transcrição de proteínas associadas ao RE (ERAD) que proporcionará o incremento de chaperonas no lúmen do RE (SCHRÖDER; KAUFMAN, 2005).

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Caso não seja restabelecido o padrão conformacional das proteínas devido ao prolongado ou irreversível estresse crônico, as proteínas são eliminadas por ubiquitinação ou pelo processo de morte celular programada (PCD) (WOEHLBIER; HETZ, 2011; LIU et al., 2011), que é um mecanismo responsável por acionar a ubiquitina-proteossoma ou o sistema de autofagia dos lisossomos (OSTANKOVITCH; BUCHNER, 2015).

O controle de qualidade das proteínas (ERQC) é um sistema composto pela participação da via UPR, juntamente com a ERAD. Este sistema restabelece a homeostase celular, ocasionado pelo excesso de proteínas aberrantes, provenientes de injurias ambientais, mutações gênicas ou espontâneas. (MCCRACKEN; BRODSKY, 2003).

No RE de células de mamíferos, o estresse é detectado por três classes de transdutores, que ativam um complexo de genes da via UPR responsáveis por monitorar e desencadear ações coordenadas no RE. Cada um destes transdutores define um braço distinto da UPR que é mediado pela proteína quinase/endoribonuclease receptora transmembrana IRE1 (IRE1a ou IRE1b), quinase transmembrana PERK e fator de transcrição transmembrana ATF6. A via UPR é regulada pela chaperona molecular binding protein BiP (RON et al., 2007).

A IRE1 é ativada quando existe um desequilíbrio entre as chaperonas e as proteínas mal dobradas e também regula a degradação associada ao RE (ERAD) e a expansão do RE em resposta ao estresse. Evolutivamente, é a via mais antiga estando presente em todos eucariotos (SCHRÖDER; KAUFMAN, 2005).

Antes da ativação da UPR, IRE1 é levada a uma conformação monomérica pela BiP, ligando-se ao seu domínio luminal. Com o aumento dos níveis de proteínas mal dobradas, ocorre a dissociação, induzindo a IRE1 a oligomerização e ativação da quinase. Com a ativação da IRE1, a mesma adquire a função de endoribonuclease, responsável pela clivagem de um único íntron do mRNA de HAC1 (mRNA XBP1 em mamíferos). A proteína resultante do splicing do mRNA de HAC1 e XBP1 atua como um potente fator de transcrição especifico da UPR para o aumento de expressão de genes alvos (CHAWLA; NIWA, 2005).

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Além do IRE1, em mamíferos fazem parte mais dois sensores que são a quinase transmembrana PERK e o fator de transcrição transmembrana ATF6. Os mesmos são ativados de maneira similar ao sensor IRE1 seguindo a dissociação da BiP de seu domínio luminal no RE. No caso da PERK, a dissociação da BiP promove a fosforilação de seu substrato e a tradução do fator de iniciação eIF2α. A liberação de BiP promove a translocação de ATF6 para o golgi, onde sofre proteólise por S1P e S2P, sendo depois translocada para o núcleo, onde se liga aos promotores para ativar a expressão de genes alvo da UPR (CHAWLA; NIWA, 2005).

Recentes investigações sobre a via UPR em plantas demonstram que os fatores de transcrição associados à membrana, bZIP17 e bZIP28, apresentam equivalência funcional a ATF6 de mamíferos. Já o IRE1 está envolvido no splicing do RNA e seu alvo é o fator de transcrição bZIP60, que além de regular o estresse no RE, pode estar envolvido em outros mecanismos de mitigação (HOWELL, 2013; TAJIMA et al., 2008).

Estudos com plantas sugerem que AtbZIP28 contribui para a tolerância ao calor, ativando a expressão de genes BiPs. Estudos em plantas de N. benthamiana indicam que bZIP60 pode estar ligada diretamente a imunidade inata e na atividade secretória das células (IWATA; FEDOROFF; KOIZUMI, 2008; URADE, 2009).

A ativação de IRE1 provoca a produção de HAC1, que atua num mecanismo de “splicing” do mRNA. O HAC1 liga-se ao cis-elemento UPRE que apresenta a sequência conservada CAGCGTG (KAMAUCHI et al., 2005).

O grupo de genes BAX inhibitor-1 (AtBI1), comumente presente em plantas como Arabidopsis, é um produto gênico modulador de estresse no RE, mediado pela PCD, que reflete a rápida indução da via UPR sob condições de estresse, exercendo um papel importante e agindo em paralelo com a via UPR (WATANABE; LAM, 2008). 3.5 FATORES DE TRANSCRIÇÃO “HEAT SHOCK” E Cis-ELEMENTOS RESPONSIVOS AO ESTRESSE NO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO

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As chaperonas, em plantas, fazem parte de um grupo em que os produtos dos genes induzidos estão atrelados a tolerância a fatores de estresse tanto biótico como abiótico. E um segundo grupo de proteínas regulatórias onde os fatores de transcrição estão inseridos, apresentam-se envolvidos na transdução e expressão de genes que contribuem de maneira independente ou conjunta regulando seca, frio ou salinidade (SHINOZAKI; YAMAGUCHI-SHINOZAKI, 2007).

Por meio de uma intricada rede de transdução de sinais, são acionados mecanismos de resposta ao estresse em proteínas chamadas de fatores heat shock (HSF) (SWINDELL; HUEBNER; WEBER, 2007). Os HSF interagem em várias famílias de chaperonas moleculares e em diferentes compartimentos celulares exibindo um alto grau de complexidade em suas interações. As HSPs e fatores de transcrição HSF estão relacionadas com mecanismos moleculares de resposta ao estresse e termotolerância, interagindo em múltiplas vias. Os mesmos foram induzidos amplamente pelo calor, frio, salinidade e estresse osmótico (AL-WHAIBI, 2010).

Vários fatores de transcrição estão envolvidos na regulação de genes responsivos ao estresse, interagindo com regiões promotoras dos cis-elementos para determinar o início dos eventos de transcrição. ABRE (“ABA-responsive element”), contendo a sequência conservada PyACGTGGC,é um cis-elemento que está relacionado com a expressão dos genes da via direta e indireta de ABA e também associados ao estresse osmótico, salino e frio (YAMAGUCHI-SHINOZAKI; SHINOZAKI, 2005).

As famílias de fatores de transcrição MYB e MYC participam no acúmulo de ABA endógeno, aumentando a tolerância ao estresse em plantas (YAMAGUCHI-SHINOZAKI; SHINOZAKI, 2005). Estudos sugerem que genes da subfamília R2R3-MYB interagem com ABA obtendo variados mecanismos de resposta relacionados ao estresse abiótico como envolvimento na regulação da abertura dos estômatos, repressão de genes ligados a respostas com ácido jasmônico, aumento da expressão de genes relacionados ao estresse pelo frio, etc (LINDEMOSE et al., 2013).

