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Tesis Doctoral
Estudio Estudio de mecanismos de pre yde mecanismos de pre ypost-condicionamiento comopost-condicionamiento como
estrategia de inducción de toleranciaestrategia de inducción de toleranciaisquémica retinianaisquémica retiniana
Fernandez, Diego Carlos
2012
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Fernandez, Diego Carlos. (2012). Estudio de mecanismos de pre y post-condicionamiento comoestrategia de inducción de tolerancia isquémica retiniana. Facultad de Ciencias Exactas yNaturales. Universidad de Buenos Aires.
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Fernandez, Diego Carlos. "Estudio de mecanismos de pre y post-condicionamiento comoestrategia de inducción de tolerancia isquémica retiniana". Facultad de Ciencias Exactas yNaturales. Universidad de Buenos Aires. 2012.
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
Estudio de mecanismos de pre y post-condicionamiento como
estrategia de inducción de tolerancia isquémica retiniana
Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos
Aires en el área: CIENCIAS BIOLÓGICAS
Diego Carlos Fernandez
Directora de tesis: Dra. Ruth E. Rosenstein
Consejero de estudios: Dr. Arturo Romano
Lugar de trabajo: Laboratorio de Neuroquímica Retiniana y Oftalmología
Experimental, Departamento de Bioquímica Humana, Facultad de Medicina. UBA.
Buenos Aires, marzo de 2012
Estudio de mecanismos de pre y post-condicionamiento como estrategia
de inducción de tolerancia isquémica retiniana
La isquemia es un componente central de diversas enfermedades retinianas que pueden provocar
ceguera irreversible. Al presente, no existen tratamientos efectivos frente al daño isquémico
retiniano. En este trabajo de Tesis se demostró por primera vez, que el post-condicionamiento
isquémico (PostC) inducido por la aplicación de pulsos breves de isquemia en forma posterior a una
isquemia prolongada, revierte significativamente las alteraciones funcionales e histológicas
provocadas por una isquemia retiniana deletérea. En cuanto a los mecanismos involucrados en este
fenómeno, los resultados obtenidos sugieren la participación de la síntesis de novo de proteínas y la
actividad de la isoforma inducible de la óxido nítrico sintasa. Además, se demostró que el daño
isquémico, al menos en parte, es causado por un aumento en las concentraciones sinápticas de
glutamato y que el PostC podría proteger a la retina al disminuir este parámetro. A continuación, se
realizó una caracterización del daño de la retina y la vía visual en un modelo de retinopatía diabética
experimental inducido por la inyección de estreptozotocina (STZ). A nivel retiniano, se observaron
alteraciones funcionales, vasculares y morfológicas significativas. En estadíos tempranos luego de la
inyección de STZ se observaron alteraciones axo-gliales en la porción distal del nervio óptico, que
podrían constituir el primer cambio estructural en la vía visual diabética. El condicionamiento
isquémico (aplicación de pulsos semanales de isquemia) revirtió significativamente todas estas
alteraciones, tanto a nivel de la retina como de la vía visual. Asimismo, los resultados obtenidos
sugieren que la disminución en los niveles de VEGF y la restauración de la actividad de glutamina
sintetasa podrían participar activamente en la protección inducida por el condicionamiento isquémico
frente a las alteraciones provocadas por la retinopatía diabética. Finalmente, se demostró que las
células ganglionares retinianas intrínsecamente fotosensibles en particular, y el sistema visual no
formador de imagen en general, se preservan en etapas avanzadas de diabetes.
En suma, los resultados obtenidos en este trabajo constituyen avances originales en la comprensión
de los mecanismos involucrados en la lesión retiniana inducida por isquemia aguda y por diabetes,
así como en la posibilidad de prevenir ambos procesos a través de la inducción de tolerancia
isquémica. La demostración de que el sistema visual no formador de imagen es menos susceptible al
daño diabético representa una valiosa pieza de información respecto a este sistema no canónico de
transducción de la información luminosa.
Palabras claves: retina, isquemia retiniana, retinopatía diabética, condicionamiento isquémico,
glutamato, axonopatía distal, ritmos circadianos.
Mechanisms of pre and post-conditioning as strategies
for ischemic tolerance induction
Ischemia is a central component of several retinal diseases that can result in irreversible
blindness. At present, there are no effective treatments to protect the retina from ischemic
damage. For the first time, in this Thesis work, we have demonstrated that ischemic post-
conditioning (PostC) induced by brief episodes of ischemia/reperfusion applied at the onset of
reperfusion, significantly protected the retina against functional and histological alterations
induced by ischemia. As for the involved mechanisms, the results suggest the participation of de
novo synthesis of proteins and the inducible isoform of nitric oxide synthase activity in the
protective mechanism triggered by PostC. We have also demonstrated that ischemic damage is,
at least in part, caused by an increase in glutamate synaptic concentrations and that PostC
protected the retina by decreasing this parameter. Moreover, we have analyzed the alterations at
retinal and visual pathway level provoked by experimental diabetes induced by streptozotocin
(STZ). Al retinal level, diabetes caused significant functional, vascular, and morphological
alterations. In addition, significant axo-glial alterations were observed at the distal portion of the
optic nerve at early stages of diabetes that could be the first structural change in the diabetic
visual pathway. Ischemic conditioning (weekly application of brief pulses of ischemia)
significantly reversed all these alterations. Furthermore, the results suggest that a decrease in
VEGF levels and the restoration of glutamine synthetase activity could be key aspects in the
protective mechanism triggered by ischemic conditioning against diabetic retinopathy. Finally,
we showed that intrinsically photosensitive retinal ganglion cells and the non-forming image
visual system are preserved at advanced stages of diabetes.
In summary, the results presented in this Thesis provide original insights for unraveling the
mechanisms involved in the retinal damage induced by acute ischemia and diabetes, as well as in
the possibility of preventing these processes through the induction of ischemic tolerance. The
demonstration that the non-forming image visual system is less susceptible to diabetic damage is
a valuable piece of information about this non canonical system of light transduction.
Key words: retina, retinal ischemia, diabetic retinopathy, ischemic conditioning, glutamate, distal
axonopathy, circadian rhythms.
ÍNDICE Página
ABREVIATURAS 1
INTRODUCCIÓN
1. El ojo
1.1. Características generales 3
1.2. Túnica interna nerviosa o retina 6
1.3. Células gliales retinianas 9
1.3.1. Astrocitos 10
1.3.2. Células de Müller 11
1.4. Vasculatura del ojo 12
1.5. Barreras hemato-oculares 14
2. Vía visual
2.1. Características generales 15
2.2. Nervio óptico 17
2.2.1. Oligodendrocitos 17
2.3. Colículo superior 19
3. Isquemia retiniana 21
4. Inducción de tolerancia isquémica 23
5. Retinopatía diabética 27
6. El glutamato retiniano 31
6.1. Participación del glutamato en el daño y en la protección retiniana 36
7. Los ritmos circadianos 37
7.1. Células ganglionares retinianas intrínsecamente fotosensibles 40
OBJETIVOS 44
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Animales 45
1.1. Inducción de isquemia retiniana 45
1.2. Inducción de diabetes experimental 45
2. Inyección intravítrea 46
2.1. Inyección intravítrea de glutamato 46
3. Procesamiento histológico 47
3.1. Secciones semifinas 47
3.2. Obtención de cortes en parafina 48
3.3. Cortes por congelación 48
Índice
4. Microscopía electrónica
4.1. Análisis ultraestructural de la retina y el nervio óptico 48
4.2. Estudio de la marca de lantano 49
5. Análisis de células TUNEL(+) 49
6. Análisis de inmunomarcación y detección con isolectina GSA 50
6.1. Inmunoflourescencia 51
6.1.1. Inmunomarcación en retinas en montaje plano 51
6.2. Inmunohistoquímica 52
6.3. Detección con isolectinas 52
6.4. Análisis por microscopía confocal 52
7. Análisis de la permeabilidad vascular 52
8. Inyección de la subunidad de la toxina colérica 53
9. Procesamiento de imágenes y cuantificación 53
9.1. Evaluación morfométrica de cortes transversales de retina 53
9.2. Cuantificación de astrocitos en retinas en montaje plano 54
9.3. Análisis del nervio óptico 54
9.4. Análisis del colículo superior: densidad neuronal y área GFAP(+) 55
9.5. Análisis del transporte de la subunidad de la toxina colérica al colículo superior 55
9.6. Cuantificación de neuronas c-Fos(+) 56
9.7. Análisis de co-localización 56
10. Western blot 57
11. Estudio funcional de la retina
11.1. Electrorretinografía escotópica 58
11.2. Potenciales oscilatorios 59
11.3. Potenciales visuales evocados 59
12. Evaluación de la actividad del ciclo glutamato/glutamina a nivel retiniano
12.1. Determinación del influjo de L-3H-glutamato y L-3H-glutamina 60
12.2. Determinación de la actividad de glutamina sintetasa 60
12.3. Determinación de la liberación de L-3H-glutamato y L-3H-glutamina 61
12.4. Determinación de la actividad de glutaminasa 61
13. Actogramas y evaluación del periodograma 62
14. Evaluación del reflejo pupilar 62
15. Lentectomía 63
16. Análisis estadístico 63
RESULTADOS
1. Post-condicionamiento isquémico retiniano 64
2. Participación del glutamato en la protección retiniana inducida por post-condicionamiento 75
Índice
3. Inducción de tolerancia isquémica como estrategia terapéutica en un modelo de diabetes experimental 83
4. Axonopatía distal temprana en la diabetes experimental 94
5. Efecto del condicionamiento isquémico sobre las alteraciones axo-gliales en la vía visual diabética 101
6. Efecto de la diabetes sobre el sistema visual no formador de imagen 113
DISCUSIÓN 126
1. Post-condicionamiento como mecanismo inductor de tolerancia isquémica frente a una isquemia retiniana aguda 126
2. Participación del glutamato en el daño isquémico retiniano y en la protección inducida por post-condicionamiento 133
3. Inducción de tolerancia isquémica en la retinopatía diabética 138
3.1. Alteraciones en la retina inducidas por diabetes experimental 139
3.2. Alteraciones en la vía visual inducidas por diabetes experimental 144
3.3. Efecto protector del condicionamiento isquémico 148
4. Efecto de la diabetes sobre el sistema visual no formador de imagen 155
CONCLUSIONES 164
REFERENCIAS 165
Abreviaturas
1
ABREVIATURAS
ACPs arterias ciliares posteriores
ACR arteria central de la retina
BDNF factor neurotrófico derivado del cerebro
CCG capa de células ganglionares
CGRifs células ganglionares retinianas intrínsecamente fotosensibles
CGRs células ganglionares retinianas
CNE capa nuclear externa
CNI capa nuclear interna
CPE capa plexiforme externa
CPI capa plexiforme interna
CS colículo superior
CTB subunidad de la toxina colérica
EE error estándar
eNOS óxido nítrico sintasa endotelial
ERG electrorretinograma
FR fotorreceptores
GABA ácido け-aminobutírico
GFAP proteína glial fibrilar ácida
GS glutamina sintetasa
H-E hematoxilina-eosina
iNOS óxido nítrico sintasa inducible
LPS lipopolisacárido bacteriano
MBP proteína básica de mielina
MET microscopía electrónica de transmisión
NGL núcleo geniculado lateral
NMDA N-metil-D-aspartato
nNOS óxido nítrico sintasa neuronal
NO nervio óptico
Abreviaturas
2
NOP núcleo olivar pretectal
NOS óxido nítrico sintasa
NSQ núcleos supraquiasmáticos
OL oligodendrocitos
PBS buffer fosfato
PCI pre-condicionamiento isquémico
PDGFR- receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaqueta
PIO presión intraocular
PKC proteína quinasa C
POs potenciales oscilatorios
PostC post-condicionamiento isquémico
SGS stratum griseum superficiale
SNC sistema nervioso central
SO stratum opticum
STZ estreptozotocina
SZ stratum zonale
VEGF factor de crecimiento vascular endotelial
VEPs potenciales visuales evocados
Introducción
3
INTRODUCCIÓN
1. El ojo
1.1. Características generales
El ojo es un órgano sensorial especializado en el procesamiento de la información visual. La
córnea y el cristalino concentran la luz y enfocan la imagen sobre la retina, una estructura que en
el desarrollo embrionario deriva del diencéfalo y constituye la primera estación de relevo del
procesamiento de la información fótica. Los diferentes elementos que componen la imagen
(intensidad de luz, color, forma y movimiento) son codificados en la retina, de modo tal que las
radiaciones electromagnéticas son transformadas en impulsos nerviosos. Esta información se
transmite por fibras nerviosas que se originan en la retina y constituyen el nervio óptico (NO).
Fuera de la región intraorbital, el NO avanza hacia la base del cráneo donde atraviesa el canal
óptico. En la cavidad intracraneal, los NOs se entrecruzan parcialmente formando el quiasma
óptico y continúan como tractos ópticos a centros visuales del cerebro, que tras diversas etapas
de procesamiento en paralelo de la información, darán origen a la imagen visual consciente. En
las últimas décadas también se ha demostrado la participación de la retina en procesos visuales
no conscientes (denominado “sistema no formador de imagen”) a través de la transmisión de
información fótica a otros centros del encéfalo, lo que permite la realización de tareas reflejas
como la adaptación del tamaño pupilar, o respuestas más complejas como la regulación de los
procesos ligados al ciclo día/noche, como los ciclos de sueñovigilia y el aprendizaje, entre
muchos otros (revisado por Schmidt y col., 2011).
La pared del globo ocular está constituida por tres capas (Figura 1A):
1. Túnica externa-fibrosa o esclero-corneal: formada por la esclera, el limbo esclerocorneal y la
córnea.
2. Túnica media-vascular, úvea o tracto uveal: formada por la coroides, el cuerpo ciliar y el iris.
Introducción
4
3. Túnica interna-nerviosa o retina: formada por la porción de la retina fotosensible y el epitelio
pigmentario, la porción de la retina no fotosensible y su epitelio pigmentario, el epitelio del
cuerpo ciliar y el epitelio del iris.
La túnica externa es una capa fibrosa y gruesa que protege las delicadas estructuras internas del
ojo y junto con la presión del humor acuoso (presión intraocular (PIO)), mantienen la forma y
turgencia del globo ocular; en la mayor parte del globo ocular es opaca y se denomina esclera.
Allí se fijan los músculos extrínsecos del ojo.
En la salida del NO en primates, la esclera se reduce a una membrana fenestrada, denominada
lámina cribosa. Hacia la porción anterior, la túnica externa se diferencia en la córnea, una
estructura transparente constituida por cinco capas, que en un orden externo-interno son: epitelio,
capa de Bowman, estroma, membrana de Descemet y endotelio. Las fibras de colágeno del
estroma, principalmente de tipo I, se disponen ordenadamente (disposición hexagonal) lo que
permite disminuir la dispersión de la luz; de este modo, la córnea no sólo cumple una función de
protección sino que además, permite reducir la distorsión en la entrada de luz al ojo. Una línea
imaginaria que conecta la terminación periférica de la capa de Bowman y la membrana de
Descemet representa la zona de transición entre la córnea y la esclera (limbo esclerocorneal).
La túnica media vascular es responsable de la nutrición y el mantenimiento de la retina externa y
la esclera y de la producción de humor acuoso, que nutre la córnea y el cristalino, ambos
avasculares. Posee tres regiones diferentes: la coroides, porción más vascularizada de la úvea,
situada por fuera de la retina; el cuerpo ciliar, un engrosamiento de tejido conectivo que se
extiende hacia el interior justo por detrás de la unión esclerocorneal y el iris, que se ubica por
encima de la superficie anterior del cristalino. En el centro, el iris define un espacio circular
denominado pupila. El iris se extiende desde el cuerpo ciliar hasta el borde pupilar. La superficie
posterior del iris está cubierta por la porción irídea de la retina no fotosensible, constituida por
una doble capa de epitelio. Las células de la porción externa se diferencian en elementos
contráctiles que se disponen radialmente formando el mioepitelio del músculo dilatador de la
Introducción
5
pupila. El otro músculo del iris es el esfínter de la pupila, de disposición circular, que regula su
diámetro.
La retina es la capa más interna y es la porción del ojo sensible a la luz. Se extiende
superficialmente sobre la coroides hasta la ora serrata, donde presenta un borde festoneado;
luego se extiende como una delgada prolongación formando las porciones ciliar e irídea de la
retina. Esta prolongación anterior está constituida por una capa más externa pigmentada,
formada por células que son una continuación del epitelio pigmentario junto con un estrato más
profundo de epitelio cilíndrico, continuación de la retina no fotosensible. La retina se encuentra
firmemente unida en la papila óptica, donde se continúa con el NO y en la ora serrata, donde se
une a la coroides. Las complejas redes nerviosas que codifican la información visual envían los
impulsos al cerebro a través del NO.
Al atravesar la córnea, la luz pasa a través de dos cámaras antes de alcanzar la retina. La cámara
anterior que contiene el humor acuoso, es una cavidad pequeña rodeada por la córnea, el iris y la
porción central del cristalino. El humor acuoso es producido por las crestas del cuerpo ciliar
(procesos ciliares) en la cámara posterior (región comprendida entre el iris y el cristalino). Una
red de células especializadas y tejido conectivo, la red trabecular que se localiza en el ángulo de
unión del iris y la córnea, es responsable del drenaje del humor acuoso. El balance entre
producción y reabsorción del humor acuoso mantiene una PIO adecuada, que brinda estabilidad
mecánica.
El cristalino es un cuerpo biconvexo y elástico, rodeado por una cápsula y suspendido de la
superficie interna del cuerpo ciliar por un ligamento circular, la zónula ciliar, que junto con el
músculo ciliar son responsables de la acomodación del cristalino. El espacio entre la pared
posterior del cristalino y la retina está formado por una matriz extracelular denominada humor
vítreo o cuerpo vítreo. Esta matriz es rica en agua, ácido hialurónico, fibras colágenas muy
dispersas, otras proteínas y glicoproteínas, entre escasas células denominadas hialinocitos
(revisado por Williams y Warwick, 1992; Fawcett, 1995; Krstić, 1997).
Introducción
6
1.2. Túnica interna nerviosa o retina
La retina codifica el mundo visual, transformando los estímulos luminosos en impulsos
nerviosos que son enviados al cerebro. En la corteza, las señales son codificadas y configuran la
percepción visual: una sensación subjetiva de la forma, el color, la profundidad y el movimiento
de los objetos. La retina es una capa delgada derivada del tejido nervioso, constituida por los
siguientes tipos celulares: fotorreceptores (FR), células horizontales, células bipolares, células
amácrinas, células ganglionares retinianas (CGRs) y células gliales. En un corte transversal de
retina se observan diez capas paralelas, que comenzando desde la más externa son: 1. Epitelio
pigmentario; 2. Segmentos externos e internos de los FR; 3. Membrana limitante externa; 4.
Capa nuclear externa (CNE); 5. Capa plexiforme externa (CPE); 6. Capa nuclear interna (CNI);
7. Capa plexiforme interna (CPI); 8. Capa de células ganglionares (CCG); 9. Capa de fibras
nerviosas y 10. Membrana limitante interna (Figura 1B).
El epitelio pigmentario está constituido por células que se originan de la capa externa de la copa
óptica durante el desarrollo embrionario. De la porción apical de la célula, parten dos tipos de
prolongaciones: microvellosidades que rodean los extremos de los FR y microvellosidades que
ocupan el espacio que hay entre ellos. Una de las funciones del epitelio pigmentario es fagocitar
los discos membranosos más distales de los segmentos externos de los FR que son
constantemente removidos y reemplazados, en tanto que los discos nuevos se forman por
invaginaciones de la membrana plasmática en la base del segmento externo de los FR.
Los FR de los vertebrados son células únicas en forma y función. Existen dos tipos de FR
clásicos: los conos y los bastones. Sus segmentos externos son la porción sensible a la luz y su
morfología les da nombre a cada uno de ellos. Contienen el pigmento visual así como los demás
componentes de la cascada de fototransducción en la que participan diversos mensajeros,
enzimas y canales iónicos. El segmento externo de los bastones está formado por discos
membranosos apilados en forma ordenada y rodeados por una membrana celular. Estos discos
son estructuras saculares en los que las paredes de doble membrana quedan separadas por el
Introducción
7
espacio intradiscal. En los conos, el segmento externo está constituido por numerosos pliegues
de membrana apilados, que se abren al medio extracelular. En los discos de membrana se
encuentra el pigmento visual rodopsina en los bastones y conopsinas en los conos. En ratas,
como en la mayoría de los mamíferos, existen dos tipos de pigmentos en los conos: la opsina M
que posee un máximo de absorción a 480 - 530 nm y la opsina S que es sensible a la luz azul y
parte del espectro de radiación UV (máx 355 - 445 nm) (Hunt y col., 2009). En ambos FR, los
segmentos externos se encuentran unidos a los segmentos internos a través de un tallo estrecho o
cilio. El cuerpo celular de los FR contiene al núcleo, ubicado en la CNE. En la mayoría de las
especies de mamíferos, los bastones son aproximadamente 20 veces más numerosos que los
conos, aunque la cantidad relativa de ambos tipos celulares varía marcadamente sobre la
superficie de la retina (Masland, 2001). En el centro de la retina de primates (área denominada
fóvea), donde la agudeza visual es máxima, se observan sólo conos.
Los FR poseen un cinturón de zónulas adherentes que divide a la célula en un dominio apical y
uno basal. El aspecto de este cinturón al microscopio óptico llevó a denominar a esta región
membrana limitante externa (Rodieck, 1973). Participan también los procesos de las células de
Müller, que constituyen el principal tipo de célula glial retiniana, y rodean y dan soporte a los
elementos nerviosos. Estas células poseen un cuerpo celular delgado, que se extiende desde la
membrana limitante externa hasta la zona más interna de la retina, donde su lámina basal
constituye la membrana limitante interna.
Los FR hacen sinapsis con células bipolares y horizontales en la CPE. En estas sinapsis pueden
observarse synaptic ribbons, estructuras peculiares que se localizan en neuronas del sistema
visual, auditivo y vestibular y están formadas por vesículas que se disponen a cada lado de una
prominencia que surge del terminal presináptico (Prescott y Zenisek, 2005). Las células
horizontales conectan los FR con las células bipolares estableciendo una vía indirecta para el
flujo de información. Existen distintos tipos de células bipolares que pueden estar conectadas
exclusivamente a bastones o a conos. La CNI está constituida por los somas de células
Introducción
8
horizontales, bipolares y amácrinas. Estas últimas tienen numerosas dendritas pero carecen de
axón. Además de conectarse unas con otras, lo hacen con las terminales axónicas de células
bipolares y dendritas de las CGRs. Esta región de contacto sináptico se denomina CPI. La CPI
presenta una organización estratificada. Se diferencia una sublámina ON apical, donde proyectan
las CGRs ON y una sublámina OFF, de proyección de las CGRs OFF. En ambas capas
plexiformes, existen synaptic ribbons y sinapsis convencionales. La CCG está constituida por los
somas celulares de las CGRs cuyos axones convergen radialmente hacia el disco óptico, por
donde las fibras abandonan el globo ocular (Figura 1B). En la CCG se localizan también una
cantidad, variable según la especie, de células amácrinas desplazadas.
Estudios clásicos de Lashley y col. (1932) demostraron que en la retina central de la rata existe
una alta densidad de CGRs, denominada area centralis. Esta especialización podría representar
una zona de mayor agudeza visual, similar a lo que se observa en la fóvea de otras especies.
Según el tamaño del soma, las CGRs pueden clasificarse en: ganglionares grandes (>14 μm, con
ocasionales ganglionares gigantes >17 μm), ganglionares medianas (11 - 14 m) y ganglionares
Figura 1. Esquema que ilustra las distintas estructuras del globo ocular (A) y las distintas células y capas de la
retina (B). Nótese la presencia de vasos sólo en la región interna de la retina. C, cono; B, bastón; CB, célula
bipolar; H, célula horizontal; A, célula amácrina; CG, célula ganglionar; M, célula de Müller; AS, astrocito
Modificado de Krstić, 1997.
Introducción
9
pequeñas (5 - 11 μm). Los axones de todas las CGRs proyectan al cerebro a través del tracto
óptico, excepto las fibras que llegan a los núcleos supraquiasmáticos (NSQ). En su mayoría, las
CGRs que inervan los NSQ a través del tracto retino-hipotalámico son intrínsecamente sensibles
a la luz y expresan el pigmento visual melanopsina, también denominado opsina 4 (Opn 4). Estas
células, cuyas características se comentarán en detalle en la sección 7.1, son responsables de
sincronizar los ritmos circadianos endógenos con los estímulos ambientales de luz/oscuridad,
entre otras funciones.
En base a las conexiones anatómicas y funcionales entre los distintos tipos celulares retinianos,
se considera que la información fluye a través de la retina siguiendo dos vías: una vía directa,
desde los FR a las células bipolares y de éstas a las CGRs y una indirecta, en el que las células
horizontales se interponen entre los FR y las células bipolares y las amácrinas entre las bipolares
y las CGRs. La vía directa de transmisión de información es altamente específica; la vía
indirecta, en cambio, es más difusa.
El principal neurotransmisor excitatorio de la retina, el glutamato, es el transmisor responsable
de la vía directa de la información visual. El glutamato es liberado desde los FR a células
bipolares y horizontales y desde las células bipolares a las CGRs y amácrinas. En oscuridad, el
glutamato es liberado en forma tónica por los FR a la brecha sináptica y su liberación se
interrumpe con la exposición a luz. El glutamato induce la despolarización de las células
bipolares OFF y la hiperpolarización de las células bipolares ON. Estas células a su vez, liberan
glutamato en las sinapsis con las CGRs. Un conjunto variado de señales liberadas por células
horizontales y amácrinas, que incluyen al ácido け-aminobutírico (GABA), la glicina y la
dopamina, modulan la vía directa.
1.3. Células gliales retinianas
La retina de mamíferos contiene tres tipos de células gliales, que se clasifican en células
macrogliales (células de Müller y astrocitos) y células microgliales. La microglía se considera
Introducción
10
parte del sistema fagocítico mononuclear que reside en la retina y todo el SNC. Son células
pequeñas, con un núcleo denso, escaso citoplasma y prolongaciones finas con pequeñas espinas.
Su morfología cambia rápidamente frente a una injuria. Las células microgliales se dividen,
aumentan de tamaño y pierden sus prolongaciones (adquiriendo un aspecto ameboideo) y
adquieren capacidad fagocítica. Entre las células macrogliales retinianas se encuentran los
astrocitos, localizados en la porción más interna de la retina (capa de fibras, CCG y parte de la
CPI) y las células de Müller, que se disponen a lo largo de toda la retina según el eje vertical.
1.3.1. Astrocitos. Inicialmente, la citoarquitectura de las astrocitos fue estudiada con técnicas de
tinción de Golgi y posteriormente mediante el uso de microscopía electrónica de transmisión
(MET), inmunomarcación e inyección de colorantes a nivel de célula-única. Son células grandes,
con forma estrellada y se caracterizan por tener en su citoplasma gran cantidad de haces de
filamentos intermedios. El patrón de ramificación de los procesos celulares varía según la
ubicación en el SNC y se clasifican en astrocitos de tipo I y II. Los astrocitos tipo I se encuentran
principalmente en la sustancia gris del SNC y poseen muchas prolongaciones muy ramificadas
que suelen extenderse hasta las paredes de los vasos sanguíneos en forma de pedicelos. De esta
forma, los astrocitos tipo I participan en la regulación de las uniones estrechas de las células
endoteliales de los capilares y vénulas que conforman la barrera hemato-encefálica y la barrera
hemato-retiniana interna. Los astrocitos más superficiales emiten prolongaciones con pedicelos
hasta contactar con la piamadre, lo que origina la membrana pial-glial. Los astrocitos tipo II
emiten prolongaciones que contactan la membrana axonal en los nodos de Ranvier de axones
mielínicos y suelen encapsular las sinapsis químicas. De esta manera, la red compleja de
procesos celulares permite a la astroglía un contacto directo con el soma, axones, dendritas y
sinapsis neuronales, vasos sanguíneos y meninges. Entre sus múltiples funciones se encuentran:
el sostén estructural, la conformación de la barrera hemato-encefálica, la regulación del flujo
sanguíneo, la modulación de la función sináptica, la participación en procesos de plasticidad, la
captación de neurotransmisores, la homeostasis neuronal, el almacenamiento de glucógeno y la
Introducción
11
participación en procesos de reparación y cicatrización, entre otros (revisado por Yi y col.,
2011). Además de la red compleja de procesos celulares que pone en contacto diversos
astrocitos, existen uniones de tipo gap entre astrocitos que permiten “concebir” a la red de
astrocitos como una unidad funcional (Malone y col., 2007). Los astrocitos presentes en la retina
adulta son células que se originaron y migraron desde el NO. Se localizan en la porción más
apical de la retina, en estrecho contacto con vasos del plexo superior y cumplen un rol
fundamental en el mantenimiento de las propiedades de las barreras endoteliales.
1.3.2. Células de Müller. Las células de Müller constituyen las principales células gliales de la
retina de vertebrados. Derivan de la glía radial y se extienden a través de todo el espesor de la
retina, contactando todos los somas y procesos de células retinianas. De esta forma, constituyen
una vía de conexión anatómica y funcional entre distintas células y compartimentos, como vasos
sanguíneos y el cuerpo vítreo. Entre las numerosas funciones de las células de Müller, se
destacan: 1) su participación en el metabolismo de la glucosa y en el aporte de nutrientes a las
neuronas y remoción de productos metabólicos; 2) la regulación del flujo sanguíneo y la
participación en la formación y mantenimiento de la barrera hemato-retiniana interna; 3) la
participación en procesos de comunicación neuronal, particularmente a través de la captación
rápida del exceso de neurotransmisores y la liberación de precursores de neurotransmisores; 4) el
control de la homeostasis de iones y agua y la regulación del pH extracelular; 5) la liberación de
diversos factores que regulan la función retiniana; y 5) la participación en procesos de reparación
y reactividad frente a daños retinianos (revisado por Bringmann y col., 2006).
Frente a una alteración en la homeostasis retiniana, las células gliales sufren un proceso de
hipertrofia celular, denominado gliosis. Las células de Müller en la retina adulta no expresan la
proteína glial fibrilar ácida (GFAP), o la expresan en niveles muy bajos. Una característica de la
gliosis es la expresión de GFAP en los procesos celulares. Esta característica constituye un
reconocido indicador de alteración retiniana (Osborne y col., 1991; Wu y col., 2003). En
determinadas condiciones se ha observado que en respuesta al daño retiniano, las células de
Introducción
12
Müller pueden desdiferenciarse y entrar nuevamente en un ciclo de duplicación celular. La
proliferación de células gliales provoca la formación de cicatrices gliales, como ocurre
frecuentemente frente a un desprendimiento de retina (Lewis y col., 2010).
Las células de Müller son un sitio de producción del factor neurotrófico derivado del cerebro
(BDNF), que es clave para la supervivencia de las CGRs. El BDNF pertenece a la familia de las
neurotrofinas, que incluye el factor de crecimiento nervioso (NGF), la neurotrofina-3 y la
neurotrofina 4/5. Estas proteínas de secreción tienen efectos pleiotrópicos en el sistema nervioso
central (SNC) (revisado por Santos y col., 2010). Cada neurotrofina se une principalmente a un
receptor específico de tipo tirosín-quinasa. El BDNF se une específicamente al receptor TrkB y
constituye el principal factor neurotrófico en la retina. Además de las células de Müller, el
BDNF es producido por las CGRs y células amácrinas. Asimismo, se ha demostrado que el CS
produce BDNF que es transportado retrógradamente hasta el soma de las CGRs (Fournier y col.,
1997).
1.4. Vasculatura del ojo
Diversos autores han estudiado la arquitectura vascular del ojo de distintos mamíferos y se ha
observado una marcada variación entre especies (Morrison y col., 1987). La arquitectura
microvascular tridimensional del NO y la porción coroidea peripapilar del ojo de la rata fue
estudiada por Sugiyama y col. (1999) y Bhutto y Amemiya (2001). En la rata, la sangre llega al
ojo por la arteria ciliar posterior que nutre la retina y la capa media vascular completa. Avanza
por la vaina del NO, penetra directamente en la porción inferior de la cabeza del NO y se divide
en tres ramas: la arteria central de la retina (ACR) y las arterias ciliares posteriores (ACPs)
medial larga y lateral larga, que irrigan el iris y el cuerpo ciliar. La porción posterior de la
coroides, incluyendo la porción peripapilar, está irrigada por colaterales cortas de las ACPs. A su
vez, el NO está irrigado por arteriolas que se originan de las ACPs y capilares que llegan desde
la ACR. La ACR se divide en seis arterias radiales que nutren toda la retina hasta la base del
Introducción
13
cuerpo ciliar. La fina red vascular está formada por arteriolas delgadas que nacen de las arterias
mayores en ángulo recto. Luego, siguen un curso largo como arteriolas precapilares que en los
puntos de ramificación presentan constricciones luminales que regulan el flujo sanguíneo. La
retina presenta una doble capa vascular formada por capilares finos que drenan en vénulas post-
capilares que constituyen una segunda red venular y corre justo por debajo de la red capilar
superficial. Los FR y el epitelio pigmentario no hacen contacto directo con capilares o vénulas,
sino que reciben nutrientes por difusión, fundamentalmente desde los coriocapilares de la túnica
media. Finalmente, las vénulas de la retina se continúan en venas largas que desembocan en la
vena central de la retina, cerca del disco óptico.
La coroides está irrigada por arterias que se forman de las ACPs. Arteriolas, meta-arteriolas
cortas y capilares avanzan por toda la coroides hacia la parte anterior del ojo, donde el plexo
denso de capilares delgados y anastomosados se une a los vasos del cuerpo ciliar en la ora
serrata. Junto con el cuerpo ciliar, el iris se encuentra irrigado por el anillo arterial iridociliar,
que se origina de la arteria ciliar anterior, que a su vez, es una ramificación de las ACPs y surge
a la altura del ecuador del globo ocular.
La sangre venosa del iris y el cuerpo ciliar drena en vénulas vórtex. Cuatro venas vórtex, que se
disponen oblicuamente en el lado dorsal, ventral, nasal y temporal cerca del ecuador llegan hasta
la esclera donde se vacían en las venas epiesclerales. La sangre de la mitad posterior de la
coroides es recogida por venas ciliares posteriores. Capilares presentes en la cabeza del NO
desembocan en la vena central de la retina, en venas de la pía y en anastomosis venosas
presentes en la coroides y todos ellos desembocan finalmente en la vena ciliar posterior presente
en la vaina del NO.
Introducción
14
1.5. Barreras hemato-oculares
Al igual que otras barreras hemato-tisulares, las barreras hemato-oculares se basan en la
presencia de uniones oclusivas en diferentes capas celulares, ubicadas en distintas regiones del
ojo (Henrikson y col., 1997). Las barreras hemato-oculares son:
1. La barrera hemato-acuosa: formada por las uniones oclusivas del epitelio no pigmentado del
cuerpo ciliar.
2. La barrera hemato-iridal: formada por las uniones oclusivas del endotelio de los vasos del iris.
3. La barrera hemato-retiniana, constituida por:
a. Uniones oclusivas del endotelio de los vasos sanguíneos de la retina interna (barrera
hemato-retiniana interna).
b. Uniones oclusivas entre las células del epitelio pigmentario (barrera hemato-retiniana
externa).
c. Uniones oclusivas de la membrana limitante externa, entre las células de Müller y los FR.
Esta última barrera fue descripta por Hernrickson y col. (1997). Sin embargo, la mayoría de los
textos postulan que la relación entre estas células ocurre a través de uniones adherentes.
La barrera hemato-retiniana interna está constituida por uniones oclusivas, que constituyen el
componente más apical de las uniones endoteliales y regulan el paso de sustancias por el espacio
paracelular. Las uniones oclusivas limitan el dominio apical de la superficie baso-lateral,
manteniendo la polaridad celular. Al presente, se conocen tres grandes familias de proteínas
integrales de membrana que regulan y limitan la difusión pasiva de sustancias del lumen vascular
al parénquima retiniano: ocludinas, claudinas y proteínas de las superfamilias de las
inmunoglobulinas JAM (del inglés, junctional adhesion molecule) (revisado por Sawada y col.,
2003). Envolviendo los capilares retinianos, se encuentran los pericitos que regulan el tono
vascular.
Introducción
15
2. Vía visual
2.1. Características generales
Los axones de todas las CGRs proyectan al disco óptico por donde salen del ojo y forman el NO.
En la porción proximal del NO los axones se mielinizan. Los NOs de ambos ojos finalmente se
encuentran en el quiasma óptico. Dependiendo de la especie, una sub-población de axones de
número variable, se cruzan al lado opuesto del encéfalo, mientras otros axones continúan su
proyección en forma ipsilateral. De esta manera, los axones provenientes de ambos ojos forman
los tractos ópticos izquierdo y derecho que proyectan a núcleos subcorticales que participan en el
procesamiento visual formador de imagen y no formador de imagen.
El sistema de transporte axonal (o flujo axoplasmático) es el responsable de la comunicación
entre las CGRs y las neuronas de núcleos centrales. El transporte anterógrado, mediado por la
proteína motor quinesina, es el responsable del transporte de proteínas que son sintetizadas en el
cuerpo neuronal y están asociadas a la estructura axonal y la transmisión sináptica. El transporte
retrógrado, mediado por dineína, participa en el transporte de factores que afectan el estado
metabólico de las CGRs. Los microtúbulos son los elementos motores que participan en el
transporte. El ATP y el calcio son esenciales para este proceso.
Mediante la utilización de diversos métodos (trazadores, lesiones retinianas y electrofisiología)
se ha estudiado el grado de decusación de las fibras retinianas en diferentes especies (Cooper y
Pettigrew, 1979; Harman y Jeffery, 1992; Ward y col., 1995). La decusación óptica fue postulada
por primera vez en el siglo XIII por Alberto Magno, al notar que daños unilaterales en el cerebro
provocaban alteraciones en el campo visual contralateral (revisado por Thessis y Grüsser, 1994).
El patrón parcial de decusación fue propuesto originalmente por Isaac Newton (Newton, 1718);
sin embargo, años después fue formalmente formulado por Taylor en 1750 (Taylor, 1750;
revisado por Jeffery, 2001). El patrón básico de visión binocular es el resultado de vías
conformadas por fibras de la hemi-retina temporal de proyección ipsilateral y fibras de la hemi-
retina nasal del ojo contralateral, que se cruzan en el quiasma óptico, para formar finalmente un
Introducción
16
tracto óptico común. La línea imaginaria que divide las CGRs en dos poblaciones, pasa
verticalmente por la fóvea (división naso-temporal). Este patrón de decusación parcial resulta en
una representación continua del campo visual en estructuras centrales de procesamiento visual.
En distintas especies se han encontrado diferente patrones de proyección. Sin embargo, en todos
los casos, la proyección cruzada es mayor que la proyección ipsilateral. Se ha observado además
que en la mayoría de los mamíferos, las CGRs que proyectan de manera ipsilateral se encuentran
en la retina temporal (Cooper y Pettigrew, 1979; Dräger y Olsen, 1980; Jeffery y col., 1998).
Existe una sub-población escasa de CGRs también localizadas en la retina temporal, que
proyectan bilateralmente. La presencia de estas células con axones bifurcados se ha
documentado en roedores y gatos, pero aún no se han caracterizado con suficiente detalle para
determinar a qué tipo celular corresponden (Illing, 1980; Jeffery y col., 1981).
