dissertação de mestrado claudio de castro...

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CLAUDIO DE CASTRO FERREIRA

PREPARAÇÃO DE FASES ESTACIONÁRIAS FLUORADAS PARA

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA EM FASE REVERSA.

CAMPINAS

2014

iii

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE QUÍMICA

CLAUDIO DE CASTRO FERREIRA

PREPARAÇÃO DE FASES ESTACIONÁRIAS FLUORADAS PARA

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA EM FASE REVERSA.

ORIENTADORA: PROFA. DRA. ISABEL CRISTINA SALES FONTES JARDIM

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

APRESENTADA AO INSTITUTO DE

QUÍMICA DA UNICAMP PARA

OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE

EM QUÍMICA NA ÀREA DE QUÍMICA

ANALÍTICA.

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA POR

CLAUDIO DE CASTRO FERREIRA, E ORIENTADO PELA PROFA. DRA. ISABEL CRISTINA

SALES FONTES JARDIM.

__________________________

Assinatura do Orientador

CAMPINAS

2014

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Dedico esse trabalho aos meus pais, Benigno e Terezinha, que muito contribuíram para meu sucesso. Também dedico aos meus irmãos Honorio e Daniel. Por fim, dedico a todos aqueles que contribuíram de alguma forma para este trabalho.

ix

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais e aos meus irmãos, pelo apoio e incentivo nessa

jornada.

À professora Isabel Jardim, pela paciência dedicação e exemplo de

profissional.

À banca, professores: Fabio Augusto, Sônia de Queiroz, Rosely

Barboza e Carol Collins.

Aos meus amigos, Jude, Lorruama, Pedro, Gizelle, Camila, Thaty,

Marllon, Roberto e Danila, pela imensa amizade.

Aos meus familiares, em especial, Bárbara, Marlene, Márcia, Maria,

Marília, Mariana, Ildene, Rosilene, Marilene, pelo apoio e incentivo.

Aos amigos que fiz em Campinas, Luana, Renata, Elisa, Carla, Gisele,

Pedro, Ligia, Marcelo, Rômulo, Sol e Marcos.

Aos amigos do LabCrom, Luana, Elisa, Karen, Renata N., Renata

M., Karen, Carla, Daniele, Cristiane,Fernanda, Lucília, Marcelo e

Elias.

Ao CNPq, CAPES e FAPESP, pela bolsa concedida e apoio financeiro.

xi

CURRICULUM VITAE

FORMAÇÃO ACADÊMICA

2008-2012 – Licenciatura Plena em Química, Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sertão Pernambucano, Campus Petrolina, Petrolina-PE.

ATIVIDADES PROFISSIONAIS

2011 - Monitor de físico-química, Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sertão Pernambucano, Campus Petrolina.

2009 – 2010 - Estágio, Embrapa Semiárido, Petronila-PE.

INDICADORES DE PRODUÇÃO CIENTÍFICA

Trabalhos Apresentados em Eventos Nacionais: 6

xiii

Resumo

Preparação de Fases Estacionárias Fluoradas para Cromatografia

Líquida de Alta Eficiência em Fase Reversa

Neste trabalho, prepararam-se fases estacionárias (FE) fluoradas capeadas

para utilização em Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em Fase Reversa

(CLAE-FR). A preparação da FE consistiu na sorção do polímero poli(metil-3,3,3-

trifluorproprilsiloxano) (PMTFS) sobre sílica, tipo B, com tamanho de partícula de 5

μm, seguido de imobilização térmica a 226 oC, por 12 horas e extração com

diclorometano, a fim de eliminar o polímero não aderido ao suporte. A FE

imobilizada, Si(PMTFS), foi submetida à reação de capeamento com

trimetilclorossilano e hexametildissilaxano, para a redução dos grupos silanóis que

não foram recobertos pelo polímero. Testes físico-químicos e cromatográficos

comprovaram a eficiência da imobilização do polímero e do capeamento. O

desempenho cromatográfico da FE fluorada capeada, Si(PMTFS)ec, foi superior

ao da não capeada e os testes de Tanaka e colaboradores demonstraram que o

capeamento diminuiu a atividade silanofílica da FE e aumentou a sua

hidrofobicidade. A FE Si(PMTFS)ec apresentou o mecanismo "U-shape", pois se

observou o aumento da retenção de compostos básicos e polares em altas

porcentagens do modificador orgânico na fase móvel. As FE de Si(PMTFS)ec

apresentaram estabilidade química superior às FE não capeadas, porém, elas

mostraram-se mais instáveis que as FE C8, C18 preparadas no grupo. Embora a

estabilidade química à fase móvel em meio básica seja uma desvantagem, a

mesma possui o mecanismo "U-shape" que pode ser utilizado para aumentar a

retenção dos compostos básicos, sem o uso de condições drásticas de pH, além

de ser uma FE mais apropriada quando se emprega o espectrômetro de massas,

pois a alta concentração de solvente orgânico na fase móvel melhora a ionização

dos analitos, aumentando as suas detectabilidades. A FE Si(PMTFS)ec constitui

em uma alternativa bem sucedida para emprego em CLAE-FR, devido a sua

capacidade em separar vários tipos de compostos.

xv

Abstract

Preparation of a Fluorinated Stationary Phases for Reversed Phase High-

Performance Liquid Chromatography

In this work, end-capped fluorinated stationary phases (SP) for use in High-

Performance Liquid Chromatography on Reversed Phase (RP-HPLC) were

prepared. The preparation of the SP consisted in the sorption of the polymer

poly(methyl-3,3,3-trifluorproprilsiloxane) (PMTFS) onto type B silica, with particle

size of 5 µm, followed by thermal immobilization at 226 °C for 12 h and extraction

with dichloromethane to eliminate the polymer that had not interacted with the

support. The immobilized SP, Si (PMTFS), was subjected to an end-capping

reaction to reduce the silanol groups that were not covered by the polymer.

Physical-chemical and chromatographic tests were conducted to evaluate the

efficiency of the immobilization of the polymer and of the end-capping reaction. The

chromatographic performance of the end-capped fluorinated SP, Si (PMTFS)ec,

was greater than that of the non-end-capped phase. The Tanaka tests showed a

decrease in silanophilic activity and an increase in hydrophobicity. The Si

(PMTFS)ec SP showed a U-shaped mechanism, because of the observed

increase in retention of basic compounds at high percentages of the organic

component in the mobile phase. The Si (PMTFS)ec SP showed superior chemical

stability to non-end-capped SP, however, less stability than C8 and C-18 SP also

prepared by the group. Although chemical stability in alkaline mobile phase is a

disadvantage, it has a "U-shape" mechanism that can be used to increase the

retention of basic compounds without the use of drastic conditions of pH, and is

more appropriate for use with a mass spectrometer. Due to the high concentrations

of organic solvent in the mobile phase the ionization of the analytes is better,

increasing the detectability. The Si (PMTFS)ec SP can be used in RP-HPLC due to

its ability to separate various types of compounds.

xvii

Sumário

Lista de Tabelas .................................................................................................... xxi

Lista de Figuras ................................................................................................... xxiii

1 Introdução ......................................................................................................... 1

1.1 Fases Estacionárias para Cromatografia Líquida ...................................... 2

1.2 Sílica .......................................................................................................... 2

1.3 Fases Estacionárias Quimicamente Ligadas ............................................. 3

1.3.1 Sílica Híbrida ....................................................................................... 5

1.3.2 Óxidos Mistos ...................................................................................... 6

1.3.3 Capeamento ........................................................................................ 6

1.3.4 Fases Poliméricas ............................................................................... 6

1.3.5 Fases Estericamente Protegidas ......................................................... 7

1.3.6 Fases Estacionárias com Grupos Polares Embutidos ......................... 8

1.3.7 Fases Estacionárias Bidentadas.......................................................... 9

1.4 Fases Estacionárias com Polímeros Sorvidos ou Imobilizados ............... 10

1.5 Fases Estacionárias Fluoradas ................................................................ 11

1.5.1 Cromatografia De Fluido Supercrítico ................................................ 15

1.5.2 Cromatografia Líquida Eletrocinética Micelar .................................... 15

1.5.3 Cromatografia de Íons ....................................................................... 16

1.5.4 Cromatografia Líquida Acoplada À Espectrometria De Massas ........ 16

1.6 Avaliação Cromatográfica das Colunas ................................................... 18

2 Objetivo ........................................................................................................... 19

2.1 Objetivos Específicos: .............................................................................. 19

3 Parte Experimental ......................................................................................... 21

3.1 Reagentes ................................................................................................ 21

3.2 Equipamentos .......................................................................................... 23

xviii

3.3 Coluna cromatográfica comercial ............................................................. 24

3.4 Suporte Cromatográfico ........................................................................... 24

3.5 Fase Estacionária Líquida ........................................................................ 25

3.6 Colunas Cromatográficas ......................................................................... 25

3.7 Polimento das colunas ............................................................................. 27

3.8 Preparo das Fases Estacionárias ............................................................ 27

3.8.1 Sorção da Fase Líquida ao Suporte .................................................. 28

3.8.2 Imobilização por Tratamento Térmico ............................................... 28

3.8.3 Extração do Polímero não Imobilizado .............................................. 29

3.8.4 Capeamento ...................................................................................... 30

3.9 Caracterização Físico-Química das Fases Estacionárias ........................ 32

3.9.1 Análise Elementar .............................................................................. 32

3.9.2 Área Superficial Específica, Volume Específico e Diâmetro de Poros

34

3.9.3 Espectrometria de Absorção no Infravermelho .................................. 34

3.9.4 Ressonância Magnética Nuclear de Silício 29 (29Si) ......................... 35

3.10 Enchimento da Coluna ............................................................................. 35

3.10.1 Recheio das colunas com a fase estacionária ................................... 36

3.11 Preparo das Fases Móveis ....................................................................... 38

3.12 Condicionamento das colunas ................................................................. 39

3.13 Avaliação Cromatográfica das Fases Estacionária .................................. 40

3.13.1 Mistura teste de Tanaka70 .................................................................. 41

3.14 Influência da Concentração do Solvente Orgânico na Fase Móvel .......... 44

3.15 Avaliação da Aplicabilidade da Fase Estacionária ................................... 46

3.15.1 Separação de Composto Fluorados .................................................. 47

3.15.2 Separação de agrotóxicos ................................................................. 48

3.15.3 Separação de Fármacos ................................................................... 49

3.16 Avaliação da Estabilidade Química .......................................................... 50

xix

4 Resultados e Discussão ................................................................................. 53

4.1 Caracterização Físico-Química ................................................................ 53

4.1.1 Espectroscopia de absorção no infravermelho .................................. 53

4.1.2 Ressonância Magnética Nuclear de Sílicio 29 ................................... 54

4.1.3 Determinação da área superficial, volume e diâmetro de poros ........ 58

4.1.4 Análise Elementar .............................................................................. 59

4.2 Caracterização Cromatográfica ................................................................ 60

4.2.1 Otimização da composição da fase móvel e da vazão de análise. .... 60

4.2.2 Análise da Mistura Teste 1 e 2 .......................................................... 62

4.2.3 Misturas teste de Tanaka .................................................................. 65

4.3 Influência da Concentração de Solvente Orgânico na Fase móvel .......... 71

4.4 Avaliação da Aplicabilidade da Fase Estacionária Fluorada .................... 76

4.4.1 Compostos Fluorados ........................................................................ 76

4.4.2 Separação de Agrotóxicos ................................................................. 78

4.4.3 Separação de Fármacos ................................................................... 79

4.5 Avaliação da Estabilidade Química da FE Si(PMTFS)ec ......................... 81

5 Conclusão ....................................................................................................... 85

6 Referências Bibliográficas .............................................................................. 87

xxi

Lista de Tabelas

Tabela 1 - Algumas fases estacionárias fluoradas comerciais. (Adaptado da

referência 55) ........................................................................................................ 13

Tabela 2-Características da sílica nua e das FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec. ...... 58

Tabela 3- Análise elementar das FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec ......................... 59

Tabela 4 - Parâmetros cromatográficos obtidos na avaliação da FE Si(PMTFS)ec,

utilizando diferentes composições de fase móvel MeOH:H2O. ............................. 61

Tabela 5 - Parâmetros cromatográficos para os compostos presentes na MT1,

usando a FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec. ............................................................. 63

Tabela 6 - Parâmetros cromatográficos para os compostos presentes na MT2,

usando a FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec. ............................................................. 64

Tabela 7 - Parâmetros obtidos através do teste Tanaka em diferentes colunas. .. 67

Tabela 8- Características físico-químicos dos fármacos estudados, fonte:

DrugBanK77. .......................................................................................................... 72

Tabela 9- Tempo de retenção de alguns fármacos separados usando a FE

Si(PMTFS)ec e variando a porcentagem de acetonitrila de 50 a 90%, em tampão

fosfato a pH 2,7 e 7,6 ............................................................................................ 72

Tabela 10 - Parâmetros cromatográficos obtidos na separação de agrotóxicos

empregando a FE Si(PMTFS)ec. .......................................................................... 79

xxiii

Lista de Figuras

Figura 1 - Tipos de grupos silanóis e ligações siloxano na superfície da sílica

amorfa. .................................................................................................................... 3

Figura 2 - Estruturas presentes em uma típica fase estacionária monomérica

ligada C8 e capeada com o grupo trimetilsilano. (Adaptado da referência 5) ......... 4

Figura 3 - Ilustração da fase estacionária polimerizada verticalmente (A) e da fase

estacionária polimerizada horizontalmente (B). 2 .................................................... 7

Figura 4 - Ilustração da fase estacionária estericamente protegida.2 ...................... 8

Figura 5 - Ilustração da fase estacionária com grupo polar embutido.2 ................... 9

Figura 6 - Ilustração da fase estacionária bidentada.2 ............................................ 9

Figura 7 - Retenção "U-shape" de compostos básicos em fases estacionárias

fluoradas. Adaptado da referência 55 *Conteúdo orgânico da FM ........................ 14

Figura 8 - Estrutura química do polímero poli(metil-3,3,3-trifluropropilsiloxano). .. 25

Figura 9 - Representação esquemática da coluna cromatográfica utilizada no

estudo (a) porcas terminais; (b) redutor de volume; (c) manga com filtro; (d) corpo

da coluna. .............................................................................................................. 26

Figura 10 - Representação esquemática do sistema de polimento desenvolvido no

LabCrom................................................................................................................ 27

Figura 11 - Representação esquemática do sistema de imobilização térmica para a

FE. ......................................................................................................................... 29

Figura 12- Representação esquemática do sistema de extração do excesso de

polímero imobilizado. ............................................................................................ 30

Figura 13 - Sistema para a reação de capeamento da FE Si(PMTFS). ................ 31

Figura 15 - Representação esquemática do sistema de enchimento de coluna. .. 36

Figura 16 - Estruturas químicas dos compostos presentes na MT1. ..................... 40

Figura 17 - Estruturas químicas dos compostos presentes na MT2. ..................... 41

Figura 18 - Estruturas químicas dos compostos presentes na Mistura A de Tanaka.

.............................................................................................................................. 42

xxiv

Figura 19 - Estruturas químicas dos compostos presentes na Misutra B de Tanaka.

.............................................................................................................................. 43

Figura 20 - Estruturas químicas dos compostos presentes na Mistura teste C e D

de Tanaka. ............................................................................................................ 44

Figura 21 - Estruturas químicas dos compostos estudados para verificar o

mecanismo "U-shape" na FE Si(PMTFS)ec. ......................................................... 46

Figura 22- Estrutura química dos compostos fluorados estudados. ...................... 48

Figura 23 - Estruturas químicas dos agrotóxicos estudados. ................................ 49

Figura 24 - Estruturas químicas dos fármacos estudados. ................................... 50

Figura 25 - Espectros de absorção na região do infravermelho da sílica pura (SiO2)

e das FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec. ................................................................... 54

Figura 26 - Nomenclatura e deslocamentos químicos das espécies de silício por

RMN de 29Si. ......................................................................................................... 55

Figura 27 - Espectros de RMN de 29Si para a sílica pura e para as fases

estacionárias Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec. ............................................................ 57

Figura 28 - Representação da curva de van Deemter, para a fase estacionária

Si(PMTFS)ec. ........................................................................................................ 62

Figura 29 - Cromatogramas obtidos nas separações da mistura teste A de Tanaka

usando as FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec. Condições cromatográficas: volume de

injeção 5 µL, Fase móvel: MeOH:H2O 80:20 (v/v), vazão: 0,300 mL min-1, detecção

UV: 254 nm e temperatura de 40°C. Identificação dos picos (A): 1 - uracila, 2- o-

terfenil, 3 - trifenileno, 4 -butilbenzeno, 5 - pentilbenzeno. .................................... 66

Figura 30 - Cromatogramas obtidos nas separações da mistura teste B de Tanaka,

usando as FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec. Condições cromatográficas: volume de

injeção 5 µL, Fase móvel: MeOH:H2O 30:70 (v/v), vazão: 0,300 mL min-1, detecção

UV: 254 nm e temperatura de 40°C. Identificação dos picos : 1 - uracila, 2 - fenol,

3 - cafeína. ............................................................................................................ 68

Figura 31 - Cromatogramas obtidos nas separações da mistura teste C (pH 2,7) de

Tanaka, usando as FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec. Condições cromatográficas:

volume de injeção 5 µL, Fase móvel: MeOH:10 mmol L-1 KH2PO4/H3PO4 30:70

(v/v); vazão: 0,300 mL min-1, detecção UV: 254 nm e temperatura de 40°C.