Em mamíferos existem várias sequências cis-regulatórias que estão envolvidas em respostas ao estresse no RE: UPRE (TGACGTG-T⁄G), que é um

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elemento cis-regulatório especifico que se liga ao sítio XBP1, ERSE (CCAAT-N9-CCACG), ERSEII (ATTGG-N-CCACG) e o fator nuclear Y(KAMAUCHI et al., 2005).

Os cis-elementos ERSE, ERSEII e UPRE também são encontrados em promotores de plantas. Temos como exemplos o pERSE (CCAAT-N10-CACG), pUPRE (ATTGGTCCACGTCATC) e pUPRE-II (GATGACGCGTAC), que estão envolvidos na expressão de genes indutores do estresse no RE (DENG; SRIVASTAVA; HOWELL, 2013).

O cis-elementos UPRE-II e UPRE-III são necessários e suficientes para conferir os mecanismos de repostas ao estresse de forma idêntica ao cis-elemento UPRE (PATIL; LI; WALTER, 2004). Mais recentemente, o cis-elemento UPRE-III (TCATCG) foi confirmado no promotor NAC3, ativando bZIP60 em genes “downstream” da UPR, incrementando sua atividade transcricional e acionando os mecanismos de regulação em cascata (SUN et al., 2013). 3.6 “IMMUNOGLOBULIN BINDING PROTEIN” (BiP)

Immunoglobulin Binding protein (BiP) é um membro da família HSP70 que está envolvido de forma transiente com proteínas não nativas. BiP é responsável por mediar a síntese protéica, evitando que ocorra a agregação de polipeptídios nascentes com erro de estrutura ou que não foram polimerizados dentro do retículo endoplasmático, como também secreção (FIGUEIREDO et al., 1997; GALILI; SENGUPTA-GOPALAN; CERIOTTI, 1998).

BiP e outros homólogos de HSP70 apresentam dois domínios ativos com trechos altamente conservados, no qual o primeiro está caracterizado na porção N-terminal com aproximadamente 45 kDa, composto por atividade ATPase, o segundo de aproximadamente de 16 kDa possuindo um sítio de ligação peptídica e outro trecho mais variável na porção carboxi-terminal de aproximadamente 10 kDa (MUENCH et al., 1997).

O sinal na extremidade carboxi-terminal em BiP é composto por um tetrapepitídeo que tem a função de reter a proteína no lúmen do reticulo endoplasmático. Contudo, existem variações do sinal de retenção. HDEL é predominantemente encontrado em plantas, enquanto KDEL está presente em

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mamíferos (FORWARD; MISRA, 2000; MUENCH et al., 1997). Em contrapartida, na planta Pseudotsuga menziesii, apresenta sinal de retenção HEEL que é altamente similar a outras BiPs de plantas formando um subgrupo distinto (FORWARD; MISRA, 2000).

Várias espécies vegetais que codificam para o gene BiP foram caracterizadas nos últimos anos. As mesmas estão relacionadas a altos níveis de armazenamento de proteínas de reserva e respostas ao estresse. Em sementes de arroz, por exemplo, o nível de expressão de BiP exerce influência na síntese, armazenamento de proteínas e de amido que estão associadas com o rendimento e a qualidade do grão (YASUDA et al., 2009).

A superexpressão de BiP em plantas transgênicas de tabaco conferiu tolerância ao estresse hídrico quando expostas à condições de seca, evidenciando que a mesma atua em mecanismos que mitigam o estresse em plantas (ALVIM et al., 2001).

A superexpressão de BiP em soja, além de conferir o atraso da senescência foliar, mostrou que os mecanismos do estresse estão interligados com outras vias de respostas na UPR, como no caso da interação com genes marcadores de morte celular (PCD) em proteínas ricas em asparagina (N-RICH PROTEIN-A, N-RICH PROTEIN-B), inibindo-os. Isso indica que BiP pode servir como um regulador negativo na indução do estresse mediado pela NPR (REIS et al., 2011; VALENTE et al., 2009).

4 MATERIAL E MÉTODOS

A execução dos experimentos foi realizada nos laboratórios de Cultura de Tecidos, Proteômica e Biologia Molecular que fazem parte da estrutura do Centro de Biotecnologia e Genética (CBG) da Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), no município Ilhéus-BA.

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4.1 MATERIAL VEGETAL E CONDIÇÕES DE CULTIVO

Para os tratamentos de estresse por frio e polietilenoglicol (PEG), 400 sementes de laranja ‘Valência’ (Citrus sinensis L. Osbeck) foram desinfestadas em álcool a 70% (v/v) por 2 minutos, logo em seguida imersas em hipoclorito de sódio a 2,5% (v/v) acrescido de Tween-20 a 0,1% (v/v) por 20 minutos. Posteriormente, as sementes foram enxaguadas quatro vezes com água destilada e estéril, e inseridas em tubos de ensaio (25 x 150 mm) contendo 10 mL de meio de cultura com metade da concentração de sais do meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962), 25 g L-1 de sacarose e 6 g L-1 de ágar, em pH 5,7. Depois deste passo, as culturas foram incubadas à temperatura de 27 ± 2 ºC, sob fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de escuro, com iluminação de 250 fótons µmol-2 s-1 conferida por lâmpadas fluorescentes brancas, por um período de doze semanas. Após esse período, as plântulas de origem nucelar foram selecionadas de acordo com sua uniformidade, e submetidas aos tratamentos com frio e polietilenoglicol (PEG). O tratamento com frio foi realizado transferindo-se as plântulas para meio MS líquido e incubação a temperatura de 4ºC. O tratamento com PEG foi aplicado transferindo-se as plântulas para meio MS líquido suplementado com 372,5 g/L de PEG-6000. Plântulas controle foram mantidas em meio MS liquido, sob condições de crescimento normal. Após a imposição de cada tratamento, as folhas e raízes compostas de 3 réplicas experimentais foram coletadas nos tempos de 6, 12, 24 e 48 horas e, em seguida, congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 oC para análises posteriores. Um “pool” de amostras de folhas foram coletadas nos diferentes tempos dentro dos tratamentos para as análises.

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Figura 1: Plântulas de laranja ‘Valencia’ submetidos aos tratamentos de tratamentos de PEG e Frio.