Las fibras de las CGRs se clasifican en tres tipos según su tamaño (grandes, medianas y
pequeñas) siguiendo la clasificación de los somas (Boycott y Wassle, 1974). En la retina de
roedores no se ha observado ningún patrón evidente en cuanto a la distribución de las CGRs.
Análogamente, se ha observado que las fibras del NO se disponen sin una organización clara en
función de su tamaño. Como consecuencia, el quiasma óptico de estos animales no presenta un
patrón interno de organización. Por el contrario, el tracto óptico de roedores presenta un patrón
claro de organización de fibras según su calibre, siendo las mayores de localización superficial,
las medianas en posición más profunda y las pequeñas, en general, localizadas en posición
próxima a la pía (Reese, 1987).
Entre los núcleos de proyección retiniana se encuentran el núcleo geniculado lateral (NGL), el
colículo superior (CS), núcleos pretectales como el núcleo olivar pretectal (NOP), los NSQ y
núcleos del sistema ocular accesorio, entre otros.
Introducción
17
2.2. Nervio óptico
En roedores, las fibras amielínicas de las CGRs se unen en la papila óptica y abandonan el globo
ocular a través de una apertura en la esclera, que en primates presenta una red de fibras de
colágeno que constituyen la lámina cribosa. Diversos estudios descartan la existencia de una
lámina cribosa clásica en ratones y ratas; por el contrario, en esta porción del NO se observa una
red compleja de procesos gliales orientados transversalmente a los axones, una estructura que
recibe el nombre de lámina glial (Howell y col., 2007; Sun y col., 2009). En esta región, los
núcleos gliales presentan una morfología en bastón en plano transversal y forman columnas
perpendiculares al eje mayor del NO. Los procesos primarios de los astrocitos organizan los
axones en fascículos. Estos procesos son mayores en la región del NO próxima a la retina y se
vuelven más delgados y menos numerosos hacia la zona mielinizada. Existen además procesos
secundarios, que subdividen los fascículos en unidades menores. Esta red compleja de procesos
tiene la potencial consecuencia funcional de permitirle a un único astrocito comunicar y regular
la función de numerosos axones y otros astrocitos (Sun y col., 2009). En ratas, la lámina glial se
extiende aproximadamente entre 80 – 85 m (en el eje longitudinal) hasta la zona de transición,
donde las fibras comienzan a mielinizarse. A partir de esta región se pierde la organización de
los axones en fascículos y disminuye el número de astrocitos, que presentan una morfología
heterogénea. Estas células se caracterizan por tener menor número de procesos que se extienden
en todas direcciones (Sun y col., 2009). En roedores se ha descripto que en la porción distal del
NO, próxima al quiasma óptico, se pierde la organización retinotópica de los axones (Baker,
1990) y se ha sugerido que esto podría deberse al cambio en la organización glial (Guillery y
Walsh, 1987).
2.2.1. Oligodendrocitos. El desarrollo del linaje oligodendrocítico ha sido ampliamente estudiado
(revisado por Miron y col., 2011; Volpe y col., 2011). Estos estudios demuestran la presencia de
un patrón claramente establecido en la maduración, que puede ser determinado mediante el uso
de marcadores de superficie celular específicos para cada estadío celular. Los precursores de
Introducción
18
oligodendrocitos (OL) son inmunopositivos para el receptor alfa del factor de crecimiento
derivado de plaquetas (PDGFR-. Estas son células multipolares, que en un estadío más
avanzado (precursores tardíos), son inmunorreactivos para el marcador O4, pero no para O1. El
OL inmaduro es una célula multipolar compleja en estado postmitótico, que se identifica con el
marcador O1. Los OL maduros poseen un cuerpo celular pequeño con un citoplasma muy denso
(son uno de los tipos celulares más electrón-densos del SNC). Presentan un retículo
endoplasmático rugoso abundante, frecuentes polirribosomas libres, complejo de Golgi
desarrollado y numerosas mitocondrias. El núcleo es esférico y contiene gran cantidad de
heterocromatina, pero es más pequeño que el de los astrocitos. A su vez, presentan menor
cantidad de prolongaciones y son menos ramificadas que los astrocitos. Los OL maduros se
disponen en columnas entre los axones y son las células responsables de la producción y
mantenimiento de la mielina en el SNC. El OL maduro se puede identificar mediante la
detección de dos componentes principales de la mielina, la proteína básica de mielina (MBP) y la
proteína proteolipídica (PLP/DM20). Los OL maduros generan grandes cantidades de membrana
que forman segmentos inter-nodales de mielina que rodean a varios axones. De esta forma, un
axón puede estar rodeado de mielina formada por diversos OL. El espacio que queda entre
vainas de mielina de distintos OL se denomina nodo de Ranvier. La mielina actúa como aislante
de alta resistencia y baja capacitancia, de manera que la corriente iónica que se transmite a través
del axón se mueve de nodo a nodo (conducción saltatoria) aumentando considerablemente la
velocidad de conducción y disminuyendo el gasto de energía. La mielina cumple además una
función protectora, ya que asegura la continuidad de la conducción del impulso nervioso. La
mielina consiste en una cubierta de membrana altamente compactada que separa los nodos de
Ranvier. La estructura de la vaina de mielina consiste en una sucesión de capas alternantes de
lípidos mixtos y proteínas. En el SNC, los nervios contienen mielina en cantidades relacionadas
con el diámetro axonal. Las vías neuronales que recorren grandes distancias presentan vainas de
Introducción
19
mielina gruesas y en consecuencia tienen mayor velocidad de conducción. Los OL pueden
formar la vaina de mielina para una cantidad variable de axones (entre 10 y 60).
2.3. Colículo superior
El CS es un centro integrador del cerebro medio que controla el movimiento reflejo de la cabeza
y el movimiento de los ojos. Es una estructura organizada en capas, según la distribución de
fibras y el tamaño y arreglo neuronal. La capa superior es delgada y prácticamente libre de
células y se denomina stratum zonale (SZ). Por debajo de ella se encuentra la capa gris
superficial, stratum griseum superficiale (SGS), que contiene numerosas neuronas pequeñas.
Esta capa suele subdividirse en superior e inferior, dado el tamaño mayor de las neuronas
inferiores. Luego sigue el stratum opticum (SO) que contiene predominantemente fibras. Estas
tres capas constituyen la porción superficial del CS que participa principalmente del
procesamiento de la información visual aferente.
El CS profundo contiene neuronas motoras de proyección. Próximo al SO se encuentra una capa
delgada con una variedad amplia de neuronas multipolares, denominado stratum griseum
intermediale (SGI). Esta capa suele dividirse a su vez, en superior e inferior según su densidad
neuronal. La capa siguiente se denomina stratum album intermediale (SAI) y contiene
numerosas fibras. Por debajo, se encuentra una capa celular denominada stratum griseum
profundum (SGP). Finalmente, la capa más profunda está formada por fibras adyacentes a la
sustancia gris periacueductal y se denomina stratum album profundum (SAP) (Figura 2). Existen
nomenclaturas alternativas según se trate de resultados obtenidos a partir de estudios
electrofisiológicos o anatómicos. La nomenclatura utilizada en este trabajo de Tesis corresponde
a una revisión de May (2006).
Las fibras de las CGRs ingresan al CS por el SO y avanzan hasta las capas más superficiales. El
principal sitio de conexión es el SGS superior y en menor medida, el SO. Se han observado
diferencias notables entre especies en las capas del CS, particularmente en la capa SGS, así como
Introducción
20
en la proporción de fibras que proyectan al CS. En animales con una región escasa de
binocularidad, como en el caso de los roedores, la gran mayoría de las terminales retinianas
proyectan del ojo contralateral. Se estima que en la rata, aproximadamente el 98% de las CGRs
proyectan al CS contralateral (Lund y col., 1980). Las fibras de proyección ipsilateral de las
CGRs de la retina temporal proyectan a la capa SO y al SGS inferior. Como se mencionó
anteriormente, un porcentaje de estas fibras son de proyección bilateral.
Las proyecciones cortico-tectales del área 17, 18 y 19 ipsilateral llegan principalmente a las
capas SGS inferior y SO y presentan una organización retinotópica. Estas proyecciones
pertenecen a neuronas piramidales de la capa V del córtex visual. Otro núcleo de conexión con el
CS es el NGL. Neuronas de la capa SGS proyectan a la porción dorsal y ventral del NGL (Figura
2D). Mediante el uso de trazadores, se ha observado que existe una red compleja de conexión
entre capas del CS (revisado por May, 2006). Asimismo, existen neuronas tecto-tectales que
comunican ambos CS (Yamasaki y col., 1984).
Las capas profundas del CS procesan información proveniente de estímulos auditivos y
somatosensoriales. Además, en estas capas se encuentran neuronas de procesamiento
multisensorial (cross-modal). Se ha observado que la frecuencia de disparos de potenciales de
acción aumenta cuando se presentan estímulos de diferente modalidad provenientes de la misma
localización espacial y en una ventana temporal estrecha (Alvarado y col., 2009).
Estudios en ratones han demostrado que las proyecciones retinianas tienen una representación
topográfica ordenada de inervación en las capas superficiales del CS: el eje nasal-temporal y el
eje dorsal-ventral de la retina tienen proyección anterior-posterior y medial-lateral en el CS,
respectivamente (Dräger y Hubel, 1975; 1976). Mediante el análisis de neuronas del CS en capas
profundas con electrodos de penetración vertical, se ha demostrado además, que los campos
visuales están alineados verticalmente con campos receptivos táctiles (vibrisas o partes del
cuerpo). Este arreglo espacial multisensorial se ha observado en menor medida con campos
receptivos auditivos, dado que estos campos son siempre mucho más grandes.
Introducción
21
Figura 2. Representación esquemática de la estructura del CS. A: esquema en vista sagital del cerebro de rata. La
línea punteada indica la zona medial del CS en corte coronal que se muestra en el panel B. B: corte coronal en la
zona medial del CS (en gris). Se muestra un detalle en C. C: detalle de las capas del CS. D: patrón de inervación de
las capas superiores del CS. Las capas superiores del CS reciben inervación de las CGRs, fibras del NGL y también
terminales de neuronas corticales (neuronas piramidales de la capa V). SZ, stratum zonale; SGS, stratum griseum
superficial; SO, stratum opticum; SGI, stratum griseum intermediale; SAI, stratum album intermediale; SGP,
stratum griseum profundum; SAP, stratum album profundum. Modificado de Paxinos y Watson, 1997; May, 2006.
3. Isquemia retiniana
El daño isquémico es un componente central de diversas enfermedades retinianas. Las isquemias
retinianas agudas ocurren como resultado de la oclusión (principalmente por trombosis) de la
ACR y en forma más crónica se asocian a la obstrucción de la vena central de la retina. La
obstrucción de la ACR es uno de los eventos más súbitos y dramáticos que se pueden encontrar
en la práctica clínica oftalmológica. La obstrucción de la ACR conlleva a una pérdida aguda y en
algunos casos permanente de la visión, debido a la afectación de las capas internas de la retina.
Entre las patologías retinianas isquémicas más frecuentes, se encuentran la retinopatía diabética
y el glaucoma, ambas enfermedades asociadas a un riesgo considerable de ceguera irreversible.
Introducción
22
Existen además causas sistémicas que generan isquemia retiniana, como la retinopatía por
hipertensión arterial u obstrucciones arteriales, como la estenosis de la arteria carótida.
No se dispone actualmente de recursos eficaces para la prevención o terapéutica del daño
isquémico retiniano debido a diversos obstáculos que han limitado el desarrollo de agentes
neuroprotectores. Uno de ellos es el tiempo; un determinado tratamiento debería ser
administrado en una ventana temporal estrecha respecto al acontecimiento isquémico, lo que
resulta frecuentemente impracticable en la clínica. En segundo lugar, las alternativas examinadas
hasta ahora han demostrado una protección incompleta, con riesgo de efectos inespecíficos y/o
adversos.
La retina es uno de los tejidos con mayor consumo de oxígeno. La constante renovación y
fagocitosis de los segmentos externos membranosos por parte de los FR y el epitelio
pigmentario, representan una elevada demanda energética. De hecho, estas células presentan un
alto número de mitocondrias. Como se mencionó anteriormente, la retina interna está irrigada
por un plexo vascular denso, mientras que la retina externa se nutre principalmente por difusión
de los capilares de la coroides, uno de los tejidos con mayor flujo sanguíneo. La retinopatía
isquémica se desencadena como resultado de la falla en la perfusión. Como consecuencia, el
flujo sanguíneo es insuficiente para compensar los requerimientos metabólicos retinianos. A
nivel celular, el daño isquémico consiste en una cascada de retroalimentación de diversos
mecanismos de daño celular, como despolarización, aumento del influjo de calcio, estrés
oxidativo y aumento de la neurotransmisión glutamatérgica, entre otros (Osborne y col., 2004).
Además, la reperfusión con sangre oxigenada después de la isquemia también tiene el potencial
de agravar el daño isquémico, un efecto conocido como lesión por reperfusión.
En condiciones de hipoxia se produce una inhibición de la síntesis proteica. Sin embargo, la
hipoxia es también un inductor del factor de transcripción HIF-1 (del inglés, hypoxia inducible
factor-1). HIF-1 desempeña un papel central en la homeostasis celular en respuesta a la hipoxia,
al unirse a regiones específicas del promotor (sitios HREs, del inglés hipoxia-response elements)
Introducción
23
de genes blanco. En respuesta a la hipoxia hay una rápida activación de HIF-1 que induce la
expresión de genes asociados a la regulación metabólica celular (como transportadores de
glucosa), angiogénesis (principalmente VEGF) y apoptosis (Bcl2 y otros factores
proapoptóticos), entre otros (revisado por Arjamaa y Nikinmaa, 2006).
4. Inducción de tolerancia isquémica
Frente al daño isquémico, y en base a la vacancia terapéutica ya mencionada, se ha sugerido
como estrategia alternativa y/o complementaria la inducción de mecanismos endógenos de
protección. El pre-condicionamiento isquémico (PCI) es un mecanismo de resistencia frente a
una injuria isquémica seguida de reperfusión, que se produce como consecuencia de la
aplicación previa de un insulto isquémico moderado/subumbral y generalmente breve. El PCI fue
originalmente descripto en el miocardio en 1986 (Murry y col., 1986) y desde entonces se ha
demostrado su efectividad en diversos sistemas, como riñón, hígado y cerebro (Pasupathy y
Homer-Vanniasinkam, 2005; Gidday, 2006). El PCI retiniano se demostró por primera vez en
1998, un hallazgo relativamente tardío en comparación con las evidencias obtenidas más de diez
años antes en otros tejidos (Roth y col., 1998). El PCI desencadena reacciones adaptativas a
nivel celular que protegen al tejido frente al daño isquémico y además contribuyen a
“reprogramar” la respuesta a la isquemia (Gidday, 2006). Cuando se exponen retinas a una
isquemia prolongada por aumento de la PIO (120 mm Hg) por encima de la presión sistólica
arterial durante 45 - 60 min, se produce una caída de la actividad electrorretinográfica y una
alteración notable e irreversible de la estructura retiniana. Si entre 24 y 72 h antes del episodio
isquémico se exponen las retinas a un aumento de la PIO de la misma magnitud pero durante
períodos cortos (~ 5 min), se observa un efecto protector significativo a nivel funcional e
histológico, que puede llegar incluso a la protección completa (Roth y col., 1998). Un aspecto
clave para la efectividad del PCI retiniano es su temporalidad. Una separación de 24 ó 72 h entre
el estímulo subumbral y la injuria isquémica induce una protección significativa, mientras que
Introducción
24
una separación de 1 h ó 7 días es inefectiva. El hecho de que sea necesario un período no menor
a 24 h podría indicar que la tolerancia inducida por PCI en la retina requiere la expresión de
proteínas con funciones protectoras. En este sentido, se ha demostrado que la inhibición de la
síntesis proteica con cicloheximida bloquea el PCI retiniano (Roth y col., 1998). Sin embargo,
resulta altamente probable que la neuroprotección retiniana incluya una serie compleja de
cambios moleculares y neuroquímicos que aún no se han identificado en forma concluyente.
Si bien una isquemia breve constituye el estímulo prototípico de PCI, es posible inducir
tolerancia isquémica por exposición a estímulos endógenos o exógenos de naturaleza no
isquémica, de forma tal que un determinado estresor puede inducir “tolerancia cruzada” respecto
a un estresor de distinta naturaleza (Gidday, 2006). La naturaleza variada de estímulos capaces
de inducir un fenotipo resistente sugiere que las vías de transducción de señales involucradas
podrían converger en un mecanismo común, finalmente responsable de la tolerancia isquémica.
En nuestro laboratorio hemos demostrado que una inflamación ocular moderada inducida por la
inyección intravítrea de 1 g de lipopolisacárido bacteriano (LPS) provoca un efecto protector
funcional e histológico significativo frente a una isquemia deletérea inducida 24 h post-inyección
de LPS (Franco y col., 2008).
Otro aspecto de interés en este área es la demostración de que una isquemia subumbral en un
determinado tejido puede inducir tolerancia isquémica en otro (Dave y col., 2006). En este
sentido, se ha demostrado que la aplicación de un torniquete breve en los miembros inferiores o
el ejercicio físico proveen protección frente a la isquemia en distintos tejidos. Este fenómeno ha
recibido la denominación de pre-condicionamiento remoto y sugiere la participación de señales
humorales o neurales que se transmiten desde el área en la que se aplicó el estímulo pre-
condicionante hacia el tejido sometido a la injuria isquémica (Loukogeorgakis y col., 2005). Las
posibles implicancias terapéuticas del pre-condicionamiento remoto han estimulado la
realización de estudios en humanos. En el año 2006 se publicó un estudio de PCI remoto en
miembros inferiores de niños sometidos a cirugía para reparación de defectos cardíacos
Introducción
25
congénitos (Cheung y col., 2006). Los pacientes expuestos a PCI remoto demostraron un menor
grado de lesión de miocardio que los controles. Estos resultados avalan sólidamente el fenómeno
de pre-condicionamiento remoto y enfatizan la necesidad de examinar la naturaleza de los
mecanismos involucrados.
Si bien el PCI podría constituir una herramienta clínica eficaz en la atenuación de los efectos
deletéreos inducidos por isquemia/reperfusión, es indudable que la posibilidad de inducir
protección con una manipulación posterior al evento isquémico, amplificaría notablemente su
potencialidad clínica. Se ha examinado la posibilidad de inducir mecanismos protectores a
posteriori del episodio de isquemia/reperfusión, es decir, mecanismos de post-condicionamiento
isquémico (PostC). El PostC consiste en la aplicación de ciclos breves de isquemia/reperfusión
durante la reperfusión que sigue a un insulto isquémico prolongado. Se ha demostrado que el
PostC en el miocardio puede ser tan eficaz como el PCI en reducir el tamaño del infarto
(Granfeldt y col., 2009). En el año 2005 se publicaron los resultados de los dos primeros estudios
clínicos sobre PostC en el miocardio, que demuestran que esta estrategia constituye una
intervención segura y eficaz para inducir protección en pacientes con enfermedad cardíaca
isquémica (Staat y col., 2005; Laskey, 2005). En forma más reciente, se ha demostrado que el
PostC es efectivo aun cuando se aplica en áreas distantes al tejido que fue previamente dañado
por isquemia, lo que se denomina PostC remoto (Li y col., 2006a).
Aunque aún se desconoce el engrama molecular de la tolerancia isquémica, se dispone de
considerable aval experimental respecto a la participación de un conjunto notablemente complejo
de señales, que incluyen neurotransmisores, neuromoduladores, canales mitocondriales de K+
sensibles a ATP, radicales libres, proteína quinasas, citoquinas y factores de transcripción, entre
muchos otros (Wang y col., 2002; Gidday, 2006). Diversos autores han evaluado la posibilidad
de reproducir farmacológicamente el efecto protector del PCI. En este sentido, la administración
de agonistas selectivos para el receptor de adenosina A1 ó A2a induce una protección
significativa frente al daño isquémico retiniano (Li y Roth, 1999). Posteriormente, estos autores
Introducción
26
demostraron la participación de los canales mitocondriales de K+ sensibles a ATP, entre otros
factores, en la cascada de señales que desencadena el PCI inducido por adenosina (Li y col.,
2000). En este contexto, se ha propuesto que la adenosina puede desempeñar, por un lado, un rol
modulatorio al activar proteínas quinasas y fosfolipasas y/o estimular la expresión de proteínas
con actividad neuroprotectora, o bien, podría desempeñar un rol directo sobre la neurona
modificando los niveles de aminoácidos excitatorios, provocar la entrada de Ca2+ y una
hiperpolarización post-sináptica (Li y col., 2000). En un trabajo reciente publicado por Brandt y
col. (2011) se ha demostrado que el aumento de los niveles intracelulares de Ca2+ constituye un
estímulo pre-condicionante que protege a las CGRs del daño por glutamato.
Diversas líneas experimentales han demostrado la participación de los canales mitocondriales de
K+ sensibles a ATP en el PCI en miocardio y en el cerebro (Sato y col., 2000; Busija y col.,
2004). La inhibición farmacológica de estos canales durante el PCI ha sido la principal
herramienta para determinar su participación en los mecanismos de tolerancia isquémica
retiniana. Sin embargo, al presente se desconoce su estructura molecular, por lo que aún existe
controversia respecto al mecanismo por el cual la apertura de estos canales induce protección
frente a un daño isquémico. Incluso se desconoce el mecanismo que desencadena la apertura de
estos canales durante el evento isquémico. Se han propuesto diversos mediadores que podrían
estimular la apertura de estos canales, como el óxido nítrico, la proteína quinasa C (PKC) o las
especies reactivas del oxígeno (ROS) (revisado por O'Rourke, 2004).
Diferencias en la intensidad, duración y/o frecuencia de un estímulo estresante determinan si este
estímulo es demasiado débil para inducir una respuesta, de magnitud suficiente para
desencadenar tolerancia, o bien demasiado robusto y por lo tanto deletéreo per se. Por lo tanto,
es posible que el PCI y el PostC provoquen cambios menores en los sistemas de señales
involucrados en el daño isquémico, desencadenando respuestas adaptativas en lugar de
deletéreas. En este marco, una orientación clave para la búsqueda de las señales involucradas
provino de la identificación de factores que participan del daño isquémico, asumiendo la
Introducción
27
hipótesis de que cambios menores en estos sistemas inducen protección. En este sentido, un
ejemplo clave es el glutamato. La participación del glutamato en el daño isquémico así como en
el mecanismo de inducción de tolerancia isquémica se discutirá en detalle en la sección 6.1.
Se ha sugerido que el óxido nítrico participa tanto en mecanismos de protección como de daño
celular. El óxido nítrico es sintetizado a partir de L-arginina por la enzima óxido nítrico sintasa
(NOS). Las isoformas de NOS presentes en neuronas (NOS neuronal (nNOS)) y en células
endoteliales (NOS endotelial (eNOS)) son enzimas de expresión constitutiva, cuya actividad
depende de los niveles de calcio intracelular. Existe además una isoforma inducible de NOS
(iNOS) independiente de calcio. Sakamoto y col. (2006) demostraron la participación de la iNOS
en el PCI retiniano, mientras que Roth y col. (2006) han caracterizado la participación de la
eNOS. Por otra parte, Zhu y col. (2006) han demostrado que la tolerancia isquémica frente a una
isquemia retiniana es tan efectiva en ratones knockout para iNOS como en los controles. Estos
autores proponen la participación efectiva de eNOS y nNOS en la respuesta adaptativa inducida
por PCI retiniano.
5. Retinopatía diabética
La retinopatía diabética es la principal causa de ceguera irreversible en adultos y sólo en EEUU
provoca más de 8.000 casos por año de nueva ceguera. Aunque no se dispone de estadísticas
actualizadas, se estima que existen ~ 1.800.000 personas con diabetes en nuestro país. A los 10
años del diagnóstico, hasta un 5% de los pacientes desarrolla amaurosis y hasta un 30% padece
una marcada disminución visual. Esta alteración es causada por un deterioro vascular retiniano
que puede provocar edema y extravasación sanguínea, que en muchos casos se ubican en la
mácula, la zona de máxima agudeza visual. La isquemia, una de las consecuencias centrales de la
disfunción, a través de la inducción de factores de crecimiento (particularmente el factor de
crecimiento vascular endotelial (VEGF)) estimula la formación de neovasos frágiles y de fácil
sangrado (retinopatía diabética proliferativa). En etapas más tardías, los neovasos (algunos
Introducción
28
fenestrados) crecen sobre la retina hacia el humor vítreo. Cuando el vítreo se desprende de la
retina, lo que ocurre frecuentemente en los diabéticos, éste tracciona los neovasos, que pueden
sangrar dentro y detrás del vítreo, provocando una hemorragia que puede obstaculizar parcial o
totalmente la visión. En el estadío final la tracción puede aumentar, separando la retina de la
pared ocular (desprendimiento de retina). También pueden crecer neovasos sobre el iris y el seno
camerular, ocasionando un aumento muy marcado de la PIO (glaucoma neovascular). El
aumento en la permeabilidad vascular es el resultado de alteraciones microvasculares tempranas,
con pérdida de pericitos, engrosamiento de la lámina basal y formación de microaneurismas.
Todas estas alteraciones han sido directamente asociadas con la hiperglucemia crónica. En
estadíos avanzados de la enfermedad, las complicaciones isquémicas se agravan, con reducción
en la perfusión de la red capilar e incluso se pueden observar zonas con ausencia completa de
perfusión.
Las estrategias terapéuticas actuales para el tratamiento de la retinopatía diabética son
esencialmente la aplicación de láser cuando aparecen signos de proliferación y la vitrectomía,
que sólo permiten prevenir la progresión de la enfermedad, pero que no logran en todos los casos
una recuperación visual significativa. Además, la fotocoagulación es un procedimiento
destructivo que puede provocar efectos secundarios adversos como pérdida de visión periférica,
visión de color o visión nocturna. Aunque el control estricto de la glucemia permite detener el
avance del déficit visual en un porcentaje considerable, la incorporación de nuevas estrategias
terapéuticas podría contribuir significativamente a disminuir la incidencia de esta disfunción o a
mejorar el cuadro.
Las posibilidades de identificar los mecanismos etiopatogénicos involucrados en el desarrollo y
progresión de la retinopatía diabética, a través de estudios que se limiten a analizar los cambios
clínicamente observables en pacientes diabéticos son limitadas y por ello, resulta imprescindible
realizar estudios invasivos más detallados, preferentemente en un modelo animal accesible. La
diabetes experimental en ratas inducida por la inyección de estreptozotocina (STZ) es un modelo
Introducción
29
ampliamente validado y por lo tanto, podría constituir una poderosa herramienta para elucidar
los mecanismos involucrados y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento de
esta enfermedad. La STZ pertenece al grupo de drogas antineoplásicas alquilantes, que
incrementa la generación del radial libre O2- por el sistema xantín-oxidasa de las células
pancreáticas y estimula la generación de H2O2 causando fragmentación del ADN y muerte
celular.
Uno de los signos característicos del daño vascular causado por la retinopatía diabética es la
disrupción de la barrera hemato-retiniana interna y el aumento de la permeabilidad vascular.
Estas alteraciones ocurren en un estadío temprano de la enfermedad, y afectan inicialmente a los
vasos de mayor calibre y luego a todo el lecho vascular. Múltiples evidencias experimentales
indican que el VEGF juega un rol central en el aumento de la permeabilidad vascular. En
muestras obtenidas de pacientes con retinopatía diabética proliferativa se ha observado un
aumento significativo de los niveles de VEGF en el cuerpo vítreo (Aiello y col., 1994; Ambati y
col., 1997). En diversos modelos experimentales de diabetes se han reproducido estos resultados
y se ha observado incluso aumento en los niveles del ARN mensajero de VEGF desde la semana
1 post-inducción de diabetes (Murata y col., 1996). Se ha postulado que el incremento en los
niveles de VEGF observado en la diabetes se debe a un aumento en la expresión que ocurre
principalmente en las CGRs y células amácrinas (Famiglietti y col., 2003). El VEGF es un factor
de crecimiento angiogénico y es también reconocido como un inductor del aumento de la
permeabilidad vascular. Se han descripto 5 isoformas diferentes de VEGF (de 121, 145, 165, 189
y 206 aminoácidos), que son resultado del splicing alternativo, siendo la isoforma VEGF165 la
más abundante. Al presente, se han identificados dos tipos de receptores de tipo tirosín-quinasa
para VEGF: VEGF-R1 (Flt-1) y VEGF-R2 (KDR/Flk-1). Aunque el mecanismo por el cual el
VEGF aumenta la permeabilidad vascular no se conoce en detalle, se ha observado que la
activación de estos receptores en células endoteliales provoca la disminución en la expresión de
ocludinas, contribuyendo a la disrupción de las uniones oclusivas (Spoerri y col., 2006). En
Introducción
30
concordancia con estos resultados, Kaur y col. (2007) han demostrado que la inhibición de la
producción de VEGF reduce el aumento de la permeabilidad vascular. En los últimos años se ha
invertido considerable esfuerzo en el desarrollo de terapias anti-VEGF. En este sentido, existe un
interés creciente en tratamientos con anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que inhiben
específicamente los efectos del VEGF. De hecho, diversos estudios clínicos se encuentran
actualmente en curso; sin embargo, se han obtenido resultados dispares según las características
particulares de los pacientes (revisado por Romero-Aroca, 2011). La complejidad de las vías
involucradas en las alteraciones vasculares sugiere que la aplicación de estrategias
complementarias es necesaria para un tratamiento eficaz frente a las alteraciones vasculares
diabéticas.
Si bien la retinopatía diabética ha sido clásicamente considerada una vasculopatía, resultados de
varios estudios indican que las neuronas retinianas también son un blanco temprano de la
diabetes. La atrofia de CGRs y la degeneración de la CNI fue inicialmente descripta por Wolter
(1961) en muestras obtenidas de pacientes diabéticos, quien sugirió además que la pérdida
gradual de neuronas comienza en etapas tempranas de diabetes y que esta degeneración puede
dar lugar a cambios vasculares secundarios. Bloodworth (1962) realizó una caracterización
histopatológica de la degeneración de las CGRs en autopsias de pacientes diabéticos y observó la
presencia de células de aspecto picnótico y con fragmentación nuclear. En un estudio posterior,
Barber y col. (1998) demostraron la muerte por apoptosis de CGRs en un modelo de diabetes
experimental. En los últimos años se han publicado diversos trabajos en los que se analizó en
detalle las alteraciones y la degeneración de las CGRs y de la capa de fibras en diversos modelos
de diabetes experimental (revisado por Kern y Barber, 2008). En base a estos resultados, se ha
postulado que la diabetes podría afectar directamente el metabolismo retiniano, provocando
apoptosis de CGRs, y estas alteraciones podrían a su vez, causar la ruptura de la barrera hemato-
retiniana interna.
Introducción
31
Además de la neurodegeneración de CGRs, se han observados otras alteraciones en las CGRs,
como degeneración axonal, disrupción del transporte retrógrado o disminución en la expresión
de proteínas asociadas a la liberación y reciclado de vesículas presinápticas, como sinaptofisina o
VAMP2 (del inglés, vesicle-associated membrane protein), en estadíos tempranos de la
enfermedad (Scott y col., 1986; Ino-Ue y col., 2000; VanGuilder y col., 2008). Como se
mencionará en detalle en la sección 6.1, se han observado también alteraciones tempranas en el
sistema glutamatérgico retiniano de animales diabéticos y se ha sugerido que el aumento en los
niveles de glutamato en la retina podría estar asociado a la neurodegeneración retiniana temprana
observada en la diabetes.
6. El glutamato retiniano
El glutamato es el principal neurotransmisor excitatorio retiniano. Proviene de la dieta y es
también sintetizado endógenamente a partir de amonio y -cetoglutarato y es utilizado en la
síntesis de proteínas y de otros aminoácidos e incluso para la síntesis de otros neurotransmisores,
como el GABA. El glutamato que actúa como neurotransmisor es incorporado en vesículas
presinápticas por un transportador, en un proceso dependiente de ATP. Una vez liberado de las
vesículas presinápticas, el neurotransmisor difunde por la brecha sináptica hasta alcanzar los
receptores postsinápticos. Existen diversos receptores glutamatérgicos que se han clasificado en
función de la respuesta celular desencadenada y su sensibilidad frente a determinados análogos
farmacológicos. Estos receptores se dividen en dos grandes grupos: los receptores ionotrópicos
(asociados a canales que permiten el flujo de iones) y los receptores metabotrópicos (acoplados a
proteínas G). A su vez, existen tres clases de receptores ionotrópicos: receptores del ácido -
amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPA), receptores de kainato y receptores de
N-metil-D-aspartato (NMDA). Estas tres clases de receptores ionotrópicos para glutamato son
complejos macromoleculares que contienen tres dominios transmembrana denominados M1, M3
y M4 y una porción reentrante en la membrana, el dominio M2, que le confiere las distintas
Introducción
32
selectividades iónicas del canal. La estimulación de los receptores NMDA es responsable del
incremento en las concentraciones de calcio intracelular y en condiciones de hiper-estimulación,
de una cascada de eventos que puede desencadenar muerte celular.
Los receptores NMDA están compuestos por un homo- o hetero-tetrámero formados a partir de
tres subunidades (Tabla 1). Presentan un sitio de unión para glutamato, glicina, magnesio, zinc y
un sitio de unión de poliaminas. Los sitios de unión para glutamato y glicina juegan un rol clave
en la activación y apertura del canal, mientras que el Mg2+ actúa como un bloqueante
dependiente de voltaje que se remueve al despolarizarse la membrana. Por su parte, los sitios de
unión para Zn2+ y poliaminas modulan la actividad del receptor.
Se han desarrollado diversos antagonistas del receptor NMDA que están siendo evaluados como
posibles agentes protectores frente a enfermedades neurodegenerativas (Iseri y col., 2011;
Figueiredo y col., 2011). A nivel retiniano, se han localizado receptores glutamatérgicos del tipo
no-NMDA y NMDA en CGRs, células amácrinas, células bipolares y horizontales (revisado por
Pulido y col., 2007).
Además de los receptores ionotrópicos, el glutamato también se une a receptores metabotrópicos
acoplados a proteínas G, modulando la producción de segundos mensajeros intracelulares y
mediando efectos lentos. Se han identificado al menos 8 subtipos de receptores metabotrópicos
de glutamato y éstos a su vez han sido clasificados en tres grupos distintos, basados en la
homología de su secuencia, su perfil farmacológico y su acoplamiento a mecanismos de
señalización intracelular. El primer grupo está integrado por el subtipo mGluR1 y mGluR5, que
activa a una fosfolipasa C, mientras que los miembros del segundo (mGluR2 y GluR3) y el tercer
grupo (mGluR4, mGluR7 y mGluR8) están acoplados negativamente a la adenilato ciclasa; el
receptor mGluR6 está acoplado a la activación de una fosfodiesterasa de GMPc y es específico
de la retina (revisado por Yang, 2004a).
El glutamato liberado al espacio sináptico es mayoritariamente captado por células de Müller y
astrocitos y en una proporción menor por neuronas presinápticas, en tanto que otra porción
Introducción
33
pequeña difunde fuera del espacio sináptico, con posible función periférica (DeVries, 2000). Los
procesos gliales que rodean las sinapsis retinianas expresan transportadores de glutamato que
captan al neurotransmisor y lo transportan al citoplasma celular, donde es amidado por la enzima
glutamina sintetasa (GS). El resultado de esta reacción es la conversión de un producto
potencialmente tóxico como el glutamato en glutamina, un producto no tóxico. La glutamina es
luego liberada de la célula glial y captada por neuronas a través de transportadores específicos.
La glutamina es finalmente hidrolizada a glutamato, por acción de la glutaminasa, completando
el ciclo glutamato/glutamina (Thoreson y Witkovsky, 1999; Poitry y col., 2000) (Figura 3). El
clearance apropiado de glutamato es crucial para una transmisión sináptica normal, así como
para evitar el posible daño por sobre-estimulación post-sináptica. La excitotoxicidad
glutamatérgica (principalmente mediada por activación de receptores NMDA) provoca la entrada
excesiva de calcio con la consecuente activación de caspasas mitocondriales. Una característica
central de este ciclo es que la perturbación de cualquiera de los procesos que lo componen podría
afectar en forma significativa el clearance y reciclado del neurotransmisor (Pow, 2001).
Los transportadores de glutamato son responsables de controlar la concentración del
neurotransmisor y por ello, desempeñan un rol primordial en la regulación del balance entre la
señalización fisiológica y la sobre-activación patológica (Rauen y Wiener, 2000). La recaptación
retiniana de glutamato es un proceso de alta afinidad, electrogénico y acoplado al gradiente de
Na+ transmembrana. Una molécula de glutamato se co-transporta con 3 de Na+ y un H+ y contra-
transporta con un K+. Por lo tanto, como consecuencia del influjo de glutamato, se produce una
translocación neta de dos cargas positivas y acidificación intracelular (Amara y Fontana, 2002).
Al presente se han descripto cinco tipos de transportadores de glutamato: GLAST (L-glutamate-
arginine transporter) o EAAT-1 (excitatory aminoacid transporter), GLT-1 (glutamate
transporter) o EAAT-2, EAAC-1 o EAAT-3, EAAT-4 y EAAT5 (Rauen y Wiener, 2000; Kanai
y Endou, 2001; Bak y col., 2006). Tanto por métodos inmunohistoquímicos como
autorradiográficos, se ha demostrado que la recaptación de glutamato tiene lugar en células de
Introducción
34
Müller, en astrocitos y en células del epitelio pigmentario y en muy bajo porcentaje en neuronas
retinianas (Ehimger y Falck, 1971; Derouiche y Rauen, 1995; Chaudhry y col., 2002). El
transportador de tipo GLAST es el principal transportador de glutamato en la retina y se expresa
en los procesos de las células de Müller y astrocitos (revisado por Tanaka, 2000); el
transportador de tipo GLT-1 se localiza en células bipolares y el EAAC-1 en células
horizontales, amácrinas y CGRs (Pow, 2001). El nivel relativo de expresión de transportadores
de glutamato en la retina de mamíferos es el siguiente: GLAST ≥ EAAC-1 > GLT-1 (Rauen y
Wiener, 2000). Diversos factores pueden regular la actividad de los transportadores de
glutamato. Por ejemplo, cambios en el estado de fosforilación de los transportadores de tipo
EAATs afectan significativamente su función, tanto a corto como a largo plazo (Pow, 2001). Por
otra parte, los transportadores de glutamato son capaces de transportar el sustrato en ambas
direcciones en función del potencial químico (Szatkowski y col., 1990) y de los gradientes
iónicos a ambos lados de la membrana, por lo que modificaciones en la concentración
intracelular de ATP influyen en el sentido del transporte (Anderson y Swanson, 2000).
Tabla 1. Receptores y transportadores de glutamato.