Identificação dos picos (A): 1 - uracila, 2 -benzilamina, 3 -fenol............................ 69

xxv

Figura 32 - Cromatogramas obtidos nas separações da mistura teste D (pH 7,6)

de Tanaka para as FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec. Condições

Cromatográficas:volume de injeção 5 µL, Fase móvel: MeOH:10 mM

KH2PO4/K2HPO4 30:70 (v/v), vazão: 0,300 mL min-1, detecção UV: 254 nm e

temperatura de 40°C. Identificação dos picos (A): 1 - uracila, 2 - fenol, 3 -

benzilamina. .......................................................................................................... 70

Figura 33 - Gráfico do tempo de retenção dos compostos ácidos, levofloxacina,

bromazepam e diazepam, em função da concentração de solvente orgânico, a pH

2,7 ......................................................................................................................... 73

Figura 34 - Gráfico do tempo de retenção dos compostos ácidos, levofloxacina,

bromazepam e diazepam, em função da concentração de solvente orgânico, a pH

7,6 ......................................................................................................................... 74

Figura 35 - Gráfico do tempo de retenção dos compostos básicos amitriptilina,

nortriptilina e fluoxetina, em função da concentração de solvente orgânico, a pH

2,7 ......................................................................................................................... 75

Figura 36 - Gráfico do tempo de retenção dos compostos básicos amitriptilina,

nortriptilina e fluoxetina, em função da concentração de solvente orgânico, a pH

7,6 ......................................................................................................................... 76

Figura 37 – Cromatogramas obtidos nas separações de difluorfenóis utilizando

colunas diferentes: A) coluna de dimensões (60 mm x 3,1 mm d.i) recheada com a

FE Si(PMTFS) adaptado da referência 49; B) coluna de dimensões (60 mm x 3,9

mm d.i) recheada com a FE Si(PMTFS)ec. Condições cromatográficas: fase

móvel: A) ACN:H2O 20:80 (v/v) B) MeOH:H2O 35:65 (v/v), volume de injeção: 5µL,

vazão: 0,300 mL min-1, temperatura ambiente e detecção UV: 254 nm.

Identificação dos picos: 1 - 2,6-difluorfenol, 2 - 2,4-difluorfenol, 3 - 2,3-difluorfenol,

4 - 3,4-difluorfenol, 5 - 3,5-difluorfenol, *- impureza. ............................................ 77

Figura 38 - Cromatogramas obtidos nas separações de agrotóxicos usando

colunas diferentes: A) Si(PMTFS)ec dimensões (60 mm x 3,9 mm d.i) e B) C18

Nova Pak (150 mm x 4,6 mm d.i). Condições cromatográficas: fase móvel:

MeOH:H2O 45:55 v/v, volume de injeção: 5µL, vazão: 0,300 mL min-1, detecção

UV: 254 nm e temperatura ambiente. Identificação dos picos: 1- imazaquim, 2-

carboxim, 3- atrazina, 4-diurom, 5- linurom. .......................................................... 78

Figura 39 - Cromatogramas obtidos na separação de uma mistura de fármacos

usando colunas diferentes: A) Si(PMTFS)ec dimensões (60 mm x 3,9 mm d.i) e B)

C18 Nova Pak (150 mm x 4,6 mm d.i). Condições cromatográficas: fase móvel

MeOH:tampão formiato pH=3,0 55:45(v/v), volume de injeção: 5µL, vazão: 0,300

xxvi

mL min-1 , detecção UV: 254 nm e temperatura ambiente. Identificação dos picos:

1 - bromazepam, 2 - alprozalam, 3 - lorazepam, 4 - diazepam. ............................ 80

Figura 40 - Variação da porcentagem de eficiência do acenafteno obtida para a

FE Si(PMTFS)ec em função da passagem de fase móvel metanol: 50 mmol L-1

K2CO/KHCO3 a pH 10,0 (50:50 v/v); vazão de 1,0 mL min-1, temperatura de 50 ºC

e detecção a 254 nm. ............................................................................................ 82

Figura 41 - Variação do fator de retenção (k) do acenafteno obtido para a FE

Si(PMTFS)ec em função da passagem de fase móvel metanol: 50 mmol L-1

K2CO/KHCO3 a pH 10,0 (50:50 v/v); vazão de 1,0 mL min-1 temperatura de 50 ºC e

detecção a 254 nm. ............................................................................................... 83

Figura 42 - Variação do fator de assimetria (As10%) do acenafteno obtido para a FE

Si(PMTFS)ec em função da passagem de fase móvel metanol: 50 mmol L-1

K2CO/KHCO3 a pH 10,0 (50:50 v/v); vazão de 1,0 mL min-1 temperatura de 50 ºC e

detecção a 254 nm. ............................................................................................... 84

1

1 Introdução

As fases estacionárias (FE) para cromatografia líquida de alta eficiência

(CLAE), em sua maioria, consistem de um suporte sólido, no qual se deposita um

líquido estacionário. Dependendo da polaridade do líquido estacionário, polar ou

apolar, têm-se, respectivamente, as FE normal e reversa. As colunas recheadas

com FE reversas são mais vantajosas, pois requerem o uso de fase móvel (FM)

menos tóxica e de menor custo, constituídas de uma mistura de solvente orgânico

e água, essas FE estabelecem um rápido equilíbrio químico após a mudança de

solvente, apresentam boa reprodutibilidade de tempo de retenção, possibilitam o

uso de eluição por gradiente, além de oferecerem uma série de colunas com

diversas seletividades. 1,2

A cromatografia líquida que utiliza colunas recheadas com fase estacionária

reversa é denominada de cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa

(CLAE-FR) e é considerada, entre as técnicas de separação, uma das mais

importantes, principalmente, para identificação e quantificação de compostos em

diversos tipos de amostras. A aplicação da CLAE-FR tem crescido de forma

contínua, nas seguintes áreas: indústria farmacêutica, medicina, alimentos,

polímeros sintéticos, meio ambiente, etc. 1,2

Cerca de 70% dos fármacos disponíveis no mercado apresentam caráter

básico e, comumente, são analisados porCLAE-FR. No entanto, alguns problemas

ocorrem na separação desses compostos que estão associados com a superfície

da FE. Na maioria das vezes, a FE em CLAE-FR é obtida através da modificação

da superfície da sílica com moléculas apolares por meio de uma reação química,

originando as fases estacionárias quimicamente ligadas (FEQL). No entanto,

somente 50% dos grupos reativos da sílica podem ser funcionalizados. Esses

grupos apresentam caráter ácido, o que leva os compostosbásicosa

interagiremfortemente por forças eletrostáticas, ocasionando picos largos e com

2

cauda. Em casos extremos, essa interação pode ser irreversível, acarretando a

deterioração da coluna.1–5

Diante dessa problemática, pesquisas no desenvolvimento de novas FE são

impulsionadas para remediar as desvantagens relacionadas às FE para CLAE-FR.

1.1 Fases Estacionáriaspara Cromatografia Líquida

Durante muitas décadas, a cromatografia líquida foi praticada utilizando

fases estacionárias mais polares e fases móveis menos polares, ou seja, a

cromatografia líquida por adsorção. Contudo, para separação de compostos de

média polaridade a apolares foi necessário o uso de fases estacionárias menos

polares e fases móveis mais polares, o que levou ao desenvolvimento da

cromatografia líquida de partição (líquido-líquido), na qual a FE é constituída de

um suporte sólido recoberto fisicamente com um filme líquido, apolar ou polar

originando a FE mecanicamente sorvida.As FE mecanicamente adsorvidas

mostraram-se ineficientes para o uso em CLAE, pois a FE sorvida era facilmente

lixiviada com a passagem da fase móvel. Esse fato impediu a obtenção de

análises reprodutíveis ou a separação de misturas complexas utilizando o modo

de eluição por gradiente.Essas restrições levaram ao desenvolvimento de fases

estacionárias mais estáveis, em que os grupos funcionais encontravam-se ligados

covalentemente sobre o suporte cromatográfico, quegeralmente é a sílica.2,6

1.2 Sílica

A sílica é o suporte cromatográfico mais utilizando em CLAE-FR, devido às

suas características favoráveis.Segundo Unger7o suporte cromatográficoideal

deve apresentar as seguintes características:as partículas do suporte devem ter

uma faixa estreita de distribuição de tamanho e elevada área superficial; os poros

3

devem ter tamanhos adequados para o analito e também boa conectividade para

permitir uma rápida taxa de transferência de massa; deve resistir termicamente,

mecanicamente e quimicamente à degradação, possuir uma superfície que seja

tanto energeticamente homogênea quanto quimicamente modificável e exibir o

mínimo de inchaço.

A sílica reúne a maioria das características descritas anteriormente, ela é

amplamente empregada, principalmente,devido a sua alta reatividade proveniente

dos grupos silanóis presentes na sua superfície.8–10

A superfície da sílica consiste de uma rede de grupos silanóis, alguns dos

quais podem formar grupos siloxanos ou ligações de hidrogênio entre si ou com a

água. A Figura 1 apresenta os grupos funcionais presentes na superfície da sílica.

Si

OO

O

OH

Isolado

Si

OO

O

OH

Si

O

O

OH

Vicinal

Si

OO

O O

H

H

Geminal

SiO

O O

O

Si

O O

O

Ligação siloxano

Figura 1 - Tipos de grupos silanóis e ligações siloxano na superfície da sílica amorfa.

Existem algumas restrições que a impedem de ser um suporte

cromatográfico perfeito, comoa baixa estabilidade química e térmica.

1.3 Fases Estacionárias Quimicamente Ligadas

AsFEQL, geralmente, são obtidas através da reação de silanização, nesse

método os reagentes silanos são ligados aos silanóis da superfície da sílica,

resultando em FE com ligações do tipo siloxanos(≡Si-O-Si-C≡).11

4

O agente silano pode ser mono, bi ou trifuncional edependendo da sua

funcionalidade e do método de preparação são obtidos as FE monoméricas ou

poliméricas. As FE clássicas para CLAE-FR geralmente são monoméricas e para

adquirir essas FE, os reagentes monofuncionais, bifuncionais ou trifuncionais são

utilizados na ausência de água.12

A concentração de silanóis na superfície da sílica nua é relatada em 8,0

µmol m-2.10Durante a modificação do suporte, somente cerca de 4 a 4,5 µmol m-2

dos silanóis reagem com os grupos funcionais.Esse fatoestá associado ao

tamanho dos grupos modificadores que sofrem impedimento estérico (Figura2).13

Figura 2-Estruturas presentes em uma típica fase estacionária monomérica ligada C8 e

capeada com o grupo trimetilsilano.(Adaptado da referência 5)

Os grupos silanóis que não reagiram durante a funcionalização do suporte,

denominados de silanóis residuais, interagem fortemente com os solutos básicos

(atividade silanofílica) devido ao caráter ácido da sílica, segundo a reação

química:

BH+SiO- SiO-BH+

5

Essa interação interfere na retenção dos compostos básicos, além de gerar

picos largos e com caudas.14 Uma forma de impedir a retenção dos compostos

básicos (BH+) é através da manipulação de pH do componente aquoso da FM,

que controla a ionização da sílica e do analito.

O pKa médio dos grupos silanóis é ao redor de 7, a supressão iônica dos

silanóis e a dissociação deles podem ser controladas utilizando tampões

inorgânicos ou orgânicos. A faixa de pH segura para trabalhoé entre 2,5 a 7,5 para

colunas típicas de CLAE-FR. Abaixo de pH 2, há a hidrólise da ligação Si-C,

ocorrendo a clivagem da fase orgânica ancorada sobre suporte cromatográfico.

Acima de pH 8, a dissolução da sílica é acelerada, resultando na perda do

suporte. 1,2,6,11

Para contornar o problema dos silanóis residuais e a baixa estabilidade

química da sílica, algumas sugestões são apresentadas, como o uso de partículas

híbridas e óxidos mistos que conferem ao suporte cromatográfico maior

resistência química, o uso de algumas alternativas para preparação de FE a fim de

aumentar a estabilidade e/ou reduzir a interação analito-silanol. Essas propostas

serão descritas a seguir.

1.3.1 Sílica Híbrida

A sílica híbrida, como próprio nome sugere, reúne em um único material,as

características favoráveis de dois materiais. Essa partícula contém grupos metil e

etileno incorporados na estrutura da sílica. A presença desses grupos confere

maior estabilidade química e redução das interações indesejáveis com os silanóis

residuais. No entanto, a diminuição dos grupos silanóis sobre a superfície da sílica

indica que há uma menor quantidade de grupos reativos responsáveis pelo

ancoramento dos grupos funcionais, resultando em uma menor densidade de

grupos orgânicos substituintes. 8,15,16,17

6

1.3.2 Óxidos Mistos

Nesses suportes cromatográficos, tem-se a combinação das propriedades

ótimas da sílica, como alta área superficial, faixa estreita de distribuição de

partículas e tamanho de poro adequado, com a alta estabilidade química e térmica

dos óxidos metálicos. As FE desenvolvidas sobre sílica metalizadas apresentam

estabilidade química superior às obtidas sobre sílica nua. No entanto, é valido

destacar que a introdução de metais no suporte aumenta seu caráter ácido,

promovendo maior interação com compostos básicos.2,18–24

1.3.3 Capeamento

É uma etapa subsequente ao processo de funcionalização da sílica.

Consiste na inserção de grupos menores como o trimetilsilano, utilizando

reagentes apropriados, como o trimetilclorossilano (TMCS) e/ou o

hexametildissilazano (HMDS). Através desse procedimento ocorre a redução dos

grupos silanóis residuais, aumentando o tempo de vida da FE e melhorando seu

desempenho cromatográfico. No entanto, parte dos silanóis residuais permanece

sem reagir.24–26

1.3.4 Fases Poliméricas

Uma alternativa para a preparação das fases estacionárias é a

polimerização vertical (Figura 3A), que consiste na ligação química de um agente

silano bifuncional (ou trifuncional) com os grupos silanóis na presença de água.

Essas FE apresentam alta resistência em meio ácido e básico. Contudo, a

presença de água leva a uma reação de entrecruzamento incontrolável, o que

7

confere pouca reprodutibilidade no preparo da FE. Para melhorar a

reprodutibilidade das fases poliméricas, as fases estacionárias com polimerização

horizontal foram desenvolvidas (Figura 3B). O método consiste em ligar sobre as

partículas de sílica uma monocamada auto-organizada de agentes silanos

trifuncionais de cadeia longas (C8, C18) e curtas (C1). Através desse método se

obtem uma FE de alta estabilidade química. No entanto, não há dados na

literatura relativos à sua reprodutibilidade. 2,6,27

(A)

(B)

Figura 3 - Ilustração da fase estacionária polimerizada verticalmente (A) e da fase estacionária polimerizada horizontalmente (B). 2

1.3.5 Fases Estericamente Protegidas

Nas fases estacionárias estericamente protegidas (Figura 4), o agente

silano contém um grupo alquil de cadeia longa (C8,C18) e dois grupos volumosos

(isopropil ou terc-butil). Esses grupos volumososimpedem o acesso de analitos

básico aos grupos silanóis. Todavia, a presença de grupos volumosos dos

agentes silanos prejudica a formação de uma cobertura densa sobre o suporte,

sendo esse recobrimento inferior às FEQL convencionais.28,29

8

Figura 4 - Ilustração da fase estacionária estericamente protegida.2

1.3.6 Fases Estacionárias com Grupos Polares Embutidos

Neste tipo de fase estacionária (Figura 5), o agentealquilsilano apresenta

um grupo polar embutido (GPE), como amida, carbamato, uréia, tiocarbamato,

inserido no terceiro grupo metila da cadeia alquila.Esse tipo de FE mantém o

caráter de FE em modo reverso, mas apresenta seletividade diferenciada àquelas

FE puramente alifáticas, além de diminuir a interação analito-silanol.

Basicamente quatro mecanismos são propostos para explicar a baixa

interação entre os solutos básicos e os silanóis residuais: há uma interação

preferencial dos analitos com os GPE; os silanóis residuais e o GPE interagem por

ligação de hidrogênio, bloqueando o acesso do composto aos grupos silanóis

residuais; forma-se uma camada de água sobre a superfície do GPE, em que o

analito, preferencialmente, interage com “FE encharcada”e, ocorre interação, por

ligação de hidrogênio, entre os GPE de cadeias adjacentes, blindando o

acessodos analitos aos grupos silanóis.2,26,28

9

Figura 5 - Ilustração da fase estacionária com grupo polar embutido.2

1.3.7 Fases Estacionárias Bidentadas

São usualmente preparadas através de uma reação química em que dois

grupos silanóis são ligados a um agente silano que contém dois grupos C18

ligados a dois átomos de silício separados por um grupo propil (Figura 6). Esse

tipo de fase restringe o acesso de solutos básicos aos grupos silanóis, além de

aumentar sua estabilidade química, permitindo o uso de fase móvel a pH 11.

Entretanto, esse tipo de fase ligada com grupos volumosos, apresenta baixo

recobrimento da camada orgânica decorrente do impedimento estérico.2,28–30

Figura 6 - Ilustração da fase estacionária bidentada.2

10

De um modo geral, muitas das propostas apresentadas anteriormente ainda

apresentaram baixo recobrimento do silanóis residuais.

1.4 Fases Estacionárias com Polímeros Sorvidos ou Imobilizados

Uma alternativa para se obterfases estacionárias para CLAE-FR é através

do recobrimento da superfície da sílica com polímeros orgânicos pré-sintetizados

sobre a superfície da sílica.31–33Esse método demonstra-se atrativo, devido à suas

inúmeras vantagens em relação as FE convencionais, como:2,34

Melhora a proteção dos silanóis residuais ou sítios ácidos de Lewis

(presentes em suportes baseados em sílica, zircônia, titânia ou alumina);

Minimização das interações por troca iônica com alguns solutos;

Proteção mais eficiente do suporte frente à fase móvel em meio básico;

Fácil preparação;

Há uma variedade de polímeros com distintas seletividades para as

diversas modalidades da cromatografia (fase reversa, troca iônica,

quiral,fase normal, exclusão por tamanho, afinidade e cromatografia de

interação hidrofílica).

As FE com determinado polímero imobilizado sobre um suporte

cromatográfico são, normalmente, preparadas de duas formas: através da

sorção/imobilização do polímero pré-sintetizado ou pela polimerização in situ do

monômero sobre o suporte.35

Como resultado desses métodos, o polímero depositado sobre a superfície

da sílica pode formar uma fina camada ou/e preencher completamente o volume

dos poros. Em ambos os casos, o polímero pode estar recobrindo as paredes dos

11

poros (por adsorção) sem entrecruzamento entre as cadeias do polímero ou, em

condições apropriadas, a cadeia polimérica pode também formar umacamada

grossa entrecruzada sem ligação química. As cadeias do polímero ainda podem

se ligar quimicamente às paredes dos poros.2

O grupo de pesquisa do LabCrom, (Laboratório de Pesquisas em

Cromatografia Líquida) do Instituto de Química da Unicamp, vem, há mais de

25anos,dando atenção às FE recobertas com polissiloxanos, sendo que já foram

estudados vários métodos de imobilização, bem como polímeros de

seletividadedistintas. Dentre os métodos de imobilização estudados têm-se: a

imobilização por tratamento térmico (TT)21,24,36–38, por radiação micro-ondas

(RM)37,39–41 e por radiação gama(RG)32,42–44.