O experimento de deficiência hídrica foi realizado em condições de casa de vegetação na Universidade Estadual de Santa Cruz, município de Ilhéus, Sul da Bahia. O material foi cedido pela Doutoranda Luana Pereira Gonçalves, sendo obtido como parte de sua dissertação de mestrado no Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular da UESC. Foram selecionadas 27 plantas de laranjeira ‘Westin’ (Citrus sinensis (L.) Osb.), de aproximadamente 1 ano de idade,de origem nucelar, enxertadas sobre limoeiro‘Cravo’ (C. limonia Osb.) e trifoliata ‘Flying Dragon’ (Poncirus trifoliata L.). Cada porta enxerto foi constituído de 9 plantas, sendo 3 repetições por tratamento (irrigado e deficiência hídrica). As plantas foram inicialmente transplantadas para vasos plásticos (45 L) contendo solo: areia (3:1) como substrato, onde permaneceram por todo o período experimental. As plantas foram podadas a cerca de 1 m a partir de sua base após o transplantio. As plantas foram fertilizadas semanalmente com 1 gL-1 de nitrato de cálcio, 0,4 gL-1 de nitrato de potássio, 0,6 gL-1 de sulfato de magnésio e 0,4 gL-1 de fosfato monoamônico (MAP). Micronutrientes F.T.E. (50 g/vaso) foram misturados ao solo por ocasião do enchimento dos vasos. As plantas foram mantidas em casa de vegetação com umidade e temperaturas do ar variando respectivamente de 70 a 96% e 21 a 32oC. Cada vaso, contendo apenas uma planta, foi irrigado para que o solo fosse mantido próximo à capacidade de campo até o momento de ser aplicado aos tratamentos. Após 30 dias do transplantio, as plantas foram submetidas a dois tratamentos: (i) Irrigado - Controle, em que o potencial hídrico foliar foi mantido entre -0,1 à -0,5 MPa durante todo o experimento, (ii) deficiência hídrica, em que ocorreu a suspensão gradativa da irrigação até o potencial hídrico foliar atingir valores entre -1,5 à -2,5 MPa. Todos os vasos foram vedados na parte superior com papel alumínio, para que fosse minimizada a perda de água por evaporação. O delineamento experimental foi realizado em blocos ao acaso, com três repetições por tratamento.

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Figura 2: Plantas de laranjeira ‘Westin’ enxertadas em limoeiro ‘Cravo’, e trifoliata ‘Flying Dragon’ mantidas em casa de vegetação, para a implementação do experimento de deficiência hídrica.

4.2 IDENTIFICAÇÃODE GENES BiPs DE CITROS

A identificação dos genes BiPs de citros foi realizada por BLAST, utilizando-

se as sequências de genes BiPs caracterizadas em Arabidopsis e soja, explorando o genoma de referência de C. sinensis disponíveis nos bancos de informação genômica do Phytozome (http://phytozome.jgi.doe.gov/), CAP (http://citrus.hzau.edu.cn/orange) e NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

4.3 ANÁLISES DAS PROPRIEDADES PROTEICAS, MOTIVOS

CONSERVADOS E ALINHAMENTO DE MÚLTIPLAS SEQUÊNCIAS

As informações sobre as sequências de aminoácidos preditas foram obtidas para cada gene BiP a partir da base de dados do Phytozome. O tamanho dos polipeptídios, peso molecular, ponto isoelétrico (pI) e índice de hidropaticidade (GRAVY) das sequências de aminoácidos foram preditos empregando-se o conjunto de ferramentas disponíveis no PROTPARAM (http://web.expasy.org/protparam/). As análises de sinais e endereçamento subcelular foram efetuadas com o auxílio do TargetP (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP). O programa SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP) foi utilizado para realizar a predição do

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sítio de clivagem do peptídeo sinal. Os alinhamentos das sequências foram realizados no ClustalX (THOMPSON et al., 1994) e os dendrogramas foram gerados no programa MEGA 7 (TAMURA et al., 2007), utilizando-se o método Neighbor-Joining (SAITO; NEI, 1987) e a opção de bootstrap de 1000 replicações. As distâncias moleculares das sequências foram calculadas de acordo com parâmetro p-distance, tratamento de dados gaps/missing e Pairwise deletion.

4.4 LOCALIZAÇÃO CROMOSSÔMICA E ANÁLISES DE CIS-ELEMENTOS DE REGIÕES PROMOTORAS E DE EXPRESSÃO EM DIFERENTES TECIDOS

A localização cromossômica dos genes foi identificada explorando-se as

informações disponíveis no banco de dados do CAP (http://citrus.hzau.edu.cn/orange/index.php).

A análise dos cis-elementos putativos em 1,5 kb na região promotora que antecede o início da tradução foi efetuada empregando-se a ferramentas PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/) e plantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/). Também foram realizadas buscas manuais por cis-elementos putativos envolvido na via UPR.

A expressão dos genes em diferentes tecidos foi analisada utilizando-se os dados de expressão em RNA-seq disponíveis no CAP (http://citrus.hzau.edu.cn/), onde foram selecionados ortólogos com a maior similaridade (ANEXO 3). Para geração e visualização do heatmap de expressão, o programa R foi utilizado. 4.5 EXTRAÇÃO DE RNA TOTAL E SÍNTESE DE cDNA

Amostras de RNA total foram isoladas utilizando-se o Kit ReliaPrepTM

(Promega), seguindo as instruções do fabricante. A qualidade e a integridade do RNA extraído foram avaliadas por análise em gel de agarose a 1,5%.

A síntese da primeira fita de cDNA foi realizada empregando-se o kit RevertAid (Fermentas), seguindo as instruções do fabricante. Em seguida, as amostras foram mantidas a -20oC.

4.6 ANÁLISE DE PCR EM TEMPO-REAL (qRT-PCR)

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Para as análises de expressão gênica via qRT-PCR foram utilizados

oligonucleotídeos especificamente desenhados para a amplificação dos genes, baseado em suas sequências disponíveis no banco de informação genômica de Citrus sinensis, no Phytozome (http://www.phytozome.org/), conforme descritos na Tabela 1.

As reações foram realizadas em termociclador da Stratagene Mx 3005P (Agilent Technologies), contendo o software MxPro-Mx 3005P, usando o kit Maxima™ SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Scientific). O gene utilizado como controle endógeno para normalização dos dados (gene de referência) foi o da gliceraldeído- 3-fosfato desidrogenase C2 (GAPC2) que apresentou baixa variação de expressão entre os endógenos testados (MAFRA et al., 2012).

As reações foram feitas em três réplicas biológicas. O volume das reações foi de 20 µL, contendo 100 ng de cDNA, 1 µL de cada primer especifico (R+F) 10 µmol.L-1 e 11 µL de Maxima® SYBR Green/ROX qRT-PCR Master Mix (2X) (Fermentas) (Tabela 1). Para testar a especificidade dos oligonucleotídeos, os produtos foram analisados por curva de dissociação. A ciclagem de amplificação foi realizada nas seguintes etapas: 50°C por 2 minutos, 95°C por 10 minutos, 95°C por 15 segundos e 60 °C por 1 minuto. Essas etapas foram repetidas por 40 ciclos. Após a ciclagem de amplificação dos genes, foi realizada a dissociação dos produtos para confirmar a formação de produtos únicos e específicos, neste caso as etapas realizadas apresentaram as seguintes características: 95 °C por 15 segundos, 60 °C por 1 minuto e 95 °C por 1 segundo. Para quantificação da expressão utilizou-se o método 2-∆∆Ct (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001), considerando a média dos valores de Ct das três réplicas realizadas.