R
ecep
tore
s
Posibles subunidades Respuesta a la estimulación glutamatérgica
Ionotrópico
NMDA NR1, NR2A-D y NR3A-B Aumento del influjo de Ca2+ (Na+) intracelular
AMPA GluR1-4 Aumento del influjo de Na+ (Ca2+) intracelular
Kainato GluR5-7 KA1-2 Aumento del influjo Na+ (Ca2+) intracelular
Metabotrópico
Tipo I mGluR1, mGluR5 Aumento de los niveles de inositol fosfato y diacilglicerol
Tipo II mGluR2, mGlur3 Disminución de los niveles de adenosina monofosfato cíclico
Tipo III mGluR4, mGluR6-8 Modula los niveles de adenosina monofosfato cíclico
Tra
nspo
rtad
ores
Localización retiniana predominante
Glial EAAT1 (GLAST) Células de Müller y astrocitos
Neuronal
EAAT2 (GLT1) Células bipolares y conos
EAAT3 (EAAC1) Células ganglionares, bipolares, horizontales y amácrinas
EAAT4 Células ganglionares, bipolares, horizontales y amácrinas
EAAT5 Células bipolares y fotorreceptores
Modificado de Pulido y col., 2007.
Como ya se mencionó, la GS es la enzima que cataliza la conversión de glutamato y amonio en
glutamina, a través de un proceso dependiente de ATP. Se ha demostrado que los transportadores
Introducción
35
de glutamato y la GS coexisten en una misma célula de Müller, lo que ha llevado a postular que
la actividad de las proteínas que median la recaptación de glutamato y su conversión a glutamina
podrían estar concertadas (Derouiche y Rauen, 1995; Shaked y col., 2002). La actividad de GS
en células de Müller les confiere una enorme capacidad de remover glutamato extracelular, dado
que la conversión de glutamato en glutamina es muy rápida, lo que provee una fuerza motriz
para el influjo de glutamato mayor que en neuronas que tienen una concentración intracelular
mayor de glutamato libre. De esta forma, la actividad acoplada de GLAST y GS (ambos
componentes centrales del ciclo glutamato/glutamina retiniano) en las células de Müller es
crucial para el control del clearance del neurotransmisor (Rauen y Wiener, 2000).
Figura 3. Representación esquemática del ciclo glutamato/glutamina. Una vez liberado al espacio sináptico, el
glutamato interactúa con receptores post-sinápticos y luego es removido de la sinapsis a través de transportadores
específicos que permiten su acceso al interior de las células de Müller, en las que es convertido en glutamina por
actividad de la GS. La glutamina se libera de estas células y se incorpora a neuronas retinianas en las que se
reconvierte en glutamato, en una reacción catalizada por la glutaminasa.
La transferencia de glutamina entre células gliales y neuronas involucra su eflujo a través de la
membrana de las células gliales y su influjo por la membrana plasmática neuronal, ambos
Introducción
36
procesos mediados por transportadores específicos. Los transportadores de glutamina se
clasifican principalmente en 2 categorías, en función de su dependencia de Na+. Los
transportadores dependientes de Na+ utilizan la energía potencial asociada al gradiente
electroquímico transmembrana del ión, mantenido por la bomba Na+/K+ ATPasa. Una vez dentro
de la neurona, la glutamina es convertida a glutamato en una reacción catalizada por la
glutaminasa, enzima que se ubica principalmente en neuronas.
6.1. Participación del glutamato en el daño y en la protección retiniana
Diversas líneas experimentales sugieren la participación del glutamato en el daño isquémico. En
este sentido, se ha demostrado que el daño funcional y morfológico inducido por la sobre-
estimulación glutamatérgica es similar al observado luego de una isquemia retiniana deletérea
(Iversen, 1991; Ikeda y col., 1992; Nucci y col., 2007). En diversos modelos experimentales, se
ha sugerido que la toxicidad inducida por este aminoácido está mediada, al menos en parte, por
receptores NMDA, ya que agonistas específicos de este receptor reproducen los efectos del
glutamato y los antagonistas los bloquean (Sucher y col., 1997; Pang, 1999; Toriu y col., 2000).
Asimismo, la administración de inhibidores de la liberación glutamatérgica previene
significativamente el daño isquémico retiniano y la isquemia induce un aumento significativo en
los niveles de glutamato (Mosinger y col., 1991; Neal y col., 1994; Cazevieille y Ozborne,
1997).
Como se mencionó anteriormente, se han propuesto diversos factores como mediadores de la
tolerancia isquémica desencadenada por el PCI o el PostC. En este contexto, diversas evidencias
experimentales avalan la participación del glutamato en el PCI cerebral. En corteza cerebral de
rata se ha demostrado un aumento en la expresión de la GS inducido por el PCI (Hoshi y col.,
2006) y se ha sugerido la participación de transportadores de glutamato en la tolerancia
isquémica cerebral (Kosugi y col., 2005). Dado que el glutamato es el principal neurotransmisor
Introducción
37
retiniano, el estudio de la participación del sistema glutamatérgico en la inducción de tolerancia
isquémica adquiere una relevancia particular en este tejido.
En cuanto a la retinopatía diabética, se ha sugerido una posible relación causal entre el aumento
en los niveles de glutamato y la disfunción y neurodegeneración retiniana asociada a la diabetes.
Estudios realizados con muestras de pacientes con retinopatía diabética proliferativa sometidos a
vitrectomía, demostraron un aumento significativo en los niveles de glutamato (medido por
cromatografía líquida de alta presión)en el cuerpo vítreo, comparado con pacientes control de
edades similares (Ambati y col., 1997; Deng y col., 2000). Un estudio relativamente reciente de
Lu y col. (2007) ha confirmando estos resultados utilizando una técnica de electroforesis capilar
láser, que brinda mayor sensibilidad de detección aún en muestras pequeñas. Estos resultados se
han reproducido en modelos experimentales de diabetes (Lieth y col., 1998; Kowluru y col.,
2001). En estadíos tempranos luego de la inducción de diabetes en ratas, se ha observado un
aumento significativo en los niveles del receptor NMDA en células de la retina interna (Ng y
col., 2004), así como una mayor actividad de la PKC (Xu y col., 2004). En base a estos
resultados, se ha propuesto que el aumento en los niveles de calcio intracelular causado por la
sobre-activación glutamatérgica podría desencadenar, por un lado, la muerte celular y a su vez,
una cascada de eventos que involucran la activación de PKC que estimula la producción de
VEGF.
7. Los ritmos circadianos
El ciclo de luz/oscuridad causado por la rotación de la Tierra, produce cambios significativos
pero “predecibles” sobre la luz ambiental. Frente a este escenario cambiante, los organismos han
evolucionado y han adquirido la capacidad de generar una representación interna del ciclo de 24
h, o representación temporal circadiana. Este reloj circadiano interno determina el tiempo y las
fases en las cuales ocurren procesos fisiológicos y eventos conductuales en respuesta a los
cambios y señales ambientales externas. Esta adaptación ha permitido a los organismos
Introducción
38
optimizar la utilización de los recursos naturales y aprovechar las condiciones cambiantes del
ambiente tan pronto como tengan lugar, o bien, anticipándose a eventos futuros, como el cambio
de estaciones. De esta forma, determinados estímulos ambientales provocan cambios fisiológicos
en respuesta a condiciones ambientales en forma predictiva. Sin embargo, un reloj biológico
interno sólo representa una ventaja adaptativa si está sincronizado con el ambiente y más aún, si
puede adaptarse o re-sincronizarse frente a un estímulo nuevo. Por lo tanto, el oscilador
circadiano requiere una sincronización diaria, a partir de la percepción de señales externas
sincronizadoras, denominadas Zeitgebers (del alemán Zeit geber, dador de tiempo).
En ausencia de cambios ambientales definidos, es decir en condiciones constantes en las que no
hay indicios externos del paso del tiempo, un organismo se encuentra en libre curso o free
running. Bajo estas condiciones, el organismo expresa ritmos circadianos con un período
cercano, pero no exacto, al experimentado antes del aislamiento, lo que indica la existencia de un
reloj endógeno, denominado reloj circadiano, cuya periodicidad es de aproximadamente 24 h.
Los animales diurnos tienen un período circadiano de más de 24 h, mientras que ciertos animales
nocturnos, como muchos roedores, generalmente presentan un período circadiano de menos de
24 h (Aschoff, 1960; Pittendrigh, 1981a y b).
Para caracterizar un ritmo se pueden definir los siguientes parámetros: (período), A (amplitud)
y (fase). El período es el intervalo de tiempo entre dos sucesos idénticos, o sea, la duración de
un ciclo; la amplitud es la distancia entre el valor medio de la variable y el máximo valor que
alcanza ésta a lo largo del período; y por último, la fase indica a qué momento del ciclo temporal
corresponde la variable en estudio.
Los ritmos biológicos abarcan un amplio rango de períodos y pueden clasificarse de acuerdo a
ellos. La mayoría de los procesos conductuales y fisiológicos (temperatura, actividad, sueño-
vigilia, secreción de hormonas, etc.) oscila con un período cercano a las 24 h. Estos ritmos se
denominan circadianos (del latín circa, cerca de, y dies, día). Sin embargo, existen también
ritmos infradianos, que tienen un período menor a las 24 h (como el ritmo respiratorio o las
Introducción
39
distintas etapas del sueño) y ritmos con período mayor a 24 h, llamados ultradianos (como el
ciclo menstrual o el cambio de pelaje).
Las principales propiedades de los ritmos circadianos fueron originalmente definidas por Colin
Pittendrigh en 1960. Algunas de ellas son: 1) los ritmos circadianos son ubicuos, 2) los ritmos
circadianos son endógenos, 3) los ritmos circadianos son oscilaciones auto-sostenidas, 4) los
ritmos circadianos son innatos, 5) los ritmos circadianos se encuentran en todos los niveles de
organización de un organismo, 6) el período endógeno () es diferente en distintas especies, 7)
es prácticamente independiente de la temperatura, es decir que compensa sus variaciones (Q10
1) y 8) los ritmos circadianos se sincronizan por periodicidades ambientales de período T, siendo
la más importante el ciclo luz-oscuridad (Pittendrigh, 1960).
El sistema circadiano está constituido por tres componentes principales: 1) una vía de entrada del
Zeitgeber (o agente sincronizador); 2) un oscilador, formado por estructuras marcapasos que
generan la señal circadiana; y 3) vías eferentes desde los marcapasos a los sistemas efectores
(Moore y Card, 1985; Meijer y Rietveld, 1989; Morin y Allen, 2006).
El principal Zeitgeber en mamíferos es el ciclo de luz/oscuridad. Existe, sin embargo, la
posibilidad de que bajo determinadas condiciones, el Zeitgeber no sincronice al reloj sino que
afecte directamente las vías eferentes, fenómeno conocido como enmascaramiento (Mrosovsky,
1999). Además de la luz, el reloj puede ser sincronizado por un gran número de estímulos
diferentes, como la temperatura, los hábitos sociales, la actividad, los olores, etc. La luz es
percibida por el sistema circadiano a través de un sistema fotorreceptor especializado. Este
sistema fue originalmente descripto en vertebrados no mamíferos, en los que existen células
fotorreceptoras circadianas localizadas en distintas regiones del cerebro, que responden
directamente a la luz que penetra a través del cráneo (Menaker, 2003). En mamíferos, los
fotopigmentos circadianos pertenecen a la familia de las opsinas. Como se mencionará en detalle
más adelante, la principal opsina involucrada en la sincronización fótica es la melanopsina.
Tanto las CGRs que contienen melanopsina, como los FR clásicos (conos y bastones)
Introducción
40
contribuyen a la sincronización fótica (Berson y col., 2002; Hattar y col., 2003). El componente
principal del reloj biológico en mamíferos son los NSQ, dos grupos de neuronas que se
encuentran en la parte anterior del hipotálamo, en la base del tercer ventrículo y sobre el quiasma
óptico (Figura 4). Los NSQ están compuestos por una población heterogénea de células,
incluyendo múltiples clases de neuronas neuro-peptidérgicas y astrocitos (Abrahamson y Moore,
2001). En roedores, estos núcleos poseen alrededor de 20.000 neuronas y 8.000 astrocitos,
compactados en un volumen de aproximadamente 1 mm3 (Klein y col., 1991). La lesión o
ablación de los NSQ provoca la desaparición de los ritmos circadianos de actividad locomotora y
secreción hormonal, entre otros. De hecho, trasplantes de tejido hipotalámico conteniendo los
NSQ en animales con NSQ lesionados, restauran los ritmos circadianos, induciendo la ritmicidad
característica del donante en el receptor (Ralph y Lehman, 1991). Los NSQ se comunican con el
resto del organismo a través de proyecciones nerviosas y secreciones humorales, tanto para las
vías de entrada como para las de salida. Las principales aferencias provienen de la retina a través
del tracto retino-hipotalámico. Existen además aferencias desde el núcleo intergeniculado (que
recibe también inervación retiniana), el rafe, tanto del núcleo dorsal como del medial y del
núcleo paraventricular del tálamo (Krout y col., 2002). En realidad, muchos de los núcleos
hipotalámicos inervados por los NSQ establecen circuitos bidireccionales, inervando ellos
mismos a los NSQ en forma recíproca (Krout y col., 2002).
7.1. Células ganglionares retinianas intrínsecamente fotosensibles
El estudio de FR detectores de irradiancia que participan en la foto-sincronización ha permitido
la identificación de un gran número de opsinas en vertebrados y quizás el hallazgo en el área más
notorio de los últimos años, la identificación de un nuevo sistema de fotorrecepción en la retina
de mamíferos, mediado por el pigmento melanopsina presente en CGRs intrínsecamente
fotosensibes (CGRifs).
Introducción
41
En mamíferos, la fotorrecepción visual formadora de imagen y no formadora de imagen es
exclusivamente ocular. Se ha demostrado que la enucleación elimina todo tipo de respuesta
frente a un estímulo lumínico (Foster y col., 1991). En ratones dr/dr cl, que poseen una mutación
en el gen Pde6b (rd) (que codifica para una isoforma de la enzima fosfodiesterasa de bastones) y
expresan la toxina diftérica bajo regulación del promotor humano OPN1LW (cl) (que controla la
expresión de un pigmento específico de conos), lo que provoca la degeneración completa de
bastones y conos, se observó que estos animales aún podían regular múltiples procesos
fisiológicos en respuesta a la luz (Lucas y col., 1999). Estos estudios permitieron sugerir la
existencia de un sistema adicional de percepción de la luz en la retina, dado que en estos ratones
(rd/dr cl) un pulso de luz induce contracción pupilar e inhibe la actividad durante la noche
(enmascaramiento por luz). En el año 2002 se publicaron conjuntamente dos trabajos en los que
se identificó y caracterizó la respuesta de las CGRifs. En un trabajo realizado por Berson y col.
(2002) se identificaron retrógradamente estas células de proyección a los NSQ y se evaluó la
respuesta intracelular directa frente a pulsos de luz, en retinas aisladas en presencia de
bloqueantes farmacológicos de la respuesta de conos y bastones. Paralelamente, un trabajo
realizado por Hattar y col. (2002) demostró que estas células intrínsecamente fotosensibles
expresan el fotopigmento melanopsina y constituían un subset pequeño de CGRs
(aproximadamente el 1 - 2 % del total de las CGRs). Estudios posteriores demostraron que la
ablación genética de melanopsina (Opn4-/-) afecta de forma directa el reflejo pupilar y la
respuesta en los ritmos de actividad frente a estímulos de luz o cambios en las fases de
estimulación (Lucas y col., 2003). Finalmente, en animales triple-knockout (rd/dr cl Opn4-/-) se
demostró la ausencia completa de respuesta fisiológica frente a estímulos lumínicos (Hattar y
col., 2003). En suma, estos estudios demuestran que las CGRifs, que contienen melanopsina,
desempeñan un papel central en la sincronización circadiana, la regulación del período
circadiano en respuesta a luz, el reflejo pupilar, la foto-inhibición aguda de la actividad nocturna
y la regulación fótica de la biosíntesis de melatonina pineal, entre otras respuestas fisiológicas.
Introducción
42
Inicialmente, las CGRifs fueron consideradas una población relativamente uniforme de CGRs.
Estudios posteriores han permitido identificar distintas poblaciones de CGRifs con
características morfológicas y funcionales particulares, e incluso con diferentes targets de
proyección central. Utilizando diferentes métodos de marcación genética (línea Opn4tau/lacZ;
sistema Cre/LoxP) se ha demostrado que las CGRifs proyectan a núcleos que participan en
procesos formadores de imagen y no formadores de imagen. Los principales sitios de proyección
son los NSQ y la región periférica del NOP (proyección bilateral en ambos casos), que participan
en la regulación de los ritmos circadianos y el reflejo pupilar, respectivamente. Estas células
proyectan también a otras estructuras cerebrales como el núcleo intergeniculado lateral y la
región ventral del NGL, ambos vinculados al comportamiento circadiano, el núcleo supraóptico,
la zona subparaventricular y la amígdala medial (Figura 4) (Hattar y col., 2006). Estudios
posteriores han permitido identificar las proyecciones de las CGRifs al NGL dorsal y al CS,
ambos involucrados en el procesamiento de la información visual consciente. Aunque las
funciones principales de las CGRifs se hayan asociado inicialmente al procesamiento no
formador de imagen, el patrón complejo de inervación de estas células sugiere una participación
activa en el procesamiento de la imagen consciente (Brown y col., 2010 y 2011).
El estudio de las CGRifs ha transcendido ampliamente su papel inicial como pigmento visual
involucrado en la respuesta circadiana y el reflejo pupilar. Estudios recientes han comenzado a
elucidar el papel que estas células desempeñan en la formación de imagen, el desarrollo de la
retina y la maduración de las proyecciones centrales, así como su participación en diversas
patologías como desórdenes del sueño, ansiedad y depresión, entre otras. Sin embargo, a pesar
del rol central de la retina en el procesamiento de la información circadiana, existe aún escasa
información que permita vincular enfermedades oculares con alteraciones del sistema generador
de los ritmos biológicos.
Introducción
43
Figura 4. A: Representación esquemática del cerebro de roedores en corte sagital, en el que se representan los
núcleos de proyección de las CGRifs. B: Retina flatmouted de un ratón que expresa -gal bajo el promotor de
melanopsina. Se observan claramente las células melanopsina(+) y sus axones que corren hacia el disco óptico
(DO). C: Corte coronal de los NSQ. Se representa en gris la zona de proyección retiniana (región ventro-lateral) al
núcleo. 3V: tercer ventrículo; QO: quiasma óptico. D: corte coronal a la altura del NGL. En gris se observa las
proyecciones retinianas. PO: área preóptica; NSQ: núcleo supraquiasmático; ZSP: zona subparaventricular; NSO:
Núcleo supraóptico; AH; núcleo anterior hipotalámico; LH: núcleo lateral hipotalámico; AM: amígdala medial;
NGLv: núcleo geniculado lateral ventral; NGLd: núcleo geniculado lateral dorsal; NIG: núcleo intergeniculado, Cs:
colículo superior. Modificado de Hattar y col., 2006.
Objetivos
44
OBJETIVOS
Sobre la base de las consideraciones mencionadas en la Introducción, los objetivos centrales de
este trabajo de Tesis fueron:
Analizar el efecto del PostC como mecanismo protector frente al daño retiniano inducido
por isquemia aguda.
Elucidar los mecanismos involucrados en la protección inducida por PostC frente al daño
isquémico retiniano agudo.
Evaluar el efecto protector del condicionamiento isquémico retiniano en un modelo
experimental de diabetes.
Elucidar los mecanismos involucrados, en la protección inducida por el condicionamiento
isquémico frente al daño retiniano inducido por diabetes experimental.
Analizar el efecto de la diabetes experimental sobre la vía visual y las áreas cerebrales de
proyección retiniana en estadíos tempranos de la enfermedad.
Evaluar la efectividad de la inducción de tolerancia isquémica como mecanismo protector
frente a las alteraciones en la vía visual inducidas por la diabetes experimental.
Evaluar el efecto de la diabetes experimental sobre el sistema visual no formador de
imagen.
Materiales y métodos
45
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Animales
Se utilizaron ratas Wistar macho adultas (300 - 350 g). Los animales se mantuvieron bajo
condiciones controladas de temperatura (21 ± 2°C) y humedad, bajo un fotoperíodo de 12 h de
luz (~ 300 lux en las jaulas) y 12 h de oscuridad (encendido de las luces a las 08.00 h) con agua y
alimento ad libitum. En todos los casos, los animales se anestesiaron con hidrocloruro de
ketamina (150 mg/kg) e hidrocloruro de xilacina (2 mg/kg) administradas intraperitonealmente y
en algunos casos se aplicó anestesia local (hidrocloruro de proparacaína 0.5%) en la córnea.
1.1. Inducción de isquemia retiniana. Los animales se anestesiaron y se aplicó anestesia local
en la córnea. Una vez comprobada la falta de respuesta frente a un estímulo corneal, se canuló la
cámara anterior de cada ojo con una aguja 30G conectada a un reservorio presurizado
conteniendo solución Ringer lactato. Mediante la modificación de la presión efectuada sobre el
reservorio, se modificó la PIO durante el tiempo deseado. Al momento de la canulación, se elevó
la presión en el reservorio a 60 - 80 mm Hg para evitar la pérdida de volumen de la cámara
anterior. Se elevó finalmente la PIO a 120 mm Hg (por encima de la presión sistólica, en ratas ~
90 mm Hg). De esta manera se logra una isquemia retiniana completa caracterizada por el
bloqueo total del flujo sanguíneo (observado mediante examinación del fondo de ojo con lupa de
oftalmología) y pérdida de la respuesta electrorretinográfica. Luego de completado el período de
isquemia retiniana, se retiró la aguja de la cámara anterior y se comprobó la inmediata
reperfusión y recuperación del flujo sanguíneo. En el caso del tratamiento simulado, se repitió el
mismo procedimiento pero sin el aumento de la PIO. Durante todo el procedimiento se controló
la temperatura corporal (termómetro rectal) y se mantuvo constante mediante el uso de mantas
térmicas. Se excluyeron de los experimentos aquellos animales que durante el procedimiento
sufrieron daño en el cristalino.
1.2. Inducción de diabetes experimental. Se administró de forma intraperitoneal una única dosis
de STZ (Sigma-Aldrich, USA) de 60 mg/kg (en buffer citrato 0,1 M, pH 4,5). En animales
Materiales y métodos
46
control se inyectó el mismo volumen de vehículo. Al día 3 post-inyección de STZ se controlaron
los niveles de glucosa en sangre (Contour TS, Bayer, Argentina) y aquellos animales con valores
superiores a 350 mg/dL se consideraron diabéticos. Se determinaron semanalmente los niveles
de glucosa en plasma y el peso corporal.
En todos los procedimientos se respetaron estrictamente las Guías para el Cuidado y Uso de
Animales de Laboratorio de ARVO, Association for Research in Vision and Ophthalmology.
2. Inyección intravítrea
Los animales se anestesiaron y se administró una gota de proparacaína en cada ojo, como
anestésico local. La inyección intravítrea se realizó utilizando una jeringa Hamilton de 10 l con
una aguja 30G, bajo un microscopio binocular de cirugía con luz coaxial (Colden, Argentina).
Con la ayuda de una pinza fina se sujetó el ojo y se introdujo la aguja a ~ 1 mm del limbo
esclerocorneal, a través de la pars plana (en un ángulo tal que evitara el contacto con el
cristalino). Se descargó lentamente el contenido de la solución y se dejó la aguja por 30 s para
evitar la salida de líquido de la cámara. Una vez completado el procedimiento, se realizó la
inyección intravítrea en el ojo contralateral. Luego de la inyección de volúmenes pequeños (4 - 5
l) se evaluó la PIO con un TonoPen XL (Mentor, USA) a distintos intervalos y se observó que
en ningún caso la inyección intravítrea provocó aumento de la PIO (datos no mostrados). Se
excluyeron los animales que desarrollaron cataratas o sangrado intraocular como resultado de la
inyección intravítrea.
2.1. Inyección intravítrea de glutamato. Se inyectaron 4 l de una solución 0,3 M de glutamato.
Para estimar la concentración final de glutamato (20 mM) se consideró un volumen total de
humor vítreo de 60 l (Sumioka y col., 2000). La dosis de glutamato se determinó en base a
resultados de Sisk y Kuwubara (1985).
Materiales y métodos
47
3. Procesamiento histológico
Bajo anestesia profunda, los animales se perfundieron con ~ 200 ml de solución fisiológica
seguida de ~ 300 ml de solución fijadora (paraformaldehído al 4% en buffer fosfato (PBS) 0,1
M, pH 7,4). Se disecó cuidadosamente el globo ocular con la porción intraorbital del NO y el
cerebro junto con la porción intracraneal del NO. Las muestras se post-fijaron en la misma
solución fijadora durante toda la noche.
Los ojos se procesaron, como se describirá posteriormente, y se obtuvieron cortes transversales
en parafina para el análisis morfométrico (espesor de capas retinianas y número de CGRs) e
inmunomarcación. Se disecó cuidadosamente la porción del NO proximal y distal (región
intracraneal próxima al quiasma óptico) y se procesaron, en algunos casos, para la obtención de
muestras semifinas (cortes transversales para análisis morfométrico) y en otros casos, se
incluyeron en parafina para la obtención de cortes para inmunomarcación. En este último caso,
se realizaron cortes transversales y longitudinales para evaluar las distintas poblaciones gliales.
Para el análisis de la región de la cabeza del NO, se disecó cuidadosamente la porción
intraorbital del NO (conteniendo parte de las tres túnicas de la pared ocular) y se incluyó en
parafina para la obtención de cortes transversales a distintas alturas del NO. En algunos casos,
los cerebros se cortaron coronalmente (~ 2 mm por detrás del quiasma óptico) y la porción
anterior se procesó para la obtención de cortes en parafina (sección horizontal) a la altura del
quiasma óptico. En otros casos, se realizaron secciones coronales y las distintas muestras del
cerebro anterior y posterior se procesaron para la obtención de cortes por congelación (cortes
coronales) de los distintos núcleos de proyección retiniana.
3.1 Secciones semifinas. Luego de varios lavados con PBS, las muestras se post-fijaron durante
1 h en 1% de OsO4 en el mismo buffer. Posteriormente, se realizaron varios lavados, las
muestras se deshidrataron mediante series crecientes de etanol, se aclararon en acetona y se
infiltraron en araldita. Se obtuvieron secciones semifinas (1m) mediante el uso de navajas de
Materiales y métodos
48
vidrio y un ultramicrótomo Porter-Blum MT2-B (Sorvall, USA), que se tiñeron con azul de
toluidina-bórax (Bancroft y Stevens, 1990).
3.2 Obtención de cortes en parafina. Luego de varios lavados, las muestras se deshidrataron
(serie creciente de alcohol: 70%, 90%, 100%), se aclararon en acetato de butilo y se embebieron
en parafina. Se obtuvieron secciones a lo largo del eje sagital del ojo, manteniendo la membrana
nictitante para facilitar su posterior orientación. Los cortes se utilizaron para el análisis
histológico y/o morfométrico (4 m, tinción con hematoxilina-eosina (H-E)) y para
inmunohistoquímica, inmunofluorescencia y análisis de células TUNEL(+) (7 m). Los NOs se
cortaron en sección transversal o longitudinal (7 m) y se utilizaron para estudios de
inmunofluorescencia. La porción anterior de los cerebros se incluyó en parafina y se obtuvieron
secciones horizontales (10 m) seriadas a la altura del quiasma óptico (conteniendo porciones
del NO y del tracto óptico) que se utilizaron para técnicas de inmunomarcación. Todos los cortes
se montaron sobre portaobjetos con carga electrostática (Superfrost Plus Esco, USA).
3.3 Cortes por congelación. Las muestras se sumergieron en soluciones crecientes de sacarosa
(10%, 20% y 30%), se armó un taco con solución criopreservante (Cryoblock, O.C.T, USA) y se
obtuvieron cortes coronales de cerebro (40 m) en un crióstato CM 1850 (Leica, Alemania). Las
secciones se mantuvieron en PBS/glicerol (50:50) a -20°C hasta su posterior utilización. Todos
los cortes se montaron sobre portaobjetos con carga electrostática.
4. Microscopía electrónica
4.1. Análisis ultraestructural de la retina y el nervio óptico. Se evaluó la ultraestructura de los
vasos de la retina interna y secciones transversales de distintas porciones del NO. Bajo anestesia
profunda, se expuso el corazón de los animales y se inyectó intracardiacamente 0,5 ml de
heparina (como anticoagulante) y 0,5 ml de nitroprusiato de sodio al 2,4% (como vasodilatador).
Los animales se perfundieron con ~ 200 ml de solución fisiológica seguida de ~ 300 ml de
glutaraldehído al 2% y paraformaldehído al 4% en PBS. Se disecó cuidadosamente el globo
Materiales y métodos
49
ocular y el cerebro (junto con la porción intracraneal del NO) y se post-fijó en el mismo fijador
durante 4 h a 4ºC con el agregado de sacarosa 0,2 M. Luego de la fijación, se tomaron muestran
de la pared del globo ocular (cercanas al NO) y porciones de NO de la región proximal y distal a
la papila óptica. Se obtuvieron secciones semifinas como se describió anteriormente. Luego del
análisis de las secciones semifinas, se obtuvieron secciones ultrafinas y se montaron sobre grillas
de 200 Mesh y se tiñeron con acetato de uranilo (1% en etanol al 70%) y con citrato de plomo de
Reynolds. Las secciones se analizaron en un microscopio electrónico Zeiss EM 10 del Instituto
Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA, Castelar, Buenos Aires, Argentina).
4.2. Estudio de la marca de lantano. Se analizó la integridad de la barrera hemato-retiniana
interna según el método de DePace (1984). Los animales se anestesiaron y perfundieron con ~
150 ml de 1 % NaNO3 en solución salina; luego se continuó la perfusión con ~ 300 ml de una
solución de lantano compuesta por: 20 mM de La(NO3)3.6H2O, 80 mM de NaCl, 3,5 mM de
KCl, 1 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2 y 1 mM de glucosa, pH 7,4. Luego de la solución de
nitrato de lantano, se perfundió por 10 min con ~ 300 ml de 2% de glutaraldehído y 4% de
paraformaldehído en una solución conteniendo 43 mM de Na2SO4, 16 mM de NaHCO3, 10 mM
de acetato de sodio, 3,5 mM de KCl, 1 nM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 1 mM de glucosa, 1,6
mM de Na2HPO4, 0,4 mM de NaH2PO4 y 33 mM de sacarosa, pH 7,4. En estas condiciones, el
lantano es insoluble y forma un precipitado electrón-denso que permite una clara localización
ultraestructural. Luego de la fijación, bajo lupa se tomaron muestras de las tres capas del globo
ocular cercanas al disco óptico. Las muestras permanecieron durante toda la noche en PBS con el
agregado de sacarosa 0,2 M y luego se procesaron como se describió en el punto anterior.
5. Análisis de células TUNEL(+)
Para la detección de células apoptóticas con fragmentación del ADN, se utilizó el kit de
detección in situ ApopTag (S7110, Chemicon-Millipore, USA), según las especificaciones del
fabricante. En cortes de retina se cuantificó el número total de células TUNEL(+) por sección.
Materiales y métodos
50
Los resultados obtenidos de 4 secciones separadas (a la altura de la cabeza del NO) se
promediaron y el valor promedio de 5 animales se consideró representativo de cada grupo. Para
el análisis del CS, se determinó el número de células TUNEL(+) en tres secciones coronales
(región rostral, medial y caudal) en la región retino-receptiva (capas SZ y SGS). El valor
promedio obtenido del análisis de 5 animales se consideró representativo de cada grupo
experimental.
6. Análisis de inmunomarcación y detección con isolectina GSA
Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios:
Anticuerpo Antígeno Especie y tipo Dilución Empresa
BDNF Factor neurotrófico derivado del cerebro Ratón
monoclonal 1:100
Neuromics, USA
Brn3a Factor de transcripción de alta expresión en neuronas Cabra policlonal 1:500 Millipore, USA
CD11b (OX42)
Integrina alfa M presente en macrófagos y microglía Ratón
monoclonal 1:100 Serotec, USA
c-Fos Proto-oncogén celular perteneciente a la familia de factores de transcripción de genes de expresión rápida.
Conejo policlonal
1:3000 Santa Cruz,
USA
ED1 (DC68) Glicoproteína de la superficie de la microglía activada, macrófagos, neutrófilos y basófilos.
Ratón monoclonal
1:100 Abcam, USA
GFAP Proteína ácida fibrilar glial característica de astrocitos y células de Müller reactivas
Ratón monoclonal
1:1200 cortes
1:400 montaje plano
Sigma, USA (conjugado-
Cy3)
MBP Proteína básica de mielina Conejo
policlonal ** **
Melanopsina Fotopigmento de las CGRifs Conejo
policlonal 1:1000
Affinity Bioreagent,
USA
NeuN Proteína nuclear específica de neuronas Ratón
monoclonal 1:200
Millipore, USA
O1 Componentes lipídicos de mielina de precursores de OL
Ratón policlonal IgM
** **
PDGFR- Receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaqueta
Cabra policlonal 1:100 Neuromics,
USA
Sinaptofisina Proteína integral de membrana presente en vesículas presinápticas
Ratón monoclonal
1:100 Dako, USA
VEGF Factor de crecimiento vascular endotelial Conejo
policlonal 1:800
Calbiochem, USA
Vimentina Filamento intermedio presente en células gliales Ratón
monoclonal 1:100 Dako, USA
** Los anticuerpos anti-MBP y anti-O1 fueron donados generosamente por el Dr. Campagnoni AT (Mental
Retardation Research Center, University of California, Los Angeles, CA, USA).
Materiales y métodos
51
Se utilizaron los siguientes anticuerpos secundarios:
Anticuerpo 2rio Especie Dilución Empresa Conjugado
Anti-ratón Cabra 1:500 Molecular Probes, USA Alexa Fluor 568
Anti-ratón IgM Burro 1:200 Jackson ImmunoResearch, USA Cy3
Anti-conejo Cabra 1:100 Jackson ImmunoResearch, USA Cy2
Anti-cabra Burro 1:100 Jackson ImmunoResearch, USA DyLight 488
Anti-cabra Burro 1:200 Jackson ImmunoResearch, USA Cy3
En todos los casos, se utilizaron secciones obtenidas como se describió anteriormente. Las
secciones obtenidas en parafina se trataron con xilol, serie decreciente de alcohol (rehidratación)
y PBS. Las secciones obtenidas en crióstato se lavaron varias veces con PBS para quitar el
remanente de glicerol. En algunos casos, dependiendo de las especificaciones del anticuerpo, se
realizó una recuperación antigénica en buffer citrato (pH 6,3) a 90ºC durante 40 min o una
permeabilización con 0,1% Triton X-100 en PBS por 30 minutos. Las secciones se incubaron
con suero de caballo normal al 4% por 60 min para disminuir la unión inespecífica. Para cada
tratamiento se realizaron controles negativos sin el agregado del anticuerpo primario.
6.1. Inmunoflourescencia. Las secciones se incubaron con anticuerpos primarios durante toda la
noche a 4˚C. Luego de varios lavados, se agregaron los anticuerpos secundarios por β h a
temperatura ambiente. Finalmente, las secciones se tiñeron con 4',6-diamidino-2-phenylindole
(DAPI, 0,5 g/ml en solución fisiológica) o Hoechst 33342 (5 g/ml en solución fisiológica) por
10 min y se montaron con medio de montaje para fluorescencia (Vectashield; Vector
Laboratories, USA). Se utilizó un microscopio de fluorescencia BX50 (Olympus, USA)
conectado a una cámara para microscopía 3CCD (Sony, USA). Las imágenes se obtuvieron y
procesaron con el software ImagePro Plus (Media Cybernetics, USA).
6.1.1. Inmunomarcación en retinas en montaje plano. Los animales se perfundieron como se
describió anteriormente. Se disecaron cuidadosamente los ojos y se post-fijaron en la misma
solución fijadora por 2 h a 4°C. Se aislaron cuidadosamente las retinas y se realizaron marcas
Materiales y métodos
52
que permitieron su posterior orientación. Se realizó la inmunomarcación como se mencionó en el
punto anterior, en free floating. Las retinas se incubaron con anticuerpos primarios durante toda
la noche (excepto con el anticuerpo anti-melanopsina que se incubó por 48 h) a 4˚C. Finalmente
se montaron en portas cargados (con la capa de fibras hacia arriba).
6.2. Inmunohistoquímica. Se realizó el bloqueo de la peroxidasa endógena con peróxido de
hidrógeno al 0,3% en PBS durante 20 min. Luego de varios lavado con PBS, las secciones se
incubaron con anticuerpos primarios durante toda la noche (excepto con los anticuerpos anti-
VEGF (48 h) y anti-c-Fos (72 h)) a 4˚C. La inmunorreactividad se reveló utilizando el complejo
biotina-estreptavidina-peroxidasa del kit LSAB2 System-HRP (Dako, USA). La reacción de
diaminobenzidina se acentuó posteriormente con un tratamiento con cloruro de cobalto al 0,5%
por 15 minutos. Los cortes se observaron y analizaron con un microscopio Eclipse E400 (Nikon,
USA) conectado a una cámara Coolpix s10 (Nikon, USA).
6.3. Detección con isolectinas. Para la detección de células microgliales, las secciones se
incubaron por 48 h a 4°C con la isolectina Griffonia simplicifolia I (Isolectina B4, 1:200; Vector
laboratorios, USA) acoplada a biotina. Luego de varios lavados se reveló la marcación utilizando
el método descripto en el punto anterior.
6.4. Análisis por microscopía confocal. Las muestras se procesaron como se describió en el
punto 6.1. Se utilizó un microscopio confocal Eclipse E800 (Nikon, USA).
7. Análisis de la permeabilidad vascular
Se analizó la permeabilidad vascular retiniana mediante la perfusión con el colorante azul de
Evans. Los animales se anestesiaron como ya se describió y se realizó una inyección
intracardíaca de una solución de azul de Evans (2% peso/volumen en PBS). Luego de 40 min los
animales se sacrificaron y se obtuvieron las retinas en montaje plano como se describió
previamente. El colorante se une con alta afinidad a la albúmina sérica. De esta manera, bajo
Materiales y métodos
53
excitación con luz de 620 nm (emisión 680 nm) es posible determinar la localización del
complejo.
8. Inyección de la subunidad de la toxina colérica
Los animales se anestesiaron y se les administró una gota de proparacaína en cada ojo, como
anestésico local. Se inyectaron 4 l de una solución 0,2% (en solución fisiológica) de la
subunidad de la toxina colérica (CTB) conjugada con el flouróforo Alexa 488 (Molecular
Probes, USA) en forma intravítrea, como ya se describió. Luego de 3 días de la inyección, los
animales se perfundieron, se disecaron cuidadosamente los cerebros y se post-fijaron durante
toda la noche. Se realizaron cortes coronales (40 m) seriados por congelación. Luego de varios
lavados, los cortes se tiñeron con DAPI y se montaron con medio de montaje para fluorescencia
para su posterior análisis.
9. Procesamiento de imágenes y cuantificación
Todas las imágenes obtenidas se ensamblaron y procesaron con Photoshop SC (Adobe Systems,
USA). Sólo se realizaron ajustes de brillo y contraste. Para todas las evaluaciones morfométricas,
las imágenes capturadas en formato TIFF se analizaron con el software ImageJ (NIH, USA).
Toda la nomenclatura usada corresponde al atlas de Paxinos y Watson (1997). Para todos los
estudios de inmunofluorescencia, se obtuvieron imágenes digitales en formato TIFF grabadas
con igual tiempo de exposición, brillo y contraste.
