การศึกษาความสัมพันธทางพันธุกรรม
ของพรรณไม สกุลโมก (Wrightia)
นางสาวอังคณา เรืองบุรี รหัสนิสิต 51032878
คณะวนศาสตร มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร
อาจารยที่ปรึกษาโครงงาน อาจารยสุธีร ดวงใจ
หัวขอในการนําเสนอหัวขอในการนําเสนอ
บทนํา
วัตถุประสงค
อุปกรณและวิธีการศึกษา
ผลการศึกษาและวิจารณผล
สรุปผลการศึกษา
หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม
บทนําบทนํา
พรรณไมสกุลโมก (Wrightia)
หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม
ไมพุมหรือไมตนขนาดเล็ก มียางขาว ใบเดี่ยวเรยีง
ตรงขาม ดอกออกออกเปนชอกระจุกตามปลายกิ่ง
กลีบดอกและกลีบเลี้ยงมจีํานวนอยางละ 5 กลีบ กลีบ
เลี้ยงดานในมีตอมที่โคน (colleters) กลีบดอกเรยีง
ซอนทับกันดานซายในตาดอก ดอกรูปเข็ม หรือรูป
กรวย ดอกบานรูปกงลอ มักพบกระบัง แยกเปนกระ
บังหนากลีบดอก (antepetalous) กระบังระหวาง
กลีบดอก (alternipetalous) และกระบังหนากระบัง
กลีบดอก (altenate lobe) เกสรเพศผู 5 อัน ติดบน
ปากหรือในกลีบหลอด กานเกสรเพศผูสั้น อับเรณูรูป
หัวลูกศร ติดแนบกับยอดเกสรเพศเมยี ไมมีจานฐาน
ดอก รังไขติดเหนือวงกลีบ มี 2 คารเพล แยกกันหรือ
ติดกันเรียวยาวเปนกานเกสรเพศเมีย ออวุลจํานวน
มาก ผลเปนฝกคู ติดกันหรือแยกกัน รูปกระสวย
เมล็ดรูปแถบ ที่โคนมีขนกระจุก (coma)
บทนําบทนํา สกุลโมกมีสมาชิกทัว่โลก 23 ชนิด กระจายพันธุกวาง พบ ในอัฟริกา เอเซีย
และออสเตรเลีย ในไทยมี 14 ชนิด ไดแก โมก Wrightia pubescens, โมกเขา
W. lanceolata, โมกแดง W. dubia , โมกบาน W. religiosa, โมกใบบาง W.
lecomtei, โมกมัน W. arborea, โมกราชินี W. sirikitae, โมกสยาม W.
siamensis โมกเหลือง W. viridiflora โมกเหลืองหอม W. laevis โมกการะเกตุ
W. karaketii, โมกนเรศวร W. poomae และ โมกพะวอ W. tokiae และ มูกขน
W. coccinea
หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม
บทนํา (ตอ)บทนํา (ตอ)
การคนพบโมกชนิดใหมในประเทศไทย
หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม
Middleton and Santisuk, 2001: W. sirikitae Middleton 2007: W. siamensis
Middleton, 2010: W. karaketii, W. poomae and W. tokiae
บทนํา (ตอ) โมกที่เปน Endemic species ในประเทศไทย
หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม
All of them are limestone endemics
บทนํา (ตอ) infrageneric classification: 4 section (Ngan, 1965)
หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม
Middleton (2010) point out “the sectional arrangement in the
genus Wrightia is in need of revision”.
Wrightia sect. Wrightia
Wrightia sect. Scleranthera
Wrightia sect. Wallida
Wrightia sect. Balfouria
บทนํา (ตอ)ขอมูลวงศวานวิวัฒนาการพรรณไมสกุลโมกนําไปใชประโยชนเรื่อง
Wrightia H
Wrightia E
Wrightia D
Wrightia F
Wrightia G
Wrightia B
Wrightia C
Wrightia A Questions
*Infrageneric Classification
Monophyly of the section ?
* Biogeography
Origin of the genus and
dispersal root ?