Tabela 1: Oligonucleotídeos empregados nas análises de qRT-PCR:

Gene Loco Oligonucleotídeo

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CsBiP1 orange1.1g005955m Forward: 5’- TCGAAACCTCCTCAATTAAACG-3’ Reverse: 5’- GCGCGTACTGCAGCAATTAT-3’

CsBiP2 orange1.1g006194m Forward: 5’- GCTATTTTGCTCCTCTTTGCTTTC- 3’Reverse: 5’- TATCACCGTCCCTAGCTTCG-3’

*GAPC2 At1g13440 Forward: 5’- TCTTGCCTGCTTTGAATGGA-3’ Reverse: 5’- TGTGAGGTCAACCACTGCGACAT-3’

*sequências dos oligonucleotídeos de acordo com (MAFRA et al., 2012). 4.7 ACÚMULO DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO (H2O2)

Discos foliares das plântulas oriundas do experimento de estresse in vitro

foram submetidos à coloração histoquímica com DAB-HCL (3,3‘ – diaminobenzidina), conforme a metodologia previamente descrita (THORDAL-CHRISTENSEN et al., 1997). As amostras foram expostas à infiltração a vácuo com 1 mg mL-1 de DAB-HCl, por 4 horas. Em seguida, os discos foliares foram mantidos imersos em etanol 70%, fervidos por 5 horas e fotografados em lupa para constatação da coloração marrom causada pela produção do peróxido de hidrogênio. 4.8 ANALISE ESTATÍSTICA

Para análise de quantificação relativa da expressão gênica utilizou-se ANOVA e o teste t de Student (p ≤ 0,05).

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5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. IDENTIFICAÇÃO DE BIPS DE CITROS E PROPRIEDADES PROTEICAS Utilizando sequências deduzidas de aminoácidos das proteínas de BiP1 e BiP2 de Arabidopsis e SoyBiPA de soja, buscas foram efetuadas na base de informação do NCBI, onde se constatou que os mesmos são membros da Ontologia KOG0100 (Eukaryotic Orthologous Groups of proteins GPR78/BiP/KAR2/HSP70). Em sequência, buscas no banco de informações genômicas de C. sinensis, no Phytozome, foram realizadas empregando-se a ontologia KOG0100 como palavra-chave. Um total de seis sequências de aminoácidos de C. sinensis da família de chaperonas moleculares GPR78/BiP/KAR2/HSP70 foram identificadas no presente estudo (Tab. 2).

As sequências de aminoácidos orange1.1g005955m, orange1.1g006194m, denominadas respectivamente de CsBiP1 e CsBiP2 no presente estudo, apresentam ORFs de 667 e 657 pb, respectivamente (Tab. 2). As chaperonas moleculares identificadas possuem massas moleculares que variam de 59,65 a 73,53 kDa. Já o ponto isoelétrico (pI) das sequências de aminoácidos apresentaram uma variação de 5,09 a 9,26 (Tab. 2). Os pontos isoelétricos das sequências CsBiP1 e CsBiP2 são compatíveis com outras BiPs de plantas, que podem apresentar um pI variando de 4,9 a 5,3 (FONTES et al., 1991; FORWARD; MISRA, 2000; WACKER; WINTERS, 1994) (Anexo 2).

Constatou-se que as sequências de aminoácidos HSP70 apresentam índice de hidropaticidade média (GRAVY) negativo, caracterizando-as como proteínas hidrofílicas (Tab. 2).

CsBiP1 e CsBiP2 estão localizadas no retículo endoplasmático (RE) e apresentam na região carboxi-terminal os sinais HDEL e NDEL, respectivamente (Tabela 2). A sequência HDEL age como um sinal de retenção no RE para proteínas BiP (BOSTON et al.,1996). As chaperonas moleculares orange1.1g006381m, orange1.1g038511m e orange1.1g043296m apresentam a sequência EEVD na região carboxi-terminal, que as evidenciam como um subgrupo

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de HSP70 com localização no citosol. As HSP70 com sinal de retenção EEVD interagem se ligando ao sistema de chaperonas HSP90 e co-chaperonas, facilitando a homeostase celular (YU et al., 2015). A proteína orange1.1g009246m contém o sinal MPTI, não sendo encontrado na literatura nenhuma informação relacionada a sua possível função.

O sinal de retenção no reticulo endoplasmático HDEL encontrada em outras isoformas de BiPs de soja e Arabidopsis é responsável por facilitar o retorno da chaperona ao RE, após conduzir os processos de montagem e dobramento da cadeia peptídica. Tais características se relacionam juntamente com o alto nível de conservação entre as mesmas e outras BiPs de plantas, que apresentam os motivos conservados pertencentes a esta categoria de HSP70. Tais relações estão concomitantemente ligadas ao fato de BiPs e outras chaperonas estarem evolucionariamente ligadas a mecanismos de resposta a estresses abióticos como tolerância ao calor e déficit hídrico. A região carboxi-terminal Asn-Asp-Glu-Leu (NDEL) da proteína CsBiP2 se assemelha a sequência Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL), podendo exercer uma função similar nesta sequência de aminoácidos. O tetrapeptídeo NDEL é uma variante do sinal de retenção HDEL que foi caracterizada na BiP da CBP-140 de mamíferos (NAVED et al., 1995). Contudo, existem evidências da funcionalidade de outros sinais de retenção em plantas além do HDEL, HEEL e KDEL, sugerindo que ocorra diferentes sinais de retenção em espécies de plantas ou que ambos sinais são funcionais dentro das mesmas espécies (DENECKE et al., 1991; FORWARD; MISRA, 2000).

O peptídeo sinal presente na porção N-terminal de CsBiP1 consiste de 24 resíduos de aminoácidos (Tabela 2), similar ao tamanho da sequência peptídica sinal de outras BiPs, como XP_006476337.1 (Luminal Binding protein 5) de Citrus sinensis identificado pela base dados do NCBI (anexo 5). Em eudicotiledôneas é evidenciado que BiPs de cada espécie apresenta peptídeo sinal de diferentes tamanhos, por exemplo, Arabidopsis, espinafre, tabaco e soja apresentam respectivamente 27, 28, 29 e 30 resíduos de aminoácidos (FORWARD; MISRA, 2000).

As sequências CsBiP1 e CsBiP2, mesmo apresentando localização subcelular no RE, apresentam peptídeos sinais distintos, de 24 e 23 resíduos,

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respectivamente (Tab. 2). As sequências orange1.1g006381m, orange1.1g009246m, orange1.1g038511m e orange1.1g043296m apresentaram peptídeo sinal de 10, 35, 22 e 12 resíduos, respectivamente.

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Tabela 2: Caracterização de sequências GPR78/BiP/KAR2/HSP70 de Citrus sinensis.

Gene Loco

Localização no cromossomo

Tamanho do polipeptídeo

(MW)

Peso

molecular (kDa)

GRAVY pI Predição

de localização subcelular

Predição do sítio de

clivagem do peptídeo sinal

C-terminal

CsBiP1 orange1.1g005955m

chr5:714,617.. 718,228 667

73,538 -0.452 5.09 Via secretora 25 HDEL

CsBiP2 orange1.1g006194m

chr3:18,626,310.. 18,629,729 657

72,773 -0.429 5,19 Via secretora 24

NDEL

- orange1.1g006381m

chr6:7,356,098.. 7,359,278 647 70,889 -0.398 5,16 - 11

EEVD

- orange1.1g009246m

chr7:29,384,101.. 29,387,518 539 59,654 -0.347 9,26 - 36

MPTI

- orange1.1g038511m

chrUn:42,847,190..