9.1. Evaluación morfométrica de cortes transversales de retina. Se obtuvieron
fotomicrografías a una distancia aproximada de 1 mm del NO (región dorsal y ventral) con un
aumento final de 200x y 400x. Se determinó el espesor total de la retina y de cada una de sus
capas y se cuantificó el número de neuronas presentes en la CCG (conteo lineal). Los resultados
se expresaron como número de células en 100 ó 200 m. Para cada ojo, se promediaron los
Materiales y métodos
54
resultados obtenidos de 4 secciones y la media de 5 ojos por grupo se consideró el valor
representativo para cada grupo.
9.2. Cuantificación de astrocitos en retinas en montaje plano. La retina se dividió en 4
cuadrantes y de cada uno se obtuvieron fotomicrografías de la región central y periférica con una
magnificación final de 200x. Las imágenes (área correspondiente a 0,125 m2) se convirtieron a
escala de grises de 8-bits, se aplicó un valor umbral a todas las imágenes determinado
inicialmente por exanimación visual y finalmente se convirtieron a modo binario. Se cuantificó
el área ocupada por astrocitos GFAP(+) y se expresó como porcentaje del área total. Para cada
retina, los resultados obtenidos de los 4 cuadrantes se promediaron y el valor promedio obtenido
de 4 ojos se consideró representativo de cada grupo.
9.3. Análisis del nervio óptico. En secciones semifinas transversales se calculó el área total del
NO a partir de fotomicrografías obtenidas con un aumento de 200x. Las secciones transversales
se dividieron en 4 cuadrantes y se tomaron fotomicrografías de cada región con una
magnificación de 1000x. Las imágenes se convirtieron a escala de grises de 8-bits, se aplicó un
valor umbral a todas las imágenes determinado inicialmente por exanimación visual y finalmente
se convirtieron a modo binario. Las fibras mielínicas se delimitaron digitalmente por el margen
interno de la vaina de mielina. Se cuantificó el número y el área de axones por imagen (Figura
5). Para cada NO se promediaron los resultados obtenidos de 4 secciones separadas y la media
obtenida de 5 nervios se consideró el valor representativo para cada grupo. Se realizaron además
histogramas de distribución de tamaño de fibras, utilizando el programa Origin (OriginLab Corp,
USA).
Se cuantificó el número y área de axones en fotomicrografías de microscopía electrónica (a un
aumento final de 3000x). Se evaluaron aproximadamente 10 fotomicrografías por NO. El g-radio
se calculó a partir de no menos de 500 axones por nervio. Para cada NO se promediaron los
resultados obtenidos de 3 secciones separadas y la media obtenida de 5 nervios se consideró el
valor representativo para cada grupo.
Materiales y métodos
55
Figura 5. Cuantificación del número y área de axones mielínicos con el programa ImageJ. A: Fotomicrografía
representativa de una sección transversal de la porción distal del NO de un animal control. Se aplicó un valor umbral
de corte en la escala de grises y se convirtió la imagen a modo binario, donde al área axonal quedó delimitada por el
borde interior de la vaina mielínica (B). Finalmente, se cuantificaron las partículas (número total y área individual)
limitando el rango de tamaño, para excluir procesos gliales y vasos sanguíneos (C).
9.4. Análisis del colículo superior: densidad neuronal y área GFAP(+). Se obtuvieron
imágenes digitales con una magnificación final de 400x (área 1000 m2) de la región superficial
retino-receptiva (SZ y SGS) del CS en corte coronal. Para el cálculo de la densidad neuronal y la
determinación del área GFAP+ (porcentaje de área ocupada por procesos de células gliales), las
imágenes se convirtieron a escala de grises de 8-bits y se aplicó en cada caso un valor umbral
que permitió binarizar las imágenes. Para cada sección se promediaron los resultados obtenidos
de 2 imágenes (área medial y lateral del CS) y el valor promedio de 3 secciones (región rostral,
medial y caudal) se consideró el valor representativo para cada animal. Finalmente los datos
obtenidos de 5 animales por grupo se promediaron y el promedio se utilizó como el valor
representativo de cada grupo.
9.5. Análisis del transporte de la subunidad de la toxina colérica al colículo superior. La
cuantificación de la marcación con CTB se realizó según el método descripto por Crish y col.
(2010) con algunas modificaciones. Se obtuvieron secciones coronales (seriado alternado,
aproximadamente 30 - 35 cortes) que se utilizaron para realizar una reconstrucción completa del
CS en vista dorsal, utilizando el programa Matlab (The MathWorks Inc, USA). Para cada
sección se delimitó y se calculó el área correspondiente a la región retinotópica. Luego se
convirtieron las imágenes digitales a escala de grises de 8-bits y se calculó la densidad óptica
Materiales y métodos
56
para la marca de CTB, que se relativizó al área total de proyección retinotópica obtenida
anteriormente. De esta forma se obtuvo un vector con la información lineal de la intensidad de
marcación relativa. Se calculó el largo total del CS (en el plano horizontal) y se dividió el vector
en bins (4 m), de la región medial a lateral. Finalmente, se aplicó una escala térmica
colorimétrica (de azul = 0% a rojo = 100%) (Figura 6). Se determinó el número de cortes y el
espesor (2x) y se realizó la reconstrucción final del mapa de proyección retinotópico al CS. Se
analizaron 5 animales por grupo.
Figura 6. Determinación del transporte de CTB al CS. A: Fotomicrografía representativa de una sección coronal del
CS de un animal control donde se observa la marca de CTB en las capas superficiales. La cuantificación de la
densidad óptica para CTB se relativizó al área total retino-receptiva (B). Finalmente se obtuvo un vector al que se le
aplicó una escala térmica según la intensidad de marcación (C).
9.6. Cuantificación de neuronas c-Fos(+). Se analizaron cortes seriados de los NSQ, el NOP y
el NGL y se cuantificó el número total de neuronas c-Fos(+) por núcleo. Finalmente, los datos
obtenidos de 5 animales por grupo se promediaron y se utilizó el promedio como el valor
representativo de cada grupo.
9.7. Análisis de co-localización. Se obtuvieron fotomicrografías seriadas con un aumento de
400x, en el plano-Z (10 m de profundidad, imágenes cada 0,5 m). Las imágenes se analizaron
para evaluar la co-localización de marcadores, utilizando el programa Olympus Fluoview
Viewer (Olympus Corporation, USA). Se utilizó el coeficiente de correlación de Pearson (r) para
determinar el grado de co-localización. Este coeficiente evalúa el grado de co-variación entre
distintas variables relacionadas linealmente. El r se mide en una escala de valores absolutos que
oscila entre 0 y 1. Un valor de r = 0 indica que no hay relación lineal entre las variables y un
Materiales y métodos
57
valor de r = 1 indica una correlación perfecta entre dos variables. Se determinó un valor umbral
de r > 0,5 para definir correlación positiva. Los resultados obtenidos de cada imagen (del Z-
stack) se promediaron y la media se registró como el valor representativo de cada muestra. Se
analizaron 2 secciones por NO y el valor de 5 animales se promedió y utilizó como valor
representativo de cada grupo.
10. Western blot
Los animales se sacrificaron y se extrajeron las retinas. Cada retina se homogeneizó en 150 l e
buffer 10 mM de HEPES, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 10 mM de KCl, 0,5% de Tritón
(v/v) pH 7,9, con el agregado de un cóctel de inhibidores de proteasas (Sigma, USA). Luego de
15 min a 4°C, los homogenatos se agitaron por 15 s y se centrifugaron a 3.000 g por 10 min. Los
sobrenadantes se utilizaron para la determinación de la concentración de proteínas. Las proteínas
(50-100 µg/ muestra) se separaron por SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida al 10 - 12 %.
Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a membranas de difluoruro de
polivinilideno durante 60 min a 15 V en un sistema Bio-Rad Trans-Blot SD (Bio-Rad
Laboratories, USA). Las membranas se bloquearon con 5% de leche en polvo descremada en
buffer Tris (pH 7,4), conteniendo 0,1% de Tween-20 durante 60 min a temperatura ambiente.
Las membranas se incubaron a 4C con los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpo
policlonal de conejo anti-VEGF (1:1000; Calbiochem, USA) por 48 h, anticuerpo policlonal de
conejo anti-melanopsina (1:1000; Affinity Bioreagent, USA) por 48 h y anticuerpo policlonal de
conejo anti-rodopsina (1:1000; Santa Cruz Biotechnology, USA) durante toda la noche.
Las membranas se lavaron con buffer Tris (pH 7,4) conteniendo 0,1% de Tween-20 y se
incubaron durante 1 h con un anticuerpo secundario anti-conejo (1:2000; Bio-Rad) acoplado a
peroxidasa. Las bandas se visualizaron por quimioluminiscencia (Western Blotting Analysis
System; Amersham Biosciences, Argentina) y se determinaron los niveles de く-actina como
control interno de carga. Las membranas se escanearon y la intensidad de las bandas se
Materiales y métodos
58
determinó utilizando el programa ImageJ. Los valores se expresaron como unidades arbitrarias
de los niveles de la proteína a determinar en cada caso respecto a los niveles de く-actina.
La concentración de proteínas se determinó por el método de Lowry y col. (1951). Se utilizó
albúmina bovina como estándar.
11. Estudio funcional de la retina
11.1. Electrorretinografía escotópica. Los animales se mantuvieron en oscuridad por 6 h y
luego se anestesiaron, como ya se describió. Se utilizó hidrocloruro de fenilefrina al 2,5% y
tropicamida al 1% (Laboratorios Alcon, Argentina) para dilatar la pupila y se administró, en
forma continua, solución salina balanceada (Laboratorios Alcon, Argentina) en la córnea, para
mantener un registro estable y prevenir una queratopatía. Los animales se colocaron frente a la
fuente luminosa, a una distancia de 20 cm. Todos los registros se realizaron dentro de los 20 min
seguidos a la inducción de la anestesia y se mantuvo constante la temperatura corporal usando
una manta térmica. Se usó un electrodo de referencia colocado en la oreja (ipsilateral), un
electrodo de tierra colocado en la porción media de la cola y un electrodo de oro en el centro de
la córnea. Para la correcta implantación de los electrodos se utilizó una luz roja de 15 W, que no
afectó la adaptación de los animales a la oscuridad. Los electrorretinogramas (ERGs) de ambos
ojos se registraron simultáneamente y en completa oscuridad. Para ello, se aplicaron 20 pulsos de
luz blanca sin atenuación (5 ms, 0,2 Hz) generados por un estimulador fótico de diodos aplicados
con una intensidad máxima de 9 cd s/ m2. Los registros se amplificaron utilizando un equipo
Akonic BIO-PC (Akonic, Argentina). La señal se registró con una ganancia de 100 V, sin
atenuación, con filtros de ruido de baja (1,5 Hz) y de alta (1000 Hz) frecuencia para optimizar el
registro. Se determinó la amplitud (en V) de la onda a (respuesta mediada por FR) como la
diferencia en amplitud entre la línea isoeléctrica y el pico negativo y la amplitud de la onda b
(respuesta mediada principalmente por células de retina interna) como la diferencia entre el pico
de onda a y el pico positivo de la onda b (Figura 7A). Se determinaron las latencias de cada
Materiales y métodos
59
onda. La respuesta electrorretinográfica se obtuvo como el promedio de los valores de cada
corrida. Se realizaron tres estímulos, con un intervalo de 5 min.
11.2. Potenciales oscilatorios. Los potenciales oscilatorios (POs) se registraron utilizando el
mismo estimulador fótico (5 ms, 0,2 Hz), con filtros de baja (100 Hz) y alta frecuencia (300 Hz).
La amplitud de los POs se calculó como el punto de máxima amplitud de cada pico en relación a
la línea de base (Figura 7B). El resultado obtenido de la suma de los tres picos de los POs se
utilizó para el análisis estadístico.
11.3. Potenciales visuales evocados. Para el registro de los potenciales visuales evocados
(VEPs) se colocaron quirúrgicamente dos electrodos de acero inoxidable, 4 mm lateral a la cisura
inter-hemisférica y 5,6 mm por detrás de bregma (electrodo activo). Se colocaron electrodos de
referencia en posición 2 mm lateral a la línea media y 2 mm antes de bregma y un electrodo de
tierra en la cola. Ambos electrodos se aislaron y fijaron con acrílico dental y la piel se suturó con
nylon 5/0. Los VEPs se evaluaron 5 días después de la implantación de los electrodos. Luego de
6 h de adaptación a la oscuridad, los animales se anestesiaron y se irrigó la córnea en forma
intermitente como ya se describió, bajo luz roja tenue. Cada ojo se registró individualmente, se
ocluyó el ojo contralateral y se registró un promedio de 70 estímulos. Los ojos se estimularon
con luz blanca sin atenuar (1 Hz) con un estimulador fótico (diodos emisores de luz), fijado a la
máxima intensidad de luz y los registros se amplificaron, filtraron (0,5 Hz filtro de baja
frecuencia, 100 Hz filtro de alta frecuencia) y promediaron. Se determinó la latencia del
componente N2-P2 desde el inicio hasta el segundo pico negativo o positivo, respectivamente
(Figura 7C).
Materiales y métodos
60
Figura 7. Se muestran registros representativos y el método utilizado para evaluar la amplitud y latencia de las
ondas a y b del ERG (A), de los picos P1, P2 y P3 de los POs (B) y la latencia del componente N2-P2 de los VEPs
(C).
12. Evaluación de la actividad del ciclo glutamato/glutamina a nivel retiniano
12.1. Determinación del influjo de L-3H-glutamato y L-3H-glutamina. El influjo de L-3H-
glutamato y L-3H-glutamina se determinó en fracciones sinaptosomales crudas de retinas. Las
retinas se homogeneizaron en sacarosa 0,32 M (1:9 P/V) y el homogenato obtenido se centrifugó
a 900 g por 10 min a 4°C. Los homogenatos libres de núcleos se centrifugaron luego a 30.000 g
durante 20 min. El precipitado se resuspendió inmediatamente en buffer HEPES-Tris,
conteniendo 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 10 mM de
HEPES y 10 mM de glucosa y ajustado a pH 7,4 con Tris-base. Alícuotas de las fracciones
sinaptosomales retinianas crudas (100-300 g de proteína/ 100 l) se incubaron a 37° C con
agitación suave, junto con 100 µl de L-3H-glutamato o L-3H-glutamina (500.000-800.000
dpm/tubo, actividad específica: 17,25 y 51 Ci/mmol, respectivamente). Luego de 5 min de
incubación, la reacción se detuvo por el agregado de 4 ml de buffer HEPES-Tris frío. La mezcla
se filtró inmediatamente bajo vacío sobre filtros Whatman GF/B. Los filtros se lavaron dos veces
con 4 ml de buffer frío. La radioactividad retenida en los filtros se determinó en un contador de
centelleo líquido. La captación inespecífica se determinó en presencia de un exceso de glutamato
o glutamina fría (10 mM).
12.2. Determinación de la actividad de glutamina sintetasa. Las retinas se homogenizaron en
forma individual en 200 µl de PBS 10 mM, pH 7,2. Alícuotas de 150 µl del homogenato se
Materiales y métodos
61
mezclaron con 150 µl de una solución stock conteniendo buffer imidazol-100 mM de HCl, 40
mM de MgCl2, 50 mM de -mercaptoetanol, 200 mM de hidroxilamina y 20 mM de ATP (sal de
sodio), ajustado a pH 7,2. Luego de una incubación a 37°C durante 15 min, se agregó 1,5 ml de
una solución 0,37 M de FeCl3, conteniendo 0,67 M de HCl y 0,20 M de ácido tricloroacético.
Las muestras se mantuvieron en hielo por 5 min, luego se removió el precipitado por
centrifugación y la absorbancia del sobrenadante se determinó a 535 nm. El blanco de la
reacción se evaluó reemplazando el tejido por buffer. Bajo estas condiciones, 1mol de -
glutamilhidroxamato tuvo una absorbancia de 0,340.
12.3. Determinación de la liberación de L-3H-glutamato y L-3H-glutamina. Se utilizaron
fracciones sinaptosomales crudas que se incubaron por 30 min a 37°C con L-3H-glutamato o L-
3H-glutamina (1.000.000 - 1.500.000 dpm/ retina) en 500 µl de buffer HEPES-Tris. Los
sinaptosomas se lavaron por centrifugación para remover el exceso de radioligando. Luego se
incubaron bajo agitación por 10 min en 500 µl del mismo buffer (5 mM de KCl) o en
condiciones de alto K+ (50 mM) conservando la osmolaridad por compensación con la
concentración de Na+. Las muestras se centrifugaron, los precipitados se digirieron con hidróxido
de hiamina y se determinó la radioactividad tanto en el medio como la incorporada en los tejidos.
La liberación fraccional se calculó como la radioactividad liberada sobre la radiactividad total
del tejido. Más del 85% de la radioactividad liberada se identificó como glutamato o glutamina
auténticos respectivamente, por cromatografía en capa delgada.
12.4. Determinación de la actividad de glutaminasa. Cada retina se homogenizó en 100 l de
7,5 mM de Tris-HCl, 0,1% Triton X-100, pH 8,8. Alícuotas de 20 l de homogenato (200 - 400
g de proteínas) se mezclaron con 100 l de una solución que contenía 20 mM de glutamina, L-
3H-glutamina (0,2 - 0,5 Ci) y buffer fosfato de potasio 45 mM, pH 8,2. Las muestras se
incubaron con agitación, por 1 h a 30°C. La reacción se frenó por el agregado de 1 ml de una
solución de 20 mM de imidazol frío, pH 7,0. Luego de una breve centrifugación, los
sobrenadantes se sembraron en una resina de intercambio aniónico de 0,6 x 3,5 cm (Dowex,
Materiales y métodos
62
AG1-X2, 200-400, Laboratorios Bio-Rad) previamente cargada con 1ml de 1 M de HCl y
lavada con agua. El exceso de sustrato de la reacción se removió con 6 ml de imidazol y el
producto final se obtuvo mediante el lavado de la resina con 3 ml de HCl 0,1 M. Alícuotas de
esta fracción se mezclaron con líquido centellante y se determinó la radioactividad. El blanco de
la reacción se determinó reemplazando el tejido por buffer. La actividad específica de
glutaminasa se expresó como moles glutamato/ mg proteína x hora
13. Actogramas y evaluación del periodograma
Los animales se mantuvieron individualmente en jaulas y se monitoreó la actividad locomotora
diaria con sensores infrarrojos ubicados sobre cada jaula. El sensor infrarrojo funciona mediante
la emisión de pulsos de luz infrarroja y luego midiendo la distancia a los objetos por el tiempo
que tarda en llegar la señal reflejada. Cada vez que cambia la distancia, el sensor abre o cierra un
interruptor. Todos los sensores se probaron para garantizar la uniformidad de la respuesta. La
actividad se registró cada 5 min y los resultados se procesaron con un software para la
adquisición de datos (ElTemps, España). Los animales se expusieron inicialmente a un
fotoperíodo de 12 h de luz (~ 200 lux en las jaulas) y 12 h de oscuridad (encendido de las luces a
las 08.00 h). Para cada animal se obtuvo un gráfico de onda (waveform) de la actividad promedio
y se calculó el ángulo de fase para el inicio de la actividad. Para ello, se determinó un valor
umbral de actividad y se calculó el tiempo (en min) desde el apagado de las luces hasta el
comienzo de la actividad (valor de bin (5 min) por encima del umbral promedio). Finalmente, los
datos obtenidos de 10 animales por grupo se promediaron y la media obtenida se utilizó como el
valor representativo de cada grupo.
14. Evaluación del reflejo pupilar
Los animales se adaptaron a la oscuridad por 1 h antes de la evaluación del reflejo pupilar. Se
aplicó un pulso de luz blanca (1200 lux) a un ojo y se registró la contracción de la pupila del ojo
Materiales y métodos
63
contralateral. Los registros se realizaron bajo luz infrarroja con una cámara de video digital
(Sony DCR-SR60, Japón). Se determinó el diámetro de la pupila antes y 30 s después de aplicar
el pulso de luz. La velocidad de muestreo fue de 30 imágenes/s. Se adquirieron las imágenes a
partir de la grabación de video digital utilizando el programa OSS Video Decompiler Software
(One Stop Soft, USA). El porcentaje de contracción de la pupila se calculó como el porcentaje
del área de la pupila a los 30 s del inicio del pulso (estado estacionario) en relación con el
tamaño de la pupila dilatada. Los datos obtenidos de 10 animales por grupo se promediaron y se
utilizó como el valor representativo de cada grupo.
15. Lentectomía
Los animales se anestesiaron como se describió, y se les aplicó anestesia local y un midriático
para dilatar la pupila (Fenilefrina 2% + tropicamida 0,5%). Se inició la cirugía con una incisión
corneo-corneal en hora doce (región dorsal). Se inyectó solución viscoelástica en la cámara
anterior para facilitar la capsulorrexis con pinza de Utrata y se realizó una hidro-disección para
facilitar el movimiento del núcleo del cristalino. Una vez completados estos pasos se amplió la
incisión corneal en 110 grados y se retiró el cristalino con una pinza de 0.12 mm. Se realizó una
irrigación/aspiración con cánula para retirar los restos de corteza y viscoelástico remanente. La
incisión corneal se suturó con puntos simples (Nylon 10-0 monofilamento). Los animales se
trataron con nepafenac 0.1% (Nevanac, Laboratorios Alcon) y moxifloxacina 0.5% (Vigamox,
Laboratorios Alcon) por 7 días (aplicación en gotas, 2 veces por día). Se realizó un control
clínico cada 36 h y se evaluó la función visual luego de 7 días post-cirugía.
16. Análisis estadístico
Para el análisis estadístico de los resultados obtenidos se utilizaron el test de Student para la
comparación entre dos grupos experimentales, o el análisis de varianza a dos vías (ANOVA),
seguido de los tests de Tukey o de Dunnett, para comparaciones múltiples.
Resultados
64
RESULTADOS
1. Post-condicionamiento isquémico retiniano
Como se mencionó en la Introducción, trabajos previos de varios grupos demostraron la alta
efectividad del PCI en la protección de la función y la estructura de la retina frente a un daño
isquémico agudo. A pesar de las eventuales ventajas que podría tener la posibilidad de inducir
protección retiniana con una maniobra realizada a posteriori del evento isquémico, al inicio de
este trabajo no se disponía de antecedentes sobre el efecto del PostC a nivel retiniano. Para
analizar la viabilidad de esta hipótesis, se evaluó el efecto protector del PostC frente a una
isquemia retiniana deletérea. Una isquemia de 40 min fue suficiente para provocar alteraciones
retinianas evidentes tanto a nivel funcional como morfológico. Se evaluó el efecto protector de la
aplicación de ciclos de isquemia/reperfusión a diferentes intervalos luego del episodio isquémico
prolongado, de acuerdo a los protocolos experimentales descriptos en la Figura 8.
La aplicación de 7 ciclos de isquemia/reperfusión (1 min/ 1 min) a los 5 min del episodio
isquémico revirtió significativamente el daño funcional (amplitud de las ondas a y b del ERG)
inducido por 40 min de isquemia. En este grupo de animales se observó una preservación
funcional completa luego de 7 días de reperfusión (Figura 9). No se observó una clara progresión
del daño funcional inducido por la isquemia de 40 min, dado que los resultados obtenidos luego
de 7 ó 14 días de reperfusión fueron esencialmente similares.
Figura 8. Protocolo y grupos experimentales utilizados para evaluar la efectividad del PostC frente al daño
isquémico agudo. Se evaluó el efecto del tiempo de isquemia, tiempo de reperfusión, número de pulsos y el efecto
de la aplicación de un único pulso de isquemia. En todos los casos, el análisis funcional y/o morfológico se realizó a
los 7 y/ó 14 días de reperfusión.
Resultados
65
Figura 9. Evaluación funcional de la protección inducida por PostC sobre el daño isquémico retiniano. En ojos
sometidos a 40 min de isquemia se observó una disminución significativa de la amplitud de las ondas a y b del ERG
luego de 7 ó 14 días de reperfusión. En ojos post-condicionados se observó una recuperación significativa de las
alteraciones funcionales inducidas por una isquemia retiniana prolongada. Se muestra la media ± error estándar (EE)
(n= 10 ojos/ grupo). **: P< 0,01 vs. control; a: P< 0,01 vs. ojos isquémicos con tratamiento simulado, test de Tukey.
En el panel inferior se muestran ERGs representativos de un ojo control, un ojo isquémico con tratamiento simulado
y un ojo isquémico con PostC, luego de 7 días de reperfusión.
La protección inducida por PostC frente al daño isquémico agudo se evaluó también a nivel
morfológico. La aplicación de 7 pulsos breves de isquemiareperfusión luego de 5 min de la
isquemia prolongada (40 min) redujo marcadamente las alteraciones histopatológicas
características del daño isquémico retiniano (Figura 10). El análisis morfométrico de retinas de
los distintos grupos experimentales indicó una preservación significativa del espesor total de la
retina y del número de células de la CCG en el grupo con PostC respecto al grupo isquémico
Resultados
66
(Tabla 2). Se obtuvieron resultados similares para el grupo isquémico y para el grupo con
isquemia y post-condicionamiento luego de 30, 45 y 60 días de reperfusión (datos no mostrados).
Figura 10. Fotomicrografías representativas de cortes transversales de retinas de los distintos grupos experimentales
luego de 14 días de reperfusión. En el panel A se muestra una retina control (detalle en B). Una isquemia de 40 min
provocó una marcada alteración en todas las capas de la retina interna (C, detalle en D), con la presencia frecuente
de pliegues de la retina externa y pérdida de FR (C, detalle en E). El PostC revirtió estas alteraciones (panel F,
detalle en G). Barras: F= 200 m; G= 50 m. CCG, capa de células ganglionares; CPI, capa plexiforme interna;
CNI, capa nuclear interna; CPE, capa plexiforme externa; CNE, capa nuclear externa, SF, segmentos internos y
externos de fotorreceptores.
Resultados
67
Con el objeto de caracterizar más detalladamente el daño morfológico inducido por la isquemia y
el efecto protector del PostC, se evaluaron los cambios macrogliales y las alteraciones a nivel de
las terminales presinápticas. En primer lugar, se analizó la respuesta glial a través de la
inmunomarcación para GFAP. En cortes transversales de retinas del grupo control, la
inmunomarcación para GFAP se limitó exclusivamente a astrocitos presentes en la capa de fibras
de las CGRs. En retinas analizadas luego de 14 días del episodio isquémico prolongado (40 min)
se observó un aumento en los niveles de GFAP en los procesos de las células de Müller
localizados a lo largo de toda la retina. Se utilizó el marcador glial vimentina (de expresión
constitutiva en células de Müller) para determinar si la gliosis caracterizada por el aumento en
los niveles de GFAP se asoció con la división y formación de nuevas células de Müller en
respuesta al daño retiniano (Figura 11). En cortes transversales de retina se cuantificó el número
de procesos gliales presentes en la CPI en diferentes regiones de la retina respecto al disco
óptico. En retinas isquémicas se observó una clara desorganización de los procesos de las células
de Müller (Figura 11), sin embargo, no se detectó un aumento significativo en el número de
procesos de células de Müller entre los grupos experimentales (datos no mostrados). La
aplicación de pulsos breves de isquemia (7 ciclos de isquemia/reperfusión, 1 min/ 1 min) luego
de 5 min de reperfusión revirtió en forma evidente las alteraciones gliales inducidas por la
isquemia prolongada (Figura 11).
La sinaptofisina es una proteína presente en las terminales presinápticas que participa en la
formación y el reciclado vesicular. En retinas control se observó una inmunomarcación intensa
para sinaptofisina en ambas capas plexiformes. En retinas isquémicas se observó una clara
disminución en la inmunorreactividad en la CPI y CPE, con zonas de ausencia completa de
marca, particularmente en la CPE. Estas alteraciones no fueron evidentes en retinas post-
condicionadas, en las que se observó una inmunomarcación intensa para sinaptofisina en ambas
capas plexiformes (Figura 11).
Resultados
68
Figura 11. Inmunomarcación para GFAP, vimentina y sinaptofisina, luego de 14 días de reperfusión. Panel
superior: En retinas control, la inmunomarcación para GFAP se observó sólo en astrocitos. En retinas isquémicas se
observó una marca intensa para GFAP en procesos de células de Müller. El PostC redujo notablemente la
inmunorreactividad para GFAP. Panel central: No se observaron diferencias en la inmunomarcación para vimentina
entre los distintos grupos experimentales. Panel inferior: En retinas control se observó una marcación intensa para
sinaptofisina en ambas capas plexiformes. En retinas de ojos isquémicos se observó una disminución marcada en los
niveles de sinaptofisina, que fue revertida por el PostC. Barra= 50 m. CCG, capa de células ganglionares; CPI,
capa plexiforme interna; CNI, capa nuclear interna; CPE, capa plexiforme externa; CNE, capa nuclear externa, SF,
segmentos internos y externos de fotorreceptores.
Resultados
69
Con el objeto de evaluar la efectividad del PostC frente a una injuria de mayor magnitud, se
analizó el efecto de la aplicación de 7 ciclos de isquemia/reperfusión (1 min/ 1 min) aplicados 5
min después de una isquemia de 60 min de duración (Figura 8). Este período de isquemia
provocó notables alteraciones funcionales y morfológicas. A nivel funcional, la isquemia de 60
min causó una disminución significativa en la amplitud de las ondas a y b del ERG, que resultó
significativamente mayor que el daño causado por una isquemia de 40 min (P< 0,01). El PostC
revirtió parcial, pero significativamente la disminución en la amplitud de las ondas a y b del
ERG inducida por la isquemia de 60 min de duración (Figura 12). Este período de isquemia
causó una disminución muy marcada del espesor total de la retina, que fue significativamente
mayor a la observada luego de 40 min de isquemia (Tabla 2). Como consecuencia de la magnitud
de las alteraciones causadas por la isquemia de 60 min, no fue posible un análisis del espesor de
las capas retinianas. Sin embargo, la aplicación de pulsos breves de isquemia revirtió
parcialmente estas alteraciones. En este caso se observó una preservación evidente de la
estructura retiniana, en comparación con retinas isquémicas con tratamiento simulado (Figura
12).
Tabla 2. Espesor total de la retina y número de células en la CCG en el grupo control (no isquémico) y en ojos con
isquemia de 40 ó 60 min, sin o con PostC, analizados luego de 14 días de reperfusión.
Tratamiento Espesor total de la retina
(en m) Número de células en la CCG
(células/ 200 m)
Control 133,8 2,5 14,2 0,6
40 min isquemia 96,6 7,7 ** 7,3 0,9 **
40 min isquemia + PostC 119,2 3,2 a 10,0 0,6 a
60 min isquemia 34,5 4,3 **, a ---
60 min isquemia + PostC 99,7 3,6 **,‡ 8,3 2,4 *
Espesor total de la retina y número de células en la CCG/ 200 m (se muestra la media ± EE, n= 10 retinas/ grupo).
* : P< 0,05, **: P< 0,01 vs. ojos no isquémicos (control), a: P< 0,01 vs. isquemia de 40 min con tratamiento
simulado, ‡: P< 0,01 vs. isquemia de 60 min con tratamiento simulado, test de Tukey.
Resultados
70
En la siguiente serie de experimentos, se analizó la influencia del número de ciclos de
isquemia/reperfusión (1 min/1 min) sobre la efectividad del PostC frente a un evento isquémico
deletéreo. Para ello, se aplicaron 3, 7 ó 10 ciclos de isquemia/reperfusión a los 5 min de una
isquemia de 40 min de duración. Luego de 7 días de reperfusión se evaluó la respuesta
electrorretinográfica. La aplicación de 7 ó 10 ciclos de isquemia/reperfusión resultó igualmente
efectiva como mecanismo protector, en tanto que 3 pulsos fueron inefectivos. Asimismo, se
Figura 12. Efecto protector del PostC frente al daño retiniano inducido por 60 min de isquemia. En retinas
isquémicas se observó una disminución significativa en la amplitud de las ondas a y b del ERG, tanto a los 7 como a
los 14 días de reperfusión. Se observaron alteraciones morfológicas en toda la retina luego de 14 días de reperfusión.
La aplicación del PostC revirtió parcialmente estas alteraciones a nivel funcional y morfológico. Media ± EE (n= 10
ojos/ grupo). **: P< 0,01 vs. control; a: P< 0,01 vs. isquemia + tratamiento simulado, Test de Tukey. Barra= 50 m.
Resultados
71
examinó el efecto de la aplicación de un único pulso de 7 min de isquemia (tiempo equivalente a
la suma de 7 ciclos de 1 min) 5 min después de la isquemia prolongada (40 min). Un único pulso
de 7 min de duración resultó igualmente efectivo en la protección frente al daño funcional
provocado por una isquemia prolongada que el inducido por los 7 ciclos de isquemia/reperfusión
(Figura 13).
En todos los casos analizados, la aplicación de pulsos breves de isquemia en ojos control (no
isquémicos) no tuvo ningún efecto evidente sobre la función electrorretinográfica (datos no
mostrados).
A continuación, se examinó la ventana temporal en la que la aplicación del PostC resulta efectiva
frente al daño isquémico. Para ello, se aplicaron 7 ciclos de isquemia/reperfusión a los 5, 10, 30,
60 min ó 24 h luego de 40 min de isquemia. Los resultados obtenidos indicaron una preservación
funcional significativa y dependiente del tiempo de reperfusión. La protección funcional resultó
máxima cuando el PostC fue aplicado 5 ó 10 min luego de la isquemia, aunque se observó una
Figura 13. Influencia del número de ciclos de isquemia/reperfusión aplicados a los 5 min de una isquemia
prolongada (40 min). Se muestra la media ± EE (n= 10 ojos/ grupo). **: P< 0,01 vs. grupo control; a: P< 0,01 vs.
isquemia + tratamiento simulado, Test de Tukey.
Resultados
72
protección menor, pero significativa aún cuando la aplicación de los pulsos de isquemia
comenzó 60 min después de la isquemia prolongada (Figura 14).
Con el objetivo de elucidar los mecanismos involucrados en la protección desencadenada por el
PostC, se evaluó la participación de la síntesis de novo de proteínas. Para ello, se inyectó
cicloheximida (0,4 mg/kg) en forma intraperitoneal. En una primera serie de experimentos, la
cicloheximida se administró 1 min antes (es decir, 4 min luego de la isquemia de 40 min) de la
aplicación de 7 ciclos de isquemia/reperfusión. La inyección de cicloheximida previa al PostC
abolió completamente la protección a nivel funcional e histológico observada en ojos post-
condicionados inyectados con vehículo (Figura 15). En contraste, la cicloheximida resultó
inefectiva cuando fue administrada luego de 6 h de finalizada la isquemia y la aplicación de los
ciclos de isquemia/reperfusión. No se observaron diferencias entre retinas isquémicas de
animales inyectados con vehículo o cicloheximida (Figura 15).
Figura 14. Influencia del tiempo de reperfusión sobre la protección funcional inducida por PostC frente a una
isquemia retiniana de 40 min. Se muestra la media ± EE (n= 10 ojos/ grupo). *: P< 0,05, **: P< 0,01 vs. control; b:
P< 0,05, a: P< 0,01 vs. ojos isquémicos con tratamiento simulado, test de Tukey.
Resultados
73
Luego, se evaluó la participación de la iNOS en la protección frente al daño isquémico retiniano
inducido por PostC. Para ello, se inyectó aminoguanidina (100 mg/kg en solución salina,
inyección intraperitoneal), un inhibidor selectivo de la iNOS, 1 min antes y 6 h después de la
aplicación de pulsos de isquemia. El protocolo de administración de aminoguanidina se
determinó en base a un estudio realizado por Kawano y col. (2007). La aminoguanidina bloqueó
completamente el efecto protector inducido por PostC (Figura 16). No se observaron cambios en
animales control inyectados con aminoguanidina o en retinas isquémicas con o sin
aminoguanidina (datos no mostrados).
Figura 15. Participación de la síntesis proteica en la protección funcional (A-C) e histológica (D-G) inducida por
PostC. Se administró cicloheximida (CHX) 4 min antes ó 6 h después del PostC (después de una isquemia de 40
min). La cicloheximida bloqueó el efecto protector del PostC a nivel funcional e histológico sólo cuando fue
administrada 1 min antes de la aplicación de los pulsos de isquemia. En los paneles B y C se muestran ERGs
representativos de un ojo isquémico con tratamiento simulado (I) y un ojo isquémico con PostC (P) luego de 7 días
de la administración de CHX. D-G: Análisis morfológico a los 14 días de reperfusión. Se muestra la media ± EE (n=
10 ojos/ grupo). **: P < 0,01 vs. grupo control; a: P< 0,01 vs. ojos isquémicos con tratamiento simulado, test de
Tukey. Barra= 50 m.
Resultados
74
Figura 16. Efecto de la aminoguanidina (AG) sobre la protección funcional inducida por PostC. A: La
administración de aminoguanidina (4 min y 6 h post-isquemia de 40 min) bloqueó completamente el efecto
protector del PostC evaluado a los 7 días de reperfusión. B: ERGs representativos de un animal con isquemia
bilateral, con PostC en el ojo derecho (OD) y tratamiento simulado en el ojo izquierdo (OI), inyectado con
aminoguanidina. Se muestra la media ± EE (n= 10 ojos/ grupo). **: P < 0,01 vs. grupo control; a: P< 0,01 vs. ojos
isquémicos con tratamiento simulado, test de Tukey.
Resultados
75
2. Participación del glutamato en la protección retiniana inducida por post-
condicionamiento
Múltiples evidencias experimentales demuestran la participación del glutamato en el daño
isquémico retiniano. En este contexto, la siguiente serie de experimentos fue diseñada con el fin
de evaluar el rol del sistema glutamatérgico en la protección inducida por PostC.
Los resultados presentados en la sección anterior demuestran la protección funcional e
histológica inducida por el PostC luego de 7 y/ó 14 días de reperfusión final. En primer lugar, se
realizó una evaluación más detallada del curso temporal de las alteraciones funcionales y
morfológicas provocadas por el daño isquémico, así como de la protección inducida por PostC.
En la Figura 17 se muestra la respuesta funcional a distintos intervalos luego de 40 min de
isquemia retiniana. A las 24 h post-isquemia se observó una disminución significativa en la
amplitud de las ondas a y b del ERG, que fue similar a la observada a los 3 ó 7 días de
reperfusión. Luego de 24 h ó 3 días de reperfusión no se observaron diferencias significativas en
la respuesta electrorretinográfica en retinas isquémicas sometidas a PostC respecto al grupo
isquémico con tratamiento simulado. Sin embargo, luego de 7 días de reperfusión, en los ojos
post-condicionados se observó una recuperación significativa de la función retiniana, de forma
tal que la amplitud de las ondas a y b del ERG fueron similares a las del grupo control (no
isquémico). En ningún caso se registraron cambios en las latencias de ambas ondas del ERG
(datos no mostrados). El análisis de los POs indicó un perfil diferente al observado para las
ondas a y b del ERG. Tanto a las 24 h como a los 3 días después de la isquemia no se observó
disminución en la amplitud de los POs; sin embargo, se observó una caída significativa en este
parámetro los 7 días post-isquemia, que fue revertida por el PostC (Figura 17C).