Entre os polímeros estudados, têm-se o poli(metiloctilsiloxano)

(PMOS)36,37,43, poli(dimetilsiloxano)(PDMS)45,46, poli(metiloctadecilsiloxano)

(PMODS)45, poli(metiltetradecilsiloxano) (PMTDS)47, poli(metilfenilsiloxano)

(PMPS)48,o copolímero dimetil-(48-52%)fenilmetil(52-48%)siloxano49, o poli(3,3,3-

metiltrifluorpropilsiloxano) (PMTFS)50,51 e o polibutadieno (PBD)44.

Neste trabalho estudou-se a fase estacionária fluorada(PMTFS) devido às

suas propriedades únicas conforme descrito a seguir. O intuito desse estudo foi

aprimorar o desempenho cromatográfico da FE, bem como sua estabilidade

química.

1.5 Fases Estacionárias Fluoradas

Os compostos organofluorados apresentam propriedades únicas, em

virtude da presença dos átomos de flúor. Suas propriedades são governadas pela

alta eletronegatividade e baixa polarizabilidade do flúor, o que confere um caráter

mais iônico na ligação C-F, em baixo conteúdo de flúor na cadeia. Dessa

maneira, os compostos organofluorados oferecem maior estabilidade térmica

12

equímica, além de elevada lipo e hidrofobicidade. Algumas dessas propriedades

são exploradas no desenvolvimento de fases estacionárias fluoradas, uma vez

que oferecem muitas vantagens comparadas às FE convencionais C8 e C18.52–54

Desde a sua introdução na década de 1980, as pesquisas com fases

fluoradas foram direcionadas como alternativas de seletividade e retenção na

modalidade da cromatografia em fase reversa. No mercado, já existe um número

significativo de FE fluoradas disponíveis(Tabela 1).Essas fases, geralmente,

contém um grupo pentafluorfenil ou uma cadeia alquila fluorada de tamanhos

diferentes.55 Algumas das principais diferenças entre as fases fluoradas e não

fluoradas foram observadas, como:55–63:

1. Os hidrocarbonetos apresentam baixa retenção em FE fluoradas;

2. Compostos fluorados exibem maior retenção em FE fluoradas do que em

FE não fluoradas;

3. Uma mistura de compostos fluorados pode ser separada em uma fase

fluorada, de acordo com o conteúdo de flúor da FE;

4. Misturas contendo compostos fluorados e não fluorados podem ser

resolvidas em fase fluorada;

5. Alto conteúdo de solvente orgânico na fase móvel pode aumentar a

retenção de muitos compostos polares e básicos;

6. Fases fluoradas melhoram o desempenho de muitas técnicas

cromatográficas incluindo a Cromatografia de Convergência, Cromatografia

Líquida Micelar, Cromatografia de Íons, Eletrocromatografia e

Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas;

13

Tabela 1- Algumas fases estacionárias fluoradas comerciais. (Adaptado da referência 55)

Marca Fornecedor Fase Ligada Tamanho de Partícula

Fluorflash FTI C8F17 5

FluorSep-RP Octyl ES C8F17 5

Fluofix Wako C6F13-ramificada 5

Thermo

5

Fluophase RP/WP Thermo C6F13 5

Tridecafluoro Silicycle C6F5 3,5

FluorSep-RP Phenyl ES

3,5

Fluophase PFP Thermo

5

Discovery F5 HS Supelco

3,5

PentaFluorphenyl Silicycle

FluoroSep-RP Propyl ES C3F7 5

Fluorchrom Silicycle Não especificado 3,5

As diferenças entre as FE fluoradas e não fluoradas indicam que o

mecanismo de separação para as FE fluoradas não ocorre por interação simples

como na modalidade em fase reversa.55Os mecanismos que regem as separações

nas FE fluoradas ainda não foram claramente definidos, entretanto, muitos deles

têm sido propostos e alguns serão descritos a seguir.26

Os compostos fluorados são preferencialmente retidos em colunas

fluoradas, em comparação com as colunas alquila. Esse comportamento é muitas

vezes atribuído à intensidade do momento dipolo da ligação C-F ou/e à baixa

polarizabilidade do átomo de flúor. A seletividade das colunas fluoradas

comparada com a das colunas alquila pode ser explicada, pelo menos em parte,

como consequência da baixa polarizabilidade do ligante flúor. Menor

polarizabilidade indica interações via forças dispersivas reduzidas, que mostra

como consequênciaa baixa retenção de composto apolares e maior retenção de

compostos fluorados.64

As fases fluoradas têm um perfil de retenção denominado “U-shape” (Figura

7). Na parte esquerda do gráfico os solutos básicos decrescem sua retenção como

14

o aumento do conteúdo orgânico (metanol ou acetonitrila) na fase móvel, segundo

comportamento típico em fase reversa. Contudo, depois do ponto mínimo do

gráfico, os compostosbásicosaumentam a sua retenção com o aumento do

conteúdo de solvente (80-90%) na fase móvel, fazendo com quea retenção na

parte direita do gráfico seja similar a de fase normal. Esse mecanismo ainda está

sob investigação. Uma possível explicação é que, quando a fase móvelpossui alta

concentração de solvente orgânico, a fase estacionária fluorada torna-sesolvatada

e os silanóis residuais ficam mais disponíveis para interagirem com os compostos

básicos por troca iônica. Esse mecanismo mostra-se favorável quando se

empregam detectores como espectrômetros de massas, pois o aumento da

porcentagem de solvente orgânico na fase móvel facilita a ionização dos

compostos.26

Figura 7 - Retenção "U-shape" de compostos básicos em fases estacionárias fluoradas. Adaptado da referência 55 *Conteúdo orgânico da FM

Essa nova classe de fases estacionárias permite aplicações em outros

modos da cromatografia líquida (CL), como cromatografia de fluido supercrítico,

CL micelar, cromatografia de íons e CL acoplada à espectrometria de massa.

15

1.5.1 Cromatografia De Fluido Supercrítico

É uma boa substituição à cromatografia líquida em fase normal,

especialmente para separação de compostos polares. Essa modalidade apresenta

várias vantagens em comparação ao modo normal, como, não utiliza solventes de

alta toxicidade (hexano, clorofórmio, etc.), proporciona separação rápida com alta

eficiência e tempo de reequilíbrio curto. O solvente usado nessa modalidade é

diferente do da CL, no qual se utiliza o fluido supercrítico, um fluido denso que se

situa acima da temperatura e pressão crítica e apresenta caraterísticas

intermediárias entre a fase líquida e gasosa.65

Um trabalho publicado pelo grupo de Lee66demostrou a eficiência das

colunas fluoradas, pois a mesma foi capaz de separar 80 componentes de uma

mistura em comparação a coluna C18.

1.5.2 Cromatografia Líquida Eletrocinética Micelar

É uma excelente alternativa para cromatografia de par iônico e para solutos

iônicos.67 Essa modalidade apresenta várias vantagens, incluindo separação

simultânea de compostos iônicos e não iônicos com retenções reprodutíveis e

previsíveis. No entanto, quando comparado com cromatográfica líquida em modo

reverso, existem algumas desvantagens: (1) os compostos hidrofóbicos

apresentam retenção excessiva devido ao poder de eluição fraco da fase móvel

micelar quando se usam fases estacionárias com poros convencionais; (2)

eficiências reduzidas, devido a baixa transferência de massa ou ao fluxo

anisotrópico.

Com o usou de fases estacionárias fluoradas nesse modo, foi observado a

redução do tempo de retenção de aminoácidos e de pequenos peptídeos e maior

retenção de sulfonamidas.68

16

1.5.3 Cromatografia de Íons

Essa técnica é utilizada para análise de componentes aniônicos e

catiônicos.Ela é especialmente empregada na análise de amostras ambientais de

água para determinar íons comuns como F-, Cl-, Br-, I-, NO3-, SO4

2- e HPO42-.

Colunas C18 de modo reverso e carbono grafitizado recoberto com

cetiltrimetilamônio são as principais colunas usadas para cromatografia de íons.

Para análise desses ânions, muitas vezes, se utiliza um surfactante catiônico.

Dessa forma, o grupo de pesquisa de Helaleh desenvolveu um método que

emprega coluna C18 recoberta com um surfactante aniônico com conteúdo

fluorado. Como resultado, obtive-se boa reprodutibilidade e bons limites de

detecção.55

1.5.4 Cromatografia Líquida Acoplada À Espectrometria De

Massas

Nas últimas décadas, essa técnica se tornou uma ferramenta importante na

análise de rotina em laboratórios de diversos campos da ciência. Na análise de

compostos farmacêuticos, em que 70% dos mesmos são básicos, utilizando CL

em modo reverso, ocorrem interações indesejáveis com os silanóis residuais.

Para solucionar tal problema, emprega-se a supressão iônica, utilizando tampões

ou aumentando o conteúdo aquoso da fase móvel para aumentar a retenção dos

compostos básicos. Esses métodos nãos são compatíveis com um espectrômetro

de massas, podendo danificá-lo ou diminuir o limite de detecção do mesmo. 69

A descoberta da retenção “U-shape” para compostos polares e básicos em

fases estacionárias fluoradas tem sido uma solução ideal, pois a alta concentração

de solvente orgânico na fase móvel, aumenta a retenção desses compostos, além

de facilitar na ionização dos mesmos.55

17

O grupo de pesquisa de cromatografia líquida do LabCrom, desenvolveu FE

baseadas em polímeros de diferentes seletividades, inclusive polímeros fluorados,

estudados por Maldaner e Jardim50,51.

O polímero utilizado no presente estudo foi o poli(metil-3,3,3-

trifluorproprilsiloxano) (PMTFS), o mesmo usado no trabalho deMaldaner e

Jardim50,51que empregaram o tratamento térmico (TT) e a radiação micro-ondas

(RM) como procedimentos de imobilização. Para a FE Si-(PMTFS)TTas condições

de imobilização otimizadas foram de 10 horas a 220 °C, enquanto que para

Si(PMTFS)RM foram 50 min a 126 °C, 91,7% mais rápido. Contudo, quando se

usa a potência RM, para a imobilização, é necessária uma etapa adicional de seis

dias para descanso da FE pós-imobilização. Os dois modos de preparo

apresentaram boas eficiências e fatores de assimetria adequados para o

naftaleno, acetonafteno e N,N-dimetilanilina.

Testes cromatográficos, como o de Tanaka e colaboradores70 são usados

para avaliar a hidrofobicidade da FE, a capacidade de diferenciar compostos

apenas pelo seu grupo metila e sua configuração espacial, sua disposição de

interagir por ligação de hidrogênio e capacidade de fazer troca iônica em pH ácido

ou alcalino. As FE Si(PMTFS)TT e Si(PMTFS)RM se mostraram capazes de

separar alquilbenzenosque se diferenciavam entre eles apenas pelo grupo metila

e pela sua configuração espacial, mas evidenciou interações de hidrogênio e troca

iônica em pH básico. Esses resultados comprovam que não houve um

recobrimento adequado do suporte cromatográfico, isto é, os grupos silanóis

residuais interagiram fortemente durante a avaliação destes testes. Outro

problema que a FE apresentou foi a sua baixa resistência química frente a FM

com pH acima de 8. Uma boa alternativa para remediar esses problemas é fazer a

reação de capeamento.

18

1.6 Avaliação Cromatográfica das Colunas

Com a quantidade expressiva de colunas cromatográficas com

seletividades e tamanho de partículas diferentes, há dificuldade na escolha de

uma coluna ideal para determinada aplicação. Dessa forma, utiliza-se um conjunto

de artifícios para caracterizar ascolunas, a fim de obtereminformações mais

apuradas sobre o comportamento cromatográfico da mesma frente a diversas

condições e classes de analitos.

Segundo Neue et al.60, existem, no mínimo, 3 atributos das FE para CLAE-FR que

são relevantes para as propriedades de retenção: a hidrofobicidade, a seletividade

estérica e a atividade silanofílica. Através da caracterização cromatográfica é

possível adquirir informações sobre as interações físico-químicas discretas entre

os compostos em análise e a FE. A caracterização cromatográfica pode ser obtida

a partir da avaliação de parâmetros cromatográficos como71: fator de retenção (k),

eficiência da coluna (Pratos/metros), fator de assimetria a 10% da altura do pico

(As) e resolução (Rs), calculados após a análise cromatográfica dediversos tipos

de misturas teste como a de Tanaka e colaboradores70.

19

2 Objetivo

O objetivo desse trabalho foi preparar fases estacionárias fluoradas com

bom desempenho cromatográfico e estabilidade química. Para atingir este objetivo

após o preparo da fase Si(PMTFS) imobilizadas por tratamento térmico submeteu-

aà reação de capeamento, obtendo a FE Si(PMTFS)ec.

2.1 Objetivos Específicos:

Caracterizar físico e quimicamente as FE para comprovar a eficiência da

imobilização e da reação de capeamento;

Caracterizar cromatograficamente as FE capeadas e não capeadas, a fim

de obterem dados relativos aos benefícios do capeamento;

Verificar a presença do mecanismo U-shape na FE Si(PMTFS)ec;

Avaliar a aplicabilidade da FE Si(PMTFS)ec em separar classes distintas de

compostos, como fluorados, agrotóxicos e fármacos;

Avaliar a estabilidade química da FE Si(PMTFS)ec frente a FM em meio

básico.

21

3 Parte Experimental

3.1 Reagentes

2,3-difluorfenol, 95%, Aldrich


2,6-difluorfenol , 95%, Aldrich



Acenafteno, 99%, Aldrich

Acetofenona, 99%, Vetec

Acetonitrila, grau HPLC, Tedia

Ácido fosfórico, 85%, Nuclear

Ácido nítrico p.a., Synth

Água deionizada, Mili-Q, Milipore

Alprazolam, adquirido da Medley

Amitriptilina 99%, Aldrich

Atrazina, 97,7% adquirido da Novartis

Benzeno p.a., Synth

Benzilamina, 99%, Merck

Benzonitrila, Riedel-de Haen

Bicarbonato de sódio, 99%, Ecibra

Bromazepam, adquirido da Medley

Butilbenzeno, 98%, Merck

Cafeína, 100% USP, Aldrich

22

Carboxim, 99,0% adquirido da BASF

Cianazina,98%, adquirido da Cyanamid

Diazepam, adquirido da Medley

Diclorometano p.a., Tedia

Diurom, 99,3%, adquirido da Du Pont

Etilbenzeno, Merck

Fenol, 99%, Aldrich

Fluoxetina, adquirido da Medley

Fosfato de dipotássio dibásico anidro, 99%, Synth

Fosfato de potássio monobásico anidro, 99%, Synth

Hexametildissilazano, 99%, Aldrich

Hexano, grau HPLC, Tedia

Hidróxido de sódio, 97%, Ecibra

Imazaquim, 99,4% ChemService

Isopropanol p.a. Tedia

Levofloxacina, adquirido da Medley

Linurom, 99,5%, adquirido da Hoescht

Lorazepam, adquirido da Medley

Metanol grau HPLC, Tedia

N,N-dimetilanilina, 98%, Fluka

Naftanelo, reagente puro Carlo Erba

Nortriptilina, 98%, Sigma

O-terfenila, 995, Merck

Pentilbenzeno, 98%, Merck

23

Propilbenzeno, 98%, Aldrich

Tetraidrofurado, grau HPLC, Tedia

Tolueno p.a., Merk

Trifenileno, 98%, Fluka

Trimetilclorossilano, 98%, Aldrich

Uracila, 98%, Aldrich

3.2 Equipamentos

Agitador magnético, Corning modelo PC351

Agitador roto-torque, Cole-Parmer modelo 7637-01

Agitador Vórtex, Phoenix modelo AP56

Analisador elementar, Perkin-Elmer modelo 2400

Analisador termogravimétrico, TA instruments modelo TGA-2050.

Balança analítica, Fischer Scientific modelo A-250, precisão de 0,0001g

Banho ultrassom, Thornton modelo T14

Bomba para enchimento de colunas, Haskel modelo 51769

Centrífuga, Fischer Scientific modelo 225

Cromatográfo a líquido, Shimadzu, composto de uma bomba de alta

pressão, Shimadzu modelo LC-10 AD; detector UV-Vis , Shimadzu modelo

SPD-10A utilizado em λ = 254 nm; válvula de injeção (alça de amostragem

de 5 µL), Rheodyne modelo 8125; os dados foram adquiridos e

processados empregando o software ChromPerfect for Windows 3.52 e

Report Write Plus (Justice Innovations)

Cromatógrafo a líquido, Shimadzu, equipado com uma bomba de alta

pressão, Shimadzu modelo LC-10AD, detector UV-Vis, Shimadzu modelo

SPD-10ª utilizado em λ = 254 nm; forno de coluna CTO-10AS; injetor

automático SIL-10AD e um sistema controlador SCL-10A. Os dados foram

adquiridos e processados empregando o software CLASS-VP da Shimadzu

24

Espectrômetro de absorção no infravermelho, Perkin-Elmer modelo FTIR

1600

Espectrômetro de ressonância magnética nuclear, Varian modelo INOVA

500

Estufa à vácuo, Yamato modelo ADP21

Forno tubular, EDG modelo 10P-S

pHmetro, Digimed modelo DM 21

Porosímetro, Micromeritics ASAP 2010

Sistema de deionização de água, Milli-Q plus, Millipore

Sistema para extração do excesso de polímero, composto por uma bomba

cromatográfica Waters modelo 510

3.3 Coluna cromatográfica comercial

Coluna analítica C18 Nova Pak, capeada, fabricada pela Waters, tamanho

de partícula 5 µm, comprimento de 150 mm, diâmetro interno de 3,9 mm.

3.4 Suporte Cromatográfico

Como suporte cromatográfico foi utilizado a sílica porosa Kromasil®, tipo B,

forma esférica, área superficial de 295 m2g-1, tamanho de partícula médio de 5 µm,

tamanho de poro 11,5 nm e lote 5052.

25

3.5 Fase Estacionária Líquida

Como fase estacionária líquida foi utilizado o polímero poli(metil-3,3,3-

trifluorpropilsiloxano) (PMTFS), produzido pela Gelest, Inc.®, lote 3C-2623, código

215-547-1015.Este polímero apresenta viscosidade de 1000 cSt. Sua estrutura

química está mostrada na Figura 8.

Si OCH3

CH3

CH3

Si

CH2

CH3

O

CH2

Si

CF3

CH3

CH3

CH3

Figura 8 - Estrutura química do polímero poli(metil-3,3,3-trifluropropilsiloxano).