42,849,658 624 68,324 -0.456 5,20 - 23

EEVD

- orange1.1g043296m

chrUn:80,387,181..

80,389,612 650 71,054 -0.412 5,43 - 13

EEVD

23

5.2. ANÁLISE FILOGENÉTICAE DE DOMÍNIOS CONSERVADOS

O dendrograma com as relações filogenéticas das GPR78/BiP/KAR2/HSP70 identificadas no presente estudo revelaram a formação de três subgrupos. A sequência de aminoácidos de CsBiP1 agrupou com as isoformas de BiPs da soja e AtBiP1 e AtBiP2 de Arabidopsis (Fig. 3). Já a sequência de aminoácidos de CsBiP2 agrupou-se com a isoforma AtBiP3 de Arabidopsis. As sequências de aminoácidos orange1.1g006381m, orange1.1g038511m, orange1.1g043296m e orange1.1g009246, que não apresentam localização subcelular no RE, agruparam-se separadas das demais sequências de aminoácidos BiPs.

Figura 3: Análise filogenética de membros de BiPs de soja e Arabidopsis e GPR78/BiP/KAR2/HSP70 de citros.

O alinhamento das sequências de aminoácidos deduzidas de CsBiP1 e

CsBiP2 com homólogos de BiPs de soja e de Arabidopsis de mostraram a existência de um padrão de conservação, compostos por 5 motivos altamente conservados em plantas (Fig. 4) (MUENCH et al., 1997).

Os motivos de ligação adenosina β e γ, juntamente com o motivo putativo de ligação de calmodulina estão localizados no domínio ATPase, na porção N-

GmBiPB GmBiPD GmBiPC GmBiPA CsBiP1 AtBiP1 AtBiP2 CsBiP2 AtBiP3 orange1.1g006381m orange1.1g009246m orange1.1g038511m orange1.1g043296m100

92

100

95

100

100

9799

9995

24

terminal do CsBiPs (aproximadamente 409 resíduos). Os motivos de ligação adenosina β eγestão relacionados com a ligação de ATP ou lançamento de ADP (FORWARD, et al., 2000). Os resíduos dos peptídeos conservados das CsBiPs TVIGIDLGTTYSC são encontrados em membros de HSP70 induzidos por estresse (FIGUEIREDO et al., 1997).

As CsBiPs apresentam alto nível de conservação entre os resíduos em relação as outras isoformas de BiPs, variando apenas no tamanho do peptídeo sinal. O domínio carboxi-terminal é composto de dois segmentos, o primeiro contendo 16 kDa (aproximadamente 148 resíduos) munido de um sítio putativo de ligação de adenosina e um núcleo do substrato, formado por 5 resíduos de aminoácidos que tem a função de auxiliar as ligações de hidrogênio que interagem com a estrutura do peptídeo e outro segmento, mais variável, contendo aproximadamente 10 kDa na porção terminal da proteína (FORWARD; MISRA, 2000; MUENCH et al., 1997).

Além disso, na porção C-terminal das CsBiPs foi constatado a presença do domínio αB e o sinal de retenção no retículo endoplasmático NDEL ou HDEL. O mesmo sinal de retenção HDEL encontrado em leveduras é uma características de membros de BiP de plantas, apresentando função idêntica em relação a outros sinais de retenção, como por exemplo o encontrado em mamíferos KDEL (DENECKE et al., 1991).

25

26

27

Figura 4: Alinhamento de sequências de aminoácidos de BiPs de C. sinensis (CsBiP1 e CsBiP2) com isoformas de BiPs de soja e Arabidopsis. Domínios de ligação de fosfato β, γ e adenosina (retângulos verde, vermelho e marrom, respectivamente). Sitio putativo de ligação de calmodulina (retângulo amarelo), domínio αB (retângulo azul), sinal de retenção HDEL (retângulo cinza) e 5 resíduos de aminoácidos formando o núcleo do substrato envolvido na formação de ligações de hidrogênio na estrutura do substrato (lilás).

28

5.3 ANÁLISE DA ESTRUTURA EXON-ÍNTRON DOS GENES HSP70 EM CITROS A análise da estrutura exon-íntron dos genes GPR78/BiP/KAR2/HSP70 de citros, usando os modelos de anotações do Phytozome, demonstraram que CsBiP1 apresenta oito éxons e sete íntrons em sua estrutura, enquanto CsBiP2 apresenta sete éxons e seis íntrons (Fig. 5). Contudo, os genes com endereçamento no citosol orange1.1g006381m, orange1.1g038511m, orange1.1g043296m, juntamente com o gene orange1.1g009246, apresentaram respectivamente 2, 3, 1, 3 éxons e 1, 2, 0, 2 íntrons. As chaperonas moleculares HSP70 dentro dos seus compartimentos subcelulares não apresentam uma conservação integral entre plantas. Porém, as HSP70s com endereçamento no citosol geralmente apresentam zero ou um íntron, enquanto que as organelares são compostas de vários íntrons(SUNG; KAPLAN; GUY, 2001).

A classificação de genes heat-shock, incluindo BiPs de plantas, é de que os mesmos são munidos de íntrons em sua estrutura e que seus éxons codificam ou para um gene, como o espinafre ou para uma família multigênica como no caso do tabaco (WACKER; WINTERS, 1994), soja (FIGUEIREDO et al., 1997) e milho (WROBEL; OBRIAN; BOSTON, 1997). Reafirmando tal abordagem, ZHU et al. (2014) menciona que embora os motivos sejam altamente conservados entre espécies, as diferenças de tamanhos entre as sequências BiP, incluindo íntrons, podem ser devido a pequenas alterações entre os aminoácidos, provocadas por duplicações nos segmentos ou InDels.

29

Figura 5: Análise da estrutura éxon-íntron dos genes GPR78/BiP/KAR2/HSP70 de laranja doce

NOME DO GENE 5UTR E1 I1 E2 I2 E3 I3 E4 I4 E5 I5 E6 I6 E7 I7 E8 3UTR

CsBiP1 153 58 788 268 97 215 82 243 158 480 94 155 126 83 87 502 277 CsBiP2 49 140 265 305 212 95 723 100 155 79 83 89 487 146

orange1.1g006381m 198 214 579 1730 269 orange1.1g009246m 108 71 318 98 526 1451 539 orange1.1g038511m 378 31 813 65 684 orange1.1g043296m 1953

30

5.4. CIS-ELEMENTOS REGULATÓRIOS DE RESPOSTA A ESTRESSES

. Na região promotora de CsBiP1, CsBiP2, orange1.1g006381m,

orange1.1g038511m e orange1.1g043296m são evidenciadas a presença dos cis-elementos ABRE, com destaque para CsBiP1 e CsBiP2, que apresentam respectivamente 2 e 5 ABREs cada uma (Tab. 3). As sequências ACGTGG e CGTACG de três ABREs encontrados na região promotora de CsBiP2 são altamente conservadas em promotores de genes de Arabidopsis e soja induzíveis por frio (MARUYAMA et al., 2011).