Resultados
76
Figura 17. Curso temporal del daño isquémico retiniano y de la protección inducida por PostC. Luego de la
isquemia prolongada sin o con PostC, se registraron ERGs y POs en los días 1, 3 y 7 de reperfusión. En todos los
intervalos evaluados, la isquemia provocó una disminución en la amplitud de las ondas a y b del ERG. El PostC
revirtió esta caída a los 7 días de reperfusión (A-B). C: ERGs representativos de los distintos grupos experimentales,
registrados al día 1, 3 y 7 post-isquemia. D: Se observaron diferencias en los POs del grupo isquémico sólo a partir
del día 7 de reperfusión. El PostC revirtió la caída en la suma de las amplitudes de los POs. E: Registros de POs
representativos de los distintos grupos experimentales, evaluados al día 1, 3 y 7 post-isquemia. Se muestra la media
EE (n= 10 retinas/ grupo). **: P< 0,01 vs. control; b: P< 0,05, a: P< 0,01 vs. ojos isquémicos con tratamiento
simulado, test de Tukey.
Resultados
77
Luego de 24 h ó 3 días de reperfusión no se observaron alteraciones morfológicas evidentes en
retinas sometidas a una isquemia prolongada (40 min), en tanto que luego de 7 días de
reperfusión se observó una disminución significativa en el espesor total de la retina, así como en
la CPI, con pérdida de células en la CCG (Figura 18 y Tabla 4 (página 82)). La aplicación de 7
ciclos de isquemia/reperfusión revirtió estas alteraciones morfológicas y no se observaron
diferencias a lo largo de todo el período de evaluación (Figura 18H).
Figura 18. Fotomicrografías representativas de cortes transversales de retinas de los distintos grupos
experimentales. Se evaluó la citoarquitectura en retinas isquémicas, sin o con PostC, luego de 1, 3 y 7 días de
reperfusión (B-D, F-H). A los 7 días de reperfusión se observó una marcada alteración morfológica en retinas
isquémicas, que afectó principalmente a la retina interna (D). El PostC revirtió estás alteraciones (H). La aplicación
de pulsos de isquemia per se (E) no tuvo efectos evidentes en comparación con retinas control (A). Barra= 50 m.
A continuación, se evaluó el curso temporal de las alteraciones macrogliales a través de la
determinación de los niveles de GFAP. Luego de 24 h ó 3 días de reperfusión, se observó un
número elevado de procesos de células de Müller inmunorreactivos para GFAP en retinas
isquémicas. A los 7 días post-isquemia se observó una inmunomarcación intensa para GFAP y
una mayor desorganización de los procesos gliales reactivos. El PostC revirtió estas alteraciones
a partir del día 3 (pero no a las 24 h) de reperfusión (Figura 19).
Resultados
78
Figura 19. Análisis por inmunoflourescencia de los niveles de GFAP. En retinas isquémicas se observó una marca
intensa para GFAP en procesos de células de Müller en todos los intervalos evaluados (B-D). En retinas isquémicas
con PostC se observó una reversión en el aumento de los niveles de GFAP a partir de los 3 días de reperfusión (F-
H). La aplicación de pulsos de isquemia (E) no modificó los niveles de GFAP en retinas control (A). Barra= 50 m.
Estos resultados demuestran que existe una progresión del daño isquémico. A nivel funcional e
histológico, la protección observada en retinas post-condicionadas resultó evidente sólo a partir
de los 7 días de reperfusión, en tanto que el análisis de las células gliales reveló cambios previos,
que fueron evidentes a los 3 días post-isquemia. Sobre la base de estos resultados y considerando
el papel central de las células de Müller en la regulación de los niveles sinápticos de glutamato,
la siguiente serie de experimentos tuvo como objetivo evaluar la actividad del ciclo de
glutamato/glutamina en retinas isquémicas, así como su participación en la protección inducida
por PostC en el mismo intervalo en el que se observaron diferencias a nivel de las células de
Müller entre el grupo isquémico y el grupo con isquemia y PostC, es decir, a los 3 días de
reperfusión. Para ello, se evaluó el uptake de glutamato en fracciones sinaptosomales obtenidas
de retina de los distintos grupos experimentales a los 3 días de la isquemia, sin o con PostC. En
retinas isquémicas se observó una disminución significativa del influjo de glutamato comparado
Resultados
79
con el grupo control (no isquémico). La aplicación del PostC (7 pulsos de isquemia/reperfusión,
1 min/ 1min) revirtió significativamente el efecto de la isquemia sobre el transporte de glutamato
(Figura 20A). A continuación, se examinó la actividad de la enzima GS en retinas de todos los
grupos experimentales. La isquemia provocó una disminución significativa en la actividad de
esta enzima, que fue completamente revertida por el PostC (Figura 20B).
Figura 20. Efecto de la isquemia, sin o con PostC, sobre el uptake de glutamato (A) y la actividad de GS (B),
evaluado a los 3 días de reperfusión. Para ambos parámetros se observó una disminución significativa en retinas
isquémicas, que fue revertida por el PostC. Se muestra la media EE (n= 10-12 retinas/ grupo). **: P<0,01 vs.
control (no isquémico); a: P<0,01 vs. isquemia con tratamiento simulado, test de Tukey.
En la Tabla 3 se muestran los resultados obtenidos en la evaluación de la liberación de glutamato
y glutamina, el uptake de glutamina y la actividad de glutaminasa. No se observaron diferencias
significativas en ninguno de estos parámetros entre los grupos experimentales. La aplicación de
pulsos de isquemia en retinas control no modificó ninguno de estos parámetros (Figura 20 y
Tabla 3).
Resultados
80
Tabla 3. Efecto de la isquemia, sin o con PostC, sobre la liberación de glutamato y glutamina, el uptake de
glutamina y la actividad de glutaminasa, a los 3 días post-isquemia.
Tratamiento
Liberación de glutamato
(% liberación)
Liberación de glutamina
(% liberación) Uptake de glutamina
(pmol/ mg prot.)
Actividad de glutaminasa
( mol glutamato/
mg prot x h) Basal Alto K+ Basal Alto K+
Control 59,6 ± 1,9 78,9 ± 1,5** 57,3 ± 1,6 81,0 ± 0,8** 43,7 ± 0,9 1,98 ± 0,31
Control + Pulsos
62,0 ± 2,0 79,0 ± 2,0** 56,6 ± 2,1 82,3 ± 1,9** 45,9 ± 0,9 1,84 ± 0,13
Isquemia 61,3 ± 1,9 80,0 ± 2,0** 60,2 ± 1,6 78,0 ± 1,4** 45,6 ± 1,2 2,12 ± 0,28
Isquemia + PostC
62,4 ± 2,9 80,3 ± 1,3** 57,5 ± 0,7 76,8 ± 2,6** 46,1 ± 1,1 1,85 ± 0,16
En condiciones de alto K+ extracelular (50 mM) se observó un aumento significativo en la liberación de 3H-
glutamato y 3H-glutamina. No se observaron diferencias significativas entre grupos experimentales para ninguno
de estos parámetros. Se muestra la media EE (n= 6 retinas/ grupo). **: P<0,01 vs. liberación basal, test de
Tukey.
Estos resultados sugieren que el daño isquémico podría involucrar un aumento en los niveles
sinápticos de glutamato y que el PostC podría proteger a la retina del daño isquémico a través de
la reducción en los niveles de este neurotransmisor. Para comprobar esta hipótesis, se inyectaron
concentraciones suprafisiológicas de glutamato en el cuerpo vítreo y se evaluó el daño retiniano.
Las consecuencias funcionales e histológicas de la inyección intravítrea de glutamato (4 l, 0,3
M, concentración final estimada: 20 mM) se representan en la Figura 21. El glutamato provocó
una caída significativa en la amplitud de las ondas a y b del ERG, así como en la amplitud de los
POs, sin modificar sus respectivas latencias. A nivel histológico se observó una marcada
alteración de la retina interna con disminución en el espesor total de la retina y de la CPI, así
como en el número de CGRs (Tabla 4). Considerando que la inyección de glutamato produjo un
daño retiniano de características similares al inducido por la isquemia, se evaluó el efecto de la
aplicación de 7 ciclos de isquemia/reperfusión (1 min/ 1 min) aplicados 5 min después de la
inyección de glutamato. Análogamente a lo observado en retinas isquémicas, la aplicación de
pulsos breves de isquemia revirtió significativamente las alteraciones funcionales y morfológicas
inducidas por la inyección intravítrea de glutamato (Tabla 4 y Figura 21).
Resultados
81
Figura 21. Evaluación funcional e histológica luego de 7 días de la inyección intravítrea de glutamato, sin o con
PostC. El glutamato provocó un daño funcional (ERG y POs) e histológico altamente significativo, que fue revertido
por la aplicación de pulsos de isquemia. Se muestra la media EE (n= 10 retinas/ grupo). *: P< 0,05, **: P< 0,01
vs. vehículo; a: P< 0,01 vs. glutamato con tratamiento simulado, test de Tukey. Barra= 50 m. CCG, capa de
células ganglionares; CPI, capa plexiforme interna; CNI, capa nuclear interna; CPE, capa plexiforme externa; CNE,
capa nuclear externa; SF, segmentos internos y externos de FR.
Resultados
82
Tabla 4. Espesor total y de las capas de la retina y número de células en la CCG en el grupo control (o vehículo), en
ojos con isquemia de 40 min, sin o con PostC, y en retinas de ojos inyectados con glutamato, sin o con PostC, luego
de 7 días de reperfusión o de la inyección de vehículo o glutamato.
Tratamiento Espesor total de
la retina ( m)
Capa plexiforme
interna ( m)
Capa nuclear
interna ( m)
Número de células en la CCG (células/ 200 m)
Control 144,2 3,8 31,9 2,2 19,9 6,1 14,9 0,9
Isquemia 119,1 5,4 ** 22,2 2,8 * 12,5 4,9 7,5 1,6 **
Isquemia + PostC 149,3 3,5 a 32,2 1,9 b 18,1 8,9 13,7 0,9 a
Glutamato 122,9 3,0 ** 20,8 2,5 ** 21,2 4,6 6,4 1,1 **
Glutamato + PostC 150,6 3,5 c 34,7 2,2 c 22,6 4,8 12,9 1,3 c
Se muestra la media EE (n= 10 retinas/ grupo). *: P<0,05, **: P<0,01 vs. control o inyección de vehículo, b: P<
0,05, a: P< 0,01 vs. isquemia de 40 min con tratamiento simulado, c: P< 0,01 vs. ojos inyectados con glutamato,
test de Tukey.
Resultados
83
3. Inducción de tolerancia isquémica como estrategia terapéutica en un modelo de
diabetes experimental
La retinopatía diabética constituye una de las principales causas de ceguera irreversible.
Actualmente no se dispone de estrategias terapéuticas completamente eficaces para disminuir la
incidencia y/o evitar la progresión de esta disfunción visual. En base a los resultados ya
presentados y considerando que el daño isquémico es un componente central de la retinopatía
diabética, el objetivo de esta etapa del trabajo de Tesis fue evaluar el efecto protector de la
tolerancia isquémica (inducida a través de la aplicación de pulsos breves de isquemia) como
estrategia terapéutica frente a las alteraciones funcionales, morfológicas y vasculares
características de la retinopatía diabética. Para ello, se utilizó un modelo experimental de
diabetes tipo I ampliamente validado en ratas, e inducido por la inyección intraperitoneal de una
dosis única de STZ. Luego de confirmada la hiperglucemia, se evaluó semanalmente la glucemia
y el peso corporal. En animales inyectados con STZ se observó un aumento significativo de la
glucemia y una caída significativa del peso corporal que progresó en el tiempo. La aplicación
semanal de pulsos de isquemia no modificó el peso corporal ni la glucemia en ratas control o
diabéticas (Tabla 5).
Tabla 5. Peso corporal y concentración de glucosa en sangre evaluados a diferentes intervalos post-inyección de STZ.
Intervalo luego de la inyección de STZ o vehículo
Peso corporal promedio (g) Concentración de glucosa en sangre (mg/dL)
Control Diabetes + pulsos de isquemia
Diabetes + tratamiento
simulado Control Diabetes + pulsos
de isquemia
Diabetes + tratamiento
simulado
3 días 315,6 ± 9,4 337,6 ± 10,0 333,7 ± 8,4 109,4 ± 6,4 484,7 ± 16,5 ** 476,0 ± 15,4**
3 semanas 404,3 ± 5,1 320,0 ± 7,9** 305,4 ± 5,2** 110,3 ± 4,3 498,1 ± 12,7** 502,3 ± 12,9**
6 semanas 432,6 ± 4,7 317,2 ± 11,1** 306,7 ± 12,2** 105,9 ± 5,3 519,8 ± 16,5** 528,3 ± 16,2**
10 semanas 461,2 ± 6,1 307,8 ± 19,2** 300,6 ± 18,5** 117,5 ± 4,3 583,4 ± 9,8** 596,3 ± 8,3**
La inyección de STZ provocó una caída significativa del peso corporal y un aumento en la glucemia. La aplicación
de pulsos de isquemia no modificó ninguno de estos parámetros. Se muestra la media EE (n= 10 animales/
grupo). **: P<0,01 vs. control (inyección de vehículo), test de Tukey.
Resultados
84
Para evaluar el efecto del condicionamiento isquémico se realizó una aplicación semanal de
pulsos breves de isquemia (5 min de isquemia por aumento de la PIO a 120 mm Hg) en un ojo y
un tratamiento simulado en el ojo contralateral de animales diabéticos. Se registraron ERGs en
forma previa al comienzo del tratamiento y luego, se realizaron registros semanales
inmediatamente antes de la aplicación de cada pulso de isquemia durante 10 semanas, de acuerdo
a los protocolos experimentales descriptos en la Figura 22.
Figura 22. Protocolo y grupos experimentales utilizados. Luego de confirmada la hiperglucemia (3 días post-
inyección de STZ), los animales recibieron semanalmente un pulso de isquemia breve (5 min) en un ojo y un
tratamiento simulado en el ojo contralateral. Las alteraciones funcionales, vasculares y morfológicas inducidas por
la hiperglucemia, así como el efecto protector del condicionamiento isquémico, se evaluaron a distintos intervalos
luego de la inyección de STZ.
Los resultados obtenidos en el análisis funcional se muestran en la Figura 23. En animales
control no se observaron diferencias significativas en la respuesta electrorretinográfica a lo largo
de las 10 semanas de evaluación. La aplicación de pulsos semanales de isquemia no afectó el
ERG en animales control (datos no mostrados). En los ojos de animales diabéticos con
tratamiento simulado se observó una disminución progresiva en la amplitud de las ondas a y b
del ERG, que fue significativa luego de 7 y 5 semanas post-inyección de STZ, respectivamente.
En los ojos contralaterales de animales diabéticos sometidos a condicionamiento isquémico se
observó una prevención significativa del daño funcional. A las 9 semanas post-inyección de STZ
la suma de las amplitudes de los POs disminuyó significativamente en ojos de animales
Resultados
85
diabéticos sometidos a un tratamiento simulado, en tanto que la aplicación de pulsos de isquemia
previno estas alteraciones (Figura 23).
Figura 23. Curso temporal de la respuesta electrorretinográfica de animales diabéticos, sin o con condicionamiento
isquémico. Se evaluaron semanalmente los ERGs (A) y los POs (C). En retinas de ojos de animales diabéticos con
tratamiento simulado (círculos negros) se observó una caída progresiva de la amplitud de las ondas a y b del ERG.
La aplicación semanal de pulsos de isquemia (círculos blancos) previno significativamente estas alteraciones, con
resultados similares a los del grupo control (no isquémico, barra gris). B: ERGs representativos de los distintos
grupos experimentales. C: Luego de 9 semanas de diabetes se observó una caída significativa en la suma de las
amplitudes de los POs. El condicionamiento isquémico revirtió esta alteración. D: Registros de POs representativos
de los distintos grupos experimentales. Se representa la media EE (n= 12 animales/ grupo). *: P<0,05, ** : P<0,01
vs. control; ‡: P<0,05, †: P<0,01 vs. ojos de animales diabéticos con tratamiento simulado, test de Tukey.
Resultados
86
El análisis histológico realizado a distintos intervalos posteriores a la inyección de STZ no reveló
cambios aparentes entre los grupos experimentales (Figura 24). En retinas de ojos con
tratamiento simulado de animales con 10 semanas de diabetes, se realizó además una evaluación
morfométrica. No se observaron diferencias en el espesor total de la retina (control: 147,5 ± 12,3
μm, diabetes + tratamiento simulado: 158,β ± 10,8 μm y diabetes + condicionamiento isquémico:
15β,0 ± 19,β μm, media ± EE), en el espesor de las capas de la retina, así como en el número de
células en la CCG entre los grupos experimentales. Análogamente, la inmunomarcación para
NeuN o Brn3a (marcadores específicos de CGRs) no reveló cambios en el número de células
entre los grupos experimentales (Figura 24D-G).
Figura 24. Análisis histológico luego de 10 semanas de diabetes. Se muestran secciones representativas de cortes
transversales de retinas con tinción de H-E o inmunomarcación para NeuN, correspondientes al grupo control (A y
D), diabetes + tratamiento simulado (B y E) y diabetes + condicionamiento isquémico (C y F). El análisis
morfométrico no reveló cambios significativos en el número de CGRs (G, evaluado mediante tinción con H-E,
Resultados
87
DAPI o inmunomarcación de células NeuN+ y Brn3a+) o en el espesor de las capas retinianas (H). Test de Tukey.
Barra: C= 50 m, E= 25 m. CCG, capa de células ganglionares; CPI, capa plexiforme interna; CNI, capa nuclear
interna; CNE, capa nuclear externa; SF, segmentos internos y externos de fotorreceptores.
A continuación, se evaluó la integridad de la barrera hemato-retiniana interna mediante la
localización del complejo azul de Evans-albúmina en retinas en montaje plano (Figura 25). En
retinas de animales control, el marcador se localizó exclusivamente en el lumen de los vasos,
marcando completamente el plexo vascular superficial y profundo, con escaso nivel de marca
inespecífica. En retinas de ojos de animales diabéticos con tratamiento simulado se observó una
marca generalizada fuera de los vasos y focos de difusión del colorante, principalmente en la
región del disco óptico y en los vasos de mayor calibre. El condicionamiento isquémico redujo
marcadamente el aumento en la permeabilidad vascular inducido por diabetes experimental y
sólo se encontraron focos aislados de difusión del colorante en vasos grandes (Figura 25).
Figura 25. Evaluación de la permeabilidad vascular mediante la perfusión del colorante azul de Evans. En retinas
control (A, detalle en D) se observó una marca intensa del colorante en el lumen vascular, en tanto que en retinas de
animales diabéticos, el colorante se localizó en el parénquima retiniano (B, detalle en E). La aplicación de pulsos de
isquemia previno marcadamente el aumento en la permeabilidad vascular inducido por diabetes experimental (C,
detalle en F). Barra: C= 500 m, F= 50 m.
Resultados
88
A continuación, se analizó la inmunomarcación para GFAP en retinas en montaje plano (Figura
26). En retinas control se observó una marca intensa en astrocitos estrellados formando una
monocapa a la altura de la membrana limitante interna, en íntimo contacto con el plexo vascular
superficial. Luego de 6 semanas de diabetes se observó una clara reducción en la
inmunorreactividad para GFAP en todas las regiones analizadas (una región central y una
periférica por cuadrante). En retinas de ojos de animales diabéticos con pulsos de isquemia, la
marcación para GFAP resultó similar a la observada en retinas control (Figura 26).
Figura 26. Inmunomarcación para GFAP a las de 6 semanas de diabetes. A: Esquema de una retina donde se
representan las regiones analizadas. En retinas control (B) se observó una marca intensa para GFAP tanto en la
región central (F) como en la periferia (J). La intensidad de la inmunomarcación para GFAP en retinas de ojos de
animales diabéticos disminuyó notablemente en todas las regiones evaluadas (C, detalle de región central en G y
periferia en K). El condicionamiento isquémico revirtió marcadamente estas alteraciones (D, detalles en H y L, de
zona central y periférica, respectivamente). Se muestran los resultados obtenidos del análisis cuantitativo del área
ocupada por astrocitos GFAP(+) en la región central (E) y periférica (I) para los distintos grupos experimentales. Se
muestra la media EE, n= 5 retinas/ grupo. *: P< 0,05, **: P< 0,01 vs. control; †: P< 0,01, vs. ojos + tratamiento
simulado, test de Tukey. Barra: A= 1 mm, D= 100 m, H y L= 50 m.
Resultados
89
Luego se analizó el estado de la barrera hemato-retiniana interna a nivel untraestructural a través
de la perfusión con nitrato de lantato. El lantano es un trazador que al precipitar forma depósitos
electrón-densos que permiten su identificación al MET. En retinas control se observaron
depósitos amorfos de lantano en el lumen de los vasos retinianos, en íntimo contacto con el
glicocálix de las células endoteliales y en el espacio apical de las uniones intercelulares hasta el
sitio de unión intercelular, lo que sugiere la presencia de uniones estrechas funcionales (Figura
27A). En vasos de retinas de ojos de animales diabéticos con tratamiento simulado se observaron
alteraciones en la integridad de la barrera sólo en un número reducido de vasos. Un análisis a
mayor aumento permitió detectar la presencia del trazador en todo el espacio intercelular y en
contacto con la lámina basal endotelial (Figura 27D). A la altura de la unión celular se observó
frecuentemente la formación de edemas (Figura 27B y E). En comparación con retinas control,
las células endoteliales de retinas de ojos de animales diabéticos presentaron un número elevado
de vesículas de micropinocitosis hacia el lumen (cara E del endotelio) así como vesículas intra-
endoteliales (0,6 - 1,1 μm de diámetro) con depósitos de lantano (Figura 27F). Estas alteraciones
se encontraron tanto en el plexo vascular superficial como en el profundo. En retinas de ojos
sometidos a condicionamiento isquémico de animales diabéticos no se observaron alteraciones a
nivel de las uniones endoteliales, aunque se detectó un número elevado de vesículas
intracelulares (Figura 27C y G).
Resultados
90
Figura 27. Evaluación ultraestructural de la integridad de la barrera hemato-retiniana interna analizada mediante la
perfusión con lantano. Se muestran secciones transversales representativas de vasos de una retina del grupo control
(A), diabetes + tratamiento simulado (B, D-F) y diabetes + condicionamiento isquémico (C y G). En todos los casos,
nótese el vaso rodeado de una lámina basal continua con un pericito (P) asociado. En retinas de animales con 6
semanas de diabetes, el trazador se localizó sobre la superficie luminal de las células endoteliales y en las uniones
intercelulares (B, flechas). Frecuentemente se observaron edemas en las zonas de unión intercelular (B, cabeza de
flecha). Sólo en algunos casos se observó disrupción de la integridad de la barrera con extravasación del trazador,
alcanzando la lámina basal (D). En el panel E se muestra un detalle de una unión entre dos células endoteliales
Resultados
91
(remarcadas en azul y rojo) con la presencia de un edema que no afectó la integridad de la barrera interna (nótese la
presencia del trazador sólo en la porción apical de la unión). La lámina basal se representa en verde. F:
Frecuentemente se observó la presencia del trazador en vacuolas de micropinocitosis y vesículas citoplasmáticas
(ver flechas) sobre la pared luminal de las células endoteliales (cara-E). G: La aplicación de pulsos de isquemia
previno la formación de edemas y la disrupción de la integridad de la barrera hemato-retiniana interna. En todos los
vasos analizados, el avance del trazador fue detenido por la unión apical intercelular (cabeza de flecha). Sin
embargo, no se observaron diferencias en cuanto a la presencia de vesículas citoplasmáticas (ver flechas). Barras: A-
C= 1,5 m; E=0,6 m; D, F, G= 0,3 m. LB: lámina basal.
A continuación, se determinaron los niveles y la localización retiniana de VEGF. A las 6
semanas de diabetes se evaluaron los niveles del VEGF por Western blot en homogenatos de
retinas de los distintos grupos experimentales. En retinas de animales diabéticos con tratamiento
simulado se observó un aumento significativo en los niveles de VEGF, en comparación con el
grupo control. La aplicación de pulsos de isquemia previno parcial, pero significativamente el
aumento en los niveles de VEGF (Figura 28A-B). A continuación, se determinaron los niveles de
VEGF a distintos intervalos luego de la aplicación de pulsos de isquemia. En retinas de ojos con
condicionamiento isquémico de animales con 6 semanas de diabetes, se observó una disminución
significativa en los niveles de VEGF luego de 3 y 7 días (pero no a las 24 h) luego del 6to pulso
de isquemia (Figura 28A-B). Estos resultados fueron confirmados mediante técnicas de
inmunohistoquímica. En retinas de animales control se observó inmunorreactividad leve para
VEGF en capas de la retina interna. A las 6 semanas de diabetes se observó un aumento marcado
en la inmunorreactividad para VEGF, particularmente en el pericarion de neuronas de la CCG y
en células presentes en la CNI. El condicionamiento isquémico revirtió el aumento en los niveles
de VEGF (Figura 28C-D). Se obtuvieron resultados similares en muestras obtenidas de animales
luego de 10 semanas de la inyección de STZ (datos no mostrados).
Resultados
92
Figura 28. Niveles retinianos de VEGF y su localización celular. A: Se analizaron los niveles de VEGF retinianos
por Western blot a las 6 semanas de diabetes. El análisis densitométrico se muestra en el panel B. Los niveles de
VEGF aumentaron significativamente en retinas de ojos de animales diabéticos con tratamiento simulado. Este
aumento fue parcialmente revertido por el condicionamiento isquémico (luego de 3 y 7 días pero no a las 24 h de la
aplicación del pulso de isquemia). Se muestra la media EE, n= 5 retinas/ grupo. *: P<0,05, **: P<0,01 vs. control;
†: P<0.01 vs. diabetes con tratamiento simulado, test de Tukey. C-E: Análisis de la inmunolocalización de VEGF en
retinas del grupo control (C), diabetes (D) y diabetes con pulsos de isquemia (E). A las 6 semanas de diabetes se
observó un marcado aumento de la inmunorreactividad para VEGF en células de la CCG (D, flechas) y de la CNI
(D, cabezas de flecha). La aplicación de pulsos de isquemia previno este aumento y sólo se observó
inmunorreactividad leve en la retina interna (E). Barra: E= 50 m. CCG, capa de células ganglionares; CPI, capa
plexiforme interna; CNI, capa nuclear interna; CNE, capa nuclear externa; SF, segmentos internos y externos de
fotorreceptores.
Finalmente, se analizó el efecto del condicionamiento isquémico sobre la progresión del daño
inducido por diabetes experimental. Para ello, se utilizó un protocolo que consistió en una
aplicación de pulsos de isquemia que comenzó a partir de la 6ta semana luego de la inyección de
STZ. Análogamente a lo ya descripto en la Figura 23, a las 6 semanas de diabetes, se observó
una disfunción visual significativa respecto a animales control, que progresó a lo largo del
estudio (Figura 29). La aplicación de pulsos breves de isquemia a partir de la 6ta semana (post-
inyección de STZ) evitó la progresión en la caída en la amplitud de las ondas a y b del ERG. Esta
Resultados
93
protección se mantuvo hasta la semana 12 post-inyección de STZ. Se obtuvieron resultados
similares en el análisis de los POs (Figura 29D).
En suma, estos resultados demuestran que el condicionamiento isquémico previno y evitó la
progresión del daño funcional retiniano característico de la diabetes experimental.
Figura 29. Curso temporal de la protección funcional inducida por la aplicación de pulsos de isquemia a partir de la
semana 6 post-inyección de STZ. A: Protocolo de aplicación de pulsos de isquemia. El condicionamiento isquémico
(círculos blancos) indujo una protección funcional significativa sobre la amplitud de las ondas a y b del ERG (panel
B-C), respecto al grupo de ojos diabéticos sometidos a un tratamiento simulado (círculos negros). Se obtuvieron
resultados similares en el análisis de los POs (D). En el panel E se muestran ERGs representativos registrados
semanalmente hasta las 12 semanas luego de la inyección de vehículo o STZ. Se muestra la media EE, n= 10
animales/ grupo. *: P<0,05, **: P<0,01 vs. diabetes con pulsos de isquemia, test de Student. En este experimento,
los parámetros electrorretinográficos de animales control (no diabéticos) fueron (en V): onda a: 82,3 6,2; onda b:
291,2 10,8; POs: 111,5 12,3 y no se modificaron a lo largo del estudio.
Resultados
94
4. Axonopatía distal temprana en la diabetes experimental
Si bien la mayor parte de la investigación en el área de la retinopatía diabética se ha focalizado
particularmente en las alteraciones vasculares retinianas, diversos autores han descripto
alteraciones funcionales en la vía visual de pacientes diabéticos en etapas tempranas de la
enfermedad. Sin embargo, al presente sólo se dispone de escasa información respecto a las
alteraciones de la vía visual en estadíos tempranos de diabetes. Por lo tanto, la serie de
experimentos que se describirá a continuación tuvo como objetivo evaluar la morfología de la
vía visual en estadíos tempranos de diabetes experimental inducida por STZ.
En primer lugar, se evaluó el transporte anterógrado de CTB a través de las proyecciones de las
CGRs al CS, en distintos intervalos posteriores a la inyección de STZ. En animales control se
observó una marcación intensa de CTB en las capas retinotópicas superficiales (SZ y SGS) del
CS (Figura 30). A las 3 semanas post-inyección de STZ no se observaron diferencias respecto al
grupo control. En cambio, a las 6 semanas de inducción de diabetes se detectó una reducción
clara en la marcación de CTB. Se realizó una reconstrucción completa (a partir de secciones
coronales seriadas) del CS en vista dorsal, en las que se cuantificó la intensidad de marca en la
región retinotópica de cada sección y finalmente se aplicó una escala térmica que permitió una
clara identificación del patrón de marcación de CTB. En animales con 6 semanas de diabetes se
observó una reducción notable de la marcación en la región central y lateral del CS, a lo largo del
eje rostro-caudal. Se observaron además frecuentes focos con ausencia completa de marca,
principalmente en la región lateral. Si bien se evidenciaron variaciones en el patrón de marcación
entre distintos animales, en todos los casos se detectó una disminución de la marca respecto a la
obtenida en animales control. En animales con 15 semanas de diabetes se observó un perfil
similar de caída en la marcación para CTB (Figura 30).
Resultados
95
Figura 30. Detección de CTB en terminales retinianas a nivel de las capas superficiales del CS. Panel superior:
Fotomicrografías representativas de secciones del CS (corte coronal) de un animal control. En el panel de la derecha
se muestra una reconstrucción en vista dorsal del mapa retinotópico de marcación para CTB. La escala térmica
aplicada indicó zonas de máxima detección de CTB (1: rojo) o ausencia del trazador (0: azul). A las 3 semanas de
diabetes no se observaron alteraciones evidentes en el transporte anterógrado. Sin embargo, a las 6 y 15 semanas
luego de la inyección de STZ se observó una clara disminución en la marcación, principalmente en la región central
y lateral del CS. Barra= 1 mm.
A continuación, se analizó el CS, el principal núcleo de proyección retiniana en roedores, a
distintos intervalos luego de la inyección de STZ. En todos los intervalos evaluados no se
observaron alteraciones evidentes en la citoarquitectura de las capas retinotópicas del CS, la
densidad neuronal o la respuesta glial (Figura 31). No se observaron células TUNEL(+) en
ninguno de los intervalos estudiados.
La alteración en el transporte de CTB en animales diabéticos observado ya a las 6 semanas post-
inyección de STZ, no parecería atribuible a alteraciones a nivel retiniano, dado que no se
observaron alteraciones en la estructura de la retina a las 10 semanas de diabetes, como ya se
mostró en la Figura 24.
Resultados
96
Figura 31. Análisis morfométrico del CS. Se evaluó el número de células y la reactividad astrocitaria (% de área
GFAP+, evaluado por densidad óptica de inmunomarcación) en la región retinotópica del CS (ver esquema,
recuadros azules en secciones coronales de la región rostral, medial y caudal) de los distintos grupos experimentales.
No se observaron diferencias significativas para estos parámetros entre los grupos experimentales. Test de Dunnett.
Barra= 50 μm. SZ, stratum zonale; SGS, stratum griseum superficial.
Por lo tanto, con el fin de identificar el sitio de disrupción del transporte axonal en la vía visual,
se realizó un análisis morfométrico en diferentes regiones del NO en el período más temprano (6
semanas de inducción de diabetes) en el que se observaron signos claros de alteración en el
transporte axonal, sin cambios evidentes a nivel retiniano o en el CS.
En la porción proximal del NO, los axones de las CGRs que salen del globo ocular están en
íntimo contacto con una red de astrocitos GFAP(+). A partir de esta zona, los axones se
mielinizan y continúan hacia el quiasma óptico (Figura 32).
Resultados
97
Figura 32. Regiones del NO analizadas. En el panel superior se muestra el esquema de un cerebro de rata en vista
ventral, donde se indica la papila óptica y la porción proximal del NO (recuadro rojo) y las porciones mielinizadas
proximal y distal del NO. Panel inferior: Esquema de la porción proximal del NO en corte sagital. Se representa la
lámina glial, la zona de transición y la región mielinizada. Las líneas horizontales (A y B) señalan la zona donde se
realizaron los cortes transversales del NO. La línea punteada representa el flujo arterial de la retina y el NO. Barra=
100 m.
Se analizaron secciones semifinas del NO en cortes transversales, en su porción mielinizada
proximal (intraorbital, próxima a la cabeza del NO) y distal (intracraneal, próxima al quiasma
óptico), como se muestra en la Figura 32. No se observaron diferencias evidentes en la porción
proximal del NO entre los grupos experimentales. En cambio, en la región distal del NO de
animales diabéticos se observó una disminución significativa en el número y en el área promedio
de los axones. El histograma de frecuencia del área axonal y la cuantificación de axones
Resultados
98
agrupados según el tamaño indicaron una alteración particular de las fibras de mayor calibre en
NOs de animales diabéticos (Figura 33). Para todas las regiones analizadas no se observaron
diferencias en el área total del NO (datos no mostrados).
Figura 33. Análisis morfométrico del NO de animales control (A-C) o de animales con 6 semanas de diabetes (F-
H). No se observaron diferencias significativas en la porción proximal del NO entre los grupos experimentales. En
secciones distales del NO de animales diabéticos se observó una clara disminución en el número (D) y en el área
promedio de los axones (E), que afectó principalmente a las fibras de mayor calibre (I). Se muestra la media ± EE
(n= 5 NOs/ grupo). **: P< 0,01 vs. control, test de Student. Barra= 25 m.
En secciones transversales de diferentes regiones del NO se analizó la morfología celular de
astrocitos GFAP(+). No se observaron diferencias en la porción proximal del NO, tanto en la
porción de la lámina glial como en la región mielinizada (Figura 34). Sin embargo, se observó un
aumento significativo de la reactividad glial en la porción distal del NO de animales diabéticos
(Figura 34).
Resultados
99
Figura 34. Inmunomarcación para GFAP en secciones transversales representativas de la región proximal (lámina
glial y porción mielinizada) y distal del NO de animales control y animales con 6 semanas de diabetes. En la porción
distal del NO diabético se observó un aumento significativo en la inmunomarcación para GFAP (densidad óptica
(DO) de marca GFAP(+) respecto al área total del NO), sin un claro aumento en el número de núcleos por sección.
Se muestra la media ± EE (n= 5 NOs/ grupo). **: P< 0,01 vs. control, test de Student. Barra= 200 m.
Finalmente, se evaluó la morfología retiniana en animales diabéticos a distintos períodos luego
de la inyección de STZ, con el objeto de determinar si las alteraciones axonales observadas en la
porción distal del NO progresan retrógradamente en la vía visual. Luego de 15 semanas de
diabetes experimental se observó una disminución significativa en el número de células en la
CCG, evaluado por tinción con H-E e inmunomarcación para dos marcadores específicos de
CGRs, NeuN y Brn3a (Figura 35). Se observó además un aumento significativo en el número de
células TUNEL(+) en la CCG (Figura 35C-D). En todos los intervalos evaluados, no se
observaron diferencias en el espesor total y de las capas internas de la retina, entre los grupos
experimentales (Tabla 6). En conjunto, estos resultados demuestran una alteración significativa
en la vía visual a las 6 semanas de inducción de diabetes experimental, particularmente en la
porción distal del NO en una etapa temprana de la enfermedad, en la que no se observaron
cambios en la porción proximal del NO y no resultaron evidentes alteraciones en la retina o el
CS.
Resultados
100
Figura 35. Análisis de CGRs en la diabetes experimental. A: Secciones transversales de retinas representativas de
los distintos grupos experimentales. A las 15 semanas de inducción de diabetes se observó una caída significativa en
el número de CGRs (B, tinción por H-E) y un aumento en el número de células TUNEL(+) presentes en la CCG (C-
D). Estos resultados se confirmaron evaluando la inmunomarcación para Brn3a (E-F). Se muestra la media ± EE (n=
5 ojos/ grupo). **: P< 0,01 vs. grupo control, test de Dunnett. Barra= 50 m. CCG, capa de células ganglionares;
CPI, capa plexiforme interna; CNI, capa nuclear interna; CNE, capa nuclear externa, SF, segmentos internos y
externos de fotorreceptores.
Tabla 6. Espesor total y capas internas de la retina.
Grupo Espesor total retina ( m) CPI ( m) CNI ( m)
Control 149,6 ± 6,2 35,6 ± 8,2 22,4 ± 8,4
Dia
bet
es 10 semanas 145,8 ± 11,2 34,5 ± 7,4 23,4 ± 5,3
12 semanas 149,1 ± 10.4 36,7 ± 5,9 20,5 ± 7,7
15 semanas 148,8 ± 9,3 37,8 ± 3,5 21,9 ± 8,4
Se muestra la media ± EE (n=10 retinas/ grupo), test de Dunnett. CPI, capa plexiforme interna; CNI, capa nuclear
interna.
Resultados
101
5. Efecto del condicionamiento isquémico sobre las alteraciones axo-gliales en la vía visual
diabética
La siguiente serie de experimentos tuvo como objetivo evaluar el efecto protector de la
inducción de tolerancia isquémica frente a las alteraciones tempranas de la vía visual diabética.
Para ello, análogamente a los descripto en el capítulo anterior, se inyectaron animales con STZ y
luego de 3 días de confirmada la hiperglucemia, se inició un protocolo de aplicación semanal de
un pulso breve de isquemia (inducida por aumento de la PIO a 120 mm Hg durante 5 min) en un
ojo y tratamiento simulado en el ojo contralateral. A las 6 semanas de tratamiento se evaluaron
las alteraciones morfológicas en distinta porciones de la vía visual.
En primer lugar, se examinó el efecto del condicionamiento isquémico sobre las alteraciones en
el transporte anterógrado de CTB. En la Figura 36 se muestran los resultados obtenidos en un
animal diabético que recibió pulsos semanales de isquemia en un ojo y tratamiento simulado en
el ojo contralateral durante 6 semanas. En el CS inervado por terminales de CGRs del ojo con
condicionamiento isquémico se observó una intensa marcación de CTB, en comparación a la
región contralateral del CS. El análisis de la reconstrucción del CS reveló que la protección
inducida por el condicionamiento isquémico fue prácticamente completa (Figura 36).
El condicionamiento isquémico previno las alteraciones axonales observadas en la vía visual
diabética. La aplicación semanal de pulsos de isquemia revirtió significativamente la caída en el
número y en el área axonal promedio en NOs de ojos de animales diabéticos (Figura 37).