3.6 Colunas Cromatográficas

O material utilizado para construir as colunas cromatográficas é de

fundamental importância, pois pode comprometer o desempenho cromatográfico

durante uma separação. Para resistir as altas pressões aplicadas pelas bombas

cromatográficas, assim como apresentar resistência química aos solventes

orgânicos utilizados como fase móvel, as colunasempregadasneste trabalho foram

constituídascom aço inoxidável 316, sem costura. Este material é descrito como

rígido e com força mecânica apropriada para as condições em que será

submetido.

Tomando como base a equaçãoque calcula a eficiência da coluna, é

possível observar que o tamanho da coluna é de fundamental importância para a

obtenção de boas eficiências.Colunas maiores apresentam maiores eficiências, no

26

entanto, o tempo de análise é superior àquelas de menores tamanhos. Em geral,

colunas curtas são utilizadas em separações simples.72

Outro fator que influencia no desempenho da coluna é seu diâmetro

interno.Colunas de diâmetros internos maiores amplificam a capacidade de

aceitação de amostra, bem como a vazão da fase móvel. Entretanto, o aumento

do diâmetro leva a picos mais largos, o que gera piora na detectabilidade.72

Para economia do material utilizado para o desenvolvimento das FE, foram

utilizadas colunas com comprimento de 60 mm e diâmetro interno de 3,9 mm.

Essas colunas foram confeccionadas na oficina mecânica da UNICAMP, a partir

de tubos de aço inoxidável 316, sem costuras. A coluna é seguida por

acessórios:2 mangas com filtros, 2 redutores de volume, 2 porcas terminais e 2

tampas são conectadasem cada uma das extremidades. O esquema da coluna

está apresentado na Figura 9.

Figura 9-Representação esquemática da coluna cromatográfica utilizada no estudo (a) porcas terminais; (b) redutor de volume; (c) manga com filtro; (d) corpo da coluna.

Os tubos adquiridos apresentavam superfície interna rugosas, dessa forma

se fez necessário o uso do método de polimento utilizado no grupo de pesquisa

LabCrom.73

27

3.7 Polimento das colunas

Para o polimento da superfície interna da colunafoi utilizado a técnica

desenvolvida no LabCrom.73 O procedimento consiste em fixar em um mandril

uma haste de ferrode diâmetro interno menor que o tubo da coluna envolto com lã

de aço e pasta de polimento com partículas abrasivas e passá-lo, inúmeras vezes,

em movimentos exaustivos de sobe e desceatravés do tubo da coluna (Figura 10).

Esse processo foi repetido até a obtenção de uma superfície interna lisa e perfeita.

Após o polimento, os tubos foram lavados com detergente e água. Finalmente, a

coluna foi deixada em ácido nítrico 50% (v/v) por 24 horas e lavada com água e

etanol.

Figura 10-Representação esquemática do sistema de polimento desenvolvido no LabCrom.

3.8 Preparo das Fases Estacionárias

As fases estacionárias foram preparadas empregando as etapas de sorção

e imobilização do polímero na sílica nua, seguido da extração do polímero não

imobilizado.

28

3.8.1 Sorção da Fase Líquida ao Suporte

O preparo foi baseado no trabalho publicado por Maldaner e Jardim50 que

descreveram o desenvolvimento da FE Si(PMTFS) imobilizada termicamente.

Antes da etapa de imobilização foi feito o procedimento de sorção. É valido

ressaltar que a etapa de imobilização é indispensável, pois aumenta a intensidade

da interação do polímero com o suporte, evitando a lixiviação do mesmo com a

passagem de fase móvel.

Primeiramente, a sílicaKromasil foi seca a 140 ºC por no mínimo 12 horas,

para a sua ativação. Em um béquer foram pesadosaproximadamente 1,13 g de

PMTFS, com ajuda de uma pipeta de Pauster, e em seguida foram adicionados 11

mL de diclorometano para obter uma solução 10%(m/v). Subsequentemente, foi

adicionado 1,0 g de sílica seca.Essas massas foram pesadas para alcançar a

proporção de 53% de PMTFS e 47% de sílica, quantidade necessária para o

preenchimento completo dos poros da sílica.

A solução foi mantida sob agitação em capela por 3 horas e deixada na

mesma por 6 dias para a evaporação do solvente e para a obtenção da fase

estacionária sorvida. Depois das etapas iniciais, a FE sorvida foi submetida ao

tratamento térmico para promover a máxima interação do polímero com a sílica.

3.8.2 Imobilização por Tratamento Térmico

A FE sorvida foi transferida para tubos de aço inoxidável(comprimento 100

mm e diâmetro interno 10mm) e conectada a umforno tubular, de maneira a obter

um fluxo de nitrogênio através do tubo, como mostrado na Figura 11.O tempo e a

temperatura de imobilização foram de 226 °C por 12 horas, condições nas quais

se obtiveram maior porcentagem de carbono imobilizada, bem como melhores

29

valores dos parâmetros cromatográficos.50Para alcançar a temperatura desejada,

o programador foi ajustado para um aquecimento gradual, isto é,a taxa de

aquecimento programada foi de 5 °C por minuto.Após a imobilização, o polímero

não imobilizado foi extraído.

Figura 11- Representação esquemática do sistema de imobilização térmica para a FE.

3.8.3 Extração do Polímero não Imobilizado

O excesso de polímero que não interagiu com a sílica foi extraído para não

comprometer o desempenho cromatográfico da fase estacionária, decorrente da

redução da velocidade de transferência de massa do soluto entre a fase

estacionária e a fase móvel. Bombas de alta pressão, tipo recíproca de pistão

duplo (Water modelo 486) foram utilizadas, empregando o diclorometano como

solvente extrator.O solvente foi bombeado por 4 horas em uma vazão de 0,5 mL

30

min-1através da fase estacionária contida em tubos de aço inoxidável(comprimento

100 mm e diâmetro interno 10mm), como mostrado na Figura 12. Após o período

de extração, a fase estacionária foi retirada do tubo de aço inoxidável, transferida

para um béquer e recoberto com papel alumínio com pequenos furos, para

secagem.

Figura 12- Representação esquemática do sistema de extração do excesso de polímero imobilizado.

3.8.4 Capeamento

A reação de capeamento foi feita nas fases estacionárias após a

imobilização do PMTFS sobre a sílica, com o intuito de reduzir os grupos silanóis

residuais, isto é, diminuir os silanóis que não foram recobertos pelo polímero.

Primeiramente, a fase Si(PMTFS), imobilizada termicamente, foi seca a

120ºC por 12 horas. Cerca de 5,0 g da FE foram transferidas para um balão de

31

fundo redondo e acrescentado 100 mL de tolueno anidro(seco em peneira

molecular).Respectivamente, foram adicionados 35 mL de hexametildissilazano e

o 15 mL de trimetilclorossilano. A reação foi mantida em refluxo por 48 horas a

110°C (Figura 13). Após este tempo, foi obtida a fase estacionária Si(PMTFS)

capeada, simbolizada por [Si(PMTFS)ec].

A FE Si(PMTFS)ec foi lavada com 20 mL de tolueno, 20 mL de isopropanol,

20 mL de metanol:água (50:50 v/v) para a remoção dos resíduos dos reagentes.A

FE capeada foi transferida para um béquer e seca em estufa por 6 horas a 110 °C

para a evaporação dos solventes.

Figura 13- Sistema para a reação de capeamento da FE Si(PMTFS).

32

3.9 Caracterização Físico-Química das Fases Estacionárias

Amostras de FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec foram coletadas e

caracterizadas físico e quimicamente para comprovar a imobilização do polímero

sobre a sílica, bem como verificar se a reação de capeamento foi efetiva. As

técnicas utilizadas para caracterização físico-químicas e seus procedimentos

serão descritos a seguir.

3.9.1 Análise Elementar

A análise elementar foi utilizada para adquirir informações a respeito da

porcentagem de carbono que foi imobilizado sobre a FE, bem como a quantidade

de carbono inserida após a reação de capeamento.

A análise elementar foi realizada no Analisador de Carbono, Hidrogênio e

Nitrogênio da marca Perkin Elmer, modelo 2400. Foram pesados cerca de 2 a 3

mg da amostra em uma cápsula de estanho. A cápsula de estanho que continha a

amostra foi levada ao aquecimento à temperatura elevada, 900-1200 ºC. Durante

o aquecimento a matéria orgânica foiconvertida em gases como CO2, NOx e

vapores de H2O, que por sua vez foram reduzidos a CO2, N2 e H2 com ajuda de

uma catalisador de cobre. A medição foi feita por condução térmica que fornece

dado a respeito da quantidade de carbono, hidrogênio e nitrogênio na amostra. As

análises foram feitas em triplicata, a porcentagem foi obtida com um erro de 1%,

inerente ao equipamento.74

Através das informações adquiridas sobre a porcentagem de carbono do

PMTFS da FE imobilizada, bem como os grupos trimetilsilanos inseridos na

mesma, foi calculado a espessura do filme do polímero na superfície do suporte.

33

Sabendo-se que o PMTFS contém 31% (m/m) de carbono, as porcentagens

de carbono obtidas por análise elementar foram convertidas em massa específica

do PMTFS (m PMTFS retido) sobre a sílica pela Equação1.

m PMTFS retido =

Equação (1)

A massa específica do PMTFS nos poros da sílica, m PMTFS poros_cheios,foi

obtida a partir do volume específico de poros da sílica,νp sílica, e da densidade do

PMTFS, p PMTFS, conforme a Equação 2.

m PMTFS poros_cheios = νp sílica (mL/g) x p PMTFS (g/mL) Equação (2)

Assumindo-se que os poros da sílica têm diâmetro (d) constantes e que o

recobrimento do PMTFS é caracterizado por uma espessura de camada de

polímero (Ƭ) constante nas paredes dos poros do suporte, esta pode ser calculada

a partir das porcentagens de carbono pela Equação3.

τ = (√

)

Equação (3)

O valor de F (fração do polímero imobilizado) foi determinado a partir da

Equação 4:

F =

Equação (4)

34

3.9.2 Área Superficial Específica, Volume Específico e Diâmetro

de Poros

Para determinar as propriedades da superfície e dos poros foi utilizado um

método em que as medidas se baseiam nas isotermas de adsorção e dessorção

de nitrogênio.

Inicialmente, o material foi colocado em uma estufa, que se encontrava a

temperatura de 120 ºC,e foi mantida por 24 horas sob vácuo, para

desgaseificação a amostra.A área superficial foi calculada de acordo com o

método deBrunaer,Emmett,Teller (BET).75 Para a obtenção do tamanho e volume

de poros, utilizou-se o método Barret, Joyner e Halenda (BJH)76que foi

desenvolvido em 1951. Estes métodossão utilizados até hoje para execução

desses cálculos.77

3.9.3 Espectrometria de Absorção no Infravermelho

Os espectros de absorção na região do infravermelho foram obtidos para

sílica pura e para FE Si(PMTFS) antes e após o capeamento.

Os espectros de absorção na região do infravermelho (IV) foram obtidos na

região de 400 a 4000 cm-1, com resolução de 4 cm-1 e uma taxa de 20 varreduras

por minutos. Os espectros das amostras de sílica e das FE, imobilizadas e

capeadas, foram obtidos pesando-se as amostras de FE e do suporte

35

cromatográfico com brometo de potássio (KBr), numa proporção de

10:1(KBr:Amostra) para formar pastilhas homogêneas.

3.9.4 Ressonância Magnética Nuclear de Silício 29 (29Si)

Os espectros de RMN 29Si e 13C com CP/MAS (polarização cruzada

segundo rotação em ângulo mágico) foram obtidos em um espectrômetro Bruker

400 MHz Anvacell, usando um rotor de zircônia, em velocidade de rotação de

3500 Hz, contendo amostras de 200 mg. O tempo de contato foi de 5 ms e o

intervalo entre os pulsos de 1,5 s. O alargamento de banda usado foi de 30 Hz e a

largura espectral para todos os espectros foi de aproximadamente 25 kHz.

Os espectros foram obtidos para a sílica pura e para as FE Si(PMTFS) e

Si(PMTFS)ec, como o intuito de identificar as funcionalidades dos grupos silanóis

e os tipos de ligações, através dos espectros de RMN de 29Si.

3.10 Enchimento da Coluna

A suspensão da fase estacionária foi preparada em um solvente adequado

denominado de solvente de suspensão, que possui duas funções: impedir que as

partículas da fase estacionária se aglomerem e evitar sedimentação das mesmas.

O solvente empregado foi o tetraidrofurano, utilizadopor apresentar melhores

resultados comparado a outros solventes que também foram estudados

(acetonitrila, metanol, isopropanol).

Foi pesado cerca de 1,0 g de FE Si(PMTFS)ec e transferida para um tubo

de ensaio e depois foram adicionados cerca de 20 mL de tetraidrofurano para

formar uma suspensão de 5 % (m/v). A suspensão de 10% (m/v) também foi

usada, no entanto, a proporção de 5 % (m/v) mostrou melhor resultado. O tubo de

36

ensaio com a suspensão foi agitado usando um agitador roto-torque, por um

período mínimo de 12 horas.

3.10.1 Recheio das colunas com a fase estacionária

O sistema utilizado para o recheio das colunas está apresentado,

esquematicamente, na Figura 15.

Figura 14- Representação esquemática do sistema de enchimento de coluna.

As colunas foram recheadas com as FE preparadas utilizando uma bomba

pneumática Haskel para pressurizar o sistema. O procedimento de enchimento

está descrito passo a passo da seguinte forma:

Primeiramente, foi observado se o reservatório de solvente (1) estava

devidamente preenchido, pois este recipiente, preferencialmente, deve ser

37

mantido sempre cheio. O metanol foi o solvente propulsor para o enchimento de

colunas e caso o reservatório estivesse vazio,fazia-se o abastecimento com

metanol previamente filtrado.

Etapas sucessivas para o enchimento:

1. Fechar a válvula do solvente (4), abrir a válvula do nitrogênio e, em

seguida, abrir a válvula de segurança(9).

2. Fechar a válvula de controle de pressão do gás nitrogênio (3) até alcançar a

pressão de 6000 psi (41,4 MPa).

3. Conectar na parte inferior do reservatório de suspensão (6) a coluna

(7).Equipar a extremidade oposta àquela que a coluna está conectada ao

reservatório de suspensão, com seus acessórios, mangacom filtro, redutor

de fluxo e porcas, para evitar a perda da FE durante o enchimento.

4. Transferir a suspensão de fase estacionária (5) para o reservatório (6) e

completar o volume do reservatório com metanol e imediatamente fechar a

sua entrada superior.

5. Abrir a válvula do solvente (4) e deixar passar 80 mL do solvente propulsor.

A medição foi feita utilizando uma proveta(8)na saída do reservatório de

suspensão, posterior a coluna que estavaconectada ao sistema.

6. Fechar a válvula do solvente (4) após a passagem de 80 mL de metanol.

7. Desconectar a coluna do reservatório e imediatamente conectar os

acessórios remanescentes da coluna na extremidade que estava conectada

no sistema de enchimento.

8. Fechar, em sequência, as válvulas de controle de pressão do gás (3), de

segurança (9) e de nitrogênio (2).

Como o enchimento é uma etapa difícil de controlar, para adquirir uma

coluna com excelentes eficiências e bons fatores de assimetria, vários recheios de

coluna com a FE foram feitos até a obtenção de parâmetros cromatográficos

aceitáveis.

38

Para o esvaziamento das colunas utilizou-se o mesmo sistema de

enchimento acoplando a coluna sem os acessórios em sua extremidade inferior,

para permitir a saída da FE contida no interior da coluna. O reservatório de

suspensão foi completado com metanol e a extremidade superior foi fechada. O

procedimento 1 e 2 foram usados, no entanto, a pressão utilizada foi de 3000 psi.

A FE foi coletada em um béquer quando a válvula do solvente foi aberta.

Para melhorar a qualidade do enchimento cromatográfico algumas medidas

devem ser tomadas. O reservatório de enchimento deve estar sempre limpo, livre

de poeira, resto de FE e outros solventes. Então, fez-se a limpeza do aparelho

com metanol e secagem com nitrogênio. Outro cuidado a ser tomado é a limpeza

interna da coluna e dos filtros. Normalmente, utiliza-se água, sabão e material

macio, como cordão de algodão, para a limpeza da superfície interna da coluna.

Os filtros foram lavados com diclorometano em ultrassom para solubilizar o

polímero que pode obstruir os filtros, etambém,com metanol para retirada da

sílica, sendo que em cada procedimento eles foram deixados no mínimo 30

minutos em banho de ultrassom. Casos extremos em que os filtros estavam

obstruídos foi feita a lavagem utilizando ácido nítrico 10% (v/v), deixando-os

imersos durante 12 horas em solução ácida. Após a lavagem ácida, os filtros

foram lavados com água deionizada, exaustivamente, para a eliminação total do

ácido.

3.11 Preparo das Fases Móveis

Todos os solventes utilizados no preparo da fase móvel foram filtrados em

uma membrana Durapore®, 0,22 µm de poro, 47 mm de diâmetro, hidrofílica

(GVWP04700, Millipore) para eliminar as impurezas sólidas.

Os volumes dos solventes que compõem a fase móvel foram medidos,

individualmente, com ajuda de uma proveta e, sequencialmente, misturados e

39

desgaseificados. Rotineiramente, as fases móveis foram desgaseificadas em

banho de ultrassom por 30 minutos, para evitar bolhas no sistema cromatográfico

que podem comprometer a repetibilidade nas retenções, bem como uma possível

danificação no sistema.

Para os testes prévios realizados para estabelecer as melhores condições

para uma boa separação, foram preparadas fases móveis com metanol e água

nas proporções de 50:50, 55:45, 60:40 e 70:30 (v/v). Outras fases móveis foram

feitas de acordo com a necessidade ou para seguir um protocolo de análise

descrito na literatura.

3.12 Condicionamento das colunas

O condicionamento é usado para eliminar todos os vestígios dos solventes

usados no enchimento da coluna e do polímero da FE que não ficou devidamente

ancorado. O condicionamento também é usado para que a FE entre em equilíbrio

com a fase móvel para se ter repetibilidade nos tempos de retenção dos

compostos eluídos. Para o procedimento, a coluna foi conectada a uma bomba

cromatográfica, mas sem acoplar ao detector para evitar a obstrução das

tubulações na entrada e saída do detector e a contaminação da cela de detecção.