ABRE por si não é suficiente para ativar o sistema transcricional responsivo a ABA, sendo também necessária a presença do cis-elemento G-BOX para ativar o mecanismo transcricional (YAMAGUCHI-SHINOZAKI; SHINOZAKI, 2005). Os cis-elementos G-BOX são encontrados em maior quantidade nas regiões promotoras de CsBiP1 e CsBiP2, 11 e 6 cis-elementos, respectivamente (Tab. 3). Em contrapartida, as HSP70 com endereçamento no citosol orange1.1g043296m, orange1.1g038511m e orange1.1g006381m apresentam uma menor quantidade de cis-elementos G-BOX, respectivamente 5, 3 e 1 cis-elementos. A região promotora do gene orange1.1g009246m não apresenta nenhum cis-elementos ABRE.

Os cis-elementos do complexo de proteína de ligação HSE estão envolvidos em respostas ao aumento de temperatura. São evidenciados nas CsBiPs, orange1.1g009246m, orange1.1g038511m e orange1.1g043296m (Tab. 3). RERKSIRI et al.(2013) evidenciaram em genes de arroz que os elementos responsivos ABRE, HSE e G-BOX podem, interagir com a termotolerância em HSPs70. MYB e MYC são cis-elementos que apresentam seus mecanismos de ativação após o acúmulo de ABA endógeno, indicando que os mesmos interagem na fase final do estresse (YAMAGUCHI-SHINOZAKI; SHINOZAKI, 2005). Foram evidenciados em CsBiPs e nas demais HSP70 a ocorrência destes cis-elementos (Tabela 3). Repetições ricas em TC estão envolvidas na capacidade de resposta ao estresse e defesa (QU et al., 2015) e foram encontradas 4 sequências em CsBiP2 e nas demais orange1.1g006381m, orange1.1g038511m e orange1.1g043296m respectivamente 1,3 2 cis-elementos (Tab. 3).

A região promotora de 1,5 kb “upstream” apresenta cis-elementos putativos envolvidos na via UPR. O elemento de resposta a proteínas mal dobradas UPRE

31

(TGACGTGG/A) e sua sequência palindrômica (CAGCGTG) é um dos cis-elementos responsivos caracterizados em mamíferos, encontrado em CsBiP1 (Tabela 3), responsável pelo aumento da expressão de genes promotores ligados diretamente com a ERAD, acionando a via de sinalização do RE para o núcleo, denominada de UPR (MORI et al., 1996).

O UPRE-2 (TACGTG), que apresenta, respectivamente, um cis-elemento em cada região promotora dos CsBiP1 e CsBiP2 (Tab. 3), se liga a proteínas bZIP (Gcn4p e Hac1p), estimulando a transcrição e induzindo genes-alvo da via UPR (PATIL; LI; WALTER, 2004).

Também foi constatado a presença do cis-elemento UPRE-3 (TCATCG) na região promotora de CsBiP1 (Tab. 3). Recentemente, SUN et al. (2013) classificou o cis-elemento UPRE-3, identificando o mesmo no promotor do gene NAC103 de Arabidopsis thaliana, interagindo com a regulação transcricional em cascata e regulando os sinais de estresse por meio da bZIP60 para genes “downstream” da UPR. De fato, PATIL; et al.(2004) mencionaram que os cis-elementos UPRE-1, UPRE-2 e UPRE-3 são suficientes e necessários para proporcionar a ativação da via UPR nos promotores-alvos.

O cis-elemento ERSE-II foi identificado na região promotora do gene CsBiP1 e caracterizado pelo motivo ATTGG-N-CCACG (Tab. 3), responsável pela ligação do fator de transcrição ATF6, induzindo o incremento de chaperonas GPR78 (Binding Protein) no RE (KOKAME; KATO; MIYATA, 2001). Além disso, a sequência anti-senso CCAAT da região promotora são flanqueadas por bases ricas em GC que estão associadas com alto nivel de expressão em células e unidades repetitivas de ERSEs (dados não mostrados) (BUZELI et al., 2002).

Na região promotora do gene CsBiP2 também foi identificado o cis-elemento responsivo à auxinas contendo a sequência CGTCTC (Tabela 3), que segundo BUZELI et al.(2002) sugere que haja um possível mecanismo que relaciona a alta atividade de promotores de BiP em células submetidas a divisão.

O CsBiP2 quando comparado com o CsBiP1 apresentam motivos conservados, endereçamento no reticulo endoplasmático e uma estrutura exón-íntron parecida, porém divergem quando comparado ao tamanho do peptídeo sinal, cis-elementos, principalmente os pertencentes da ERAD. Estas características são muito conservadas em proteínas de ligação BiP. Tais indícios são constatados

32

quando relacionamos o CsBiP2 com a isoforma AtBiP3 de Arabidopsis que apresentam 95% de ortologia com a mesma de acordo com a árvore filogenética. A constatação de que AtBiP3 apresenta altos níveis de expressão quando submetida a estresse (SUNG; VIERLING; GUY, 2001) foi confirmada no gene CsBiP2 quando submetido ao tratamento com PEG (fig. 8).

Diferenças entre a quantidade de cis-elementos putativos em plantas responsáveis pela ativação da via UPR são evidenciados entre os mesmos, em que a isoforma AtBiP3 apresenta o elemento de resposta ao estresse no RE (ERSE), cis-elemento este que não ocorre no CsBiP2. Em CsBiP1 foram catalogados cinco cis-elementos putativos da via UPR, diferentemente de CsBiP2 que apresenta apenas um. A presença de cis-elementos putativos da via UPR está relacionada com a rápida indução de BiPs no lúmen do reticulo endoplasmático, proporcionando a atenuação do estresse.

33

Tabela 3: Cis-elementos regulatórios putativos em 1,5 kb na região promotora que antecede o início da tradução em genes GPR78/BiP/KAR2/HSP70 de laranja doce.

.

