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7/23/2019 Clonagem Dna
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Clonagem de DNA
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1 - Formar DNA recombinante1 - Formar DNA recombinante
bacterifagos
bacterifago
s
bacterifago
s
bacterifago
s
bacterifago
s
Bactrias esto sobre constante ataque deBactrias esto sobre constante ataque debacterifagos (virus).bacterifagos (virus).
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Para se protegerem muitas desenvolveram um sistema
para destruir DNA estranho (por ex dosbacterifagos, impedindo assim o seu ataque).! So endonucleases--(enzimas de restrio, porque
restringem a infeco por bacterifagos)! Corta qualquer DNA que entra na bactria
PORQUE No destrudo o seu prprio DNA?
Possuem um gene que impede as Enz Rest de atacar o prprio DNAcromossomal
Enzimas de restrioEnzimas de restrio
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2- Uso de plasmdeos (vectores de clonage
3 - Transformao3 - Transformao
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4 - Reconhecimento4 - Reconhecimentodos clones transformadodos clones transformado
Transformao
Preparao de clulas
competentesE.Coli- clula
hospedeiraTransformao qumica
- CaCl2 e choque trmico
Transformao
Transformao elctrica
- Choques elctricos
cromossoma
3. E.Coli sem plasmdio
2. E.Coli+ plasmdio
3
2
1
1. E.Coli + DNA recombinante
Lima, N.; Mota, M. 2003.Biotecnologia. Fundamentos e Aplicaes. Edies Tcnicas. pp. 130.
Situaes que podem ocorrer:
Adio de DNArecombinante
construdo in vitro
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Que estratgias utilizar para seleccionar asclulas com DNA recombinante?
Resistncia a antibiticos
- Ampicilina
Actividade da !-Galactosidase(gene Lac Z)
Marcas de seleco do vectorMarcas de seleco do vector
AmpR
Lac Z
Insero de DNAestranho
Origem dereplicao
www.science.uwaterloo.ca/course-notes/biology
Meio de cultura com ampicilina
Transformao
Como seleccionar
as clulas comDNArecombinante?
Clulas semplasmdiosClula com
plasmdio
Clula complasmdio
Seleco das clulas complasmdios
Resistncia ampicilina
www.science.uwatterloo.ca/course-notes/biology
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Gene Lac Zintacto
Gene Lac Zdesintegrado
!-Galactosidase
X-GalPigmento azul
!-Galactosidase
Actividade daActividade da !!-Galactosidase-Galactosidase
Meio de cultura comMeio de cultura comampicilinaampicilina
X-GalX-Gal
++
www.science.uwat terloo.ca/course-notes/biology
Seleco dos clonesSeleco dos clones
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Questes:
Quantos fragmentos se obtm do DNA de um organismo?
Quantos clones podero existir?
Como procurar o Clone que nos interessa?
E se houver pouco material?
Como restringir a escolha?
Pontos de Discusso
Master plate
Filter
Solution
containing
probe
Filter liftedand flipped over
Radioactivesingle-stranded
DNAProbeDNA
Gene ofinterest
Single-stranded
DNA from cell
Hybridization
on filter
Master plate
Coloniescontaining
gene of
interest
A special filter paper is
pressed against themaster plate, transferring
cells to the bottom side of
the filter.
The filter is laid
under photographicfilm, allowing any
radioactive areas to
expose the film
(autoradiography).
After the developed
film is flipped over,the reference marks
on the film and master
plate are aligned tolocate colonies
carrying the gene of
interest.
The filter is treated to break
open the cells and denaturetheir DNA; the resulting
single-stranded DNA
molecules are treated so that
they stick to the filter.
Hibridizao DNAComo encontrar a colnia com o gene
de interesse?