O método de condicionamento foi feito logo após o enchimento, passando-

se a fase móvel MeOH:H2O 50:50 (v/v) em uma vazão de 0,300 mL min-1, durante

2 horas. A coluna foi conectada ao detector para verificar a linha de base e caso

houvesse variação na linha de base durante a passagem da fase móvel, o

condicionamento era refeito.

40

3.13 Avaliação Cromatográfica das Fases Estacionária

Após o recheio da coluna com a FE Si(PMTFS)ec foi necessário

estabelecer as condições ótimas de proporção de metanol:água na FM e da vazão

da FM, que apresentassem parâmetros cromatográficos aceitáveis segundo a

literatura71,78. Esse estudo foi realizado avaliando uma mistura de compostos

como características distintas, contidas nas misturas testes 1 e 2.

A mistura teste 1 (MT1)foi utilizada para medir a seletividade e a

hidrofobicidade da FE e é composta de solutos polares (acetofenona 20 mg L-1) e

apolares (benzeno 2 mg L-1, tolueno 2mg L-1 e naftaleno 100 mg L-1).Com esta

mistura foram avaliados os parâmetros cromatográficos como eficiência (para o

naftaleno), fator de assimetria (para o naftaleno) e resolução (entre todos os

compostos). As estruturas dos compostos da MT1 estão mostrados na Figura 16.

NH

NH

O

O

Uracila

O CH3

Acetofenona

Benzeno

CH3

Tolueno

Naftaleno

Figura 15-Estruturas químicas dos compostos presentes na MT1.

A mistura teste 2 (MT2) é constituída de uracila, fenol (200 mg L-1), N,N-

dimetilanilina (80 mg L-1), naftaleno(60 mg L-1) e acenafteno (200 mg L-1), cujas

estruturas químicas estão apresentadas na Figura 17. Esta mistura foi usada para

estimar a acidez da FE, assim como a sua polaridade, pois é constituída por

compostos ácidos (fenol), básicos (N,N-dimetilanilina) e neutros (naftaleno e

acenafteno). Através desta mistura foram avaliados os parâmetros

41

cromatográficos como eficiência(para acenafteno e naftaleno), fator de

assimetria(para N,N-dimetilanilina, acenafteno e naftaleno) e resolução(entre

todos os compostos). A uracila foi adicionada nas misturas teste para a obtenção

do tempo de retenção de um composto não retido pela fase estacionária ou tempo

de retardamento da fase móvel, tM, que é uma parâmetro essencial para a

realização dos cálculos de vários parâmetros cromatográficos.

NH

NH

O

O

Uracila

OH

Fenol

NCH3 CH3

N,N-dimetilanilina

Naftaleno

Acenafteno

Figura 16-Estruturas químicas dos compostos presentes na MT2.

As duas misturas foram preparadas e avaliadas em FM metanol:água nas

proporções 50:50, 55:45, 60:40, 70:30 v/v. A coluna que apresentou melhores

parâmetros cromatográficos, posteriormente, foi avaliada segundo os protocolos

de Tanaka e colaboradores70. A descrição desse teste encontra-se a seguir.

3.13.1 Mistura teste de Tanaka70

Os testes de Tanaka são compostos de 4 misturas que fornecem

informações a respeito da hidrofobicidade da FE, seletividade metilênica eestérica,

capacidade de ligação de hidrogênio e capacidade de troca iônica em meio ácido

e básico. Todas as misturas foram avaliadas a temperatura de 40 ºC, empregando

42

uma vazão ótima de fase móvel de 0,3 mL min-1 e detecção a 254 nm. As misturas

e suas respectivas fases móveis foram:

Mistura (A): uracila, butilbenzeno, pentilbenzeno, o-terfenila e trifenileno.

FM: metanol:água, 80:20 (v/v);

Mistura (B): uracila, cafeína e fenol. FM: metanol:água 30:70 (v/v);

Mistura (C): uracila, benzilamina e fenol. FM: metanol:20 mmol L-1 de

K2HPO4/KH2PO4 pH 7,6, 30:70 (v/v);

Mistura (D): uracila, benzilamina e fenol. FM: metanol: 20 mmol L-1 de

KH2PO4/H3PO4 pH 2,7, 30:70 (v/v).

As estruturas químicas dos compostos presentes na Mistura A de Tanaka,

estão mostrados na Figura 18.

NH

NH

O

O

Uracila

Butilbenzeno

Pentilbenzeno

o-terfenila

Trifenileno

Figura 17-Estruturas químicas dos compostos presentes na Mistura A de Tanaka.

A hidrofobicidade da FE é medida de acordo com o fator de retenção do

pentilbenzeno (kpentilbenzeno), esse valor depende somente da quantidade de

polímero imobilizada sobre a sílica. A seletividade metilênica é medida pela razão

dos fatores de retenção do pentilbenzeno e do butilbenzeno,

43

αCH2=kpentilbenzeno/kbutilbenzeno, pois esses alquilbenzenos se diferenciam entre si

apenas pelo grupo metila.

A seletividade estérica é medida pela razão entre os fatores de retenção do

trifenileno e do o-terfenila, αT/O=ktrifenileno/ko-terfenil, que se diferenciam apenas pela

sua configuração espacial.

A capacidade de ligação de hidrogênio é obtida pela razão entre os fatores

de retenção da cafeína e do fenol, αC/F=kcafeína/kfenol. Essa medida expressa o

número de silanóis disponíveis para formarem ligações de hidrogênio com os

constituintes da amostra.As estruturas químicas dos compostos presentes na

Mistura B de Tanaka, estão mostrados na Figura 19

.

NH

NH

O

O

Uracila

N

N

CH3

O

CH3

O

N

N

CH3

Cafeína

OH

Fenol

Figura 18 - Estruturas químicas dos compostos presentes na Misutra B de Tanaka.

A capacidade de troca iônica em meio básico é medida pela razão entre os

fatores de retenção da benzilamina e do fenol em pH 7,6, αB/F=kbenzilamina/kfenol.O

valor obtido é uma estimativa da atividade silanofílica total da FE. As estruturas

químicas dos compostos presentes na Mistura C e D de Tanaka, estão mostrados

na Figura 20.

44

NH

NH

O

O

Uracila

NH2

Benzilamina

OH

Fenol

Figura 19-Estruturas químicas dos compostos presentes na Mistura teste C e D de Tanaka.

A capacidade de troca iônica em meio ácido é medida pela razão entre os

fatores de retenção da benzilamina e do fenol em pH 2,7, αC/F=kcafeína/kfenol. O valor

obtido é uma estimativa da acidez dos grupos silanóis residuais.

3.14 Influência da Concentração do Solvente Orgânico na Fase

Móvel

Em uma separação de compostos básicos e polares utilizando uma coluna

fluorada, a quantidade do componente orgânico na fase móvel influencia

diretamente na retenção desses compostos. O pH do conteúdo aquoso da fase

móvel tem relação direta com o aumento da retenção, principalmente, para os

compostos básicos.

Para o estudo dessas duas variáveis, conteúdo orgânico e pH do meio

aquoso, foram preparadas, separadamente, duas séries de fases móveis, sendo

que em cada série o conteúdo aquoso da fase móvel foi tamponado em meio

ácido ou básico.

45

Série 1 (meio ácido):

FM: acetonitrila:10 mmol L-1 de KH2PO4/H3PO4pH 2,7, 50:50; 60:40; 70:30;

80:20; 90:10 (v/v).

Série 2(meio básico) :

FM: acetonitrila:10 mmol L-1 de K2HPO4/KH2PO4pH 7,6, 50:50; 60:40; 70:30;

80:20; 90:10 (v/v).

Para a análise do mecanismo U-shape, foi avaliado,individualmente, o

tempo de retenção da amitriptilina (10 mg L-1), nortriptilina (10 mg L-1), fluoxetina

(10 mg L-1), lexofloxacina (10 mg L-1), bromazepam (10 mg L-1) e diazepam (10 mg

L-1) em cada proporção de fase móvel dasduas séries. As condições

cromatográficas utilizadas foram: temperatura ambiente, detecção UV-Vis 220 nm,

empregando uma vazão de 0,3 mL min-1.As estruturas químicas dos compostos

usados nesses estudos estão mostrados na Figura 21.

46

N

Amitriptilina

NH

Nortriptilina

F3C

O NHCH3

Fluoxetina

NH

N

N

Br

O

Bromazepam

N

N

O

N

CH3 F

O

OH

O

CH3

Levofloxacina

NN

O

CH3

Cl

Diazepam

Figura 20- Estruturas químicas dos compostos estudados para verificar o mecanismo "U-shape" na FE Si(PMTFS)ec.

3.15 Avaliação da Aplicabilidade da Fase Estacionária

Para avaliar a aplicabilidade das fases estacionárias fluoradas realizaram-

se as separações de compostos fluorados, agrotóxicos e fármacos. As misturas

foram preparadas em concentrações suficientes para que houvesse avaliação

qualitativa dos compostos.

O desempenho da fase estacionária preparada [Si(PMTFS)ec] foi

comparado com o de uma coluna comercial, do tipo C18 Nova Pak®, 5 µm.

47

Primeiramente injetaram-se os compostos individualmente, para a obtenção

dos seus tempos de retenção e, posteriormente, preparou-se uma mistura dos

compostos em fase móvel de força cromatográfica inferior às fases móveis de

análise e fizeram-se as injeções das misturas.

3.15.1 Separação de Composto Fluorados

Uma mistura de compostos fluorados, contendo 2,6-difluorfenol , 2,4-

difluorfenol, 2,3-difluorfenol, 3,4-difluorfenol, 3,5-difluorfenol, todos na

concentração de 10 mg L-1, foi analisada em FM ACN:H2O 20:80 e 25:75 (v/v).

Como o metanol é um solvente menos tóxico e mais barato que a

acetonitrila, fez-se a alteração da seletividade da FM mantendo a mesma força

cromatográfica, desse modo, usou-se a proporção MeOH:H2O 35:65 v/v para a

separação dos mesmos solutos. As condições cromatográficas utilizadas foram:

temperatura ambiente, detecção UV-Vis a 254 nm e vazão de 0,3 mL min-1 para a

coluna recheada com Si(PMTFS)ec. As estruturas químicas dos compostos

fluorados estão ilustradas na Figura 22.

48

OH

FF

2,6-difluorfenol

OH

F

F

2,4-difluorfenol

OH

F

F

2,3-difluorfenol

OH

F

F

3,4-difluorfenol

OH

FF

3,5-difluorfenol

Figura 21- Estrutura química dos compostos fluorados estudados.

3.15.2 Separação de agrotóxicos

Analisou-se uma mistura preparada com 20 mg L-1 de cada um dos padrões

de agrotóxicos, em elevada pureza, imazaquim, atrazina, diurom, linurom e

carboxim, cujas estruturas químicas estão ilustradas na Figura 23. Esta mistura foi

analisada em FM MeOH:H2O 45:55 (v/v), vazão de 0,3 mL min-1 para a coluna

preparada no laboratório e vazão de 1,2 mL min-1 para a coluna comercial,

temperatura ambiente e detecção UV-Vis em 254 nm.

49

NN

NH

O

O

OH

Imazaquim

N

N NHNHCH3

CH3

CH3

Cl

N

Atrazina

NH

O

N

CH3

CH3Cl

Cl

Diurom

NH

O

N

O

CH3Cl

Cl

CH3

Linurom

NH

O

S

O

CH3

Carboxim

Figura 22 - Estruturas químicas dos agrotóxicos estudados.

3.15.3 Separação de Fármacos

Uma mistura de fármacos na concentração de 20 mg L-1 para cada um

deles, contendo os seguintes benzodiazepínicos:bromazepam, alprozolam,

lorazepam e diazepam, foi analisada em temperatura ambiente, detecção UV-Vis

a 220 nm, FM MeOH:10 mmolL-1HCO2NH4/HCO2H pH 3,0 55:45 (v/v), vazão de

0,3 mL min-1 para coluna recheada com Si(PMTFS)ec e 1,2 mL min-1 para a

coluna comercial C18. As estruturas químicas dos fármacos estão mostradas na

Figura 24.

50

NH

N

N

Br

O

Bromazepam

N

NH

OH

O

Cl

Cl

Lorazepam

N

N

Cl

N

NCH3

Alprazolam

NN

O

CH3

Cl

Diazepam

Figura 23- Estruturas químicas dos fármacos estudados.

3.16 Avaliação da Estabilidade Química

A estabilidade química da fase estacionária Si(PMTFS)ec foi avaliada em

condições alcalinas de fase móvel, metanol: 50 mmol L-1K2CO3/KHCO3 a pH 10

(50:50 v/v) e empregando temperatura de 50 °C . Essas condições de análise são

consideradas drásticas e foram adotadas com o objetivo de acelerar a

deterioração e o colapso da fase estacionária. Os resultados foram comparados

com a estabilidade química da FE Si(PMTFS) descrita na literatura.79

51

A estabilidade química em condições alcalinas foi avaliada pelo

monitoramento de parâmetros cromatográficos, eficiência, fator de assimetria 10%

da altura do pico e fator de retenção para o composto mais retido (acenafteno) da

mistura teste 2, utilizada para este estudo. Para efeito de comparação, as

condições cromatográficas para a análise da estabilidade química da FE

Si(PMTFS)ec foram as mesmas utilizadas para a FE Si(PMTFS). Dessa maneira,

a fase móvel metanol:50 mmol L-1K2CO3/KHCO3 a pH 10 (50:50 v/v) foi eluída

através da colunas cromatográfica contento a fase estacionária Si(PMTFS)ec, a

uma vazão de 1,0 mL min-1, empregando uma temperatura de 50°C e detecção

UV-Vis 254 nm. A mistura teste 2 foi injetada a cada 30 minutos.

Antes do início das avaliações de estabilidade, a coluna cromatográfica foi

condicionada por 30 minutos com a fase móvel metanol:50 mmol L-1

K2CO3/KHCO3a pH 10 (50:50 v/v).

A estabilidade química da fase estacionária fluorada foi determinada em

termos de número de volumes de colunas eluídos, sendo que cada volume de

coluna (Vcol) corresponde ao volume da fase móvel que ocupa os espaços internos

da coluna cromatográfica, que não são ocupados pela fase estacionária. O volume

de coluna é determinado através do produto entre a vazão de análise e o tempo

de retenção de um soluto não retido, no caso, a uracila, conforme mostra a

equação 5:

Vcol= F. tMEquação(5)

sendo:

F: vazão da FM de análise.

tM: tempo de retenção de um composto não retido.

53

4 Resultados e Discussão

4.1 Caracterização Físico-Química

As caracterizações físico-química foram realizadas,em triplicatas, para a

fase estacionária Si(PMTFS)ec. Para comparação, em alguns momentos

tambémforam feitas as caracterizaçõesda sílica nua e da fase estacionária

Si(PMTFS).

4.1.1 Espectroscopia de absorção no infravermelho

O suporte cromatográfico, as fases estacionárias Si(PMTFS) e

Si(PMTFS)ec foram caracterizadas por espectroscopia de absorção na região do

infravermelho, para a determinação da presença de grupos funcionais

característicos. Na Figura 25 estão apresentados os espectros no infravermelho

da sílica pura, da FE Si(PMTFS) e da FE Si(PMTFS)ec.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0

11

50

98

09

80

35

00

35

00

Tra

nsm

itâ

ncia

(u

.a)

Número de Onda(cm-1)

SiO2

Si(PMTFS)

Si(PMTFS)ec

11

00

14

00

14

00

11

50

98

0

35

00

54

Figura 24-Espectros de absorção na região do infravermelho da sílica pura (SiO2) e das FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec.

Nos espectros obtidos para sílica pura podem serdestacadasas bandas em

3500 cm-1, 1653 cm-1 e 1100 cm-1. As bandas observadas em 3500 cm-1 e 1653

cm-1 referem-se às vibrações das moléculas de água adsorvidas na superfície da

sílica e dos grupos silanóis. A banda de adsorção em 1100 cm-1 refere-seao

estiramento das ligações siloxanos (≡Si-O-Si≡)e a banda em 980 cm-1

corresponde aos grupos silanóis livres.

Nos espectros de IV obtidos para as FE podem ser destacadas as bandas

na região de 1150 cm-1 e 1400 cm-1que correspondem, respectivamente, aos

estiramentos C-F e estiramentos característicos do carbono ligado a 3 átomos de

flúor, confirmando, que o polímero foi imobilizado sobre a sílica.

Outra banda característica a ser observada está na região de 980 cm-1.

Esta banda, atribuída aos grupos silanóis livres, praticamente desapareceu no

espectro obtido para a FE Si(PMTF)ec, confirmando o sucesso do capeamento.

4.1.2 Ressonância Magnética Nuclear de Sílicio 29

Através da espectroscopia de RMN de 29Si é possível determinar a

funcionalidade dos silanos e os tipos de ligações encontradas nas fases

estacionárias. As nomenclaturas e os deslocamentos químicos características das

espécies de silício presentes na superfície da sílica, estão mostrados na Figura

26.

55

Si

O O

OHHO

Geminais

Si

OH

O OO

Livres

Si

O

O OO

Si

H

OO

OH

Vicinais

SiO

O

O

O

Ligação Siloxano

Q2

-92 ppm

Q3

-101 ppm

Q4

-110 ppm

Si

OO

O

O

Si OHH3C

R

D1H

Si

OO

O

O

Si

OO

O

Si CH3

R

O

SiH3C

R

n

D2’

Si

CH3

O

Rn

D2’’

Si

OO

O

O

Si CH3H3C

CH3

M

-22 ppm -16 ppm -32 ppm +13 ppm

Figura 25- Nomenclatura e deslocamentos químicos das espécies de silício por RMN de29Si.

No espectro de 29Si da sílica pura, mostrado na Figura 27, pode-se observar

os grupos que compõem a estrutura da sílica, que consistem basicamente de

ligações tipo siloxanos e silanóis. Os picos localizados em deslocamentos

químicos de -91 ppm, -101 ppm e -110 ppm, são atribuídos, respectivamente, aos

grupos geminais (Q2), grupos vicinais e livres(Q3) e as ligações tipo siloxanos (Q4).

Analisando a razão entre a intensidade dos picos Q3 e Q4,foi possivel obter, de

forma comparativa, a quantidade de silanóis livres presentes na supefície da sílica

e a de grupos siloxanos. A razão Q3/Q4 estimada em 3,98para sílica nua, indica a

presença de uma quantidade significativa de silanóis livres na superficie da

mesma. A presença dos grupos geminais e livres são de fundamental importância

56

para a funcionalização da superfície da sílica, pois estes grupos são bastante

reativos.