Cis-elementos

LOCO DO GENE ABRE MBS LTRE MYCR HSE TC-RICH

REPEATS

G-BOX

AUXIN-

RESPONSIVE ELEMENTS

UPRE-1 UPRE-2 UPRE-3 ERSE-II

CsBiP1 2 1 0 2 2 0 12 0 2 1 1 1 CsBiP2 5 2 0 0 1 4 6 1 0 1 0 0

orange1.1g006381m 2 1 0 0 0 1 3 - - - - - orange1.1g009246m 0 0 1 1 1 0 0 - - - - - orange1.1g038511m 1 1 1 0 2 3 1 - - - - - orange1.1g043296m 3 2 0 0 1 2 5 - - - - -

34

5.5. EXPRESSÃO GÊNICA EM DIFERENTES TECIDOS

Foram observados diferentes padrões de expressão de genes da família GPR78/BiP/KAR2/HSP70 de citros em diferentes tecidos. Os resultados indicam que CsBiP1 e orange1.1g006381m são mais expressos em folhas e flores, enquanto CsBiP2, orange1.1g043296m e orange1.1g038511m tem maior expressão no fruto (Figura 6). De fato, DEROCHER; VIERLING (1995) evidenciaram que HSP70s citosólicas apresentam três classes de expressão: as que apresentam indução pelo calor, outro grupo com expressão constitutiva, porém não induzida pelo calor, e o terceiro grupo também expresso de forma constitutiva e induzida pelo aumento de temperatura. Tais características sugerem que as HSP70s citosólicas apresentam uma interação tecido especifica em plantas, proporcionando diferenças funcionais entre as mesmas (GUY; LI, 1998;DEROCHER; VIERLING, 1995; CASCARDO, et al.,2001). O resultado de expressão de CsBiP1 no tecido floral corrobora com os resultados de expressão de BiP1 e BiP2 encontrados por SUNG et al (2001), onde foi evidenciado um leve aumento de expressão nesse tecido em Arabidopsis. Reafirmando esses resultados, recentemente MARUYAMA et. al.(2014) encontrou o gene BiP3 expresso no pólen de plantas silvestres de Arabidopsis.

FONTES et al.(1991) ressaltou que a proteína BiP se constitui em maior quantidade em células submetidas a rápida divisão celular. Em nosso estudo, orange1.1g009246m foi observado ser altamente expresso em calos, que contêm células em rápida divisão celular.

Segundo CASCARDO et al. (2001), genes BiP exibem regulação órgão-específica. Assim, as isoformas SoyBiPA (folhas, raízes e sementes) e SoyBiPD (expresso em todos os órgãos), que são ortólogos de CsBiP1, parecem compartilhar um padrão de expressão compatível com o mesmo de citros.

35

Figura 6: (HEATMAP) Perfil de expressão de genes GPR78/BiP/KAR2/HSP70 em folha, flor, calo e fruto de Citrus sinensis. 5.6. EXPRESSÃO GÊNICA (qRT-PCR) 5.6.1 EXPRESSÃO DOS GENES CsBiP1 e CsBiP2 EM CITROS SUBMETIDOS

A DEFICIT HIDRICO A análise quantitativa de PCR em tempo real em resposta a deficiência

hídrica em folhas de laranja doce enxertadas sobre limoeiro ‘Cravo’ (tolerante à seca) e trifoliata ‘Flying Dragon’ (suscetível à seca) revelou diferentes respostas de CsBiPs a depender da variedade porta enxerto. CsBiP1 teve a sua expressão induzida pela deficiência hídrica em folhas de laranja doce

36

enxertadas em ‘Cravo’), mas reprimida em folhas de laranja doce enxertadas em‘Flying Dragon’ (Fig. 8). Por outro lado, a expressão de CsBiP2 foi mantida constante em ‘Cravo’ e reprimida em ‘Flying Dragon’ sob condição de deficiência hídrica.

Figura 7: Análise da expressão relativa do genes CsBiP1 e CsBiP2 em folhas de laranjeira ‘Westin’ enxertadas sobre limoeiro ‘Cravo’ ou trifoliata ‘Flying Dragon’, sob condições controle (potencial hídrico foliar de -0,1 à -0,5 MPa) ou de deficiência hídrica (potencial hídrico foliar de -1,5 à -2,0 MPa). A expressão do gene GAPC2 foi usado como normalizador endógeno. Os dados representam a média de três réplicas biológicas. *Diferenças significativas pelo teste t ao nível de 5% de probabilidade. 5.6.2 EXPRESSÃO DOS GENES CsBiP1 e CsBiP2 EM RESPOSTA A FRIO E

PEG

A análise quantitativa de PCR em tempo real de CsBiPs em folhas submetidas a estresse com PEG nos diferentes tempos também demonstrou padrões de expressão distintos entre os genes. Sob tais circunstâncias, pode-se inferir que os mesmos são regulados por estresse pela deficiência hídrica. A expressão de CsBiP1 foi significativamente induzida somente em 48 h após o tratamento, enquanto que a expressão de CsBiP2 foi induzida 6 h após o tratamento e manteve-se em elevados níveis até 48 h (Fig. 8). Um detalhe

37

importante nos CsBiPs é um leve incremento na expressão de CsBiP1 no tempo de 6 horas. Contudo, após isso, CsBiP1 apresentou diminuição da expressão no tempo de 12 horas, acompanhado do aumento gradativo da expressão nos tempos seguintes. CsBiP2 apresentou um resultado inverso nos tempos de 12 e 24 horas, seguido do aumento da expressão em 48 horas.

O perfil de expressão no tempo de 48 horas em CsBiP1 é compatível com os resultados relatados em trigo por ZHU et al.(2014), onde o mesmo submeteu a plantas ao tratamento com PEG 6000 nos mesmos tempos.

A análise da expressão no tratamento de baixa temperatura (4ºC) nos tempos de 6, 12, 24 e 48 horas revelou que CsBiP1 foi reprimido em todos os tempos, apresentando no tempo de 24 horas a maior repressão (Fig. 9). Por outro lado, CsBiP2 teve uma indução de expressão sob baixa temperatura, obtendo seu ápice de expressão no tempo de 12 horas.

Com exceção de CsBiP1 quando submetido ao tratamento com temperatura de 4ºC, os demais tratamentos CsBiPs apresentaram aumento de expressão em folhas quando comparados com as plantas controle. SUNG; VIERLING; GUY, 2001 evidenciaram um padrão de expressão parecido em AtBiP1 e AtBiP2 que apresentaram pouca ou nenhuma expressão quando submetido a baixas temperaturas. Em contrapartida, os mesmos autores evidenciaram em Arabidopsis que a capacidade de resposta ao frio é limitada a HSP70 citosólicas e mitocondriais que apresentam alto padrão de indução em 12 e 48 horas. Como tal, CsBiP2 apresentou aumento de expressão neste tratamento, resultado este que pode estar atrelado à presença de fatores Heat-Shock pertencentes aos cis-elementos regulatórios putativos do mesmo. De fato, CsBiP2 apresenta cinco cis-elementos ABRE, sendo que três destes são munidos das sequências conservadas ACGTGG e CGTACG evidenciados em promotores induzíveis de frio de Arabidopsis ou soja (MARUYAMA et al., 2011). Esta quantidade de cis-elementos ABRE pode influenciar no aumento mais vigoroso da transcrição de proteínas provocando o incremento dos mecanismos de respostas fisiológicas.

38

Figura 8: Análise da expressão relativa do genes CsBiP1 e CsBiP2 em folhas de plântulas de laranja ‘Valência’, sob condições controle e tratamento com PEG nos tempos de 6, 12, 24 e 48 h. A expressão do gene GAPC2 foi usado como normalizador endógeno. Os dados representam a média de três réplicas biológicas. *Diferenças significativas pelo teste t em nível de 5% de probabilidade.

