11
Caracterização do domínio Péctico Homogalacturonano naParede Celular de Cacau (Theobroma cacao L.) e
análise da Expressão Tecido-Específica de genes envolvidos nas Reações de Reciclagem de Grupos Metil durante a
Doença Vassoura-de-Bruxa
Orientador: Prof. Dr. Gonçalo A. G. Pereira
Co-orientadora: Dra. Maria Carolina Sacatolin do Rio
Aluno: Gleidson Silva Teixeira
22
Tópicos da Apresentação
• Introdução– A Vassoura-de-bruxa– Parede celular primária– Homogalacturonano (HGA)– Reciclagem de metil via SAM (S-adenosil-L-metionina)
• Objetivos• Metodologia• Resultados preliminares• Próximos passos
33
Introdução
• A Vassoura-de-Bruxa• Agente etiológico: Moniliophthora perniciosa• Evolução e sintomas da doença
44
• Implicações no desenvolvimento vegetal• Defesa contra a invasão por microrganismos
IntroduçãoParede celular primária
Zeiger, T. Plant Physiology 3ed 2005.
55
Domínios pécticos
Willats, WGT et al. Plant Molecular Biology 2001a.
(1→2)-α-L-rhamnose-(1→4)-α-D-galacturonic acid
(1→4)-α-linked-D-galacturonic acid
Introdução
66
Homogalacturonano (HGA)
Ridley, BL et al. Phytochemistry 2001.
1
4
6
6
3
2
(1→4)-α-linked-D-galacturonic acid
Introdução
77
Homogalacturonano (HGA)Introdução
Willats, WGT et al. Planta 2001b.
• Ocorrência de GalA não metilado na superfície de células epidermais e radícula
• Regiões de-metiladas restritas a junções celulares
88
IntroduçãoReciclagem de grupos metil
Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002.
ACC
ACC Synthase
ACC Oxidase
(1-aminocyclopropane-1-carboxylate)
SAM Synthase
demethylesterificationPME
Índice de metil SAM:SAH
99
IntroduçãoAlterações na atividade de HGA-MT
Mouille, G et al., The Plant Journal 2007.
PAM1Qua2
Krupková, E et al., The Plant Journal 2007.
TSD2
1010
IntroduçãoReciclagem de grupos metil
Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002.
(-)
ACC
ACC Synthase
ACC Oxidase
(1-aminocyclopropane-1-carboxylate)
SAM Synthase
demethylesterificationPME
1111
Alterações na atividade de SAHH Introdução
1212
IntroduçãoReciclagem de grupos metil
Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002.
(-)(-)
ACC
ACC Synthase
ACC Oxidase
(1-aminocyclopropane-1-carboxylate)
SAM Synthase
demethylesterificationPME
1313
Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002.
Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002.
IntroduçãoAlterações na atividade de ADK
1414
Introdução
Pereira, LAR et al., Planta 2006b.
Alterações na atividade de ADK
(10% ADK activity)
LM7
1515
IntroduçãoAlterações na atividade de SAMS
• Aumento da atividade de SAMS• Acúmulo de SAM e SAH
SAMS
1616
IntroduçãoReciclagem de grupos metil
Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002.
ACC
ACC Synthase
ACC Oxidase
(1-aminocyclopropane-1-carboxylate)
SAM Synthase
demethylesterificationPME
?
1717
SAM com precursor de etileno Introdução
Scarpari, LM et al. J Exp Bot 2005.
1818
IntroduçãoReciclagem de grupos metil
Moffatt, BA et al. Plant Physiology 2002.
ACC
ACC Synthase
ACC Oxidase
(1-aminocyclopropane-1-carboxylate)
SAM Synthase
demethylesterificationPME
1919
Lionett, V et al., Plant Physiology 2007.
Alterações na atividade de PMEs Introdução
2020
• Caracterização do domínio péctico HGA;
• Análise da expressão de genes envolvidos nas reações de reciclagem de metil via SAM
Objetivos do projeto
2121
MetodologiaExperimento em
casa de vegetação
Hibridização in situ Imunolocalização
Fixação em Karnovsky Escolha dos epítopos
Desidratação e inclusão
Microtomia emontagem
Escolha das lâminas
Definição dosanticorpos primários
Síntese de anticorpossecundários
FotografiaFotografia
Interpretação dosresultados
Desidratação e Inclusão
Microtomia emontagem
Escolha das lâminas
Síntese de cDNA eamplificação
Clonagem eseqüenciamento
Linearização e transcrição in vitro
Escolha dos genes esíntese de primers Fixação em FAA
Extração de RNA
2222
ACC
SAM Synthase
demethylesterificationPME
QUA1 e QUA2
ACC Oxidase
JIM5 – JIM7
PAM1
Resultados preliminares
2323
28S rRNA
18S rRNA
T. c
acao
T. c
acao
M. m
uscu
lus
• Extração de RNA
Resultados preliminares
2424
Qua1 Qua2 PME SAHH ADK SAMS CaffMT Accox 50bp
200bp
Resultados preliminares
• Síntese de cDNA e amplificação por PCR
2525
• Clonagem
Resultados preliminares
200bp
50bp PME 50bp ADK ADK
200bp
50bp Qua1 Qua2 PME SAHH ADK SAMS CaffMT Accox
200bp
200bp
2626
• Seqüenciamento
100bp Qua1 Qua2 PME SAHH ADK SAMS CaffMT Accox
400bp
Resultados preliminares
M13 F 2949
M13 R 197
2727
ER-Sp6 T7 (F) ER-T7 Sp6 (R) F B1 +R B4 -F C2 +R C4 -F D2 -R D4 +F E3 -R E4 +F F1 +R F4 -F G2 -R G4 +F A2 -R A5 +F x +R H4 -
SAMS
CaffMT
Accox
Qua1
Qua2
PME
SAHH
6
7
8
1
2
3
4
Linearização/TranscriçãoAmostra Frame (BLASTx)
Linearização/Transcrição
Nco I
Nco I
ASSal I
S AS
S AS
AS S
AS S
Nco I
Apa I
GENE
Sal I
Sal I
Sal I
Sal I
5 ADK
Sal I
Nco I
S
S
Nco I
Sal I AS Nco I
Sal I
AS
AS S
Nco I
S
Resultados preliminares
2828
λ hi
nd II
I
4361bp
2322bp
Não
dig
.
S (A
paI)
AS
(Sal
I)
~ 3233bp
Resultados preliminares
• Linearização do plasmídeo
λ hi
nd II
IS
AH
H N
ão d
ig.
SA
HH
AS
(Apa
I)
AD
K S
(Sal
I)
AD
K N
ão d
ig.
4361bp
2322bp
~ 3237bp ~ 3233bp
2929
Próximas etapas
• Transcrição in vitro (síntese da sonda)• Confecção das lâminas para a hibridização• Hibridização in situ• Real-Time PCR ou PCR semi-quantitativo• Confecção das lâminas para a imunolocalização• Imunolocalização
3030
Próximas etapas
Digoxigenin
BCIP/NBT