57

Figura 26-Espectros de RMN de 29Si para a sílica pura e para as fases estacionárias Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec.

No espectro obtido para a FE Si(PMTFS), queestá apresentado na Figura

27, é notório o surgimento de novas espécies na região de -20 a -22 ppm. O sinal

em -22 ppm corresponde as cadeias do PMTFS fracamente ligadas à sílica ou

fisicamente sorvida (D2”) e os sinais em -20 ppm correspondem ao polímero

(PMTFS) ligado covalentemente à superfície da sílica (D1H e D2’). Também

observa-se a diminuição significativa da intensidade do sinal correspondente aos

50 0 -50 -100 -150 -200

Q4

Q3

Q2

ppm

SiO2

50 0 -50 -100 -150 -200

D2''

D1

H+ D

2'

Q4

Q3

Q2

ppm

Si(PMTFS)

50 0 -50 -100 -150 -200

Q4

Q3

Q2

D1

H+ D

2'

D2''

M

ppm

Si(PMTFS)ec

58

silanóis geminais (Q2) e da relação Q3/Q4 (1,98), indicando que houve uma

redução dos grupos silanóis residuais decorrentes da interação do polímero com o

suporte cromatográfico.

Na Figura 27 também pode ser visualizado o espectro RMN de 29Si para a

FE Si(PMTFS)ec. Analisando esta figura, verifica-se o aparecimento do sinal em

+14 ppm atribuído ao grupo TMS ligado a sílica,mostrando que o capeamento foi

realizado com sucesso. Comparando os espectros da FE capeada com o da não

capeada e da sílica, observa-se que houve uma redução dos silanóis residuais, o

que reafirma que com o capeamento houve a ligação do TMS com os silanóis

residuais, bloqueando-os.

4.1.3 Determinação da área superficial, volume e diâmetro de

poros

A sílica pura e as fases estacionárias Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec foram

submetidas à análise para determinação da área superficial, diâmetro de poro e

volume de poro. Os resultados estão mostrados na Tabela 2.

Tabela 2-Características da sílica nua e das FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec.

Material

Área Superficial Específica (m2 g-1)

Diâmetro de Poro (nm)

Volume de Poro ( cm3 g-1)

Sílica pura 295 11,7 0,88

Si(PMTFS) 254 10,1 0,64

Si(PMTFS)ec 246 10,1 0,62

Após a imobilização do polímero sobre a sílicaé possível observar a

diminuição da área superficial específica e do diâmetro e de volume de poro.

Esses resultados sugerem que o polímero preencheu relativamente os poros do

material.

59

Após a reação de capeamento, os parâmetros referentes à área superficial

específica e volume de poro, diminuíram devido a inserção das moléculas de

trimetilsilanos nas regiões em que o polímero não recobriu a sílica.

Com os dados relativos ao diâmetro de poro, é possível observar, que tanto

a imobilização do polímero PMTFS sobre a sílicaquanto a reação de capeamento,

não levaram a obstrução dos poros da sílica, isto é, a modificação do suporte

ocorreu no interior dos poros sem bloqueá-los.

4.1.4 Análise Elementar

Através da análise elementar foi possível determinar a quantidade de

carbono, em termos de porcentagem,presente na superfície da sílica.

As fases estacionárias Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec foram submetidas à

análise elementar utilizando um analisador de carbono, hidrogênio e nitrogênio,

para estimar a quantidade de carbono proveniente do polímero que está

imobilizado sobre o suporte, bem como a quantidade de carbono dos

trimetilsilanos ligados à sílica. Os valores estão mostrados na Tabela 3.

Tabela 3- Análise elementar das FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec

FE %C nm

Si(PMTFS) 10,83 1,8

Si(PMTFS)ec 11,88 1,97

Comparando a porcentagem de carbono da fase estacionária Si(PMTFS)

com a Si(PMTFS)ec, é possível observar que houve um aumento de 9,7%na

porcentagem de carbono, indicando que após a reação de capeamento uma

quantia significativa de moléculas de trimetilsilanos foram efetivamente ligadas ao

60

suporte. A espessura da camada da fase estacionáriafoi ligeiramente aumentada

com a ligação dos grupos trimetilsilanos.

.

4.2 Caracterização Cromatográfica

Junto com a caracterização físico-química, a caracterização cromatográfica

descreve algumas propriedades intrínsecas da FE que avalia o potencial de

separação da mesma.

Para efeito de comparação, uma coluna, com a mesma dimensão da que

continha a FE Si(PMTFS)ec, foi recheada com a fase estacionária Si(PMTFS) sem

o capeamento. Para verificar o efeito do capeamento, as colunas fluoradas foram

avaliadas utilizando as (MT1) e (MT2) e as misturas de Tanaka e colaboradores70.

4.2.1 Otimização da composição da fase móvel e da vazão de

análise.

Inicialmente, foram determinadas a composição ideal da fase móvel e a sua

vazão ótima para a análise usando a FE Si(PMTF)ec. A porcentagem de solvente

orgânico na fase móvel ideal para a avaliação da FE Si(PMTFS)ec foi determinada

pelas análises dos cromatogramas obtidos com as injeções das misturas testes 1

e 2.Fases móveis de MeOH:H2O nas composições de 50:50, 55:45, 60:40 e 70:30

(v/v) foram utilizadas nasanálises da FE Si(PMTFS)ec.Os parâmetros

cromatográficos estão mostrados na Tabela 4.

61

Tabela 4-Parâmetros cromatográficos obtidos na avaliação da FE Si(PMTFS)ec, utilizando diferentes composições de fase móvel MeOH:H2O.

Mistura teste 1

Composição FM MeOH:H2O (v/v) N/m (m-1)a As10%a tR(min)a ka,b Rsc

50:50 80140 0,8 18,1 10,4 6,4

55:45 84084 0,9 11,1 6,0 4,5

60:40 79805 0,9 5,6 2,6 2,0

70:30 66600 1,3 4,4 1,7 1,1

Mistura teste 2

Composição FM MeOH:H2O (v/v) N/m (m-1)d As10%e tR(min)d kd,b Rsf

50:50 79760 1,0 35,1 21,1 10,3

55:45 83732 0,9 20,5 12,0 9,3

60:40 84222 0,9 7,9 4,0 6,3

70:30 61650 1,1 7,1 3,5 3,0 acalculado para o pico do naftaleno; bmedido para uracila;ccalculado para o par tolueno/naftaleno;dcalculado para o pico do acenafteno;ecalculado para o pico da N,N-dimetilanilina;fcalculado para o par naftaleno/acenafteno. Condições cromatográficas: vazão de 0,3 mL min-1, temperatura ambiente e detecção UV-Vis a 254 nm.

Avaliando os resultados da Tabela 3 para a MT1, é possível observar que a

composição de fase móvel MeOH:H2O 50:50, 55:45, 60:40 (v/v) apresentaram

parâmetros adequados e boa eficiência.

Os resultados obtidos para MT2, que estão mostrados na Tabela 3,

indicaram que as composições de fase móvel MeOH:H2O 50:50 e 55:45 (v/v)

forneceram tempos de retenção longospara o acenafteno em relação a

composição 60:40 e 70:30 (v/v). No entanto, para todas as composições de fase

móvel, os parâmetros cromatográficos como fator de assimetria, resolução e

eficiência, foram satisfatórios.

A composição de fase móvel MeOH:H2O 60:40 (v/v)foi selecionada, pois

apresentou boa eficiência,para os compostos mais hidrofóbicos da MT1 e MT2,

parâmetros cromatográficos e tempo de análise satisfatórios. Assim, a partir da

melhor composição de fase móvel foi avaliada a vazão ótima através da

construção da curva de van Deemter.

62

A curva de van Deemter relaciona altura de um prato (H) à velocidade linear

da fase móvel (µ) , essa relação está mostrada na Figura 28. O ponto mínimo da

curva, que corresponde ao valor máximo de eficiência da coluna, 1,27 µm

(eficiência de 79327 N/m para o naftaleno) foi obitido empregando a vazão de 0,3

mL min-1 (3,82 cm min-1).

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4

H.1

0-6(m

)

cm min-1)

0,3 mL min-1

Figura 27- Representação da curva de van Deemter, para a fase estacionária Si(PMTFS)ec.

4.2.2 Análise da Mistura Teste 1 e 2

Utilizando a vazão e a composição de fase móvel ótimas para a fase

estacionária Si(PMTFS)ec, foram avaliadas as misturas testes MT1 e MT2 e

calculados os parâmetros cromatográficos para os compostos presentesnas

mesmas. Para efeito de comparação, as MT1 e MT2 foram avaliadas em uma

coluna recheada com a fase estacionária Si(PMTFS), em fase móvel MeOH:H2O

63

50:50 (v/v),empregando vazão 0,3 mL min-1, sendo que essas condições foram

previamente otimizadas.50

A MT1, composta por solutos neutros de diferentes polaridades, foi utilizada

para avaliar a seletividade hidrofóbica da fase estacionária. Através do naftaleno,

composto de maior hidrofobicidade presente na MT1, foipossível calcular a

eficiência da coluna, assim como os demais parâmetros cromatográficos.

Na Tabela 5, estão mostrados os parâmetros cromatográficos para cada

composto que compõe a MT1, analisados nas fases estacionárias Si(PMTFS) e

Si(PMTFS)ec.

Tabela 5-Parâmetroscromatográficos para os compostos presentes na MT1, usando a FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec.

Mistura teste 1 para FE Si(PMTFS)

Composto tR k Pratos Pratos/m As10 Rs

(min)

Uracila 1,67 0 1160 19293 2,5 0

Acetofenona 4,91 2 3610 60171 1,4 10,0

Benzeno 6,63 3 3905 65089 1,2 5,0

Tolueno 10,15 5 3973 66222 0,9 7,0

Naftaleno 14,13 8 4391 73185 1,0 5,0

Mistura teste 1 para FE Si(PMTFS)ec

Composto tR k Pratos Pratos/m As10 Rs

(min)

Uracila 1,57 0 1113 18546 1,8 0

Acetofenona 2,84 1 3072 51197 1,3 4,0

Benzeno 3,81 1 3992 66529 1,0 4,0

Tolueno 4,98 2 4587 76444 0,9 4,0

Naftaleno 5,58 3 4760 79327 0,9 2,0

Avaliando as fases estacionárias fluoradas, ambas apresentaram

seletividade hidrofóbica, pois houve boa resolução entre todos os compostos da

MT1. Os parâmetros cromatográficos calculados para o pico do naftaleno, que

64

estão mostrados na Tabela 4, estão dentro da faixa aceitável para ambas as fases

estacionárias.

A MT2, composta por substâncias ácidas, básicas e neutras com

polaridades distintas, foi utilizada para avaliar o caráter ácido da fase estacionária.

A N,N-dimetilanilina, composto fortemente básico, interage com os silanóis

residuais da fase estacionária devido ao caráter ácido desses grupos.

Os parâmetros cromatográficos calculados para os compostos presentes na

MT2, analisados nas fases fluoradas, estão apresentados na Tabela 6. A coluna

recheada com a fase estacionária Si(PMTFS)ec apresentou eficiência superior à

fase estacionária Si(PMTFS), entretanto, ambas apresentaram boas eficiências.

Os fatores de assimetria para os compostos mais hidrofóbicos, nafteleno e

acenafteno, e para a N,N-dimetilanilina, para ambas as FE estão de acordo com

os valores aceitos na literatura, que é de 0,9 a 1,2, sendo aceitos valores de até

1,6.80

Tabela 6- Parâmetroscromatográficos para os compostos presentes na MT2, usando a FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec.

Mistura teste 2 para a FE Si(PMTFS)

Composto tR k Pratos (Pratos/m) As10 Rs

(min)

Uracila 1,70 0 1530 25515 2,5 0

Fenol 2,70 0,6 2770 46167 2,0 6,0

N,N-dimetilanilina 8,50 4,1 3929 65481 1,3 9,0

Naftaleno 14,20 7,5 4260 70990 1,2 8,0

Acenafteno 23,40 13 4665 77743 1,0 8,0

Mistura teste 2 para a FE Si(PMTFS)ec

Composto tR k Pratos (Pratos /m) As10 Rs

(min)

Uracila 1,60 0 1108 18462 1,9 0

Fenol 2,00 0,3 1991 33187 1,3 3,0

N,N-dimetilanilina 4,10 1,6 4069 67816 1,2 9,0

Naftaleno 5,50 2,5 4740 78998 0,9 5,0

Acenafteno 7,90 4 5008 83464 0,9 6,0

65

De acordo com os resultados mostrados anteriormente, a presença dos

átomos de flúor na FE, promove um retenção diferenciada, principalmente, para os

compostos básicos e polares. Isso ocorre, pois o soluto básico apresenta-se em

sua forma dissociada, dessa maneira, há uma predominância na interação do tipo

íon dipolo-dipolo entre o soluto e a FE, promovendo assim picos simétricos. No

entanto, a reação de capeamento é recomendada, poisprotege a FE de possíveis

adsorções irreversíveis dos compostos básicos com os sítios ácidos da FE,além

de aumentar a hidrofobicidade da FE, o que melhora a retenção dos compostos

apolares.

4.2.3 Misturas teste de Tanaka

Nesse estudo também foi utilizada a FE Si(PMTFS), para mensurar os

efeitos da reação de capeamento nas fases fluoradas. Esses resultados foram

comparados com os descritos na literatura, que avaliaram as misturas teste de

Tanaka para colunas comerciais fluoradas, mostrados na Tabela6.

A Mistura A avalia a hidrofobicidade(kpentilbenzendo), a seletividade hidrofóbica

(αCH2=kpentilbenzeno/kbutilbenzeno) e a seletividade estérica(αT/O=ktrifenileno/ko-terfenil). Os

cromatogramas que representam a separação desta mistura nas colunas

recheadas com as FE Si(PMTFS)ec e Si(PMTFS) estão mostrados na Figura 29 e

os parâmetros propostos por Tanaka e colaboradores estão na Tabela 6.

66

0 2 4 6

Re

sp

osta

do

De

tecto

r

Si(PMTFS)ec

1

2

2

3

4 5

0 2 4 6

Tempo (min)

Si(PMTFS)

13

4 5

Figura 28 - Cromatogramasobtidos nas separações da mistura teste A de Tanaka usando

as FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec. Condições cromatográficas: volume de injeção 5 µL,

Fase móvel: MeOH:H2O 80:20 (v/v),vazão: 0,300 mL min-1, detecção UV: 254 nm e

temperatura de 40°C. Identificação dos picos (A): 1- uracila, 2-o-terfenil, 3-trifenileno, 4-

butilbenzeno, 5-pentilbenzeno.

A partir do fator de retenção do pentilbenzeno, foi possível avaliar o

recobrimento do suporte pelo polímero. Na FE Si(PMTFS) o fator de retenção do

pentilbenzeno foi inferior que na FE Si(PMTFS)ec, apontando que após a inserção

dos trimetilsilanos houve um aumento na hidrofobicidade da FE. Comparando os

valores obtidos para as colunas recheadas com as FE preparadas com as colunas

comerciais fluoradas, foipossível comprovar que as FE fluoradas comerciais

apresentaram menores hidrofobicidades.

Avaliando os resultados, em termos da razão entre os fatores de retenção,

destacando o αCH2=kpentilbenzeno/kbutilbenzeno, compostos que são diferentes entre si

por apenas um grupo metileno (-CH2-), foi possível concluir que a FE Si(PMTFS)

tem menor capacidade em diferenciar um composto apenas pelo seu grupo

metilênico quando comparada com a FE Si(PMTFS)ec. A seletividade hidrofóbica

67

da FE Si(PMTFS)ec é semelhante a das FE fluoradas comerciais, comprovando

que o capeamento aumentou este parâmetro.

Tabela 7-Parâmetros obtidos através do teste Tanaka em diferentes colunas.

Coluna kPB αCH2 αT/O αC/F αB/PpH 7,6 αB/PpH 2,7 N/m

Si(PMTFS) 1,0 1,1 1,3 1,6 3,50 0,01 73000

Si(PMTFS)ec 1,4 1,2 1,3 0,6 2,88 0,13 79000

(Fluorflix)eca 0,57 1,24 0,58 0,81 2,06 0,38 60500

Fluorflirxa 0,48 1,2 0,67 1,37 3,9 0,26 68900

ainformações retiradas da referência 81.

Outra avaliação que foi feitaatravés da mistura A de Tanaka foi a

seletividade estérica da FE. Através desses resultados foi possível concluir que as

FE baseadas em PMTFS são capazes de separar compostos que diferenciam

entre si apenas pela configuração espacial. O valor αT/O 1,3 para ambas as FE

fluoradas preparadas no laboratório indicaram que a cadeia do polímero PMTFS

está distribuída uniformemente na FE.

A mistura teste B, avalia a capacidade da FE em interagir como a cafeína

por ligação de hidrogênio. Essa interação ocorre devido a presença de silanóis

que não foram recobertos pelo polímero, isto é, quando maior a quantidade de

silanóis residuais mais retida ficará a cafeína na FE. Essahabilidade foi medida

através da razão entre o fator de retenção da cafeína e do fenol(C/F).

Os cromatogramas obtidos com a análise da mistura B para as FE

fluoradas, estão mostrados na Figura 30 e a razão entre o fator de retenção da

cafeína e do fenol (C/F) está mostrado na Tabela 6.

68

0 2 4 6

Re

sp

osta

do

De

tecto

r

Si(PMTFS)1

2

3

0 2 4 6

Tempo(min)

Si(PMTFS)ec1

3

2

Figura 29- Cromatogramasobtidos nas separações da mistura teste B de Tanaka, usando

as FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec. Condições cromatográficas: volume de injeção 5 µL,

Fase móvel: MeOH:H2O 30:70 (v/v), vazão: 0,300 mL min-1, detecção UV: 254 nm e

temperatura de 40°C. Identificação dos picos : 1-uracila, 2- fenol, 3- cafeína.

Avaliando os resultados obtidos, a FE fluorada capeada apresentou menor

interação por ligação de hidrogênio que a FE não capeada, isso ocorreu devido a

diminuição dos grupos silanóis residuais promovida pela reação de capeamento. A

razão entre o fator de retenção da cafeína e do fenol (C/F) foi menor que 1,0 para

a FE Si(PMTFS)ec (C/F= 0,6) e maior que 1,0 para FE Si(PMTFS) (C/F= 1,6).