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

5

CsBIP 1

Quantif

icação R

elativa

de mR

NA

ControleT6 hT12 hT24 hT48 h

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

CsBiP2

Quantif

icação R

elativa

de mR

NA

ControleT6 hT12 hT24 hT48 h

39

Figura 9: Análise da expressão relativa do genes CsBiP1 e CsBiP2 em folhas de plântulas de laranja ‘Valência’, sob condições controle e tratamento com frio nos tempos de 6, 12, 24 e 48 h. A expressão do gene GAPC2 foi usado como normalizador endógeno. Os dados representam a média de três réplicas biológicas. *Diferenças significativas pelo teste t ao nível de 5% de probabilidade.

-5-4-3-2-1012

Quan

tificaç

ão Re

lativa

de m

RNA

CsBiP1

ControleT6 hT12 hT24 hT48 h

00,5

11,5

22,5

33,5

CsBiP2

Quan

tificaç

ão Re

lativa

de m

RNA

ControleT6 hT12 hT24 hT48

40

5.6.3 ACÚMULO DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO (H2O2) Para avaliar o incremento do estresse oxidativo nos tratamentos com PEG e frio, H2O2 foi detectado em discos foliares de plantas de laranja doce, após cada respectivo estresse, utilizando-se a técnica histoquímica DAB-HCL. Nos tratamentos submetidos a estresse com PEG e frio, observou-se um maior escurecimento do tecido foliarem relação à planta controle, proporcionado pelo maior acúmulo de H2O2 (Fig. 10). Houve variação de intensidade de coloração dos discos foliares entre os tratamentos, evidenciando de um modo geral um maior acúmulo de H2O2 ao longo do tempo de exposição aos respectivos tratamentos. O aumento da produção de H2O2 está relacionada com o aumento do estresse no RE e o dobramento de proteínas, podendo afetar a homeostase celular (MALHOTRA; KAUFMAN, 2007).

Figura 10: Detecção de peróxido de hidrogênio (H2O2) em discos foliares de C. sinensis tratados com HCL-DAB (1 mg mL-1 ). As plântulas foram submetidas a estresses por PEG ou frio e a produção de H2O2 foi visualizada por meio da coloração com DAB nos tempos de 6, 12, 24 e 48 h após a imposição dos estresses. A) planta controle; B-E) plantas submetidas ao tratamento com PEG; F-I) plantas submetidas ao tratamento com frio.

41

6. CONCLUSÕES O genoma de C. sinensis codifica para seis proteínas homólogas de

GPR78/BiP/KAR2/HSP70, sendo que apenas CsBiP1e CsBiP2 representam ortólogos de isoformas bem caracterizadas de BiPs;

As análises de expressão gênica sugerem que CsBiP1 pode desempenhar um papel na tolerância à deficiência hídrica em citros, enquanto queCsBiP2 pode desempenhar um papel na tolerância ao frio;

CsBiP1 e CsBiP2 podem ser utilizados como alvos de estudos funcionais visando a confirmação de suas funções como BiPs, bem como a verificação da viabilidade do uso desses genes em programas de melhoramento genético para tolerância a estresses abióticos em citros.

7. ANEXOS

1.

Figura 11. PCR quantitativo em enxertadas sobre “Flying Dragon” (Osb.).

PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) de mudas de laranja Westin enxertadas sobre “Flying Dragon” (Poncirus trifoliata) e limoeiro “cravo” (

42

PCR) de mudas de laranja Westin

) e limoeiro “cravo” (C. limonia

Figura 12. PCR quantitativo em Valencia (Citrus sinensis L. Osbeck) 2.

Tabela 4. Ponto Isoelétrico (p

No. de acesso

(GenBank) NP_001234941.1

NP_001238736.1

BAD95470.1

AAK21920.1

AED93812.1 AED94755.1

NP_172382.4

XP_006476337.1

PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) de folhas de laranja

L. Osbeck) nos tratamentos de PEG e frio.

Ponto Isoelétrico (pI) de proteínas BiP em de soja e

Best BLAST [espécie]

pI

SoyBiPA 5,11

SoyBiPB 5,11

SoyBiPC 5,06

SoyBiPD 5,08

AtBiP1 5,08AtBiP2 5,11

AtBiP3 4,95

BiP5 – Citrus sinensis 5,09

43

PCR) de folhas de laranja

de soja e Arabidopsis.

pI

5,11

5,11

5,06

5,08

5,08 5,11

4,95

5,09

44

3. Tabela 5. Ortólogos de C. sinensis do banco de informações genômicas do CAP com maior similaridade em relação aqueles do banco de informações genômicas do Phytozome, usados para a confecção do Heatmap.

Loco Phytozome Ortólogo do CAP Cobertura Identidade CsBiP1 Cs5g01840.1 100% 99% CsBiP2 Cs3g14220.1 100% 100%

orange1.1g006381m Cs6g05890.1 100% 99% orange1.1g009246m orange1.1t04990.1 84% 100% orange1.1g038511m orange1.1t02795.1 88% 100% orange1.1g043296m gene Cs7g29010.1 91% 100% 4.

45

Figura 13. Peptídeo sinal do acesso XP_006476337.1 (Luminal Binding protein 5) de Citrus sinensis(NCBI). 5. Tabela 6. Proteínas BiP em plantas. BLAST contra o banco de dados não redundante do NCBI utilizando a sequência CsBiP1.

No. de acesso (GenBank)

Best BLAST [espécie]

e-value

XP_006439283.1 hypothetical protein CICLE_v10019184mg [Citrus clementina]

0,0

XP_006476337.1 PREDICTED: luminal-binding protein 5 [Citrus sinensis] 0,0

KDO76629.1 hypothetical protein CISIN_1g0059551mg [Citrus sinensis] 0,0

XP_012086670.1 PREDICTED: luminal-binding protein 5-like [Jatropha curcas]

0,0

XP_008437399.1 PREDICTED: luminal-binding protein 5 [Cucumis melo] 0,0

XP_007040596.1 Heat shock protein 70 (Hsp 70) family protein [Theobroma cacao]

0,0

ACJ11746.1 luminal binding protein [Gossypium hirsutum] 0,0

XP_002263323.1 PREDICTED: luminal-binding protein 5 [Vitis vinifera] 0,0

XP_002303672.1 BiP isoform A family protein [Populus trichocarpa] 0,0

KHM99873.1 Luminal-binding protein 5 [Glycine max] 0,0

KYP42326.1 Luminal-binding protein 4 [Cajanus cajan] 0,0

NP_851119.1 Luminal-binding protein 2 [Arabidopsis thaliana] 0,0

BAA13948.1 luminal binding protein [Arabidopsis thaliana] 0,0

46

BAA12348.1 luminal binding protein (BiP) [Arabidopsis thaliana] 0,0

47

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