Resultados
102
Figura 36. Transporte anterógrado de CTB en terminales retinianos a nivel de las capas superficiales del CS. Se
muestran tres secciones representativas (región rostral, medial y caudal) de un animal diabético con
condicionamiento isquémico en un ojo y tratamiento simulado en el ojo contralateral. Se observó una clara
disminución en la marcación para CTB en el CS inervado por el ojo con tratamiento simulado. La aplicación
semanal de pulsos de isquemia previno esta alteración y se observó un patrón de marcación similar al observado en
animales control. En el panel derecho se muestran reconstrucciones del mapa de inervación del CS en vista dorsal.
Barra= 1 mm.
Asimismo, se evaluó el efecto del condicionamiento isquémico sobre las alteraciones gliales
inducidas por diabetes experimental. En primer lugar, se realizó una inmunomarcación para
GFAP en cortes transversales de la porción distal del NO. En NOs de ojos de animales diabéticos
con condicionamiento isquémico se observó una disminución significativa en la intensidad y en
el área ocupada por procesos de astrocitos GFAP(+), en comparación a los resultados obtenidos
en la vía contralateral (diabetes + tratamiento simulado) (Figura 38). En la Figura 38E se muestra
una sección horizontal del quiasma óptico de un animal diabético en vista panorámica. En la vía
Resultados
103
óptica conformada por axones del ojo sometido a condicionamiento isquémico se observó una
clara disminución en la reactividad glial (tanto en el NO ipsilateral como en el tracto óptico
contralateral), respecto a la vía contralateral formada por axones de las CGRs del ojo con
tratamiento simulado.
Figura 37. Análisis morfométrico de la porción distal del NO. En el panel superior se muestran secciones
transversales representativas de la porción distal del NO de un animal control y un animal con 6 semanas de
diabetes, con o sin condicionamiento isquémico. Panel central: Histogramas de frecuencia del área axonal evaluado
en NOs de animales representativos de los distintos grupos experimentales. La aplicación de pulsos de isquemia
previno significativamente la caída en el número de axones y en el área axonal promedio inducida por la diabetes.
Se muestra la media ± EE (n= 6 NOs/ grupo). *: P< 0,05, **: P< 0,01 vs. grupo control; b: P< 0,05, a: P< 0,01 vs.
ojos de animales diabéticos con tratamiento simulado, Test de Tukey. Barra= 25 μm.
Resultados
104
Figura 38. Análisis de células GFAP(+) en la porción distal de la vía visual diabética. Se muestran cortes
transversales de la porción distal del NO de un animal representativo del grupo control (A), diabético + tratamiento
simulado (B) y diabético + condicionamiento isquémico (C). En NOs diabéticos con tratamiento simulado se
observó un aumento significativo en la intensidad y en el área ocupada por procesos de células gliales GFAP(+)
(densidad óptica (DO) total en al área evaluada, D). La aplicación de pulsos de isquemia revirtió este aumento. En el
panel E se muestra una sección en plano horizontal del quiasma óptico de un animal diabético representativo (ver
esquema). En la vía óptica del ojo con condicionamiento isquémico se observó una clara disminución en la
reactividad glial, respecto a la vía contralateral con tratamiento simulado. Se muestra la media ± EE (n= 6 NOs/
Resultados
105
grupo). **: P< 0,01 vs. grupo control; a: P< 0,01 vs. NOs de ojos de animales con tratamiento simulado, Test de
Tukey. Barra: C= 25 μm, E= 600 m. TO: tracto óptico.
Se evaluaron las posibles alteraciones en la mielina (OL maduros) inducidas por diabetes
experimental y el efecto del condicionamiento isquémico sobre este parámetro. En la Figura 39
se muestra la inmunomarcación para MBP en secciones horizontales de la porción distal del NO.
En NOs de animales diabéticos se observó una ligera desorganización de la mielina, con
frecuentes zonas de desmielinización. Mediante un análisis de doble marcación para MBP y
GFAP se observó claramente que las zonas de desmielinización fueron ocupadas por células
gliales GFAP(+). La aplicación de pulsos de isquemia revirtió marcadamente estas alteraciones
en la porción distal del NO de animales diabéticos (Figura 39G-I).
Figura 39. Alteraciones de la mielina en la vía visual diabética. Inmunomarcación para MBP y GFAP en secciones
horizontales del NO distal representativas del grupo control (A-C) y de un animal diabético con tratamiento
simulado (D-F) o con condicionamiento isquémico (G-I). En animales diabéticos se observaron zonas de
desmielinización y reactividad glial, que fueron prevenidas por el condicionamiento isquémico. Barra= 50μm.
Resultados
106
A nivel ultraestructural, en cortes transversales de NOs de animales diabéticos se observaron
axones en degeneración con desorganización en el empaquetamiento de la mielina, pérdida de
axones grandes y frecuentemente se observaron cuerpos lamelares membranosos (Figura 40B).
En NOs de ojos diabéticos con condicionamiento isquémico se observó una preservación
significativa de la estructura de los axones grandes y en la envoltura mielínica (Figura 40C). El
análisis morfométrico de NOs diabéticos con tratamiento simulado indicó una disminución
significativa en el área axonal promedio, que fue revertida por la aplicación de pulsos de
isquemia (Figura 40D). La disminución en el número de axones grandes y en el área axonal
promedio de NOs de animales diabéticos dio como resultado una clara alteración en la curva
obtenida del cálculo de la relación axón-mielina, con una pendiente significativamente mayor en
la recta de ajuste, respecto a NOs de animales control (P< 0,01). La aplicación de pulsos de
isquemia previno estas alteraciones (P< 0,01) (Figura 40E). Los resultados obtenidos para las
pendientes fueron: 0,22 ± 0,03 en controles, 0,33 ± 0,06 en el grupo diabetes + tratamiento
simulado; y 0,21 ± 0,05 en diabéticos + condicionamiento isquémico (media ± EE). No se
observaron diferencias entre los grupos experimentales respecto a los valores de g-radio (0,70 ±
0,04; 0,72 ± 0,05; 0,71 ± 0,04 para el grupo control, diabetes + tratamiento simulado y diabetes +
condicionamiento isquémico, respectivamente, media ± EE).
Resultados
107
Figura 40. Análisis ultrastructural de axones mielinizados de la porción distal del NO. En el grupo control (A) se
observaron paquetes compactos de axones formando fascículos. En NOs de ojos de animales diabéticos con
tratamiento simulado se encontraron signos claros de degeneración axonal y desorganización de la mielina (B,
flechas) y una disminución en el área axonal promedio (D). El condicionamiento isquémico evitó estas alteraciones
(C-D). E: Análisis de la relación fibra-mielina evaluada en animales representativos de los distintos grupos
experimentales. En un NO representativo de un animal diabéticos (trazo punteado) se observó una pendiente mayor
de la curva de ajuste respecto al grupo control (trazo continuo). El condicionamiento isquémico (trazo discontinuo)
previno estas alteraciones y se obtuvieron resultados similares a los observados en el grupo control. Se muestra la
media ± EE (n= 3 NOs/ grupo). **: P< 0,01 vs. control; b: P< 0,05 vs. NOs de ojos de animales diabéticos con
tratamiento simulado, test de Tukey. Barra= β μm.
Para analizar el efecto del condicionamiento isquémico sobre el linaje oligodendrocitario, se
evaluó la morfología celular de OL inmaduros (células O1+) y precursores de OL (células
PDGFR- +) por inmunofluorescencia. A las 6 semanas de diabetes se observó una gran
desorganización celular en las poblaciones de células O1+ y PDGFR- con la presencia de
células con cuerpos hipertrofiados (Figura 41). En cortes longitudinales de NOs de ojos de
animales diabéticos con pulsos de isquemia se observó una marcada preservación de la
Resultados
108
morfología celular de ambas poblaciones, con procesos celulares alineados paralelamente a los
paquetes de axones (Figura 41).
Figura 41. Evaluación de células del linaje oligodendrocítico. Se analizó la morfología de OL inmaduros (células
O1+) y precursores de OL (células PDGFR-+) por inmunofluorescencia. En NOs de ojos de animales diabéticos
con tratamiento simulado se observó un aumento en la inmunorreactividad para ambos marcadores (medido como
densidad óptica (DO) del área de marcación positiva), con la presencia de células hipertrofiadas. La aplicación de
pulsos de isquemia semanales previno estas alteraciones. Se muestra la media ± EE (n= 6 NOs/ grupo). *: P< 0,05,
**: P< 0,01 vs. control; a: P< 0,01 vs. NOs de ojos de animales diabéticos con tratamiento simulado, test de Tukey.
Barra= 50 m.
El análisis por microscopía confocal de las poblaciones macrogliales en NOs diabéticos reveló
una gran proximidad entre células GFAP+ y O1+, pero sin co-localización entre marcadores (r =
0,35 ± 0,12; media ± EE). En estos animales se observó un porcentaje elevado de células
PDGFR- + con morfología hipertrofiada y desorganización celular que resultaron
inmunopositivas para GFAP (Figura 42). Asimismo, se observó una alta co-localización entre
ambos marcadores (r = 0,75 ± 0,10). En la vía contralateral de animales diabéticos,
correspondiente a ojos con condicionamiento isquémico no se observó co-localización entre
marcadores (r = 0,36 ± 0,09), de manera similar a lo observado en muestras de animales control
(r = 0,29 ± 0,08).
Resultados
109
Figura 42. Análisis de co-localización por microscopía confocal. En NOs de ojos de animales diabéticos con
tratamiento simulado se observó una clara co-localización para PDGFR- y GFAP. Se muestran imágenes de la
reconstrucción en el eje-Z. La aplicación de pulsos de isquemia previno las alteraciones en la morfología de células
PDGFR- y la co-expresión de GFAP en estas células. En el panel de la derecha se muestran gráficos
representativos del análisis de co-localización para GFAP vs. PDGFR- en una sección del plano Z. Barra= 25 μm.
A continuación, se analizó la respuesta microglial mediante una marcación con isolectina GSA.
En la porción distal del NO de animales control y diabéticos, sin o con condicionamiento
isquémico, se observó una morfología celular característica de microglía en reposo, con somas
en forma de bastón y procesos celulares finos y ramificados (Figura 43). En ninguno de los
grupos experimentales se observaron células inmunorreactivas para marcadores de microglía
activada (CD11b+ y ED1+).
Resultados
110
Figura 43. Análisis de células microgliales en la vía visual diabética. Se muestran secciones horizontales de NOs de
un animal representativo del grupo control (A) y un animal con 6 semanas de diabetes (B). En todos los grupos
experimentales se observaron células microgliales en reposo. A mayor aumento se observan claramente los procesos
finos y ramificados característicos de la microglía en reposo. En animales con 6 semanas de diabetes no se
observaron diferencias entre NOs de ojos sin o con condicionamiento isquémico. Barra= 50 µm; inset= 25 µm.
Para determinar la participación del BDNF en el mecanismo de protección desencadenado por el
condicionamiento isquémico, se evaluaron los niveles y la localización retiniana de esta
neurotrofina en los distintos grupos experimentales. En retinas de animales control se observó
una marca intensa de BDNF en el pericarion de células en la CCG y en la CNI. A las 6 semanas
de diabetes no se evidenciaron diferencias en la inmunorreactividad para BDNF entre los grupos
experimentales (datos no mostrados). Sin embargo, a las 10 semanas de inducción de diabetes se
observó una caída en los niveles de BDNF en células de la CCG y la CNI (Figura 44). El
condicionamiento isquémico revirtió notablemente el efecto de la diabetes sobre los niveles de
BDNF. En este sentido, el número de células BDNF(+) presentes en la CCG resultó similar al
observado en retinas del grupo control (Figura 44B). Un análisis a mayor aumento permitió
observar una recuperación en los niveles de BDNF en las CGRs y en los procesos de las células
de Müller (Figura 44C).
Se evaluó además la inmunorreactividad para BDNF en el CS, a distintos intervalos luego de la
inducción de diabetes. En ninguno de los intervalos post-inyección de STZ analizados se
observaron diferencias en la inmunomarcación para BDNF en las capas superficiales del CS, en
comparación con resultados de animales control (datos no mostrados).
Resultados
111
Figura 44. Inmunomarcación para BDNF. A: Luego de 10 semanas de diabetes se observó una marcada
disminución en la inmunorreactividad para BDNF en células de la CCG y la CNI, respecto a retinas de animales
control. La aplicación de pulsos de isquemia revirtió estas alteraciones. B: cuantificación del número de células
BDNF+ en la CCG para los distintos grupos experimentales. C: En retinas de ojos de animales diabéticos con
condicionamiento isquémico se observó una marca intensa para BDNF en las CGRs Brn3a+ (cabezas de flecha) y en
procesos de células de Müller (flechas). Se muestra la media EE (n= 5 retinas/ grupo). **: P<0,01 vs. control; a:
P<0,01 vs. diabetes con tratamiento simulado, test de Tukey. Barra: A=50 m, C=25 m.
Con el objetivo de caracterizar los mecanismos involucrados en la protección inducida por el
condicionamiento isquémico se evaluó la actividad de GS y el uptake de glutamato luego de 6
semanas de diabetes. En retinas de ojos de animales diabéticos con tratamiento simulado se
observó una disminución significativa en la actividad de GS con respecto al grupo control. El
condicionamiento isquémico previno esta disminución (Figura 45A). No se observaron
diferencias significativas en el influjo de glutamato entre los grupos experimentales (Figura
45B). La aplicación de pulsos semanales de isquemia en ojos de animales control no afectó estos
parámetros (Figura 45).
Resultados
112
Figura 45. Efecto de la diabetes y el condicionamiento isquémico sobre la actividad de GS (A) y el uptake de
glutamato (B), evaluado a las 6 semanas de inducción de diabetes. En retinas de ojos de animales diabéticos con
tratamiento simulado se observó una disminución significativa en la actividad de GS, que fue prevenida por el
condicionamiento isquémico. No se observaron diferencias significativas en la captación de glutamato entre los
grupos experimentales. Se muestra la media EE (n= 10 retinas/ grupo). **: P<0,01 vs. control; a: P<0,01 vs.
diabetes con tratamiento simulado, test de Tukey. C+P: ojos controles con pulsos semanales de isquemia. D+P: ojos
con condicionamiento isquémico de animales diabéticos.
Resultados
113
6. Efecto de la diabetes sobre el sistema visual no formador de imagen
El siguiente objetivo del presente trabajo de Tesis fue analizar el sistema visual no formador de
imágenes en la diabetes experimental inducida por STZ. Múltiples evidencias experimentales
indican que las células que expresan melanopsina representan una sub-población reducida de
CGRs y son responsables de codificar y transmitir la información fótica a centros visuales no
formadores de imágenes, como los NSQ y el NOP. Dado que a las 15 semanas de diabetes
experimental se observó una caída significativa en el número de CGRs, así como alteraciones
marcadas en las proyecciones retinianas al CS, la serie de experimentos que se presentarán a
continuación tuvo como objetivo caracterizar el estado de las CGRifs y de las vías de proyección
de estas células a núcleos visuales no formadores de imágenes en etapas avanzadas de diabetes
experimental.
En primer lugar, se analizó la progresión del daño funcional en etapas avanzadas de diabetes. A
las 12 ó 15 semanas de diabetes no se observaron diferencias significativas en el ERG y en los
POs, respecto a los resultados obtenidos a las 10 semanas post-inyección de STZ (Figura 46A-
C). El registro de los VEPs (un indicador de la función de la vía visual) indicó un aumento
significativo en la latencia del componente N2-P2, ya evidente a partir de las 12 semanas de
diabetes (Figura 46D).
Resultados
114
Figura 46. Alteraciones funcionales retinianas en etapas avanzadas de diabetes experimental. Luego de 10, 12 y 15
semanas de diabetes se observó una caída significativa en la amplitud de las ondas a y b del ERG (A y B) y en la
suma de las amplitudes de los POs (C), sin una clara progresión del daño funcional. El análisis de los VEPs indicó
un aumento significativo en la latencia del componente N2-P2 en animales con 12 ó 15 semanas de diabetes. En los
paneles E-G se muestran registros representativos de un animal control (trazo negro) y un animal con 15 semanas de
diabetes (trazo gris). Se muestra la media ± EE (n= 10 animales/ grupo). *: P< 0,05, **: P< 0,01 vs. control, test de
Tukey.
Otra de las características que se observó en etapas más avanzadas de diabetes experimental fue
la aparición de cataratas que se hizo evidente en la mayoría de los animales luego de 11 - 12
semanas post-inyección de STZ. Considerando que la opacidad del cristalino podría afectar
directamente la entrada de luz, lo que a su vez podría modificar las variables evaluadas, se
realizó una lentectomía en un grupo de animales diabéticos luego de 6 semanas de la inyección
de STZ. Con el objetivo de reducir el daño y la inflamación ocular post-quirúrgica, se evaluaron
diferentes métodos para la remoción del cristalino. La cirugía que permitió obtener mejores
resultados consistió en una pequeña incisión en la córnea por la región dorsal y un corte de la
cápsula del cristalino, que permitió extraer la lente completa, sin alteración de la porción
posterior de la cápsula. De esta manera, se evitó el contacto con el cuerpo vítreo y un posible
desprendimiento de retina. Los animales se trataron con antiinflamatorios, como se indica en
Resultados
115
Materiales y Métodos, y se evaluaron clínicamente durante los días posteriores a la cirugía.
Luego de 7 días post-cirugía se realizó un análisis funcional para evaluar los resultados de la
operación. En ningún caso se observaron signos evidentes de alteración funcional retiniana
(datos no mostrados). Finalmente, a las 8 semanas post-operación se evaluó la respuesta
electrorretinográfica y la morfología retiniana. En la Figura 47 se muestra el análisis funcional y
morfológico realizado en animales con 15 semanas de diabetes, sometidos a lentectomía a la
semana 6 post-inyección de STZ.
Figura 47. Evaluación funcional y morfológica en animales control o con 15 semanas de diabetes, sometidos a
lentectomía (LX) en la semana 6 post-inyección de vehículo o STZ. Luego de la operación se observó una
recuperación funcional completa en animales control. En animales diabéticos de 15 semanas con cirugía de cataratas
se obtuvieron resultados similares a los observados en animales diabéticos sin cirugía. El análisis morfológico indicó
que la operación no provocó alteraciones retinianas o signos de inflamación. Nótese la cápsula posterior intacta
(flechas). Se muestra la media ± EE (n= 5 animales/ grupo). Barra= 500 m.
Resultados
116
En la siguiente serie de experimentos se evaluó el estado de las proyecciones retinianas a los
NSQ y al NOP. A las de 6, 10 y 15 semanas de inducción de diabetes se realizaron inyecciones
intravítreas de CTB y se analizó el transporte anterógrado. En todos los intervalos evaluados no
se observaron diferencias evidentes en el área y en la intensidad de la marcación observada en
toda la región retino-receptiva (porción ventral-lateral) de los NSQ y el NOP, aunque en todos
los casos se observó una clara alteración del transporte anterógrado de las CGRs de proyección
al CS. En la Figura 48 se muestran fotomicrografías representativas de un animal con 15
semanas de diabetes, en el que se observó una disminución notable en la marcación de CTB en
las distintas regiones del CS, en tanto que no se evidenciaron cambios en las terminales
retinianas que proyectan a los NSQ o al NOP.
A continuación, se cuantificó el número total de CGRifs en retinas en montaje plano de los
distintos grupos experimentales. En la Figura 49 se muestran los resultados obtenidos en el
análisis por inmunofluorescencia para melanopsina. Se identificaron claramente los cuerpos
celulares de las CGRifs y sus dendritas principales, en contacto con dendritas de células
adyacentes, formando una red de conexión que se extendió por toda la retina. A mayor aumento
se observó claramente la morfología de las dendritas “arrosariadas” con engrosamientos
puntuales intensamente reactivos para melanopsina. En retinas de animales con 15 semanas de
diabetes no se observaron diferencias en el número total de CGRifs (Figura 49A). En cortes
transversales de retinas diabéticas se identificaron CGRs melanopsina(+) en la CCG y cuerpos
celulares desplazados en la CNI, con proyecciones dendríticas principalmente en la sub-lámina
OFF de la CPI, de manera similar a lo observado en retinas de animales control (Figura 49G).
Sin embargo, tanto en montaje plano como en cortes transversales de retina (datos no
mostrados), la cuantificación reveló una caída significativa en el número de CGRs que expresan
Brn3a en retinas de animales con 15 semanas de diabetes (Figura 49D).
Resultados
117
Figura 48. Detección de CTB en terminales retinianas de proyección al CS (panel superior), a los NSQ (panel
central) y al NOP (panel inferior). Se muestran fotomicrografías representativas de un animal control y un animal
con 15 semanas de diabetes. A las 15 semanas de diabetes se observaron severas alteraciones en el transporte
anterógrado de axones que proyectan al CS. Sin embargo, no se observaron cambios en el área y la intensidad de la
marcación en núcleos visuales que participan en el sistema no formador de imágenes, como los NSQ y el NOP.
Barra: panel superior= 1 mm; panel central= 200 m; panel inferior= 500 m. Se muestran resultados de animales
representativos para cada grupo (n= 6 animales/ grupo).
Resultados
118
Figura 49. Análisis de las sub-poblaciones de CGRs en la diabetes experimental. A: Cuantificación de CGRs
melanopsina(+) en retinas de animales control y animales con 15 semanas de diabetes. B-C: Se muestran esquemas
representativos de la cuantificación de las CGRs melanopsina(+) en retinas en montaje plano de los distintos grupos
experimentales. D: Se observó una caída significativa en el número de CGRs Brn3a(+) en la región periférica de
retinas de animales diabéticos. E-F: Microfotografías representativas de la región periférica de retinas de un animal
control y un animal diabético, donde se observan CGRs Brn3a(+) y los cuerpos celulares y proyecciones dendríticas
de las CGRs melanopsina(+). En el panel G se muestra un corte transversal representativo de la retina de un animal
con 15 semanas de diabetes. Se observan CGRs Brn3a(+) y melanopsina(+) con proyecciones dendríticas en la capa
plexiforme interna. Se muestra la media ± EE (n= 5 animales/ grupo). *: P< 0,05 vs. control, test de Student. Barra:
C= 1mm, F-G= 25 m. N: nasal, T: temporal, S: superior, I: inferior.
A continuación, se evaluaron los niveles de melanopsina por Western blot en retinas de animales
control y animales diabéticos a las 15 semanas de la inyección de STZ. No se observaron
Resultados
119
diferencias significativas en ninguno de los períodos evaluados entre los grupos experimentales.
Análogamente, no se observaron diferencias para el fotopigmento rodopsina, característico de los
bastones (Figura 50).
Figura 50. Determinación por Western blot de los niveles de melanopsina y rodopsina en retinas de anímales
control y animales con 15 semanas de diabetes. Se muestra el análisis densitométrico para cada proteína
(relativizado a -actina) y geles representativos para dos animales controles (C1, C2) y dos animales con 15
semanas de diabetes (D1, D2). Se muestra la media ± EE (n= 5 animales/ grupo).
Para determinar el estado funcional de la conexión retino-hipotalámica en animales diabéticos, se
evaluó la respuesta de neuronas de los NSQ a un pulso de luz. Para ello, se aplicó un pulso de 1 h
de luz blanca brillante (1200 lux) luego de 4 h de apagada la luz (0.00 h, ZT 16). Luego de 30
min del pulso de luz, los animales se perfundieron en oscuridad y se determinaron los niveles de
c-Fos (gen de expresión temprano) por inmunohistoquímica. En animales con 15 semanas de
diabetes se observó una caída significativa en el número de células c-Fos(+) en la región retino-
receptiva de los NSQ, en comparación con animales control (Figura 51). Asimismo, se evaluó la
respuesta de neuronas de los NSQ a un pulso de luz en animales sometidos a lentectomía a la
semana 6 post-inyección de vehículo o STZ. A las 15 semanas post-inyección de STZ, se analizó
la respuesta de los NSQ frente a un pulso de luz en animales con remoción de cristalino. En este
Resultados
120
caso se observó una reversión completa de la caída del número de neuronas c-Fos(+) observada
en animales diabéticos sin cirugía (Figura 51).
Figura 51. Inducción de c-Fos en los NSQ por un pulso de luz (1 h) a ZT 16. Se cuantificó el número total de
neuronas c-Fos(+) en cortes seriados de los NSQ en animales control y animales con 15 semanas de diabetes, sin o
con lentectomía (LX) realizada a las 6 semanas de la inyección de STZ. Se muestran fotomicrografías
representativas (región rostral, medial y caudal) de los NSQ de los distintos grupos experimentales. Se muestra la
media ± EE (n= 5 animales/ grupo). **: P< 0,01 vs. control, a: P< 0,01 vs. diabetes + LX, test de Tukey. Barra= 200
m. 3V: tercer ventrículo; OX: quiasma óptico.
Se obtuvieron resultados similares en el análisis de la respuesta a un pulso de luz en el NOP y el
núcleo intergeniculado. En ambos núcleos se observó una disminución marcada del número de
Resultados
121
neuronas c-Fos(+) en animales con 15 semanas de diabetes, que fue revertida por la remoción del
cristalino (Figura 52).
Figura 52. Inducción de c-Fos en el NOP y el núcleo intergeniculado por un pulso de luz (1 h) a ZT 16. Se evaluó el
número de neuronas c-Fos(+) por inmunomarcación en cortes seriados de los núcleos, en animales control (A-C) y
animales con 15 semanas de diabetes (D-F). Se muestran secciones representativas de cortes transversales del
mesencéfalo, donde se remarcan el NOP (B y E) y el núcleo intergeniculado (C y F). A mayor aumento se observa
claramente la disminución en el número de neuronas c-Fos(+) observadas en la periferia del NOP (E) y en el núcleo
intergeniculado (F) de un animal con 15 semanas de diabetes. Barra= 500 m.
Se analizó el reflejo pupilar consensual en animales control y diabéticos luego de 6 y 10 semanas
post-inyección de STZ. Debido al desarrollo de cataras no fue posible determinar el reflejo
pupilar a intervalos posteriores. En todos los casos evaluados no se observaron diferencias
significativas en el porcentaje de contracción pupilar (Figura 53).
Resultados
122
Figura 53. Determinación del reflejo pupilar consensual en animales control y animales con 6 ó 10 semanas de
diabetes. No se observaron diferencias significativas entre los grupos experimentales. Se evaluó el porcentaje de
contracción de la pupila (respecto al área de la pupila en oscuridad) medida para cada ojo en forma individual. Se
muestra la media ± EE (n= 10 animales/ grupo).
Finalmente, se analizaron los ritmos de actividad locomotora en animales diabéticos. En una
primera etapa, se evaluó la actividad locomotora mediante un sensor infrarrojo que permite
detectar movimiento en animales expuestos a un ciclo de 12 h de luz (200 lux)/ 12 h de
oscuridad (encendido de las luces 8.00 am). En la Figura 54 se muestran los ritmos de actividad
locomotora (actogramas en doble plot) de un animal representativo del grupo control y un animal
diabético. En animales con 10 - 14 semanas de diabetes se observó un ritmo normal de actividad
en completa sincronización con el ciclo de luz/oscuridad. Sin embargo, se observó un retraso
significativo en el comienzo de la actividad respecto al apagado de las luces. El ángulo de fase
fue: control = 3,4 ± 3,1 min; diabetes = 29,13 ± 6,4 min (P< 0,01, test de Student, n= 10
animales/ grupo).
Resultados
123
Figura 54. Análisis de la actividad locomotora. En el panel superior se muestran actogramas (en doble plot)
representativos de un animal control y un animal con 10 semanas de diabetes al comienzo del experimento. Se
realizó un retraso de fase de 4 h (asterisco rojo) y se determinó el tiempo de re-sincronización. Finalmente, los
animales se sometieron a lentectomía bilateral (asterisco azul) y se evaluaron las posibles alteraciones en el patrón
circadiano de actividad. En el panel central se muestran periodogramas representativos de un animal control y un
animal diabético en una etapa previa (trazo negro) o posterior (trazo rojo) a la remoción del cristalino. En el panel
inferior se muestran gráficos de onda para la actividad promedio de un animal control y un animal diabético en una
etapa previa (trazo negro) o posterior (trazo rojo) a la lentectomía. Se muestran resultados representativos de un
animal control y un animal diabético (n= 10 animales/ grupo).
Resultados
124
Además, se analizó la capacidad de re-sincronización frente a un retraso de 4 h en la fase del
ciclo de luz/oscuridad. En animales con 14 - 15 semanas de diabetes se observó un retraso
significativo en el período necesario para resincronizar al nuevo ciclo (Figura 55). Considerando
la ya mencionada incidencia de cataratas en los animales diabéticos, se realizó una lentectomía
bilateral y luego de 14 - 20 días de recuperación, se evaluó nuevamente la capacidad de re-
sincronización. Luego de la cirugía se observó una disminución en la actividad total de los
animales que se recuperó paulatinamente. No se observaron diferencias evidentes en cuanto al
ritmo de actividad, comparado con los resultados obtenidos en forma previa a la cirugía (Figura
54). La operación no modificó el retraso en el comienzo de la actividad tras al encendido de las
luces (ángulo de fase), observado en estos animales luego de 14 - 15 semanas de diabetes. El
valor de ángulo de fase para animales diabéticos sin cristalino fue = 30,0 ± 1,4 min (media ±
EE). Sin embargo, se observó una recuperación significativa en el período necesario para re-
sincronizar a un retraso de 4 h en la fase del ciclo de luz/oscuridad, en comparación con
resultados obtenidos de animales diabéticos previa lentectomía (Figura 55).
Resultados
125
Figura 55. Efecto de un retraso de fase (4 h) en el tiempo de re-sincronización en animales control y diabéticos, sin
o con cirugía de cataratas. Se observó un retraso significativo en el tiempo necesario para re-sincronizar a la nueva
fase en animales diabéticos con cataratas (círculos blancos), respecto a animales control (círculos negros), que fue
significativamente revertido por la lentectomía (triángulos negros). Se muestra la media ± EE (n= 10 animales/
grupo). ). **: P< 0,01 vs. control, a: P< 0,01 vs. diabetes + lentectomía, test de Tukey.
Discusión
126
DISCUSIÓN
Como se mencionó en la Introducción, el daño isquémico es un componente central de diversas
enfermedades retinianas prevalentes como la retinopatía diabética, la retinopatía por hipertensión
arterial, la trombosis de la vena central de la retina y el glaucoma, que constituyen las causas más
frecuentes de ceguera irreversible. No se dispone actualmente de recursos eficaces para la
prevención o terapéutica del daño isquémico, de manera tal que esta afección retiniana
representa un aspecto de gran relevancia en el marco de la Salud Pública. En este trabajo de
Tesis se ha analizado la posibilidad de inducir protección de la retina frente al daño isquémico
agudo a través del PostC y se han analizado los posibles mecanismos involucrados en este
proceso. Asimismo, se analizó la efectividad de la tolerancia isquémica como estrategia
terapéutica frente al daño de la retina y la vía visual inducido por diabetes experimental y
finalmente, se examinó el sistema no formador de imágenes en períodos avanzados de diabetes.
A continuación, se discutirán los resultados obtenidos en este trabajo en función de los objetivos
planteados.
1. Post-condicionamiento como mecanismo inductor de tolerancia isquémica frente a una
isquemia retiniana aguda
Frente a la vacancia terapéutica en el tratamiento del daño isquémico retiniano, se ha sugerido
como estrategia alternativa y/o complementaria la inducción de mecanismos endógenos de
protección. En este sentido, se ha demostrado que el PCI induce la neuroprotección retiniana más
robusta alcanzada frente al daño inducido por isquemia/reperfusión (Roth y col., 1998). Sin
embargo, al inicio de este trabajo no se disponía de evidencias que avalaran la posibilidad de
inducir protección de la retina con una manipulación posterior al evento isquémico. Los
resultados obtenidos en este trabajo de Tesis indican que la aplicación de pulsos breves de
isquemia durante la reperfusión que sigue a un episodio isquémico deletéreo, protegió
significativamente de las alteraciones funcionales e histológicas causadas por la isquemia. Estos
Discusión
127
resultados constituyen la primera demostración experimental de la eficacia del PostC a nivel
retiniano. El PostC fue descripto originalmente por Zhao y col. (2003) en un modelo de isquemia
cardíaca. Posteriormente, se caracterizó el efecto protector del PostC en diversos modelos in vivo
e in vitro, y en otros sistemas como hígado y riñón (Tsang y col., 2004; Sun y col., 2004; Liu y
col., 2007). La efectividad del PostC a nivel cerebral se demostró por primera vez en el año 2006
(Zhao y col., 2006). Utilizando un modelo de isquemia cerebral inducido por la oclusión
permanente de la arteria cerebral media (en la porción distal) y oclusión temporal de la arteria
carótida común durante 15, 30 ó 60 min, estos autores demostraron que la aplicación de tres
ciclos de isquemia/reperfusión (30 s/ 10 s) luego de 30 s de la isquemia, revierte
significativamente el daño morfológico observado a los dos días de reperfusión. Estos resultados
sugieren que el período próximo a la isquemia (es decir, en el inicio de la reperfusión) es crítico
en la génesis del daño isquémico. Por lo tanto, la intervención en estadíos iniciales de
reperfusión podría ser clave para inducir tolerancia isquémica.
El aumento de la PIO a 120 mm Hg por 40 min provocó cambios morfológicos y funcionales
significativos a nivel retiniano. En este sentido, se observó una disminución significativa de la
amplitud de la onda a (una medida de la actividad de los FR) y de la onda b (que refleja la
respuesta de las células bipolares y células de Müller) del ERG.
En cuanto a la morfología, se observó una marcada alteración de la retina interna y pliegues a
nivel de los FR. Las alteraciones fueron evidentes a partir de los 7 días de reperfusión y se
profundizaron a los 14 días post-isquemia. La aplicación de pulsos breves de isquemia revirtió
significativamente las alteraciones funcionales y morfológicas. De hecho, en retinas post-
condicionadas no se observaron diferencias significativas respecto a lo observado en el grupo
control (no isquémico). La respuesta funcional y los cambios morfológicos se evaluaron también
luego de 30, 45 y 60 días de reperfusión (datos no mostrados) y no se observaron diferencias
respecto a lo observado luego de 14 días de reperfusión en retinas isquémicas, entre estos
períodos. Asimismo, la protección inducida por PostC fue evidente en todos los intervalos
Discusión
128
examinados, lo que indica que el PostC no retrasa meramente el daño isquémico, sino que induce
una protección persistente en el tiempo.
La isquemia indujo cambios en las células gliales y en terminales presinápticos, como lo indican
los resultados obtenidos a través del análisis por inmunofluorescencia (GFAP y sinaptofisina).
La reactividad glial ha sido ampliamente validada como un marcador de alteración retiniana
(Pekny y Nilsson, 2005). En condiciones patológicas, se han descripto cambios en los niveles
astrocitarios de GFAP y en la expresión de esta proteína en las células de Müller (Osborne y col.,
1991; Wu y col., 2003). En retinas isquémicas se observó un aumento en la expresión de GFAP
y desorganización de los procesos de células de Müller (sin cambios aparentes en el número de
células) luego de 14 días de reperfusión, en tanto que ambos fenómenos fueron revertidos por el
PostC.
La sinaptofisina es una proteína vesicular del terminal presináptico que se asocia con otras
proteínas vesiculares y participa en la biogénesis y el reciclado vesicular (Gincel y Shoshan-
Barmatz, 2002; Bonanomi y col., 2007). La disminución en los niveles de esta proteína en la CPI
y la CPE de retinas sometidas a isquemia, sugiere una severa alteración en la función sináptica y
neurotransmisión, particularmente entre la retina media y externa, que fueron revertidas por el
PostC.
Al presente, se han utilizado fundamentalmente dos modelos de isquemia retiniana. El primero,
consiste en la oclusión de la ACR a través de la ligadura del NO. El segundo modelo se basa en
el aumento de la PIO a ~ 120 mm Hg por encima de la presión sistólica arterial (~ 90 mm Hg).
La vasculatura de la coroides es responsable de la nutrición de los FR. A diferencia del ojo de
primates, toda la capa vascular media en la rata está irrigada por las ACPs, que provienen de la
arteria ciliar posterior del NO. Esta característica anatómica determina que en el modelo de
ligadura del NO, dependiendo de la fuerza aplicada, se puede lograr un bloqueo completo de la
irrigación retiniana por la ACR, pero además se afecta la irrigación de la capa coriocapilar que
nutre los FR por difusión. Por lo tanto, este modelo de isquemia difiere considerablemente de las
Discusión
129
características observadas en las retinopatías isquémicas humanas. En el modelo de isquemia
utilizado en este trabajo de Tesis, en cambio, la vasculatura coroidea no se afecta. Una posible
desventaja del modelo de isquemia inducido por aumento de la PIO es el riesgo de desencadenar
desprendimientos de retina. Sin embargo, en las condiciones experimentales utilizadas y con los
recaudos necesarios, la incidencia de esta complicación se redujo al mínimo. Cabe señalar que en
nuestras condiciones experimentales, a los 14 días de reperfusión se observaron alteraciones
considerables de la retina externa, con pérdida de células y pliegues de los segmentos externos
de los FR. En contraste con nuestros resultados, Sakamoto y col. (2006), utilizando un modelo de
isquemia similar al utilizado en este trabajo, no observaron alteraciones en la retina externa, en
tanto que Roth y col. (1998) demostraron una desorganización leve de los FR luego de una
isquemia retiniana inducida por ligadura del NO. Una posible explicación para esta discrepancia
es la utilización de distintas cepas de ratas. En los trabajos citados anteriormente se utilizaron
ratas Sprague-Dawley, en tanto que en este trabajo se utilizó la cepa Wistar. En este sentido, se
ha descripto que el daño isquémico retiniano es altamente dependiente de la cepa de rata
(Ettaiche y col., 2001). Otra diferencia de significación entre éste y los trabajos mencionados,
radica en el intervalo de análisis post-isquemia. En estos trabajos, como en la gran mayoría de
los estudios realizados sobre inducción de tolerancia isquémica en el SNC, el análisis histológico
se realizó a los 7 días de reperfusión, en tanto que en este trabajo de Tesis, los estudios
morfológicos se realizaron mayoritariamente 14 días después de la isquemia. Considerando los
resultados obtenidos junto a los antecedentes mencionados, es posible postular que existe una
progresión en el daño histológico retiniano asociado a la isquemia. De esta forma, las células de
la retina interna podrían ser más susceptibles al daño isquémico agudo, dado que se alteran
significativamente aun en un período en el cual se evidenciaron cambios comparativamente
menores en los FR. Alternativamente, es posible que la muerte de las CGRs y de células de la
retina media afecte secuencialmente a los FR, provocando la muerte de estos últimos.
Discusión
130
Ettaiche y col. (2001) caracterizaron el daño funcional retiniano en función de la duración del
evento isquémico. En concordancia con estos autores, los resultados obtenidos indican que la
aplicación de 60 min de isquemia provocó alteraciones funcionales y morfológicas que
resultaron significativamente mayores que las inducidas por 40 min de isquemia. De todas
maneras, aún en estas condiciones “más drásticas” de daño, el PostC también fue
significativamente efectivo, a pesar de que la magnitud de la recuperación funcional e
histológica fue menor.
