DNA Profiling e Genetica Forense

Silvia Fuselli fss@unife.it

Lezione 1

I geni negli individui

• Omozigote: lo stesso allele ad un locus in organismi diploidi (o poliplodi)

• Eterozigote: Alleli diversi ad un locus in organismi diploidi (o poliplodi)

E O E

I geni nelle popolazioni• Polimorfico: presenza di >1 tipo genico distinto nella

popolazione (variante, forma alternativa)

• Monomorfico: nella popolazione esiste un solo tipo genico

P M P

I geni nelle popolazioni• Polimorfico: presenza di >1 tipo genico distinto nella popolazione (variante,

forma alternativa)

• Monomorfico: nella popolazione esiste un solo tipo genico

Il polimorfismo può essere inteso su scala genetica (esempio: single nucleotide polymorphism, SNP)

O su scala popolazionistica (colori, tipi di giaguari in Sud America)

Distribuzione nel genoma dei diversi tipi di marcatori molecolari polimorfici

Tassi di mutazione (frequenza)

I microsatelliti (short tandem repeats, STRs)

Sequenze ripetitive di 2-5 paia di basi in tandem

Come ottenere un profilo individuale STR (DNA fingerprinting)

Raccolta del campione biologicoEstrazione del DNA

Amplificazione delle regioni di interesse(primer marcati fluorescenti)

Lettura dei frammenti con un sequenziatore automatico a capillare

Ladder: una specie di “legenda”Include tutti gli alleli conosciuti (ripetizioni) ad ogni locus in analisi

Il profilo STR del campione in esme può essere definito confrontando gli alleli con quelli della ladder

Omozigote 15:15

Eterozigote 14:16 Eterozigote

24:25

Single nucleotide polymorphism (SNP)

La sequenza genomica di ogni coppia di individui della nostra specie è uguale (in media) per il 99.9%.

Circa 1 in 1000 “lettere” del DNA umano può variare in forma di SNP.

Regola generale: 1 SNP ogni 1000 bp all’interno della nostra specie, 1 SNP ogni 100 uomo-scimpanzè

Polymerase chain reaction (PCR)

qualche ora

Dal prodotto di PCR al sequenziamento di Sanger

94-96°C

50-68°C

68-72°C

Dal prodotto di PCR al sequenziamento di Sanger

Verifica dell’avvenuta reazione (e possibile quantificazione), ad esempio per elettroforesi su gel di agarosio

Marker (frammenti a lunghezza nota)

Prodotto di reazione

Purificazione del prodotto di PCR:

Esempio Exo/SAP (dobbiamo pulire da dNTPs e primers residui)

Strand Separation

Primer Annealing

Termination

Elongation

Il sequenziamento di Sanger

Standard Nucleotides

ddNTP incorporation leads to chain growth termination

Dye-labeled dideoxynucleotides

Termination

http://www.wiley.com/college/pratt/0471393878/student/animations/dna_sequencing/index.html

Capillary Electrophoresis ABI 3730, 96-capillary

cromatogramma

Un programma specifico opera il BASECALLING (converte i picchi in A, T, G, C)

Stranneheim and Lundeberg 2012

2000

https://www.illumina.com/systems/sequencing-platforms.html

illumina

illumina

illumina

1800 Gb maximum output

Huma genome: 3.3 Gb

Che copertura (coverage) ottengo per un genoma con una run?

illumina

https://www.thermofisher.com/it/en/home/brands/ion-torrent.html

Ion Torrent

Applications

Epigenetica

Espressionegenica

Caratterizzazione regioni di interazione DNA-proteine

Applications: genomes, exomes, transcriptomes

Applications

Applications

environmental DNA (eDNA)

Can be avoided

• Frammentazione

• Size selection

• Legame adattatorilibrary

• Serve a reggiungere una quantità di DNA stampo sufficiente per la letturadel sequenziamento

Template preparation

• Sequencing by synthesis

• Lettura del segnalesequencing

Preparazione della library

Preparazione della libraryIl DNA va pre-processato prima di essere sequenziato

Passaggi:

1. Frammentazione (fisica o enzimatica)

2. Le estremità dei frammenti vengono riparate e rese «blunt» o con specifici nucleotidi terminali (es A o T)

3. Alle estremità vengono legati degli adattatori specifici per ogni NGS technology

Preparazione della library

Preparazione della library

Preparazione della library: Illumina

Preparazione della libraryPreparazione della library: Illumina

https://www.youtube.com/watch?v=bFNjxKHP8Jc

https://www.youtube.com/watch?v=DyijNS0LWBY

https://www.youtube.com/watch?v=ZlPH9FzUOq8https://www.youtube.com/watch?v=fCd6B5HRaZ8

Gli adattatori P5 e P7 servono per legare il frammento da sequenziare alla flow cell dove ci sono delle sequenze complementari e servono anche da primer

Release of an H+ during extension (Ion Torrent)

Quali campioni e quali dati sono tipici della metagenomica?

Target capture and variant calling

Alcune definizioni

• Metagenomics: is the study of all genomes present in any given environment without the need for prior individual identification or amplification

• DNA barcoding: DNA barcoding is a taxonomic method, that uses one or more standardized short genetic markers in an organism’s DNA to identify it as belonging to a particular species. Through this method unknown DNA samples are identified to registered species based on comparison to a reference dataset

• Metabarcoding: biodiversity assessment using DNA barcodes

• Environmental DNA (eDNA): complex mixture of genomic DNA from manydifferent organisms found in an environmental sample

• Microbiome: all the microbes in a community

Metagenomics is the study of genetic material recovered directly from environmental samples. (Wikipedia)

Metagenomics is the study of all genomes present in any given environment without the need for prior individual identification or amplification. For example, in its simplest form, a metagenomic study might be the direct sequence results of DNA extracted from a bucket of sea water. (EBI metagenomics)

OTU: Operational Taxonomic Unit. The taxonomic level of sampling defined by the researcher in a study; for example, individuals, populations, species, genera, or strains.

https://www.ebi.ac.uk/metagenomics/

Shot-gun(sequenzio tutto!)

Amplicon-based

Con i nuovi metodi di sequenziamento e l’aumento di informazioni nelle banche dati si può passare ad uno shotgun sequencing (simile ad un sequenziamento genomico, ma di tutto ciò che è stato raccolto nel campione) (vedere il progetto http://extrememicrobiome.org/)

(A) Sampling from habitat(B) filtering particles, typically by size(C) DNA extraction and lysis(D) sequencing (E) sequence assembly.

http://blog.booleanbiotech.com/nanopore_2016.html

D

E