Esses resultados estão de acordo com os estimados na literatura, em que

descreve que as FE que apresentam maior interação por ligação de hidrogênio o

C/Fé maior que 1,0, diferente para as FE que apresentam menor capacidade de

interação por ligação de hidrogênio, em que esses valores devem ser inferiores a

1,0.70Nas FE fluoradas comerciais, (Fluorflix) e (Fluorflix)ec, esses valores foram

similares às FE recobertas pelo polímero PMTFS, indicando que o capeamento

reduz a atividade silanofílica.

69

Através da mistura C e D de Tanaka, foi possível avaliar a capacidade da

FE em interagir com compostos básicos por troca iônica. Nesse estudo, avaliou-se

o comportamento da benzilaminaem meio ácido ou básico, para verificar a

capacidade da FE em interagir por troca iônica. Essa capacidade é dependente do

pH do meio e da quantidade de silanóis residuais presentes na FE. A medição foi

feita através da razão dos fatores de retenção entre a benzilamina e o fenol.

Os cromatogramas que avaliaram a mistura C, estão mostrados na Figura

31 e a razão entre o fator de retençãoda benzilamina e do fenol está Tabela 6.

0 5 10

Re

sp

osta

do

De

tecto

r

Si(PMTFS)ec

12

3

0 2 4 6 8 10

Tempo (min)

Si(PMTFS)1+2

3

Figura 30 - Cromatogramas obtidos nas separações da mistura teste C (pH 2,7) de

Tanaka, usando as FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec. Condições cromatográficas: volume

de injeção 5 µL, Fase móvel: MeOH:10 mmol L-1 KH2PO4/H3PO4 30:70 (v/v); vazão: 0,300

mL min-1, detecção UV: 254 nm e temperatura de 40°C. Identificação dos picos (A): 1-

uracila, 2-benzilamina, 3-fenol.

Em meio ácido, a pH 2,7, a benzilamina encontra-se carregada

positivamente, no entanto, nesse pH ocorre a supressão iônica dos silanóis, que

são relativamente ácidos. Através dos resultados obtidos para as FE fluoradas,

tanto as baseadas em PMTFS quanto as comerciais, verificou quenão

70

ocorreutroca iônica entre a benzilamina e os silanóis remanescentes, devido as

condições cromatográficas estabelecidas.

Como os silanóis presentes na FE apresentam caráter ácido,a pH 7,6, eles

estão desprotonados e a benzilamina protonada. Assim, em meio alcalino, ocorre

a interação por troca iônica do composto básico com os silanóis residuais, cuja

magnitude depende da quantidade de silanóis que não foram devidamente

recobertos. A extensão da troca iônica em pH básico é mensurada através da

razão entre o fator de retenção da benzilamina e do fenol (B/F).

Os cromatogramas obtidos na separação da mistura D para as FE fluoradas

estão apresentados na Figura 32 e a razão entre o fator de retenção da

benzilamina e do fenol está na Tabela6.

0 2 4 6 8 10 12

Re

sp

osta

do

De

tecto

r

Si(PMTFS)ec1

2

3

0 2 4 6 8 10 12

Tempo

Si(PMTFS)

1

2

3

Figura 31- Cromatogramas obtidos nas separações da mistura teste D (pH 7,6) de

Tanaka para as FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec. Condições Cromatográficas:volume de

injeção 5 µL, Fase móvel: MeOH:10 mM KH2PO4/K2HPO4 30:70 (v/v), vazão: 0,300 mL

min-1, detecção UV: 254 nm e temperatura de 40°C. Identificação dos picos (A): 1- uracila,

2-fenol, 3- benzilamina.

Os resultados referentes à FE Si(PMTFS)ec demonstraram que a reação de

capeamento diminuiu a quantidade de silanóis que não foram recobertos pelo

71

polímero, isto porque o B/F foi relativamente menor para a FE capeada.As FE

fluoradas, tanto as comercais quanto as preparadas no laboratório, apresentaram

atividade silanofílica significativa, mesmo após a reação de capeamento,

indicando que essa característica é comum para esse tipo de FE.

Outro dado interessante referente às FE recobertas com PMTFS foi que o

fator de assimetria, calculada para benzilamina foi de 1,3 para a FE Si(PMTFS) e

0,9 para a FE Si(PMTFS)ec. Esse fato pode ser explicado, devido a interação do

tipo íon dipolo-dipolo entre a benzilamina e a FE , o que reduz a interação com os

silanóis residuais.

4.3 Influência da Concentração de Solvente Orgânico na Fase

móvel

As fases estacionárias fluoradas exibem um perfil de retenção conhecido

como “U-shaped”. A retenção dos analitos polares diminui com o aumento do

conteúdo do modificador orgânico na fase móvel em baixa ou moderada

concentração do solvente. Entretanto, os compostos básicos após passarem pelo

ponto de inflexão, usualmente, apresentam umaumento na retenção em alta

concentração de solvente orgânico na fase móvel (80-90%). Esse mecanismo é

similar ao que ocorre em cromatografia de interação hidrofílica.55

A influência da concentração de acetonitrila na retenção de compostos

ácidos e básicos foi estudada para verificar o mecanismo “U-shaped” na FE

Si(PMTFS)ec. A constante de dissociação ácida e o coeficiente de partição

octanol/água dos compostos estudados estão listados na Tabela 8. As retenções

de cada analito em diferentes concentrações de acetonitrila, em uma faixa de 50 a

90%, em tampão fosfato a pH 2,7 e 7,6, estão mostradas na Tabela 9.

72

Tabela 8- Características físico-químicos dos fármacos estudados, fonte:DrugBanK82.

Fármacos log P pKa

Amitriptilina 4,91 9,4

Nortriptilina 4,43 10,47

Fluoxetina 4,17 9,8

Levofloxacina -0,02 6,2;5,45

Bromazepam 2,54 2,68;12,24 Diazepam 3,08 2,92

Tabela 9- Tempo de retenção de alguns fármacos separados usando a FE Si(PMTFS)ec e variando a porcentagem de acetonitrila de 50 a 90%, em tampão fosfato a pH 2,7 e 7,6

Fármacos % ACN

50 60 70 80 90

10 mmol tampão fosfato (pH 2,7) Amitriptilina 2,78 1,89 1,7 1,8 2,2

Nortriptilina 2,78 1,8 1,64 1,72 1,98

Fluoxetina 2,68 2 1,73 1,77 2,09

Levofloxacina 1,37 1,32 1,34 1,42 1,55

Bromazepam 1,92 1,68 1,57 1,6 1,5

Diazepam 3,4 2,44 2,01 1,87 1,6

10 mmol tampão fosfato (pH 7,6)

Amitriptilina 21 13,5 10,5 7,1 8,88

Nortriptilina 12,1 9,18 7,83 8 10,2

Fluoxetina 13,5 9,57 8,25 7,79 9,02

Levofloxacina 1,57 1,52 1,61 1,65 1,72

Bromazepam 1,99 1,7 1,58 1,53 1,57

Diazepam 3,51 2,48 2,03 1,79 1,78

Nas Figuras 33 e 34 podem ser visualizados os comportamentos da

retenção dos fármacos ácidos, levofloxacina, bromazepam e diazepam, em função

do aumento da porcentagem de solvente orgânico, respectivamente, em pH 2,7 e

7,6.

73

Figura323 - Gráfico do tempo de retenção dos compostos ácidos, levofloxacina,

bromazepam e diazepam, em função da concentração de solvente orgânico, a pH 2,7

Em teoria, os compostos ácidos deveriam aumentar sua retenção em pH

ácido, o que não ocorreu com o bromazepam e diazepam que apresentaram

comportamento clássico de fase reversa, uma vez que as suas retenções

diminuíram com o aumento da concentração de acetonitrila, até 90%. De acordo

com o pKa do bromazepam e do diazepam, esse compostos deveriam estar na

sua forma molecular em pH 2,7, no entanto, a porcentagem do modificador

orgânico influencia diretamente no pH da fase móvel, aumentando o pH da fase

móvel.1 Dessa forma, o bromazepam e diazepam foram avaliados em uma

condição em que sua retenção foi diminuída por se apresentarem na sua forma

dissociada e terem pouca interação com os silanóis residuais que também

estavam na sua forma não dissociada.Acima de 80% de acetonitrila na FM, a

levofloxacina mostrou um aumento na sua retenção, provavelmente devido a sua

alta polaridade, pois em FM com alto conteúdo de solvente orgânicoo mecanismo

de retenção é similar ao de modo normal, no qual o analito interage,

50 60 70 80 90

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

Te

mp

o d

e R

ete

nção

(m

in)

Porcentagem de Acetonitrila (%)

Levofloxacina

Bromazepam

Diazepam

74

preferencialmente, com os grupos silanóis. Em pH 7,6, Figura 34, o

comportamento desses compostos foi semelhante ao que ocorreu em pH 2,7.

Figura 334-Gráfico do tempo de retenção dos compostos ácidos,levofloxacina, bromazepam e diazepam, em função da concentração de solvente orgânico, a pH 7,6

Os gráficos do tempo de retenção versus o volume percentual de

acetonitrila a pH 2,7 (Figura 33) e 7,6 (Figura34) mostraram que não ocorreu o

mecanismo “U-shaped” para as substâncias de caráter ácido bromazepam e

diazepam, utilizando a FE Si(PMTFS)ec.

Os tempo de retenção para os fármacos amitriptilina, nortriptilina e

fluoxetina em função do aumento da porcentagem de acetonitrila na fase móvel,

em pH 2,7 e 7,6, podem ser visualizados, respectivamente, nas Figuras 35 e 36.

Os anatilos básicos mostraram aumento na retenção em baixa e alta

concentração de acetonitrila, resultando no perfil de retenção “U-shaped”,

característico em fases fluoradas.Os compostos básicos, em pH ácido,

50 60 70 80 90

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

Te

mp

o d

e R

ete

nção

(m

in)


Levofloxacina

Bromazepam

Diazepam

75

aumentaramas suas retenções em porcentagens de ACN acima de 70% na

composição da fase móvel, devido ao aumento do caráter polar dos composto em

pH ácido (Figura 35).

Figura 34-Gráfico do tempo de retenção dos compostos básicos amitriptilina, nortriptilina efluoxetina, em função da concentração de solvente orgânico, a pH 2,7

A pH 7,6, os composto básicos estão na sua forma protonada e o silanóis

em sua forma dissociada, o que leva a interação por troca iônica. A retenção dos

analitos básicos em pH básico foi maior comparada com a retenção em meio

ácido, indicando que a interação por troca iônica domina esse efeito.

As FE fluoradas, tanto as capeadas quanto as não capeadas, apresentam

quantidade expressiva de silanóis residuais. Como o mecanismo "U-shape"

depende da atividade silanofílica da FE, esse efeito foi mais pronunciado em meio

básico, explicando o porquê da maior retenção dos analitos básicos em meio

alcalino.55

50 60 70 80 90

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

2,6

2,8

3,0

Te

mp

o d

e R

ete

nção


Amitriptilina

Nortriptilina

Fluoxetina

76

Figura 35-Gráfico do tempo de retenção dos compostos básicos amitriptilina, nortriptilina e fluoxetina, em função da concentração de solvente orgânico, a pH 7,6

4.4 Avaliação da Aplicabilidade da Fase Estacionária Fluorada

4.4.1 Compostos Fluorados

Para comprovar a capacidade da FE Si(PMTFS)ec em separar compostos

fluoradas, foi usada uma mistura de difluorfenóis que são isômeros de posição.

Com o uso de FM na proporção 20:80 (ACN:H2O v/v), condições usadas na FE

sem o capeamento, o tempo de análise foi um pouco maior que 15 min,

comprovando que houve um aumento na hidrofobicidade da FE com a inserção

dos grupos trimetilsilanos. Assim, aumentou a porcentagem de solvente orgânico

na FM para ACN:H2O 25:75 (v/v) para aumentar a força cromatográfica da FM e

50 60 70 80 90

6

8

10

12

14

16

18

20

22

Te

mp

o d

e R

ete

nçã

o (

min

)


Amitriptilina

Nortriptilina

Fluoxetina

77

obter menor tempo de análise, boas eficiências e fatores de assimetria

adequados.

Como o metanol é um solvente mais barato e menos tóxico que a

acetonitrila se fez a alteração da seletividade da FM mantendo a mesma força

cromatográfica.Desse modo, usou-se a proporção 35:65 (MeOH:H2O v/v) para a

separação dos mesmos solutos. Observou-se que utilizando o metanol, a

eficiência e o fator de assimetria dos picos se mantiveram similares à FM que

empregou acetonitrila como modificador orgânico. Na Figura 37 podem ser

visualizados os cromatogramas obtidos nas separações dos compostos fluorados

usando as FE Si(PMTFS) e Si(PMTFS)ec.

Figura 36– Cromatogramas obtidos nas separaçõesde difluorfenóis utilizando colunas

diferentes: A) coluna de dimensões (60 mm x 3,1 mm d.i) recheada com a FE Si(PMTFS)

adaptado da referência 49; B) coluna de dimensões(60 mm x 3,9 mm d.i) recheada com a

FE Si(PMTFS)ec. Condições cromatográficas: fase móvel: A) ACN:H2O 20:80 (v/v) B)

MeOH:H2O 35:65 (v/v), volume de injeção: 5µL, vazão: 0,300 mL min-1, temperatura

ambiente e detecção UV: 254 nm. Identificação dos picos: 1- 2,6-difluorfenol, 2- 2,4-

difluorfenol, 3- 2,3-difluorfenol, 4- 3,4-difluorfenol, 5- 3,5-difluorfenol, *- impureza.

78

4.4.2 Separação de Agrotóxicos

A separação de agrotóxicos de diferentes classes utilizando a FE

Si(PMTFS)ec está apresentada na Figura 38.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

5

4

3

2

1

Re

sp

osta

do

De

tecto

r

Tempo(min)

A)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

5

4

3

2

1

Re

sp

osta

do

De

tecto

r

Tempo(min)

B)

Figura 37- Cromatogramas obtidos nas separações de agrotóxicos usando colunas

diferentes: A) Si(PMTFS)ec dimensões (60mm x 3,9 mm d.i) e B) C18 Nova Pak(150 mm

x 4,6 mm d.i). Condições cromatográficas: fase móvel: MeOH:H2O 45:55 v/v, volume de

injeção: 5µL, vazão: 0,300 mL min-1, detecção UV: 254 nm e temperatura ambiente.

Identificação dos picos: 1- imazaquim, 2-carboxim, 3- atrazina, 4-diurom, 5- linurom.

Analisando os cromatogramas da Figura 38, verifica-se que os picos estão

estreitos, simétricos e bem resolvidos, mostrando que, visualmente, a FE

proporcionou um bom desempenho cromatográfico, além de um tempo de análise

bastante satisfatório, próximo a 14 minutos. Este tempo é adequado considerando

que a separação foi realizada por eluição isocrática.

Na Tabela 1 são mostrados os valores de eficiência, fator de assimetria,

fator de retenção e resolução dos agrotóxicos analisados. A resolução entre

atrazina e diurom foi suficiente para que ocorresse a separação completa dos

compostos, isto é, resolução acima de 1,5. A atrazina, diurom e linurom são

compostos clorados, dessa forma é possível comprovar a eficiência da coluna em

separar compostos que são halogenados.

79

Tabela 10-Parâmetros cromatográficos obtidos na separação de agrotóxicosempregando

a FE Si(PMTFS)ec.

Agrotóxicos tR(min) k N Eficiência (N/m) As10 Rs

Imazaquim 1,01 0 758 12630 1,3 0

Carboxim 5,87 4,8 3917 65280 1,1 18,7

Atrazina 7,44 6,4 3485 58085 1,4 3,6

Diurom 8,37 7,3 4220 70335 1,0 1,8

Linurom 13,71 12,6 4598 76640 0,9 8,1

Para comprovar a eficácia da separação de agrotóxicos utilizando FE

fluorada, foi utilizada uma fase comercial C18 nas mesmas condições, no entanto,

a vazão da coluna comercial foi ajustada, pois esta apresenta dimensões maiores

que a coluna recheada com Si(PMTFS)ec. A coluna C18 apresentou resoluções

maiores que a FE fluorada, porém o tempo de análise foi superior. As separações

conseguidas nas duas colunas foram boas, contudo vale ressaltar a eficiência da

FE Si(PMTFS)ec na separação dos agrotóxicos, uma vez que suas dimensões

eram bem menores.

4.4.3 Separação de Fármacos

Para comprovar que a coluna Si(PMTFS)ec é eficaz na separação de

fármacos, devido às interações dos átomos de flúor com os compostos polares, foi

utilizada uma mistura de benzodiazepínicos, como o bromazepam, alprozolam,

lorazepam e diazepam. Esses quatro compostos pertencem ao grupo de fármacos

com função ansiolítica.82A mistura desses compostos foi bem separada utilizando

a coluna fluorada, com bom tempo de análise, bons fatores de assimetria e

eficiência, como pode ser confirmado na Tabela 10 e na Figura 39.

80

0 5 10 15

Tempo (min)

C18 Nova Pack

12

3

4

Res

post

a do

Det

ecto

r

Si(PMTFS)ec

1 2

3

4

Figura 38- Cromatogramas obtidos na separação de uma mistura de fármacos

usandocolunas diferentes: A) Si(PMTFS)ec dimensões (60mm x 3,9 mm d.i) e B) C18

Nova Pak(150 mm x 4,6 mm d.i). Condições cromatográficas:fase

móvelMeOH:tampãoformiato pH=3,0 55:45(v/v), volume de injeção: 5µL, vazão: 0,300 mL

min-1 , detecção UV: 254 nm e temperatura ambiente. Identificação dos picos: 1-

bromazepam, 2 - alprozalam, 3- lorazepam, 4-diazepam.

Utilizando a coluna C18 (Nova Pak), o tempode análise foi maior em

relação a coluna recheada com a FE Si(PMTFS)ec. O alprazolam, por

exemplo,apresentou fator de assimetria inadequado quando analisado na coluna

C18 Nova Pak. Contudo, mesmo a coluna C18 tendo uma eficiência bem maior,

ela apresentou baixa resolução entre o alprozalam e lorazepam, o que não

ocorreu na coluna recheada com a FE Si(PMTFS) ec. A diferença de eficiência se

dá pela diferença dos comprimentos de coluna das utilizadas, pois quanto maior o

comprimento da coluna, maior é a eficiência.2

81

Tabela 10-Parâmetros cromatográficos obtidos nas separações de fármacos usando colunas Si(PMTFS)ec e C18 Nova Pak.