La serie de experimentos en los que se avaluó el efecto del número de pulsos indicó que 3 pulsos
no fueron suficientes, en tanto que 7 ó 10 ciclos de isquemia/reperfusión resultaron igualmente
efectivos, un hecho no sorprendente si se tiene en cuenta que la protección inducida por 7 ciclos
fue prácticamente completa. Resultados similares se obtuvieron en un modelo de PostC frente al
daño isquémico en el miocardio (Yang y col., 2004). En la gran mayoría de los estudios sobre
PostC se aplicaron pulsos de isquemia/reperfusión, siendo la intermitencia en la perfusión post-
isquemia un factor común a la mayoría de los protocolos utilizados. Para determinar si la
alternancia de ciclos de isquemia/reperfusión es una condición necesaria para la inducción de
tolerancia isquémica, se evaluó la efectividad de la aplicación de un único episodio de isquemia
de una duración igual a la suma de la duración de los pulsos. La aplicación de un único pulso de
7 min de isquemia, 5 min después de la isquemia prolongada, constituyó una estrategia
igualmente efectiva que la obtenida con 7 pulsos de 1 min, con la ventaja adicional de que su
aplicación es más sencilla ya que requiere una menor manipulación de los animales.
Análogamente, Pignataro y col. (2008) demostraron la eficacia de un único pulso de isquemia
aplicado luego de una isquemia cerebral focal por oclusión de la arteria cerebral media.
El conjunto de resultados obtenidos demuestra que el PostC es tan efectivo como el PCI en la
protección del daño isquémico agudo. Sin embargo, las ventajas del PostC respecto al PCI son
evidentes, particularmente en lo que respecta a su eventual aplicación clínica, debido a que la
aparición de isquemia retiniana es un evento impredecible, en cambio, el inicio de la reperfusión
Discusión
131
podría ser más fácil de predecir. En este marco, resultó de particular interés determinar la
ventana temporal para la aplicación del PostC. En modelos de isquemia cardíaca y cerebral, la
aplicación de ciclos de isquemia/reperfusión a partir de 1 min después de la isquemia
prolongada, no resulta efectivo frente al daño y el PostC sólo induce protección cuanto se aplica
inmediatamente después de la isquemia (Pignataro y col., 2008; Wang y col., 2008). Estos
resultados sugieren que la ventana temporal para la efectividad del PostC depende altamente del
tejido. Los resultados obtenidos demuestran que en la retina, el PostC fue efectivo aun cuando se
aplicó a los 60 min post-isquemia. En comparación con los hallazgos obtenidos en otros tejidos
(incluido el cerebro), estos resultados sugieren que el período de intervención parece menos
crítico en la retina que en otros sistemas, lo que aumenta su eventual aplicabilidad en términos de
una potencial translación clínica.
Como se mencionó en la Introducción, diversas vías de señalización han sido asociadas a la
inducción de tolerancia isquémica. Para dilucidar el/los posible/s mecanismo/s involucrado/s, se
evaluó, en primer lugar, la participación de la síntesis de novo de proteínas. Para ello, a distintos
períodos de reperfusión se inyectó cicloheximida, un bloqueante de la translocación del ribosoma
60S, ampliamente utilizado en experimentos in vivo (Schneider-Poetsch y col., 2010; Maciejak y
col., 2010). La cicloheximida bloqueó completamente el efecto protector inducido por PostC
cuando se administró 1 min antes, pero no 6 h después de la isquemia prolongada. Estos
resultados sugieren que existe una ventana temporal estrecha (menor a 6 h), en la que ocurren
cambios traduccionales asociados a la protección inducida por el PostC. En concordancia con
estos resultados, en neuronas piramidales de la capa CA1 del hipocampo se demostró que la
inyección de cicloheximida simultáneamente con la aplicación de pulsos de isquemia suprimió el
efecto protector, pero no fue efectivo cuando se inyectó 5 h después del PostC (Burda y col.,
2006).
En base a estos resultados, se evaluó la participación de un factor de inducción temprana que
pudiera estar asociado a la protección desencadenada por PostC. Si bien los mecanismos
Discusión
132
involucrados en el PostC no se conocen en detalle, se ha sugerido que podrían ser similares a los
descriptos en el PCI (Tissier y col., 2007; Pignataro y col., 2008). El óxido nítrico ha sido
involucrado como un mediador autócrino yo parácrino de tolerancia isquémica en diversos
tejidos, incluida la retina (Zhu y col., 2006). Evidencias farmacológicas sumadas a estudios
realizados en animales knockout para las distintas isoformas de la NOS, avalan la participación
del óxido nítrico en la tolerancia isquémica. Sin embargo, existe controversia respecto a la
participación de las distintas isoformas de NOS en el PCI. Zhu y col. (2006) demostraron que la
protección del PCI es completa en ratones knockout para la iNOS, en tanto que la tolerancia
isquemia no ocurre en ratones knockout para la eNOS o nNOS. En contraposición, estudios
realizados por Sakamoto y col. (2006) demostraron que el PCI es bloqueado por la
administración de aminoguanidina y/o L-N6-(1-iminoetil) lisina (inhibidores de la iNOS), pero
no por NG-nitro-L-arginina, NG-monometil-L-arginina (inhibidores no selectivos de las
isoformas constitutivas de NOS) o 7-nitroindazol (inhibidor de la nNOS), lo que sugiere la
participación de la iNOS en la protección asociada al PCI. En nuestro laboratorio hemos
demostrado la participación de la iNOS en el mecanismo de protección inducido por pre-
condicionamiento heterólogo frente al daño isquémico retiniano (Franco y col., 2008).
Análogamente, los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que la protección inducida por
PostC retiniano podría involucrar un mecanismo dependiente de iNOS. Es necesario señalar que
la aminoguanidina no tuvo efecto sobre retinas control y no agravó el daño inducido por la
isquemia, lo que permite descartar un posible efecto deletéreo del tratamiento per se con
aminoguanidina. De acuerdo a estos resultados, es posible sugerir a la iNOS como un blanco
posible del efecto de la cicloheximida. En conjunto, sin excluir la participación de otra señales,
los resultados obtenidos sugieren que el óxido nítrico derivado de la iNOS podría desempeñar un
papel central en la protección inducida por PostC retiniano. Se discutirán más adelante las
evidencias obtenidas a favor de la participación adicional del glutamato en el PostC retiniano.
Discusión
133
En suma, estos resultados demuestran por primera vez la efectividad del PostC frente al daño
isquémico retiniano agudo. La protección histológica y funcional dependió de diversos factores,
como el período de isquemia, el número de ciclos de isquemia/reperfusión y la ventana temporal
de aplicación del PostC durante la reperfusión, con resultados positivos incluso cuando el PostC
se aplicó luego de 60 min de reperfusión. En cuanto a los mecanismos involucrados, hemos
demostrado que la síntesis proteica participa en la protección y que la iNOS podría ser una
proteína clave.
2. Participación del glutamato en el daño isquémico retiniano y en la protección inducida
por post-condicionamiento
Como se mencionó en la Introducción, se ha postulado que el PCI y el PostC podrían provocar
cambios de menor magnitud en los mismos sistemas de señales que están involucrados en el
daño isquémico, desencadenando respuestas adaptativas en lugar de deletéreas (Gidday, 2006).
Por lo tanto, una clave en la elucidación de los mecanismos involucrados en estas estrategias de
protección provino de la identificación de factores que participan del daño isquémico. En este
sentido, un conjunto considerable de evidencias avala la participación del glutamato en el daño
isquémico. Se ha demostrado que la administración intravítrea de agonistas de receptores
glutamatérgicos, en particular de tipo NMDA, provocan un daño marcado en la retina interna,
similar al observado en modelos de isquemia retiniana aguda (Iversen, 1991; Ikeda y col., 1992;
Nucci y col., 2007). Asimismo, se ha demostrado un aumento significativo en la liberación de
glutamato inducido por isquemia (Cazevieille y Osborne, 1997). Para evaluar la participación del
glutamato en la protección inducida por PostC, se consideró necesario realizar un estudio más
detallado de la progresión del daño retiniano asociado a una isquemia aguda, así como de la
protección inducida por PostC. Los resultados obtenidos sugieren la existencia de un fenómeno
de progresión del daño isquémico, al menos de acuerdo a criterios histológicos, que se hace más
evidente con el tiempo de reperfusión. En este contexto, se ha demostrado que los cambios
Discusión
134
histológicos y funcionales progresan con el tiempo post-isquemia y que la alteración del ERG es
anterior a los cambios morfológicos (Rosenbaum y col., 2001). Los resultados obtenidos en este
trabajo avalan el concepto de que la amplitud de las ondas a y b del ERG escotópico (pero no los
POs) constituyen los indicadores más sensibles del daño retiniano inducido por
isquemia/reperfusión, dado que estos parámetros funcionales revelaron una alteración en un
período en el que la morfología de la retina no difería en forma evidente del control (es decir a
las 24 h y 3 días después de la isquemia).
El origen y el sustrato neuronal responsable de los POs no han sido aún determinados con
precisión y son motivo de controversia. En general, los POs se han asociado a vías neuronales de
la retina interna, en particular a las células amácrinas. Sin embargo, también se ha demostrado la
participación de células bipolares y CGRs (Heynen y col., 1985; Wachtmeister, 1998). Además,
se demostró que la respuesta de los POs depende fuertemente de la perfusión sanguínea de la
retina interna (Wachtmeister, 1998). Contrariamente a lo esperable, la suma de la amplitud de los
POs disminuyó significativamente sólo 7 días después de la isquemia. Al presente, no se dispone
de una clara explicación para este resultado. Si bien la alta variabilidad entre animales obtenida
en el registro de los POs podría ser una causa, también es posible sugerir que la actividad de las
capas internas de la retina fueron afectadas por la isquemia en forma posterior a la alteración de
las capas media y externa (como lo reflejan las amplitudes de las ondas b y a del ERG,
respectivamente).
A pesar de que a los 3 días post-isquemia la estructura general de la retina se encontró
conservada, en este período el PostC revirtió el aumento en los niveles de GFAP en células de
Müller inducido por la isquemia/reperfusión. Dado que las células de Müller desempeñan un rol
central en el clearance de glutamato, se decidió evaluar los mecanismos involucrados en el
reciclado de glutamato sináptico en el primer período en el que fueron evidentes cambios a nivel
de las células de Müller, tanto en retinas isquémicas con tratamiento simulado como en las
Discusión
135
retinas con PostC, es decir a los 3 días post-isquemia. Los resultados obtenidos indican que el
influjo de glutamato y la actividad de GS son susceptibles del daño por isquemia/reperfusión.
El glutamato es neurotóxico en cantidades excesivas. Dado que no existen enzimas que degraden
glutamato en el medio extracelular, los transportadores de glutamato son responsables de
mantener el glutamato sináptico en concentraciones no tóxicas. Las células de Müller expresan
transportadores de glutamato de tipo GLAST, el tipo de transportador retiniano más activo para
este neurotransmisor. La isquemia provocó una disminución significativa en la captación de
glutamato. Aunque diversos trabajos han demostrado una disminución en la expresión de
transportadores gliales de glutamato en retinas isquémicas, evaluada a través de técnicas de
inmunodetección (Napper y col., 1999; Barnett y col., 2001), en estos estudios no se examinó la
capacidad funcional del transportador, en tanto que los resultados obtenidos en este trabajo
demuestran un déficit en la capacidad de remoción del glutamato sináptico en retinas isquémicas.
El glutamato captado por las células de Müller es rápidamente convertido a glutamina por la GS,
lo que genera una fuerza motriz para el transporte de glutamato mayor que en neuronas que
contienen concentraciones intracelulares de glutamato libre mucho mayores (Pow, 2001). De
hecho, aunque el influjo de glutamato es controlado por la expresión y/o modificaciones post-
traduccionales de transportadores específicos, estudios fisiológicos sugieren que el transporte de
glutamato puede ser también dependiente de su metabolismo (Gegelashvili y Schousboe, 1998;
Tanaka, 2000). Se ha demostrado que un aumento en las concentraciones intracelulares de
glutamato disminuye el transporte neto de este neurotransmisor y se ha sugerido que el
metabolismo intracelular instantáneo de glutamato podría ser necesario para una remoción
eficiente del entorno extracelular (Attwell y col., 1993; Otis y Jahr, 1998).
Una vez catalizada la reacción por la GS, la glutamina es liberada por las células de Müller y
puede ser utilizada por las neuronas como precursor para la síntesis de glutamato. Luego de 3
días de reperfusión, no se observaron alteraciones en la liberación de glutamato, la liberación y la
captación de glutamina y la actividad de glutaminasa en retinas isquémicas. Sin embargo, la
Discusión
136
disminución en el influjo de glutamato y en la actividad de GS podrían contribuir en forma
sinérgica o redundante al incremento excesivo en los niveles de glutamato a nivel de la brecha
sináptica. El PostC revirtió significativamente las alteraciones en el influjo de glutamato y en la
actividad de GS inducidas por isquemia. Dado que a los 3 días de reperfusión el PostC revirtió
las alteraciones en el clearance de glutamato pero no se observaron evidencias de protección
funcional o morfológica, estos resultados podrían sugerir que la protección inducida por el PostC
involucra la restauración de los niveles sinápticos de glutamato. Cabe señalar que la aplicación
de pulsos de isquemia en retinas de animales control no afectó ninguno de los parámetros del
ciclo glutamato/glutamina. Estos resultados concuerdan con las determinaciones morfológicas y
funcionales, que indican que el PostC carece de efectos per se. Considerando que los parámetros
del ciclo glutamato/glutamina se analizaron en retinas enteras, no resulta posible discriminar la
localización retiniana de los fenómenos observados. Sin embargo, a nivel retiniano, los
transportadores gliales que captan glutamato y la enzima GS se localizan principalmente en las
células de Müller. Por lo tanto, los resultados obtenidos sugieren a las células de Müller como el
sustrato anatómico de los efectos protectores del PostC, aunque la participación de otros tipos
celulares no puede descartarse en forma concluyente.
En conjunto, estos resultados sugieren que el daño isquémico puede ser mediado, al menos en
parte, por un aumento en las concentraciones sinápticas de glutamato y que el PostC protege del
daño isquémico revirtiendo este efecto. Existen al menos dos condiciones necesarias (aunque no
suficientes) para comprobar la viabilidad de esta hipótesis: 1) altas concentraciones de glutamato
deberían provocar un daño similar al observado en retinas sometidas a una isquemia deletérea y
2) el PostC debería proteger del daño retiniano funcional y morfológico inducido por el exceso
de glutamato. Los resultados obtenidos satisficieron estas condiciones. Luego de la inyección
intravítrea de concentraciones suprafisiológicas de glutamato se observó una alteración marcada
de la retina interna y una disfunción electrorretinográfica significativa, análogamente a lo
observado en retinas isquémicas, lo que avala la participación del glutamato en la injuria
Discusión
137
isquémica. Por otro lado, la aplicación de pulsos de isquemia revirtió las alteraciones funcionales
y morfológicas inducidas por concentraciones suprafisiológicas de glutamato, lo que a su vez,
avala la participación del glutamato en el PostC. Una interpretación alternativa para estos
resultados es que la isquemia y el exceso de glutamato involucren mecanismos diferenciales de
daño que convergen en un mecanismo final común, blanco del efecto protector del PostC. Al
presente no resulta posible discriminar entre estas alternativas. Sin detrimento de ello, los
resultados obtenidos indican que el PostC, además de proteger del daño isquémico, previene de
la injuria causada por la neurotoxicidad glutamérgica, lo que amplificaría notablemente su
espectro de acción, haciéndola extensible a diversas afecciones retinianas que cursan con un
aumento descontrolado en las concentraciones de glutamato sináptico, como es el caso de la
retinopatía diabética, que se discutirá en detalle más adelante.
El mecanismo de protección desencadenado por la tolerancia isquémica no ha sido aún
completamente elucidado. Sin embargo, en base al conjunto de antecedentes disponibles, es
posible que se trate de un proceso multifactorial que requiere la interacción de numerosos
mecanismos y vías de señalización, segundos mensajeros y vías efectoras. Se ha demostrado que
en estadíos tempranos luego de la isquemia, aumentan los niveles de óxido nítrico lo que podría
avalar su participación en el daño por isquemiareperfusión. El óxido nítrico activa diversas vías
de señalización, e incluso puede provocar la liberación de glutamato en neuronas de manera
indirecta, a través de la inhibición de la cadena respiratoria mitocondrial, o bien, directamente
activando la exocitosis vesicular, en un mecanismo independiente de calcio (Bal-Price y Brown,
2001; Di Stasi y col., 2002). Sin embargo, estos eventos sólo se activan en presencia de altas
concentraciones de óxido nítrico. En este sentido, Hangai y col. (1996) demostraron un aumento
marcado en los niveles de iNOS en células gliales durante la reperfusión. Como ya se mencionó,
existen evidencias a favor de que las mismas señales que desencadenan daño pueden ejercer
efectos protectores, dependiendo de diversos factores, como su concentración. En este sentido,
Roth y col. (2006) demostraron un aumento en los niveles de iNOS en células microgliales
Discusión
138
retinianas luego de 15 min y hasta 6 horas después de la aplicación de un estímulo pre-
condicionante. En el contexto de los efectos protectores, también se ha demostrado que el óxido
nítrico puede provocar la S-nitrosilación de los grupos tioles del receptor NMDA provocando
cambios conformacionales que inactivan al receptor (Gbadegesin y col., 1999; Gow y col.,
2000). En suma, los resultados obtenidos indican que la reducción en los niveles de glutamato en
el espacio sináptico, conjuntamente con la síntesis proteica en una determinada ventana temporal
y la inducción de la iNOS, constituyen componentes centrales en la protección retiniana inducido
por PostC. Al presente, no se dispone de evidencias que permitan vincular causalmente entre sí,
los cambios en la concentración de glutamato y la actividad de iNOS, aunque de acuerdo a los
resultados obtenidos, el curso temporal de la respuesta desencadenada por el PostC podría incluir
a la síntesis de proteínas en general y de iNOS en particular, como eventos más tempranos (en el
rango de horas) que el efecto sobre el reciclado de glutamato sináptico (en el rango de días).
Asimismo, estas diferencias en la dinámica de la respuesta al PostC podría correlacionarse con
diferencias en cuanto a los sustratos anatómicos de estos fenómenos, que aún no han sido
formalmente identificados.
3. Inducción de tolerancia isquémica en la retinopatía diabética
La efectividad de los mecanismos de tolerancia isquémica inducidos por una gran variedad de
estímulos pre- o post-condicionantes ha sido ampliamente documentada. Incluso se han
caracterizado mecanismos de protección inducidos por estímulos remotos, de aplicación distante
al sitio de la lesión isquémica, o bien a través de la administración de agentes farmacológicos, de
aplicación local o sistémica. Tanto el PCI como el PostC son altamente eficaces frente al daño
isquémico en diversos sistemas, como corazón, pulmón, hígado y SNC (Pasupathy y Homer-
Vanniasinkam, 2005; Gidday, 2006; Granfeldt y col., 2009). Sin embargo, en todos los casos, el
efecto protector de la tolerancia isquémica ha sido sistemáticamente evaluado en modelos de
isquemia aguda. En cambio, la serie de experimentos que se discutirá a continuación, tuvo por
Discusión
139
objeto evaluar el efecto protector del condicionamiento isquémico en un modelo experimental de
daño crónico, como es la retinopatía diabética inducida por la inyección de STZ. Dos aspectos
centrales avalaron este objetivo: 1) la isquemia es un componente central de la disfunción
retiniana inducida por diabetes y 2) diversos antecedentes (que se mencionarán más adelante)
señalan al glutamato como un factor clave en el daño diabético retiniano. De esta forma, la
aplicación de pulsos de isquemia podría evitar o reducir el componente isquémico asociado a la
diabetes, y además, la disminución de los niveles sinápticos de glutamato podría evitar o reducir
la neurodegeneración retiniana inducida por diabetes. Como se discutirá a continuación, los
resultados obtenidos confirmaron esta hipótesis. Para una mayor claridad, se analizará en
primera instancia el curso temporal de las alteraciones de la retina y la vía visual inducidas por
diabetes experimental y a continuación, se discutirán los resultados obtenidos con respecto al
efecto de la inducción de tolerancia isquémica en la retinopatía diabética inducida por STZ.
El modelo experimental en ratas inducido por una inyección única de STZ constituye una
herramienta ampliamente validada para el estudio de las alteraciones inducidas por diabetes, que
resultan compatibles con los cambios observados en pacientes diabéticos. A partir del 3er día
post-inyección, la STZ provoca un aumento significativo y persistente de la glucemia y una
pérdida progresiva del peso corporal. Es relevante remarcar que el efecto protector del
condicionamiento isquémico resultó independiente del perfil glucémico, dado que la aplicación
de pulsos semanales de isquemia no modificó los niveles de glucosa en plasma ni la pérdida de
peso corporal.
3.1. Alteraciones en la retina inducidas por diabetes experimental
La hiperglucemia crónica inducida por la inyección de STZ provoca una disfunción visual
progresiva, que se evidencia ya en estadíos tempranos de diabetes experimental. Se ha invertido
considerable esfuerzo en la identificación de los marcadores más tempranos de la enfermedad,
que permitan diagnosticar el daño diabético en las etapas iniciales, lo que indudablemente
Discusión
140
representaría una gran ventaja terapéutica. En este contexto, un número considerable de trabajos
han descripto alteraciones tempranas en la respuesta electrorretinográfica. Sin embargo, existe
controversia respecto a las manifestaciones más tempranas del daño funcional retiniano inducido
por diabetes. Aunque diversos autores han identificado cambios en la amplitud de la onda b del
ERG como la primera alteración en ratas inyectadas con STZ (Li y col., 2002), existe mayor
consenso en que el indicador funcional inicial corresponde a cambios en la amplitud y/o en la
latencia de los POs, incluso en pacientes diabéticos (Juen y Kieselbach, 1990; Hancock y Kraft,
2004). Los resultados obtenidos en este trabajo indican diferencias significativas en la amplitud
de las ondas a y b del ERG luego de 7 y 5 semanas de diabetes, respectivamente. También en
este caso, contrariamente a nuestras expectativas, la caída en la suma de la amplitud de los POs
en retinas de animales diabéticos, resultó significativamente menor al grupo control sólo a partir
de la semana 9 post-inyección de STZ. Como ya se mencionó, una posible explicación es la gran
dispersión obtenida en el análisis de los POs. Además, considerando que en el protocolo de
registro se utilizó una única intensidad de estímulo luminoso, es posible suponer que un análisis
más exhaustivo, a través de la estimulación con diferentes intensidades, hubiera permitido
obtener mayor información respecto al perfil de alteración de los POs en función del tiempo de
diabetes.
Las alteraciones en la morfología retiniana se observaron en un período considerablemente
posterior a los cambios funcionales. Sólo a las 15 semanas de diabetes se observó una caída
significativa en el número de CGRs, sin afectar el espesor de las capas internas de la retina. En
este sentido, Barber y col. (1998) han demostrado atrofia de la retina interna luego de 7,5 meses
de diabetes y se han descripto anormalidades en el árbol dendrítico de CGRs en muestras de
pacientes en estadíos avanzados de la enfermedad (Meyer-Rüsenberg y col., 2007). Por lo tanto,
análogamente a lo observado en el modelo de isquemia aguda, los resultados sugieren que en el
marco temporal analizado, existe un fenómeno de progresión del daño retiniano diabético, en el
Discusión
141
que las alteraciones funcionales preceden a los cambios morfológicos, al menos en función de las
herramientas disponibles para analizar ambos aspectos.
Un componente clave de la retinopatía diabética es el aumento en la permeabilidad vascular. Las
alteraciones en las propiedades de la barrera hemato-retiniana interna pueden deberse a diversos
factores, aunque el proceso por el cual la hiperglucemia induce aumento en la permeabilidad
vascular aún no se conoce en detalle. La perfusión con azul de Evans es una técnica ampliamente
utilizada para evaluar la integridad de la barrera hemato-retiniana interna (Ma y col., 1996;
Zhang y col., 2005). Una vez inyectado intracardiacamente, el colorante se une irreversiblemente
a la albúmina, de manera que es posible determinar la localización del complejo en la porción
intra- o extra-vascular. En retinas de animales control, el colorante se observó exclusivamente
restringido al compartimento vascular. Además, en estas retinas se observó una marca intensa
para GFAP en el cuerpo de astrocitos y en los procesos gliales en contacto con vasos sanguíneos
de diferente calibre. En cambio, en retinas de animales con 6 semanas de diabetes se observó un
marcado aumento en la permeabilidad vascular, con focos de fuga del colorante y marca difusa
en todo el compartimento extra-vascular y en forma concomitante, se observó una disminución
significativa de la inmunorreactividad para GFAP en astrocitos. Estos resultados podrían sugerir
una relación causal entre las alteraciones observadas en los astrocitos en contacto con los vasos
sanguíneos y el aumento en la permeabilidad vascular. En este sentido, diversos autores han
demostrado el rol de los astrocitos en el control de las propiedades de barrera de las células
endoteliales y se ha sugerido que la disfunción de astrocitos inducida por diabetes experimental
está íntimamente relacionada con el aumento en la permeabilidad vascular y la formación de
edemas (Barber y col., 2000; Rungger-Brändle y col., 2000; Asnaghi y col., 2003). Si bien
diversos procesos metabólicos y alteraciones celulares se han asociado a la pérdida de integridad
de la barrera hemato-retiniana, el sitio celular y el mecanismo preciso de este proceso resultan
aún controversiales. Estudios de inmunomarcación para albúmina a nivel ultraestructural,
indican la completa integridad de las uniones oclusivas que forman la barrera hemato-retiniana
Discusión
142
interna en retinas de animales diabéticos, con alteraciones en el transporte trans-endotelial de
proteínas séricas y un incremento en el número de vesículas citoplasmáticas de entre 0,4 - 1,0
m de diámetro. En este sentido, se ha descripto que el aumento en la permeabilidad vascular
podría estar mediado por el transporte trans-endotelial de vesículas de gran tamaño, conteniendo
proteínas como la albúmina, e incluso por la fusión de vesículas que forman canales tubulares
trans-endoteliales (sistema vesículo-tubular) (Caldwell y Slapnick, 1992; Vinores y col., 1998).
En estos trabajos, no se han documentado alteraciones de las uniones oclusivas inter-
endoteliales, salvo en casos de degeneración de células vasculares. Al presente, sólo dos trabajos
han evaluado las alteraciones en la barrera hemato-retiniana interna a nivel ultraestructural
(Caldwell y Slapnick, 1992; Vinores y col., 1998). Los resultados presentados en este trabajo de
Tesis confirman los resultados obtenidos por Caldwell y Slapnick (1992), aunque en este caso,
los estudios se realizaron en un período de diabetes mucho más avanzado (es decir, a los 5 meses
post-inyección de STZ). En animales con 6 semanas de diabetes, se observó la presencia
frecuente de edemas (sin afectar la integridad de las uniones oclusivas) y un aumento marcado en
el número de vesículas endoteliales conteniendo lantano. Estas alteraciones se observaron en
vasos localizados en el plexo superior e inferior de la retina interna. Asimismo, en estadíos
tempranos de diabetes se han descripto alteraciones en células de Müller y una disminución en
los niveles de ocludina, particularmente en capilares de la retina media, que han sido asociadas
con una disfunción de la barrera hemato-retiniana interna (Barber y col., 2000; Abukawa y col.,
2009). Estos autores sugieren que las poblaciones de células macrogliales podrían responder a la
hiperglucemia crónica, lo que podría afectar diferencialmente a los vasos de la retina interna y su
permeabilidad vascular. Considerando la relevancia de la pérdida de integridad de la barrera
hemato-retiniana en el daño diabético, un análisis más exhaustivo a diferentes intervalos post-
inyección de STZ podría contribuir a determinar el rol causal de los astrocitos y las células de
Müller en las alteraciones de la barrera hemato-retiniana interna.
Discusión
143
El aumento en la permeabilidad vascular provoca y exacerba la isquemia retiniana, la formación
de edemas y una reacción glial con daño neuronal. En el año 1994 se publicó el primer estudio
en el que se demostró un aumento en los niveles de VEGF en muestras de cuerpo vítreo de
pacientes con retinopatía diabética proliferativa (Aiello y col., 1994). A partir de entonces, una
cantidad considerable de estudios han identificado al aumento en los niveles de VEGF como un
factor clave en las alteraciones vasculares características de la diabetes (revisado por Whitmire y
col., 2011). Estudios en modelos animales han demostrado que la inyección repetida de altas
concentraciones de VEGF induce cambios vasculares y un aumento en la permeabilidad vascular
análogos a los observados en los primeros estadíos de la retinopatía diabética, posiblemente a
través de un mecanismo que involucra alteraciones post-traduccionales de ocludinas y
disminución en su expresión (Antonetti y col., 1999; Tolentino y col., 2002). Existen diversos
estudios clínicos que utilizan terapias anti-VEGF para el tratamiento de la retinopatía diabética
(Ng y Adamis, 2006; Arevalo y col., 2007). Si bien los resultados son alentadores, estas terapias
son recomendadas conjuntamente con un tratamiento con láser, según las características del
paciente. En concordancia con estos antecedentes, en este trabajo de Tesis se demostró un
aumento en los niveles retinianos de VEGF, tanto a las 6 como a las 10 semanas post-inyección
de STZ. En retinas de animales diabéticos, el VEGF se localizó preferencialmente en el
pericarion de neuronas de la CCG y en células en la CNI.
En conjunto, estos resultados permitieron caracterizar las alteraciones funcionales, vasculares e
histológicas retinianas en el modelo de retinopatía diabética experimental inducida por STZ. Este
modelo experimental reproduce considerablemente la gran complejidad de esta enfermedad
retiniana multifactorial, análogamente a lo que se observa en pacientes diabéticos. Seguramente
por estas razones, al presente, el tratamiento de la enfermedad tiene un éxito considerablemente
limitado, dado que un tratamiento terapéutico efectivo debería revertir o al menos evitar la
progresión de todas y cada una de estas alteraciones, que probablemente contribuyan
sinérgicamente a la pérdida de visión.
Discusión
144
Los estudios clínicos del efecto de la diabetes sobre la función visual mayoritariamente se han
restringido al análisis a nivel retiniano. Sin embargo, una función visual normal implica
necesariamente la integridad de toda la vía visual en su conjunto. Por lo tanto, la serie de
experimentos que se discutirá a continuación tuvo como objetivo el análisis de la vía visual en el
modelo de diabetes experimental inducido por STZ.
3.2. Alteraciones en la vía visual inducidas por diabetes experimental
En estadíos tempranos de retinopatía diabética se han descripto anormalidades en la función de
la vía visual, como la reducción en la sensibilidad al contraste, la reducción en la amplitud del
ERG pattern y aumento en la latencia de los VEPs, que fueron evidentes en forma previa a las
alteraciones vasculares (Sokol y col., 1985; Bresnick, 1986; Prager y col., 1990; Martinelli y
col., 1992). En este sentido, se ha sugerido que las alteraciones en los VEPs podrían deberse a
cambios en la velocidad de conducción de las fibras del NO (Verrotti y col., 2000). Estudios
morfológicos en autopsias de NOs de pacientes diabéticos han revelado cambios severos en
axones, gliosis y daños vasculares (Giarelli y col., 1986). Sin embargo, al comienzo de este
trabajo sólo se disponía de escasa información respecto a la vía visual en estadíos tempranos de
diabetes. Los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis demuestran por primera vez, un
déficit en el transporte axonal anterógrado y alteraciones axo-gliales en la porción distal del NO
a las 6 semanas de diabetes experimental.
La CTB es un trazador que se une específicamente a receptores de neuronas, es activamente
incorporado y transportado por el citoesqueleto del axón y ha sido ampliamente utilizado en el
estudio de la vía visual (Angelucci y col., 1996; Prichard y col., 2007). Luego de 6 semanas de
diabetes se observó una marcada disminución en los niveles de CTB en las terminales retinianas
a nivel del CS. En concordancia con este resultado, otros autores han descripto cambios en el
transporte retrógrado en estadíos tempranos de diabetes experimental (Ino-Ue y col., 2000). En
conjunto, estos resultados podrían sugerir una “desconexión” entre la retina y el CS en etapas
Discusión
145
tempranas de la enfermedad. En ninguno de los períodos evaluados se observaron alteraciones
neuronales o gliales en el CS, lo que descarta la posibilidad de que la alteración en el transporte
axonal se deba a una degeneración trans-neuronal retrógrada de las CGRs inducida por el daño
de neuronas del CS.
Con el objetivo de identificar el sitio de bloqueo del transporte anterógrado en la vía visual
diabética, se evaluó la citoarquitectura del NO en la porción intraorbital (no mielinizada y
mielinizada) e intracraneal. En la porción distal del NO de animales diabéticos se observó una
caída significativa en el número y el área promedio de los axones, que afectó particularmente a
las fibras de mayor calibre. Las alteraciones axonales observadas en la porción distal del NO
podrían ser responsables de las alteraciones en el trasporte anterógrado de CTB.
Las razones de una susceptibilidad particular de esta región del NO frente al daño diabético son
aún desconocidas. Sin embargo, existe amplia evidencia experimental en favor de que la primera
manifestación morfológica de daño en la vía axonal puede diferir del sitio “original” de daño,
como se observa en la degeneración Walleriana. La axonopatía distal ha sido ampliamente
documentada en modelos de lesión de nervios periféricos. En este contexto, se ha descripto que
el sitio inicial de lesión se encuentra alejado de las primeras alteraciones morfológicas que se
evidencian en el axón. A nivel central, las limitaciones para el análisis de las vías axonales han
dificultado el estudio de la progresión del daño axonal y la participación glial. La vía retino-
colicular ha sido utilizada como modelo para evaluar el daño axonal distal e identificar las
proyecciones de las CGRs. Sin embargo, sólo en los últimos años se ha prestado particular
atención a las distintas poblaciones axonales de proyección y a los centros de inervación
afectados por isquemia retiniana u otras enfermedades oculares. En modelos de isquemia
retiniana aguda se han observado alteraciones en el transporte anterógrado de las CGRs y
disminución de la inervación retiniana del CS, así como alteraciones trans-neuronales que
afectan neuronas de las capas superficiales del CS (Lafuente y col., 2002; Avilés-Trigueros y
col., 2003; Mayor-Torroglosa y col., 2005). Trabajos de Ino-ue y col. (1998a; 1998b y 2000) han
Discusión
146
demostrado cambios en el NO luego de 3 meses de inducción de diabetes experimental en ratas,
con caída en el número de axones y atrofia de las fibras de mayor calibre. En este trabajo de
Tesis se obtuvieron resultados similares, con cambios axonales significativos acompañados de
alteraciones gliales en la porción distal del NO, pero en un estadío considerablemente anterior de
diabetes (6 semanas post-inyección de STZ), en el que aún no se evidenciaron cambios en la
porción proximal del NO o en los somas de las CGRs.
La astrocitosis es una característica común a diversas enfermedades neurodegenerativas, que
llevan a una redistribución del citoesqueleto y en algunos casos, incluso a la proliferación celular
(revisado por Escartin y Bonvento, 2008). Se han demostrado alteraciones axonales y gliales en
nervios periféricos de pacientes diabéticos en estadíos avanzados de la enfermedad (Greene y
col., 1992). En el presente trabajo, se han observado alteraciones gliales a las 6 semanas de
diabetes, que no fueron evidentes en períodos más tempranos. Los resultados obtenidos indican
un aumento marcado en la inmunorreactividad para GFAP, conjuntamente con una disminución
en el número y el área de los axones en la porción distal del NO de animales diabéticos. Dada la
simultaneidad de los fenómenos descriptos, no es posible determinar si las alteraciones gliales,
son causa o consecuencia de las alteraciones axonales.
En la porción proximal del NO, las fibras de las CGRs se mielinizan y continúan hacia el
quiasma óptico. En la porción distal del NO de animales con 6 semanas de diabetes se
observaron alteraciones en la inmunomarcación para MBP, un componente de la mielina
madura, que cumple un rol relevante en la formación y estructura de la vaina de mielina (Shine y
col., 1992). Esta desorganización en la mielina fue confirmada por estudios de MET, en los que
se observó que las principales alteraciones se debieron a desarreglos de la mielina de los axones
de mayor calibre, algunos en vía de degeneración, con la formación frecuente de cuerpos
lamelares.
En algunos casos, luego de una lesión aguda, ocurre un proceso de remielinización mediado por
la activación de progenitores de OL. En estas condiciones, los progenitores de OL responden a
Discusión
147
señales quimioatractantes, migran a la zona que limita con la región dañada, proliferan y forman
nuevos OL que recubren los axones de nueva mielina (Arnett y col., 2004; Bondan y col., 2006).
Sin embargo, este proceso se vuelve progresivamente limitado. En pacientes y en modelos
animales de patologías desmielinizantes como la esclerosis múltiple, se ha demostrado que las
células progenitoras de OL, por razones mayormente desconocidas, pierden gradualmente su
capacidad de formar OL maduros y se acumulan en los bordes de la lesión, como células
aberrantes (revisado por Miron y col., 2011). Luego de 6 semanas de diabetes, en la porción
distal del NO se observó un aumento en la inmunomarcación para O1 y PRGFR-, marcadores
de OL inmaduros y progenitores de OL, respectivamente. En ambos casos se observaron
alteraciones en la morfología celular, con cuerpos hipertrofiados y un aumento en el número de
procesos y desorganización celular. Aún no se dispone de evidencias que permitan elucidar el rol
de estas células en la progresión de la axonopatía distal diabética. Es posible que estas células
contribuyan a una remielinización en períodos más avanzados de la enfermedad, aunque la
morfología celular alterada junto con la expresión de marcadores no característicos de células
progenitoras de OL (como GFAP), sugieren que estas células podrían avanzar hacia un fenotipo
aberrante incapaz de diferenciarse a OL maduros, como se ha observado en otras enfermedades
desmielinizantes (Wolswijk, 1998).
En diversos trabajos se han descripto alteraciones microgliales en retinas de animales diabéticos,
incluso en estadíos tempranos luego de la inyección de STZ (Rungger-Brändle y col., 2000;
Ibrahim y col., 2011). Sin embargo, luego de 6 semanas de diabetes no se observaron cambios en
la morfología de las células microgliales o signos de reactividad microglial. Al presente, no es
posible descartar la posibilidad de que las alteraciones de la microglía ocurran en etapas más
avanzadas de la enfermedad. En suma, estos resultados sugieren que en estadíos tempranos de
diabetes experimental existe un daño axo-glial en la porción distal del NO, que posiblemente sea
responsable de la falla en la comunicación retino-colicular y que precede las alteraciones
observadas en los somas de las CGRs. En este sentido, estos resultados sugieren que las
Discusión
148
alteraciones axo-gliales en la porción distal del NO podrían constituir el primer cambio
estructural en la vía visual inducido por diabetes experimental. Por lo tanto, el déficit visual en
etapas tempranas de la enfermedad, podría ser reducido a través de intervenciones que preserven
la función axonal distal, antes de la pérdida del sustrato neuronal.
3.3. Efecto protector del condicionamiento isquémico
El conjunto de resultados ya discutidos indica que la diabetes experimental (y presumiblemente
también la diabetes humana) induce una notable variedad de alteraciones, tanto a nivel de la
retina como de la vía visual. La hipótesis de trabajo que fundamentó la siguiente serie de
experimentos fue que la inducción de tolerancia isquémica es capaz de prevenir esta gama
diversa de cambios funcionales, vasculares y axo-gliales. Los resultados presentados en este
trabajo de Tesis confirman esta hipótesis y demuestran por primera vez, que la aplicación
semanal de pulsos breves de isquemia que careció de efectos per se, previene el conjunto de
alteraciones retinianas y de la vía visual inducido por diabetes experimental.
