doktorantka: Żaneta muchewicz promotor główny · *mikroskopia sił atomowych (afm) analiza...
TRANSCRIPT
Doktorantka: Żaneta Lewandowska
Główny opiekun naukowy: Dr hab. Piotr Piszczek, prof. UMK – Katedra Chemii Nieorganicznej i Koordynacyjnej, Wydział Chemii
Dodatkowy opiekun naukowy: Prof. dr hab. Wiesław Kozak – Zakład Immunologii,
Wydział Biologii i Ochrony Środowiska
Badania nad wytwarzaniem
nanopowłok o działaniu
przeciwzapalnym oraz
możliwościami ich wykorzystania
do otrzymania nowej generacji
implantów stosowanych w
chirurgii twarzowo-szczękowej
Badanie właściwości
fizykochemicznych
Badanie topografii powierzchni
*Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)
*Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)
*Mikroskopia sił atomowych (AFM)
Analiza jakościowa warstw
* Spektroskopia odbicia rozproszonego w podczerwieni (DRIFT)
*Metoda dyfrakcji rentgenowskiej (EDX, XRD)
Ocena aktywności fotokatalitycznej
Badanie kąta zwilżania
Ocena stabilności i trwałości materiałów powłokowych w środowisku płynów ustrojowych
Ocena stabilności i trwałości materiałów
powłokowych w środowisku płynów ustrojowych
Czysty Ti oraz TNT o średnicy 23, 30 oraz 96 nm
pokryte nanosrebrem w różnych ilościach
(5, 10 i 15 mg użytego prekursora Ag)
Zanurzenie próbek w roztworze soli
fizjologicznej (PBS) – symulacja płynów ustrojowych człowieka
Czas zanurzenia – 1, 3 i 4 tygodnie
0
4
8
12
16
20
0 1 2 3 4
Wy
nik
[µ
g/l
]
tydzień
TNT 4V
0
5
10
15
20
25
30
0 1 2 3 4
Wy
nik
[µ
g/l
]
tydzień
TNT 6V
0
3
6
9
12
15
0 1 2 3 4
Wy
nik
[µ
g/l
]
tydzień
TNT 18V
0
4
8
12
16
20
0 1 2 3 4
Wy
nik
[µ
g/l
]
tydzień
Tytan
5 mg 10 mg 15 mg 30 mg
Badania biologiczne
Badania immunologiczne
*Zakładanie hodowli komórkowej fibroblastów
*Ocena żywotności fibroblastów za pomocą testu MTT
*Izolacja i hodowla komórek mononuklearnych
*Oznaczenie stężenia zapalnych i przeciwzapalnych cytokin we krwi za pomocą testu ELISA
Badania mikrobiologiczne
*Staphylococcus aureus ATCC 29213 – szczep referencyjny
*Staphylococcus aureus H9 – szczep kliniczny
Przygotowanie materiału biologicznego do obrazowania
Fibroblasty – warunki hodowli
W doświadczeniu użyto mysie fibroblasty linii komórkowej L929
Hodowlę prowadzono we wzbogaconej pożywce hodowlanej RPMI 1640 zawierającej 2 mM L-glutaminy,10% inaktywowanej surowicy płodowej bydlęcej (FBS), 100 mg streptomycyny/ml i 100 IU penicyliny/ml
Biomateriał użyty podczas doświadczeń in vitro został wcześniej wysterylizowany przy użyciu autoklawu (121°C przez 15 minut)
Wpływ rodzaju materiału biologicznego na adhezję komórek L929 (po 24h) i proliferacji (po 72h) oceniano za pomocą testu MTT
Komórki mononuklearne
– warunki hodowli
Komórki mononuklearne izolowano z krwi obwodowej szczurów rasy Wistar
wykorzystując metodę wirowania w jednostopniowym gradiencie gęstości
Biomateriał użyty podczas doświadczeń in vitro został wcześniej wysterylizowany przy
użyciu autoklawu (121°C przez 15 minut)
Poszczególne warianty stymulacji i inkubacji komórek przeprowadzono z użyciem
1 mln komórek/ml inkubowane w pożywce hodowlanej RPMI 1640
Kontrolna stymulacja komórek z LPS (stężenie 1 μg/ml/106 komórek ) była
przeprowadzona przez 4h
Kontrolna inkubacja komórek z 0,9% sterylnym NaCl była przeprowadzona również
przez 4h
Po upływie czasu inkubacji komórek z badanymi płytkami zebrano supernatanty do
probówek typu Eppendorf i próby zwirowano, a następnie zamrożono w -20°C i
wykorzystano podczas oznaczania poziomu TNF-α i PGE2 z użyciem testu ELISA.
Porównanie średnich stężeń PGE2 zmierzonych w
supernatantach pohodowlanych po inkubacji
komórek mononuklearnych z badanymi płytkami w
dwóch wariantach czasowych
0
50
100
150
200
250
Ti Ti+Ag 23nm 23nm+Ag 38nm 38nm+Ag
30,6 42,2
28,2
7,3
121,1 110,2
94,8 92
111,8 99,6
204
129,6
Stę
żen
ie P
GE
2 [
pg
/ml]
wariant doświadczenia
po 4 godzinach
po 24 godzinach
Zmiana w stężeniu PGE2 uwalnianej przez komórki
mononuklearne inkubowane z badanymi płytkami,
które zaobserwowano pomiędzy 4- i 24-godzinami
inkubacji.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Ti Ti+Ag 23nm 23nm+Ag 38nm 38nm+Ag
210
118
296
1267
68 18
Zm
ian
a ilo
ści PG
E2 w
cią
gu
do
by
[%]
Porównanie średnich stężeń TNF-α zmierzonych w
supernatantach pohodowlanych po inkubacji
komórek mononuklearnych z badanymi płytkami w
dwóch wariantach czasowych
0
50
100
150
200
250
Ti Ti+Ag 23nm 23nm+Ag 38nm 38nm+Ag
70,5
95,3
119,7
90,9
19,1
45,5
133,6
157,1
231,3
210,1
243,6
136
Stę
żen
ie T
NF-α
[p
g/m
l]
wariant doświadczenia
po 4 godzinach
po 24 godzinach
Zmiany w stężeniu TNF-α produkowanego przez
komórki mononuklearne inkubowane z badanymi
płytkami, które zaobserwowano pomiędzy
4 i 24-godzinami inkubacji.
0
200
400
600
800
1000
1200
Ti Ti+Ag 23nm 23nm+Ag 38nm 38nm+Ag
90 65 93 131
1179
199
Wzr
ost
ilo
ści TN
F-α
w c
iąg
u d
ob
y [
%]