Coluna Si(PMTFS)ec

Composto tR(min) N Eficiência(N/m) As10 Rs

Bromazepam 3,14 2488 41472 1,7 0

Alprozalam 4,08 3034 50575 1,0 3,5

Lorazepam 6,36 2679 44651 1,3 5,8

Diazepam 8,28 3670 61163 1,1 3,7

Coluna C18 Nova Pak

Composto tR(min) N Eficiência(N/m) As10 Rs

Bromazepam 3,57 3480,9 58014,8 1,6 0

Alprozalam 6,28 3421,8 57030,4 0,8 2,9

Lorazepam 6,58 4675,4 77923,9 1,4 0,7

Diazepam 12,28 6788,6 113143,2 1,0 11,6

4.5 Avaliação da Estabilidade Química da FE Si(PMTFS)ec

As Figuras 40, 41 e 42mostram, respectivamente, as variações na

porcentagem de eficiência, no fator de retenção e no fator de assimetria da fase

estacionária Si(PMTFS)ec, ao passar através dela diversos volumes de coluna da

fase móvel alcalina, metanol:tampão de 50 mmol L-1 deK2CO/KHCO3a pH 10,

50:50 v/v,vazão de 1 mL/min e temperatura de 50 ºC. Estas condições agressivas

de FM foram empregadas para acelerar a deterioração da fase estacionária e em

um menor tempo poder avaliar a sua estabilidade química frente a pH alto.

82

Figura 39- Variação da porcentagem de eficiência do acenafteno obtida para a FE Si(PMTFS)ec em função da passagem de fase móvel metanol: 50 mmol L-1 K2CO/KHCO3

a pH 10,0 (50:50 v/v); vazão de 1,0 mL min-1, temperatura de 50 ºC e detecção a 254 nm.

Para avaliar a estabilidade química da fase estacionária, a MT2 foi injetada

a cada 30 minutos e monitorou-se a eficiência do composto mais retido da mistura,

que no caso foi o acenafteno. O decréscimo da eficiência até a metade do seu

valor inicial indica a morte da coluna, isto é, a coluna é considerada inutilizável

após a perda de 50% da sua eficiência.Portanto, após a passagem de cerca de

250 volumes de coluna de FM, a coluna perdeu a sua estabilidade química.

Outro parâmetro cromatográfico que foi avaliado nesse estudo, foi a queda

do fator de retenção, Figura 41, do acenafteno, uma vez que em meio básico (pH

> 8,0) ocorre a dissolução da sílica, na qual a fase estacionária líquida (PMTFS)

se encontra imobilizada, dessa maneira, a diminuição do fator de retenção do

analitosugere a degradação da coluna cromatográfica.

0 100 200 300 400 500 600 700 800

0

20

40

60

80

100

Eficiê

ncia

(%

)

Volume de Coluna

83

Figura 40- Variação do fator de retenção (k) do acenafteno obtido para a FE Si(PMTFS)ec em função da passagem de fase móvel metanol: 50 mmol L-1 K2CO/KHCO3

a pH 10,0 (50:50 v/v); vazão de 1,0 mL min-1 temperatura de 50 ºC e detecção a 254 nm.

Considerando os resultados obtidos para a FE Si(PMTFS)ec e comparando

com as informações obtidas da literatura sobre a FE Si(PMTFS)79em ternos da

queda na eficiência em relação ao pico do acenafteno, a FE capeada apresentou

maior estabilidade química, uma vez que resistiu a passagem de

aproximadamente 250 volumes de coluna, enquanto a FE Si(PMTFS) resistiu a

aproximadamente 150 volumes de coluna. A maior resistência da FE fluorada

capeada é explicada devido ao maior recobrimento da FE após a reação de

capeamento. Entretanto, a estabilidade química das FE fluoradas foi inferior a

várias outras FE preparadas no LabCrom empregando suporte de sílica não

modificado e FE não capeadas.

Os fatores de retenção e de assimetria para a FE Si(PMTFS)ec se

mostraram instáveis até o final do teste, sendo que o decréscimo do fator de

retenção do acenafteno e o aumento da assimetria de seu pico estão relacionados

0 100 200 300 400 500 600

0

2

4

6

8

10

12

14

k

Volume de Coluna

84

com a perda contínua da FE líquida, ocasionada pela dissolução do suporte

cromatográfico.

Figura 41- Variação do fator de assimetria (As10%) do acenafteno obtido para a FE Si(PMTFS)ec em função da passagem de fase móvel metanol: 50 mmol L-1 K2CO/KHCO3 a pH 10,0 (50:50 v/v); vazão de 1,0 mL min-1 temperatura de 50 ºC e detecção a 254 nm.

Antes dos testes, a FE foi submetida a análise elementar para a obtenção

da quantidade de carbono presente na FE.A FE Si(PMTFS)ec apresentou 11, 88

% de carbono, no início dos testes. Após o teste de estabilidade química frente à

fase móvel básica, a quantidade de carbono mensurada na FE foi próxima a 0,3%,

comprovando a perda da FE, após a passagem de um volume relativamente

pequeno de FM, apontando para uma FE de baixa estabilidade química em pH

elevado de FM.

0 100 200 300 400 500

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0A

s10%

Volume de Coluna

85

5 Conclusão

Os espectros de absorção na região do infravermelho, bem como os de

RMN de29Si,confirmaram que houve uma interação efetiva da sílica com o PMTFS

edemonstraram que a reação de capeamento foi bem sucedida. O aumento da

hidrofobicidade da FE é característico após o capeamento e foi confirmado através

do aumento da porcentagem de carbono, verificada nas análises elementares.

Na caracterização cromatográfica observou-se que os parâmetros

avaliados, eficiência, fator de assimetria e resolução, melhoraram após a reação

de capeamento, bem como sua estabilidade química. A diminuição dos grupos

silanóis residuais reduziu significativamente as interações de compostos básicos

com a FE. Os testes de Tanaka e colaboradores70 caracterizaram a FE

Si(PMTFS)ec como apropriada para separar compostos que diferenciam entre si

pelo grupo metila e pela configuração espacial. A inserção dos grupos

trimetilsilano diminuiu a atividade sinalofílica e a interação por troca iônica, em

relação a FE sem o capeamento. O efeito “U-shape” foi observado nesta FE,

mesmo após a diminuição das interações por troca iônica da FE Si(PMTFS)ec.

Este efeito depende do pH da FM e dos pKa dos compostos analisados.

As separações de compostos fluorados, alguns fármacos e agrotóxicos

mostraram que a FE Si(PMTFS)ec pode ser aplicada em cromatografia líquida de

alta eficiência em fase reversa.

A estabilidade química da fase Si(PMTFS)ec frente a fase móvel a pH 10,

foi superior à FE Si(PMTFS), no entanto, essas fases se mostraram mais

instáveis em relação às FE preparadas no grupo do LabCrom.

Embora a baixa estabilidade química em meio básico seja uma

desvantagem, o efeito U-shape, que ocorreu nesta FE, aumenta a retenção de

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compostos básicos em alta concentração de solvente orgânico em FM, o que leva

a ser considerada vantajosa, sobretudo, quando se emprega oespectrômetro de

massas na detecção de compostos básicos e polares.

87

6 Referências Bibliográficas

(1) Borges, E. M. .; Goraieb, K. Quim. Nova2012, 35, 993–1003.

(2) Faria, A. M.; Collins, C. H.; Jardim, I. C. S. F. 2009, 20, 1385–1398.

(3) Chen, X.; Griesser, U. J.; Te, R. L.; Pfeiffer, R. R.; Morris, K. R.; Stowell, J. G.; Byrn, S. R. J. Pharm. Biomed. Anal.2005, 38, 670–677.

(4) J.L.Wells. Pharmaceutical Preformulation: The physicochemical properties of drug substances; Ellis Horw.; New York, 1988.

(5) McCalley, D. V. J. Chromatogr. A2010, 1217, 858–880.

(6) Lanças,F.M. Cromatografia liquida moderna - hplc/clae; edição, 1a, Ed.; Atomo.; 2009.

(7) K.K. Unger, U. T. High performace liquid chromatography; Willey.; New York, 1989.

(8) Pesek, J. J.; Matyska, M. T. J. Sep. Sci.2005, 28, 1845–1854.

(9) Rudazl, C. S. S.; Tchapla, J. V. A. 2001, 53.

(10) Nawrocki, J. J. Chromatogr. A1997, 779, 29–71.

(11) Synder, L. R.; Kirkland, J. J.; Glajch, J. L. Practical hplc method development; 2, Ed.; Wiley.; New York, 1997.

(12) Tonhi, E.; Collins, K. E.; Jardim, I.C.S.F; Collins, C. H. 2002, 25, 616–623.

(13) McCalley, D. V. J. Chromatogr. A2010, 1217, 858–880.

(14) Engelhardt, H.; Blay, C.; Saar, J. Chromatographia2005, 62, s19–s29.

(15) Wyndham, K. D.; Gara, J. E. O.; Walter, T. H.; Glose, K. H.; Lawrence, N. L.; Alden, B. A.; Izzo, G. S.; Hudalla, C. J.; Iraneta, P. C. 2003, 75, 6781–6788.

(16) Yu, H.; Jia, C.; Wu, H.; Song, G.; Jin, Y.; Ke, Y.; Liang, X. J. Chromatogr. A2012, 1247, 63–70.

(17) Cheng, Y.; Walter, T. H.; Lu, Z.; Iraneta, P.; Bonnie, A.; Gendreau, C.; Neue, U. D.; Grassi, J. M.; Carmody, J. L.; John, E.; Gara, O.; Fisk, R. P. 2000, 18.

88

(18) Silva, C. R.; Airoldi, C.; Collins, K. E.; Collins, C. H. J. Chromatogr. A2008, 1191, 90–98.

(19) Silva, C. R.; Airoldi, C.; Collins, K. E.; Collins, C. H. J. Chromatogr. A2005, 1073, 155–162.

(20) Vigna, C. R. M.; Morais, L. S. R.; Collins, C. H.; Jardim, I. C. S. F. J. Chromatogr. A2006, 1114, 211–215.

(21) Da Silva, C. G. a; Collins, C. H. J. Chromatogr. A2012, 1232, 248–256.

(22) Da Silva, C. G. a; Collins, C. H.; Lesellier, E.; West, C. J. Chromatogr. A2013, 1315, 176–187.

(23) Faria, A. M.; Collins, K. E.; Collins, C. H. J. Chromatogr. A2007, 1156, 51–59.

(24) Da Silva, C. G. a; Collins, C. H. J. Chromatogr. A2012, 1260, 81–87.

(25) Pesek, J. J.; Matyska, M. T.; Yu, R. J. J. Chromatogr. A2002, 947, 195–203.

(26) Maldaner, L.; Collins, C. H.; Jardim, I. sabel C. F. S. 2010, 33, 1559–1568.

(27) Li, L.; Car, P. W.; Evans, J. F. J. Chromatogr. A2000, 868, 153–167.

(28) Kirkland, J. J. J. Chromatogr. A2004, 1060, 9–21.

(29) Silva, C. R.; Jardim, I. C. S. F.; Collins, C. H. 2004, 27, 270–276.

(30) Road, M.; Straten, M. A. Van; Claessens, H. A. 1998, 70, 4344–4352.

(31) Words, K.Chromatographia.1984, 19, 170–179.

(32) Words, K.Chromatographia.1984, 18, 265–274.

(33) Schomburg, G. TrAC Trends Anal. Chem.1991, 10, 163–169.

(34) Claessens, H. a.; van Straten, M. a. J. Chromatogr. A2004, 1060, 23–41.

(35) Petro, M.; Berek, D. Chromatographia1993, 37, 549–561.

(36) Bottoli, C. B. .; Vigna, C. R. .; Fischer, G.; Albert, K.; Collins, K. E.; Collins, C. H. J. Chromatogr. A2004, 1030, 217–223.

(37) Fonseca, D. a; Collins, K. E.; Collins, C. H. J. Chromatogr. A2004, 1030, 209–215.

89

(38) Vigna, C. R. M.; Bottoli, C. B. G.; Collins, K. E.; Collins, C. H. J. Chromatogr. A2007, 1156, 60–67.

(39) Morais, L. S. R.; Jardim, I. C. S. F. J. Chromatogr. A2005, 1073, 127–135.

(40) Begnini, F. R.; Jardim, I. C. S. F. J. Chromatogr. A2013, 1297, 113–122.

(41) Lopes, N. P.; Collins, K. E.; Jardim, I. C. S. . J. Chromatogr. A2004, 1030, 225–229.

(42) Silva, R. B.; Collins, K. E.; Collins, C. H. J. Chromatogr. A2000, 869, 137–141.

(43) Costa Melo, L. F.; Jardim, I. C. S. F. J. Chromatogr. A1999, 845, 423–431.

(44) Lopes, N. P.; Collins, K. E.; Jardim, I. C. S. F. 2003, 987, 77–85.

(45) Júnior, E. S. da S. Preparação de Fases Estacionárias para CLAE com uma Mistura de Poli(dimetilsiloxano) e Poli(metiloctadecilsiloxano) Sorvidos e Imobilizados por Tratamento Térmico sobre Sílica., UNICAMP, 2007.

(46) Bottoli, C. B. G. Sorção, imobilização e extraçao de polissiloxanos em sílica porosa para uso em cromatografica líquida de alta eficiência., UNICAMP, 2002, p. 209.

(47) Farias, A. M. Desenvolvimento de fases estacionarias para cromatografia liquida de alta eficiencia em fase reversa a partir da adsorção e imobilização do poli(metiltetradecilsiloxano) sobre silica metalizada, UNICAMP, 2010.

(48) Fioravanti, L. M. A. Preparação e caracterização de fases estacionárias para CLAE de pol(metilfenilsiloxano) sobre sílica sorvida e imobilizada por radiaçao micro-ondas., UNICAMP, 2007, p. 100.

(49) Lourenço, J. Preparação e caracterização de fases estacionarias de dimetil-metil-fenil siloxano sobre silica para cromatografia liquida de alta eficiencia, 2005.

(50) Maldaner, L.; Jardim, I. C. S. F. J. Sep. Sci.2010, 33, 174–181.

(51) Maldaner, L.; Jardim, I. C. S. F. Chromatographia2010, 72, 617–626.

(52) Uneyanna, K. Organoflurine Chemistry; Blackwell .; 2006.

(53) Chamber, R. . Flurine in Organic Chemistry; Blackwell .; 2004.

90

(54) Krisch, P. Modern, Fluorooganic Chemistry-Synthesis, Reactivity, Applications; Wiley-VCH.; Weinheim, 2004.

(55) Zhang, W. J. Fluor. Chem.2008, 129, 910–919.

(56) Turowski, M.; Morimoto, T.; Kimata, K.; Monde, H.; Ikegami, T.; Hosoya, K.; Tanaka, N. J. Chromatogr. A2001, 911, 177–190.

(57) V, E. S. P. B.; Danielson, D.; Beaver, G. 1991, 544, 187–199.

(58) West, C.; Lesellier, E. J. Chromatogr. A2006, 1110, 200–213.

(59) Shearer, J. W.; Ding, L.; Olesik, S. V. J. Chromatogr. A2007, 1141, 73–80.

(60) Vantran, K.; Iraneta, P. C.; Alden, B. A. 2003, 174–186.

(61) Development, A. 2003, 295–306.

(62) Glatz, H.; Blay, C.; Engelhardt, H.; Bannwarth, W. Chromatographia2004, 59, 567–570.

(63) Kiridena, W.; DeKay, C.; Koziol, W. W.; Ali, Z.; Ahmed, H.; Poole, C. F. Chromatographia2006, 63, 407–417.

(64) Marchand, D. H.; Croes, K.; Dolan, J. W.; Snyder, L. R.; Henry, R. a.; Kallury, K. M. R.; Waite, S.; Carr, P. W. J. Chromatogr. A2005, 1062, 65–78.

(65) Poole, C. .; Tour, J. . Org. Chem2005, 70, 3396–3424.

(66) Wu, N.; Shen, Y.; Lopez-Avila, V.; Lee, M. L. J. Microcolum Sep.1999, 11, 287–897.

(67) Kord, A. S.; Khaledi, M. . Anal. Chem.1992, 64, 1901–1907.

(68) Thomas, D. P.; Foley, J. P. J. Chromatogr. A2004, 1060, 1–11.

(69) Cordoba-Borrego, M.; Cordoba-Diaz, M.; Cordoba-Diaz, D. J. Pharm. Biomed. Anal.1999, 18, 919–926.

(70) Kimata, K.; Iwaguchi, K.; Onishi, S.; Jinno, K.; Hosoya, K.; Araki, M.; Tanaka, N. J. Chromatogr. Sci.1989, 27, 721–728.

(71) Collins, C. H. .; Braga, G. L. .; Bonato, P. S. . Fundamentos de cromatografia; UNICAMP, Ed.; Campinas, 2006.

91

(72) Brown, P. R.; Weston, A. Hplc and ce principles and pratice; Academic P.; London, 1997.

(73) Collins, K. E. .; Franchon, A. C. .; Jardim, I. C. S. F. .; Radanovic, E. .; Gonçalves, M. C. . LC-GC N. AM2000, 18, 106–117.

(74) Elmer, P. Use’s manual elemental analysis; Norwalk: Perkin Elmer, Ed.; 1996.

(75) Brunauer, S.; Emmett, P.; Teller, E. J. Am. Chem. Soc.1938, 60, 309–319.

(76) Barrett, E.P.; Joyner, L.G.; Halend, P. . 1951, 72, 373 – 340.

(77) Meynen, V.; Cool, P.; Vansant, E. F. 2009, 125, 170–223.

(78) Convention, U. S. P. (USP). US Pharmacopeia 27; Rockville, Ed.; 2004.

(79) Jardim, I. C. S. F.; Maldaner, L.; Lourenço, J.; Fioravanti, L. M. a; Collins, C. H. J. Sep. Sci.2010, 33, 2917–2929.

(80) Synder, L. R.; Kirkland, J. J.; Glajch, J. L. Practical hplc method development; 2, Ed.; Wiley.; New York, 1997.

(81) Euerby, M. R.; Petersson, P.; Campbell, W.; Roe, W. J. Chromatogr. A2007, 1154, 138–151.

(82) DrungBank, Disponível em: www.drugbank.ca. Acessado em Maio de 2014.

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