* Diversification pattern
Origin of the limestone endemic
species ?หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม
บทนํา (ตอ)บทนํา (ตอ)
ขั้นตอนการวิเคราะหความสัมพันธเชิงวิวัฒนาการ
เลือกขอมูลที่เหมาะสม (ลําดับนิวคลีโอไทดหรือลําดับกรดอะมิโน) และเก็บขอมูลของแตละตัวอยางที่ศึกษา
Multiple alignment (โปรแกรม Clustal X)
วิเคราะห phylogenetic จากขอมูลที่ไดจาก Multiple alignment ดวยโปรแกรมที่เหมาะสม
(PHYLIP, DnaSP, MEGA, PAUP, MrBayes)
แสดง tree และแปลผลที่ได
หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม
วัตถุประสงค
เพื่อตรวจสอบความเหมาะสม ของสวนของ cp genome
จํานวน 5 บริเวณ (matK, rps16, rpl16, trnL-trnLF และ
trnSG ) เพื่อใชหาความสัมพันธทางพันธุกรรมของพรรณ
ไมสกุลโมก Wrightia
เพื่อศึกษาความสัมพันธทางพันธกุรรมและวิวัฒนาการ
ของพรรณไมในสกุลโมก Wrightia โดยใชขอมูลดเีอ็นเอ
ในสวนคลอโรพลาสตจีโนม
หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม
ตัวอยางพรรณไมสกุลโมกที่ศึกษา
อุปกรณและวิธีการศึกษา
หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม
Type specimen โมกนเรศวร W. poomae
และ โมกพะวอ W. tokiae
33 ตัวอยางของพรรณไมสกุลโมก ตัวอยาง
ใบเก็บในซิลิกาเจล (8 ตัวอยาง sequenced)
DNA extraction
PCRPCR
PCR purification
Sequencing PCR
Editing and Assembling DNA sequences
Multiple Alignment
Phylogenetic analyses
หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม
อุปกรณและวิธีการศึกษา(ตอ)
การสกัดดีเอ็นเอ โดยใชวิธี Modified CTAB
Liquid nitrogenลางดวย Sorbitol 2
ครั้งCTAB
Chloroform
isopropanal70 % ethanol TE buffer RNases
หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม
อุปกรณและวิธีการศึกษา(ตอ)
เลือกสวน cp genome สําหรับใชศึกษา
matK gene
rpl16
rps16
trnL-trnLF
trnSG
หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม
อุปกรณและวิธีการศึกษา(ตอ)
การทํา PCR: cp 65 C -1.5 min.
หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม
94 C 50 C 65 C
1 min. 0.45 min. 1.3 min.
อุปกรณและวิธีการศึกษา(ตอ)
การทํา PCR purification
สง PCR product ไป sequence ที่ Biodesign (Direct sequencing)
Phosphatase + Exonuclease PCR product
หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม
37 C 85 C
45 min. 15 min.
อุปกรณและวิธีการศึกษา(ตอ)
Editing DNA sequence and Assembling: chromas Pro
การทํา Multiple Alignment
การทํา Phylogenetic analyses: MP in PAUP
หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม
อุปกรณและวิธีการศึกษา(ตอ)
ผลและวิจารณการศึกษา
ผลการสกัดดีเอ็นเอ: Silica dried + modified CTAB
หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม
ผลและวิจารณการศึกษา (ตอ)
ผลการทํา PCR: primer and PCR condition
matK gene OK
trnL-trnLF OK
rpl16 OK
rps16 OK
trnSG OK
หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม
ผลและวิจารณการศึกษา (ตอ)
ลักษณะของแตละ region ที่ศึกษา
A: ATCCA A TTT TG
B: ATCCA AGGT TG
C: ATCCA AGGT AT
D: ATCCA TGGT AT
matK gene 1803 1772 24 7
trnL-trnLF 865 855 7 3
rpl16 gene 1075 1055 12 8
rps16 gene 813 800 6 7
trnSG 604 594 7 3
Combined 5190 5102 60 28
หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม
Informative indel matK gene, trnL-trnLF , rpl16 , trnSG
Phylogenetic relationships within the genus WrightiaWrightia religiosa G B
Wrightia sirikitiae G B
Wrightia sirikitia Wri24
Wrightia coccinea G B
Wrightia poomae Wri21
Wrightia dubia G B
Wrightia dubia Wri15
Wrightia arborea G B
Wrightia tokiae Wri23
Wrightia dubia Wri31
Wrightia hybrids Wri32
Wrightia lanceolata G B
Wrightia antidysenterica Wri25
Wrightia Wri28
Stephanostema stenocarpum
Pleioceras barteri
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
Majority rule and BP
100
72
73
73
95
73
64
77
100
หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม
ผลและวิจารณการศึกษา (ตอ)
Phylogenetic relationships within the genus WrightiaWrightia religiosa G B
Wrightia sirikitiae G B
Wrightia sirikitia Wri24
Wrightia coccinea G B
Wrightia poomae Wri21
Wrightia dubia G B
Wrightia dubia Wri15
Wrightia arborea G B
Wrightia tokiae Wri23
Wrightia dubia Wri31
Wrightia hybrids Wri32
Wrightia lanceolata G B
Wrightia antidysenterica Wri25
Wrightia Wri28
Stephanostema stenocarpum
Pleioceras barteri
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
Majority rule and BP
100
72
73
73
95
73
64
77
100
หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม
ผลและวิจารณการศึกษา (ตอ)
Phylogenetic relationships within the genus WrightiaWrightia religiosa G B
Wrightia sirikitiae G B
Wrightia sirikitia Wri24
Wrightia coccinea G B
Wrightia poomae Wri21
Wrightia dubia G B
Wrightia dubia Wri15
Wrightia arborea G B
Wrightia tokiae Wri23
Wrightia dubia Wri31
Wrightia hybrids Wri32
Wrightia lanceolata G B
Wrightia antidysenterica Wri25
Wrightia Wri28
Stephanostema stenocarpum
Pleioceras barteri
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
Majority rule and BP
100
72
73
73
95
73
64
77
100
หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม
ผลและวิจารณการศึกษา (ตอ)
Monophyly of each section (Ngan, 1965) ?Wrightia religiosa G B
Wrightia sirikitiae G B
Wrightia sirikitia Wri24
Wrightia coccinea G B
Wrightia poomae Wri21
Wrightia dubia G B
Wrightia dubia Wri15
Wrightia arborea G B
Wrightia tokiae Wri23
Wrightia dubia Wri31
Wrightia hybrids Wri32
Wrightia lanceolata G B
Wrightia antidysenterica Wri25
Wrightia Wri28
Stephanostema stenocarpum
Pleioceras barteri
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
Majority rule and BP
100
72
73
73
95
73
64
77
100
หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม
ผลและวิจารณการศึกษา (ตอ)
sect. Wallida
sect. Balfouria
sect. Wallida
Support Middleton
(2010) “the sectional
arrangement in the
genus Wrightia is in
need of revision”.
sect. Scleranthera
sect. Scleranthera
sect. Scleranthera
Hybrids and hybridizationWrightia religiosa G B
Wrightia sirikitiae G B
Wrightia sirikitia Wri24
Wrightia coccinea G B
Wrightia poomae Wri21
Wrightia dubia G B
Wrightia dubia Wri15
Wrightia arborea G B
Wrightia tokiae Wri23
Wrightia dubia Wri31
Wrightia hybrids Wri32
Wrightia lanceolata G B
Wrightia antidysenterica Wri25
Wrightia Wri28
Stephanostema stenocarpum
Pleioceras barteri
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
Majority rule and BP
100
72
73
73
95
73
64
77
100
หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม
1. Corolla infundibuliform; stamens completely
included in the corolla tube W. dubia
1. Corolla rotate or salverform; stamens clearly
exserted from the corolla tube.
Other Wrightia
ผลและวิจารณการศึกษา (ตอ)
สรุปผลการศึกษา
สวนที่เปน parsimony informative คือ trnL-trnLF, trnSG,
matK, rpl16 และ rps16 มีจํานวนเทากับ 3, 3, 7, 7 และ 8 ตามลําดับ ซึ่งมีคาคอนขางนอย จึงตองนําขอมูลทั้งหมดมารวมกัน ไดจํานวน parsimony informative เทากับ 28
จาก Phylogenetic tree ไมสอดคลองกับการแบง Section ของ Ngan (1965) แตสนับสนุนความคิดเห็นของ Middleton ที่วาเปนการแบง Section ที่ยังไมดีพอ
การเกิดลูกผสมขามชนิด เปนปรากฎการณที่เกิดขึ้นกับพรรณไมสกุลโมกได ถาจะศึกษาตอตองมีขอมูลที่มาจากนิวเคลียส มาเสริมดวย
หองปฏิบัติการชีวโมเลกุล ภาควิชาชีววิทยาปาไม
ขอขอบคุณ
อาจารยสุธีร ดวงใจ อาจารยที่ปรึกษาโครงงานและ
สนับสนุนคาใชจาย
ผูเก็บตัวอยางที่ใชศึกษาทุกทาน
ภาควิชาชีววิทยาปาไมสําหรับความพรอมของ
เครื่องมือตางๆ
อาจารยภาควิชาชีววิทยาปาไมทุกทาน