La aplicación de pulsos semanales de isquemia previno significativamente las alteraciones
funcionales retinianas (ERG y POs) inducidas por diabetes. De hecho, en retinas de ojos de
animales diabéticos con condicionamiento isquémico, se observó una reversión completa del
daño funcional, dado que se obtuvieron resultados similares a los del grupo control (no
diabético). Asimismo, la aplicación semanal de pulsos de isquemia previno las alteraciones
vasculares observadas en ojos de animales diabéticos con tratamiento simulado, lo que podría
contribuir a una recuperación del desbalance en la homeostasis retiniana. En retinas de ojos con
condicionamiento isquémico se observó una prevención del aumento en la permeabilidad
vascular (evaluado con azul de Evans) y de las alteraciones gliales. Asimismo, la aplicación de
pulsos de isquemia previno la formación de edemas, que pueden contribuir a la extravasación de
albúmina.
Discusión
149
Como ya se mencionó, las alteraciones vasculares, con el consecuente aumento en la
permeabilidad vascular y la formación de edemas, han sido estrechamente asociadas al aumento
en los niveles de VEGF. La aplicación de pulsos de isquemia provocó una disminución
significativa en los niveles de VEGF, lo que sugiere que el condicionamiento isquémico podría
actuar como una terapia anti-VEGF.
En el primer protocolo de condicionamiento isquémico utilizado, los pulsos de isquemia se
aplicaron conjuntamente con la inducción de diabetes experimental. Si bien estos experimentos
tuvieron como objetivo evaluar el efecto del condicionamiento isquémico sobre la progresión de
las alteraciones características de la diabetes, la relevancia clínica de estos resultados es
indudablemente limitada y de valor relativo en cuanto a su eventual transferencia clínica. La
retinopatía diabética en humanos es una neuropatía progresiva. En concordancia, en el modelo de
diabetes experimental inducido por STZ, se identificaron diferentes estadíos de alteración
retiniana, que presentan las siguientes características: i) 3 semanas post-inyección de STZ: sin
cambios retinianos evidentes (RD asintomática); ii) 6-10 semanas post-inyección de STZ:
alteraciones funcionales (ERG, POs) y vasculares (RD moderada); iii) 15 semanas post-
inyección de STZ: progresión de las alteraciones funcionales (ERG, POs y VEPs) y alteraciones
morfológicas (RD avanzada). En base a estas observaciones, se utilizó un protocolo de
aplicación de pulsos de isquemia a partir de la semana 6 post-inyección de STZ, un intervalo en
el que las alteraciones funcionales ya son evidentes. En estas condiciones, la tolerancia
isquémica evitó la progresión del daño funcional en ojos de animales diabéticos. En conjunto,
estos resultados indican que el condicionamiento isquémico previene y evita la progresión del
daño retiniano inducido por diabetes experimental y constituyen la primera evidencia
experimental de que la inducción de tolerancia isquémica es una estrategia de protección
retiniana no sólo frente a una injuria isquémica aguda, sino también frente a un daño crónico y
progresivo.
Discusión
150
Como ya se mencionó, luego de 6 semanas de diabetes no se observaron cambios evidentes en la
morfología retiniana, en particular a nivel de las CGRs. Sin embargo, en este período temprano
de diabetes, se observaron alteraciones en el transporte anterógrado de CTB y daños axo-gliales
en la porción distal del NO. La aplicación de pulsos semanales de isquemia también previno
significativamente estas alteraciones. En la vía visual de ojos de animales diabéticos con
condicionamiento isquémico se observó una marcada preservación del transporte anterógrado de
CTB. Asimismo, se observó una prevención significativa de las alteraciones axonales y gliales
(astrocitos y células del linaje oligodendrocítico) inducida por diabetes, lo que indica que la
tolerancia isquémica evitó el déficit en la comunicación retino-colicular.
Como se mencionó anteriormente, las alteraciones axonales observadas en la porción distal del
NO de animales con 6 semanas de diabetes, en los que no se evidenciaron alteraciones en la
citoarquitectura retiniana, podrían constituir la primera manifestación morfológica de alteración
en la vía visual diabética. Sin embargo, esta evidencia no constituye una demostración formal de
que la porción distal del NO sea el sitio primario de la lesión neuronal que provoca estas
alteraciones. Es posible que una señal subumbral en el soma de las CGRs sea el estímulo que
desencadena un daño inicialmente observable en la porción distal del NO, con la consecuente
degeneración retrógrada hacia el sitio de lesión, de forma tal que el estadío final de la progresión
del daño es la muerte celular. En este sentido, a las 15 semanas de diabetes se observó una
disminución en el número de CGRs y un aumento en el número de células apoptóticas en la
CCG. En este contexto, aún no es posible determinar el sustrato anatómico preciso de la
protección inducida por el condicionamiento isquémico. Sin embargo, considerando que la
aplicación de pulsos de isquemia afecta primariamente a la retina, es posible suponer que la
tolerancia isquémica tiene un efecto directo sobre los cuerpos celulares retinianos, que a su vez,
se manifiesta como una protección a nivel axonal. Por lo tanto, cambios neuroquímicos
retinianos podrían ser responsables del daño neuronal, así como de la protección inducida por el
condicionamiento isquémico. En animales con 6 semanas de diabetes se observó una
Discusión
151
disminución en la actividad de GS, que fue revertida por la aplicación de pulsos semanales de
isquemia. Esto sugiere que la diabetes experimental induce un aumento en los niveles de
glutamato en el espacio sináptico que podría provocar una sobre-estimulación neuronal, con el
consecuente daño por excitotoxicidad, evidenciado inicialmente en la porción distal del NO
diabético. En concordancia con estos resultados, se ha demostrado que el primer cambio evidente
luego de la inyección intravítrea de NMDA ocurre en la porción distal del NO (Saggu y col.,
2008).
Una causa posible del aumento en los niveles de glutamato podría asociarse a una disfunción del
transportador de este neurotransmisor en las células de Müller, análogamente a lo observado en
el modelo de isquemia retiniana aguda. Sin embargo, los antecedentes disponibles al respecto
son controversiales. Por un lado, trabajos de Li y Puro (2002) y Zeng y col. (2010) demuestran
una disfunción significativa en el transportador de glutamato en células de Müller aisladas de
retinas de animales diabéticos a intervalos tempranos luego de la inyección de STZ.
Contrariamente, Ward y col. (2005) demostraron un aumento en la actividad del transportador de
glutamato (evaluado a través de la captación de D-aspartato) en ratas diabéticas, en tanto que
Mysona y col. (2009) no observaron cambios en la actividad del transportador inducidos por la
hiperglucemia. En este trabajo de Tesis, no se observaron diferencias en el influjo de glutamato
en retinas de ojos de animales con 6 semanas de diabetes, sin o con condicionamiento isquémico.
Posiblemente, la utilización de distintos métodos de evaluación de la actividad del transportador,
así como la preparación utilizada y las condiciones en las que se realizaron los experimentos,
podrían explicar esta controversia. Existe mayor consenso respecto a la disfunción temprana de
la GS inducida por diabetes experimental. En períodos tempranos de diabetes experimental, se ha
observado una disminución significativa en la actividad y en los niveles del ARN mensajero
(estudios de real-time PCR) de GS e incluso se ha sugerido su utilización como posible
biomarcador para evaluar la severidad y la progresión de la retinopatía diabética (Lieth y col.,
1998; Yu y col., 2009; El-Remessy y col., 2010). Por lo tanto, el hecho de que la tolerancia
Discusión
152
isquémica indujera una recuperación total de la actividad de esta enzima podría ser un aspecto
central en el mecanismo de protección inducido por los pulsos breves de isquemia.
Seki y col. (2004) demostraron una disminución en los niveles de BDNF (a nivel de ARN
mensajero y la proteína) en células de la retina interna y en células de Müller en estadíos
tempranos de diabetes experimental. La aplicación de pulsos de isquemia evitó la caída en los
niveles de BDNF en la retina interna inducida por diabetes, aunque estos cambios fueron
evidentes a las 10 (y no a las 6) semanas post-inyección de STZ. Considerando la disminución en
la inmunorreactividad para BDNF observada en los somas de las CGRs, es posible que esta caída
se deba a una falla en el transporte retrógrado y a la pérdida de axones que afectan la llegada de
la neurotrofina al soma neuronal. Sin embargo, la recuperación inducida por el condicionamiento
isquémico sobre los niveles de BDNF en células de la retina interna y células de Müller parece
indicar que el efecto de los pulsos de isquemia podría ocurrir también a nivel local y
simultáneamente en distintos tipos celulares. Harada y col. (2011) han demostrado que el BDNF
en células de Müller induce la expresión de otros factores neurotróficos que afectan la
supervivencia de las CGRs. En conjunto, estos resultados sugieren que el condicionamiento
isquémico podría tener un efecto directo sobre los somas de las CGRs, y a su vez (en forma
paralela o secuencial), podría actuar sobre las células de Müller, induciendo un aumento en la
expresión de BDNF, y con ello contribuir a la neuroprotección de las CGRs.
Diversas líneas experimentales sugieren que la tolerancia isquémica, inducida por PCI o PostC,
es un fenómeno de adaptación frente al daño isquémico previo o subsecuente, que provee una
protección altamente significativa al evitar o prevenir la neurodegeneración. La eficacia de
mecanismos de inducción de tolerancia isquémica se ha evaluado sobre diversas poblaciones
neuronales, como neuronas de la región CA1 del hipocampo, neuronas piramidales de la corteza
cerebral o neuronas retinianas (Wang y col., 2008; Brandt y col., 2011) e incluso a nivel
sináptico (Hogins y col., 2011). Sin embargo, no existía evidencia directa acerca del efecto
protector del condicionamiento isquémico sobre la capacidad de inducir protección a nivel
Discusión
153
axonal. Los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis sugieren que la diabetes experimental
inducida por STZ podría constituir un modelo de utilidad para evaluar las alteraciones axonales
distales, así como para el desarrollo de posibles estrategias terapéuticas.
En base a los resultados obtenidos en este trabajo, es posible suponer que frente al daño inducido
por diabetes experimental, el condicionamiento isquémico desencadena una serie compleja de
eventos que se representan en la Figura 56. En este contexto, la tolerancia isquémica podría
ejercer un efecto directo sobre las CGRs y células de la CNI, a través de la prevención del
aumento en la expresión de VEGF inducido por diabetes, lo que podría evitar o reducir las
alteraciones vasculares características de la diabetes (como el aumento en la permeabilidad
vascular y la formación de edemas), que a su vez podrían evitar las alteraciones en los astrocitos,
reduciendo así el daño vascular y neuronal. Alternativamente, la aplicación de pulsos de
isquemia podría afectar en forma directa a los astrocitos, impidiendo el desarrollo de las
alteraciones vasculares. El efecto del condicionamiento isquémico sobre las CGRs se evidenció
además, a través de la recuperación del transporte anterógrado y del daño axonal temprano. De
esta forma, la prevención del daño axonal podría evitar las alteraciones gliales (astrocitos y
células del linaje oligodendrocítico) observadas en la porción distal del NO de ojos de animales
diabéticos con tratamiento simulado. Por otra parte, los pulsos de isquemia podrían afectar a las
células de Müller, modulando la actividad de GS, con la consecuente prevención del daño por
sobre-estimulación glutamatérgica, y por otro lado, estimular la síntesis de BDNF, que a su vez,
contribuye a la supervivencia de las CGRs.
Discusión
154
Figura 56. Modelo propuesto para los posibles mecanismos involucrados en la protección desencadenada por el
condicionamiento isquémico frente al daño inducido por diabetes experimental. Las líneas punteadas representan los
posibles blancos celulares del condicionamiento isquémico. (*) Otros autores han sugerido que el aumento en los
niveles de calcio intracelular causado por la sobre-activación glutamatérgica, podría desencadenar una cascada de
eventos que incluyen el aumento en la producción de VEGF en CGRs (Xu y col., 2004). La reversión inducida por el
condicionamiento isquémico de la disminución de la actividad de GS observada en retinas de animales con 6
semanas de diabetes, podría contribuir a disminuir la excitotoxicidad, y a su vez, los niveles de VEGF en las CGRs.
Como se mencionó repetidamente, la disfunción visual asociada a la diabetes involucra una serie
compleja de fenómenos que afectan distintos blancos moleculares y celulares. Considerando que
la tolerancia isquémica previene el daño diabético, no resulta sorprendente que los eventos
involucrados en la protección constituyan también un conjunto complejo de fenómenos. Todavía
no estamos en condiciones de establecer un orden secuencial de los eventos involucrados y de
hecho, aún desconocemos si efectivamente existe un orden secuencial o se trata de un conjunto
de epifenómenos que ocurren en forma paralela. Una reflexión similar es aplicable a la
retinopatía diabética en sí, para la que si bien se ha elucidado con cierto grado de detalle el curso
temporal de las alteraciones, no existen pruebas concluyentes respecto a la causalidad relativa de
estos cambios. De hecho, un número considerable de alteraciones ocurren en forma simultánea,
Discusión
155
al menos para la escala temporal analizada en este trabajo. Sin embargo, es indiscutible que todas
las alteraciones inducidas por diabetes experimental contribuyen significativamente a la
disfunción visual y que la prevención de todas estas alteraciones es un requisito sine que non
para un tratamiento exitoso de la enfermedad. En este contexto, aun cuando son muchos los
interrogantes que quedaron sin responder, el conjunto de resultados obtenidos en este trabajo de
Tesis indican que la inducción de tolerancia isquémica inducida a través de una manipulación
inocua per se, previene el complejo conjunto de alteraciones inducidas por la diabetes
experimental, tanto a nivel funcional, como vascular y morfológico.
Aunque no se dispone de estadísticas actualizadas en nuestro país, la retinopatía diabética es la
lesión retiniana que más frecuentemente requiere tratamiento oftalmológico. La terapéutica
disponible no ha alcanzado un éxito razonable más allá de evitar la progresión de la disfunción.
Además, una consecuencia probable de la progresión de la enfermedad es la ceguera total e
irreversible. La posibilidad de desarrollar con éxito nuevas estrategias terapéuticas para el
tratamiento de esta enfermedad podría beneficiar a toda la población que padece este tipo de
afección, así como a su entorno familiar y social. Si bien los resultados obtenidos en este trabajo
de Tesis en su estado actual son intransferibles a la Oftalmológica Clínica, la identificación de
los mecanismos involucrados en la tolerancia isquémica, podría permitir en un futuro no lejano
reproducir farmacológicamente el efecto protector. En este sentido, la inducción de tolerancia
isquémica podría constituir una futura avenida fértil para el desarrollo de terapias de nueva
generación en el tratamiento de esta disfunción visual prevalente e invalidante.
4. Efecto de la diabetes sobre el sistema visual no formador de imagen
El conjunto de hallazgos descriptos en las secciones anteriores demuestra que la diabetes
experimental provoca cambios altamente significativos en la retina y la vía visual, que fueron
evidentes incluso en estadíos relativamente tempranos de la enfermedad e incluyen la muerte de
CGRs por apoptosis en etapas más avanzadas.
Discusión
156
Además de su función como “órgano de la visión”, en la última década se ha identificado y
caracterizado el circuito neuronal a través del cual el ojo actúa además como un sensor de luz
ambiental, incluso en ausencia de percepción visual consciente. Estas funciones visuales, como
la regulación de los ritmos circadianos, la supresión fótica de la síntesis de melatonina pineal o el
reflejo pupilar, entre otras, están controladas por una sub-población de CGRs, que expresan un
fotopigmento retiniano novel, la melanopsina. Las CGRifs proyectan principalmente a los NSQ
y están involucradas en la modulación de los ritmos circadianos (Berson y col., 2002; Lucas y
col., 2003; Hattar y col., 2006). Considerando el rol fundamental de la información fótica en la
regulación del sistema visual no formador de imagen, es de indudable interés determinar cómo
las enfermedades oftalmológicas pueden afectar a estas funciones visuales. Sin embargo, la gran
mayoría de los estudios sobre la retinopatía diabética se han centrado en las CGRs que participan
en las funciones visuales conscientes, en tanto que el efecto de la diabetes sobre el sistema visual
no formador de imágenes ha recibido comparativamente menor atención. En este sentido, la
mayoría de los trabajos relacionados con esta temática han sido publicados más de 10 años atrás.
Estas evidencias experimentales han demostrado anormalidades en el ritmo circadiano de
diversos procesos fisiológicos (como en los niveles de corticosterona o melatonina pineal) y
conductuales (actividad locomotora o patrón de ingesta) en pacientes diabéticos, así como en
modelos de diabetes experimental (Velasco y col., 1988; Shimomura y col., 1990; Van Cauter y
col., 1997). A diferencia de otras enfermedades oculares, la influencia de la diabetes sobre el
sistema circadiano podría ser doble ya que podría ejercer un impacto a través de la pérdida de
CGRifs y además, podría tener un efecto directo sobre el reloj central o las vías eferentes. Si
bien, como ya se discutió, en estadíos avanzados de diabetes experimental (15 semanas) se
observó una caída significativa en el número de CGRs, alteraciones en el transporte anterógrado
y daño en la porción distal del NO, en estos estudios no se examinó si el tipo particular de
CGRifs era igual o diferencialmente susceptible a los efectos de la diabetes.
Discusión
157
En forma más reciente, se han descripto cambios en el árbol dendrítico de las CGRs
melanopsina(+) en ratones diabéticos (Gastinger y col., 2008), así como alteraciones en el reflejo
pupilar en pacientes con retinopatía diabética (Bughi y col., 2006), aunque el vínculo directo
entre la diabetes, las CGRifs y la fisiología circadiana no había sido hasta ahora exhaustivamente
analizado. Por lo tanto, la serie de experimentos que se discutirán a continuación se realizó con
el fin de evaluar el sistema visual no formador de imagen en un estadío avanzado de diabetes
experimental, en el cual se observaron alteraciones considerables en la retina y la vía visual.
Luego de 15 semanas de diabetes, paralelamente a una clara disminución en la marcación para
CTB a nivel del CS, se observó una preservación completa del patrón de inervación de CTB en
núcleos visuales no formadores de imagen, como los NSQ y el NOP, lo que podría indicar una
preservación preferencial de las proyecciones de las CGRifs frente al daño inducido por diabetes.
Estudios realizados por Trejo y Cicerone (1984) en ratas han demostrado que las neuronas que
inervan el NOP presentan una velocidad de conducción lenta (~ 3 m/s) y corresponderían a fibras
de menor calibre. En NOs de animales con 15 semanas de diabetes se observó una preservación
de las fibras de menor calibre (datos no mostrados), lo que sugiere que el tamaño de las fibras
podría constituir una “explicación anatómica” para la susceptibilidad diferencial de los axones de
las CGRifs. En cuanto a los cambios a nivel retiniano, se evaluó el estado de las CGRs
melanopsina(+) a las 15 semanas de diabetes, período en el que se observó una caída
significativa en el número de CGRs Brn3a(+). Recientemente se ha demostrado que la sub-
población de CGRifs son células que no expresan la proteína Brn3a (Jain y col., 2012).
Considerando que el porcentaje de CGRifs es muy pequeño (1- 2%) comparado con el resto de la
población de CGRs, esta evidencia no contradice el hecho de la proteína Brn3a sea un marcador
ampliamente utilizado para la evaluación de CGRs. Al presente, se han identificado 5 sub-
poblaciones de CGRifs (Ecker y col., 2010). Las células mejor caracterizadas son las M1, que
poseen un árbol dendrítico abundante con estratificación en la subcapa OFF de la CPI y las M2
con estratificación en la sub-lámina ON de la CPI, en tanto que las M3 presentan dendritas que
Discusión
158
llegan a ambas sub-láminas de la CPI. Además, se han descripto sub-poblaciones M4 y M5, pero
la información respecto a estas neuronas fotosensibles es aún escasa. Las células M1 presentan
un alto nivel de expresión de melanopsina y por ello, la utilización de anticuerpos anti-
melanopsina permite detectar mayoritariamente este subtipo celular, y en menor medida a las
células M2. Además, las células M1 constituyen el principal input retiniano de los NSQ y el
NOP (Ecker y col., 2010). En retinas de animales con 15 semanas de diabetes se observó una
preservación de las CGRifs, sin cambios en el número de células. En concordancia con este
resultado, no se observaron diferencias en los niveles proteicos de melanopsina. En conjunto,
estos resultados demuestran que tanto los cuerpos neuronales y los niveles de melanopsina, como
las proyecciones axonales de estas células, se encuentran preservados en estadíos avanzados de
diabetes. Por lo tanto, la siguiente serie de experimentos tuvo por objetivo evaluar el estado
funcional de la conexión entre las CGRifs y neuronas de los NSQ, el principal núcleo de
proyección de las CGRifs. Para ello, se utilizó como herramienta la expresión de cFos en los
NSQ inducida por un pulso de luz. Múltiples pruebas experimentales demuestran que la
exposición a un pulso de luz induce un rápido aumento en los niveles de la proteína c-Fos en
neuronas de la porción retino-receptiva (región ventro-lateral) de los NSQ (Rea, 1989; Edelstein y
col., 2000). Esta proteína participa en la regulación temprana de la transcripción génica mediada
por la cascada de señales que se disparan frente a un estímulo externo (Marx, 1987; Sheng y
Greenberg, 1990). En este sentido, se ha demostrado que la administración de un oligonucleótido
antisentido que bloquea la expresión de c-Fos, inhibe la respuesta inducida por un pulso de luz
en animales en libre curso (Wollnik y col., 1995). Yamanouchi y col. (1997) demostraron una
disminución significativa en el aumento de expresión de c-Fos inducida por un pulso de luz en
los NSQ de ratas con 2 meses de diabetes. Sin embargo, estos autores reconocen que dada la
posible influencia de las cataratas sobre la entrada de luz, no les fue posible determinar el
mecanismo responsable de esta alteración. Además, cabe señalar que este trabajo fue publicado
en forma previa a la identificación y caracterización de las CGRifs. En este trabajo de Tesis, se
Discusión
159
obtuvieron resultados similares en cuanto a la respuesta de los NSQ a un pulso de luz, pero se
profundizó el análisis al evaluar el estado de las CGRifs y de las vías de conexión con los NSQ
en animales con lentectomía. En animales sometidos a lentectomía luego de 6 semanas de
diabetes y expuestos a un pulso de luz a las 8 semanas post-cirugía, se observó una reversión
completa de la disminución en el número de neuronas c-Fos(+) en los NSQ frente a un pulso de
luz observada en animales diabéticos sin remoción del cristalino.
La vía central de conexión nerviosa responsable del reflejo pupilar ha sido motivo de extensa
investigación, dada la ventaja que ofrece este circuito para evaluar en forma no invasiva la
función visual y neurológica. El iris está inervado por terminales axonales cuyos cuerpos
celulares se encuentran en el ganglio ciliar que está inervado por el núcleo de Edinger-Westphal.
Aún existe controversia respecto al patrón de inervación de este núcleo y se han observado
diferencias entre especies. En roedores, cada núcleo de Edinger-Westphal recibe inervación
bilateral del NOP y a su vez, cada NOP recibe inervación retiniana de ambos ojos. Este patrón de
inervación es crítico para el reflejo pupilar consensual (revisado por Young y Lund, 1998).
Como se mencionó anteriormente, no se observaron alteraciones en el patrón de proyección
retiniana a nivel del NOP en animales diabéticos. Por lo tanto, para la evaluación del estado
funcional de la conexión entre las CGRifs y neuronas del NOP, se examinó el reflejo pupilar
consensual. En animales con 6 ó 10 semanas de diabetes (intervalos en los que aún no se han
desarrollado cataratas) no se observaron diferencias en la contracción del iris inducida por un
pulso de luz brillante, lo que sugiere que la conexión morfológica y funcional entre la retina y el
NOP se encuentra preservada del daño diabético, al menos en los períodos analizados.
En animales con 15 semanas de diabetes no se observaron diferencias en los niveles de los
pigmentos visuales rodopsina y melanopsina, presentes en FR y CGRifs, respectivamente, que
participan en el reflejo pupilar. Estos resultados son compatibles con lo observado en el análisis
del reflejo pupilar; sin embargo, es necesario remarcar que en estos intervalos, la función
retiniana, evaluada a través del ERG, se encontró significativamente disminuida en retinas de
Discusión
160
animales diabéticos. Si bien no se dispone de una interpretación clara de esta discrepancia, la
preservación de los niveles de melanospina y el número de CGRifs observada en animales
diabéticos podría indicar que en las condiciones evaluadas, las CGRifs desempeñan un rol
preponderante en el reflejo pupilar. En este sentido, se demostró un reflejo pupilar prácticamente
inalterado en animales con degeneración completa de los FR clásicos (Lucas y col., 2003).
Las variaciones en la luz ambiental representan una señal clave para la sincronización de los
ritmos circadianos. Luego de 10 - 15 semanas de diabetes, los animales presentaron ritmos de
actividad locomotora sincronizados con el ciclo de 24 h en forma similar a los animales control,
con la salvedad de una alteración significativa en el ángulo de fase (inicio de la actividad tras el
apagado de la luz). Estos resultados fueron similares a los obtenidos previamente por Shimazoe y
col. (2000) en ratas con 8 semanas de diabetes. Dado que la diabetes es una enfermedad con
múltiples manifestaciones sistémicas, los cambios en el ángulo de fase (que no fueron afectados
por la remoción de las cataratas) podrían ser una consecuencia del daño que provoca esta
enfermedad sobre los NSQ, o bien, sobre las vías de entrada yo salida del reloj central. Los
animales con 15 semanas de diabetes fueron capaces de resincronizar el ritmo de actividad
locomotora luego de un cambio de fase de 4 h, aunque el tiempo necesario para la
resincronización fue significativamente mayor que en los controles. En animales diabéticos con
lentectomía se observó una recuperación parcial, pero significativa de este parámetro, lo que
sugiere la participación de un “componente ocular” en esta alteración, más allá de otras
alteraciones sistémicas. Si bien no se realizó un análisis exhaustivo de la citoarquitectura de los
NSQ, estos resultados sugieren que luego de 15 semanas de diabetes la vía de entrada y la
respuesta post-sináptica se encuentran considerablemente preservadas. En concordancias con
estos resultados, Shimazoe y col. (2000) demostraron que luego de 2 meses de diabetes, la tasa
de disparo de potenciales de acción de neuronas de los NSQ tras un retraso de fase inducido
farmacológicamente por glutamato, no difiere de la observada en animales control.
Discusión
161
En pacientes diabéticos, la incidencia de cataratas es elevada y de una rápida progresión.
Diversos estudios realizados en pacientes con cataratas han demostrado alteraciones en la
sincronización de los ritmos circadianos y en la arquitectura del sueño (Brøndsted y col., 2011,
Kessel y col., 2011). Recientemente, Schmoll y col. (2011) demostraron trastornos en tareas
cognitivas en pacientes con cataratas, que son revertidas por la cirugía. Los resultados obtenidos
en este trabajo de Tesis, indican que la opacidad del cristalino afecta las funciones visuales no
formadoras de imagen, a pesar de la preservación del sistema neuronal. Se ha propuesto que la
opacidad del cristalino reduce la entrada de luz, en particular en el espectro del azul, afectando
preponderantemente a la melanopsina (Kessel y col., 2010), una hipótesis que ha sido al menos
indirectamente confirmada por los resultados obtenidos en este trabajo.
En un trabajo reciente se realizó un análisis oftalmológico prospectivo durante 10 años en el que
se demostró un aumento significativo en la agudeza visual luego de la remoción del cristalino en
pacientes diabéticos (Ostri y col., 2011). De esta forma, la cirugía de cataratas, una intervención
relativamente sencilla y sin efectos adversos considerables, plantea la posibilidad de mejorar
considerablemente no sólo la función visual formadora de imágenes, sino también restaurar las
alteraciones del sistema visual no formador de imagen inducidas por la diabetes, y con ello, la
calidad de vida de los pacientes.
Es necesario señalar que los resultados obtenidos en el estudio del efecto de la diabetes sobre el
sistema visual no formador de imagen, fueron sorprendentes. Considerando el conjunto de
alteraciones de la retina, la vía visual y el complejo conjunto de efectos sistémicos de la
enfermedad, resultaba esperable una alteración significativa también extensible a este sistema,
que como ya se mencionó, no había sido previamente analizado en detalle. Siguiendo la línea
argumental de este trabajo, la idea original era caracterizar estas alteraciones y evaluar los
efectos del condicionamiento isquémico sobre este sistema particular. Si bien no puede
descartarse que estos cambios puedan ocurrir en etapas aún más avanzadas de la enfermedad, los
circuitos CGRifs-NSQ y CGRifs-NOP resultaron considerablemente “insensibles” a la diabetes,
Discusión
162
en intervalos en los que ya tuvieron lugar alteraciones muy notables a nivel retiniano y en la vía
visual.
La amplia diversidad de las CGRs permite suponer que diferencias en la expresión de proteínas o
enzimas permitan a un tipo celular ser más resistente frente a un daño. A modo de ejemplo, se ha
demostrado que CGRs con altos niveles de citocromo oxidasa son más resistentes frente al daño
retiniano (von Bussmann y col., 1993). Asimismo, Li y col. han demostrado que las CGRifs son
más resistentes que el resto de las CGRs frente a un daño por lesión del NO o por hipertensión
ocular, presumiblemente a través de un aumento en la expresión de la vía de supervivencia
celular mediada por fosfatidil-inositol 3-quinasa (PI3K)/ proteína quinasa B (Akt) (Li y col.,
2008). En el terreno de la mera especulación, estos resultados podrían interpretarse a la luz de la
función central del sistema circadiano a nivel fisiológico y conductual. Las CGRifs forman parte
de un circuito neuronal evolutivamente conservado y con una alta jerarquía en la organización
fisiológica. Es posible que el hecho de que los componentes del sistema circadiano retiniano sean
más robustos y redundantes que otros tipos celulares, permita garantizar una mayor resistencia y
una organización circadiana adecuada y funcional aun frente a las alteraciones metabólicas,
vasculares y neurales provocadas por la diabetes.
EPÍLOGO
¿Qué sabemos ahora que no sabíamos cuando empezamos esta tesis?
En el transcurso de este trabajo de Tesis, hemos logrado avances originales y de consideración
en la comprensión de los mecanismos involucrados en la lesión retiniana inducida por isquemia
aguda y por diabetes, así como en la posibilidad de prevenir ambos procesos a través de la
inducción de tolerancia isquémica. Asimismo, hemos demostrado que las CGRifs en particular, y
el sistema no formador de imagen en general, tienen una menor susceptibilidad al daño
diabético, lo que representa una valiosa pieza de información respecto a este sistema no canónico
de transducción de la información luminosa. Otro aspecto central que hemos aprendido a lo largo
Discusión
163
de estos años, tiene que ver con la génesis del conocimiento científico en sí, porque
paradójicamente, esta Tesis ha generado un número mayor de interrogantes que aquellos que
logramos responder. Quizás el desarrollo científico sea ese devenir que implica cerrar algunas
puertas, con la condición inexorable de abrir nuevas puertas cada vez. Por ello, si bien los
resultados obtenidos satisficieron considerablemente los objetivos que nos propusimos al inicio,
las perspectivas futuras de esta línea de trabajo podrían ser tan inciertas (la incertidumbre es una
condición intrínseca al desarrollo científico) como estimulantes, frente al profundo deseo de
contribuir a mejorar la calidad de vida y preservar la visión de quienes podrían padecer por no
tenerla.
Conclusiones
164
CONCLUSIONES
La isquemia retiniana aguda (40 min) indujo cambios significativos a nivel funcional y
morfológico, que fueron revertidos por la aplicación de PostC (aplicación de ciclos de
isquemia/reperfusión al inicio de la reperfusión).
La síntesis proteica, en una ventana temporal estrecha, participa del mecanismo protector
desencadenado por el PostC y la iNOS podría ser una proteína clave en este mecanismo.
El daño isquémico es mediado, al menos en parte, por un aumento en las concentraciones
sinápticas de glutamato y el PostC podría proteger del daño isquémico revirtiendo este
efecto.
La diabetes experimental inducida por la inyección de STZ provocó cambios funcionales,
vasculares y morfológicos significativos a nivel retiniano. Se observó un fenómeno de
progresión del daño retiniano diabético, en el que las alteraciones funcionales precedieron a
los cambios morfológicos.
El aumento en los niveles de VEGF retiniano podría constituir una pieza clave en el daño
diabético.
En estadíos tempranos de diabetes experimental, se observaron alteraciones axo-gliales en la
porción distal del NO, que podrían constituir el primer cambio estructural en la vía visual
inducido por diabetes experimental.
El condicionamiento isquémico (pulsos semanales de isquemia) revirtió las alteraciones
observadas en la retina y la vía visual diabética.
En etapas tempranas de diabetes se observó una disminución significativa de la actividad de
GS.
La aplicación semanal de pulsos de isquemia revirtió significativamente el aumento en los
niveles de VEGF y la disminución en la actividad de GS inducidos por diabetes.
En etapas avanzadas de diabetes experimental de observó una preservación de las CGRifs en
particular, y el sistema visual no formador de imagen en general.
Referencias
165
REFERENCIAS
Abrahamson EE, Moore RY. Suprachiasmatic nucleus in the mouse: retinal innervation, intrinsic
organization and efferent projections. Brain Res 916(1-2):172-91, 2001.
Abukawa H, Tomi M, Kiyokawa J, Hori S, Kondo T, Terasaki T, Hosoya K. Modulation of retinal
capillary endothelial cells by Müller glial cell-derived factors. Mol Vis 15:451-7, 2009.
Aiello LP, Avery RL, Arrigg PG, Keyt BA, Jampel HD, Shah ST, Pasquale LR, Thieme H, Iwamoto MA,
Park JE y col. Vascular endothelial growth factor in ocular fluid of patients with diabetic
retinopathy and other retinal disorders. N Engl J Med 1;331(22):1480-7, 1994.
Alvarado JC, Stanford TR, Rowland BA, Vaughan JW, Stein BE. Multisensory integration in the superior
colliculus requires synergy among corticocollicular inputs. J Neurosci 20:29(20):6580-92, 2009.
Amara SG y Fontana ACK. Excitatory amino acid transporters: keeping up with glutamate,
Neurochemistry International 41:313-318, 2002.
Ambati J, Chalam KV, Chawala DK, D'Angio CT, Guillet EG, Rose SJ, Vanderlinde RE, Ambati BK.
Elevated け-aminobutyric acid, glutamate, and vascular endothelial growth factor levels in the
vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy. Archives of Ophthalmology
115(9):1161–1166, 1997.
Anderson SM, Swanson RA. Astrocyte glutamate transport: Review of properties, regulation, and
physiological functions, Glia 32:1-14, 2000.
Angelucci A, Clascá F, Sur M. Anterograde axonal tracing with the subunit B of cholera toxin: a highly
sensitive immunohistochemical protocol for revealing fine axonal morphology in adult and
neonatal brains. J Neurosci Methods 65:101-12, 1996.
Antonetti DA, Barber AJ, Hollinger LA, Wolpert EB, Gardner TW. Vascular endothelial growth factor
induces rapid phosphorylation of tight junction proteins occludin and zonula occluden 1. A
potential mechanism for vascular permeability in diabetic retinopathy and tumors. J Biol Chem
13:274(33):23463-7, 1999.
Arevalo JF, Fromow-Guerra J, Quiroz-Mercado H, Sanchez JG, Wu L, Maia M, Berrocal MH, Solis-
Vivanco A, Farah ME. Pan-American Collaborative Retina Study Group. Primary intravitreal
Referencias
166
bevacizumab (Avastin) for diabetic macular edema: results from the Pan-American Collaborative
Retina Study Group at 6-month follow-up. Ophthalmology 114:743-750, 2007.
Arjamaa O, Nikinmaa M. Oxygen-dependent diseases in the retina: role of hypoxia-inducible factors. Exp
Eye Res 83(3):473-83, 2006.
Arnett HA, Fancy SPJ, Alberta JA, Zhao C, Plant SR, Kaing S, Raine CS, Rowitch DH, Franklin RJ,
Stiles CD. bHLH transcription factor Olig1 is required to repaired myelinated lesions in the CNS.
Science 306:2111-15, 2004.
Aschoff J. Exogenous and endogenous components in circadian rhythms. Cold Spring Harb Symp Quant
Biol 25:11-28, 1960.
Asnaghi V, Gerhardinger C, Hoehn T, Adeboje A, Lorenzi M. A role for the polyol pathway in the early
neuroretinal apoptosis and glial changes induced by diabetes in the rat. Diabetes 52:506-511,
2003.
Attwell D, Barbour B, Szatkowski M. Nonvesicular release of neurotransmitter. Neuron 11:401-407,
1993.
Avilés-Trigueros M, Mayor-Torroglosa S, García-Avilés A, Lafuente MP, Rodríguez ME, Miralles de
Imperial J, Villegas-Pérez MP, Vidal-Sanz M. Transient ischemia of the retina results in massive
degeneration of the retinotectal projection: long-term neuroprotection with brimonidine. Exp
Neurol 184(2):767-77, 2003.
Bak LK, Schousboe A, Waagepetersen HS. The glutamate/GABA-glutamine cycle: aspects of transport,
neurotransmitter homeostasis and ammonia transfer. J Neurochem 98(3):641-53, 2006.
Baker GE. Prechiasmatic reordering of fibre diameter classes in the retinofugal pathway of the ferret. Eur
J Neurosci 2: 24–33, 1990.
Bal-Price A, Brown GC. Inflammatory neurodegeneration mediated by nitric oxide from activated glia-
inhibiting neuronal respiration, causing glutamate release and excitotoxicity. J Neurosci
1;21(17):6480-91, 2001.
Bancroft JD, Stevens A. Theory and practice of histological techniques. Churchill Livingstone. 1990.
Referencias
167
Barber AJ, Antonetti DA, Gardner TW. Altered expression of retinal occludin and glial fibrillary acidic
protein in experimental diabetes. The Penn State Retina Research Group. Invest Ophthalmol Vis
Sci 41:3561-3568, 2000.
Barber AJ, Lieth E, Khin SA, Antonetti DA, Buchanan AG, Gardner TW. Neural apoptosis in the retina
during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. J Clin Invest 102:783-
791, 1998.
Barnett NL, Pow DV, Bull ND. Differential perturbation of neuronal and glial glutamate transport
systems in retinal ischaemia. Neurochem Int 39:291–299, 2001.
Berson DM, Dunn FA, Takao M. Phototransduction by retinal ganglion cells that set the circadian clock.
Science 295(5557):1070-1073, 2002.
Bhutto IA, Amemiya T. Microvascular architecture of the rat choroid: corrosion cast study. Anat Rec
264(1):63-71, 2001.
Bloodworth JMB. Diabetic retinopathy. Diabetes 2:1–22, 1962.
Bonanomi D, Rusconi L, Colombo CA, Benfenati F, Valtorta F. Synaptophysin I selectively specifies the
exocytic pathway of synaptobrevin 2/VAMP2. Biochem J 404(3):525–534, 2007.
Bondan EF, Lallo MA, Trigueiro AH, Ribeiro CP, Sinhorini IL, Graça DL. Delayed Schwann cell and
oligodendrocyte remyelination after ethidium bromide injection in the brainstem of Wistar rats
submitted to streptozotocin diabetogenic treatment. Braz J Med Biol Res 39:637-46, 2006.
Boycott BB, Wassle H. The morphological types of ganglion cells of the domestic cat’s retina. J Physiol
(Lond) 240: 397–419, 1974.
Brandt SK, Weatherly ME, Ware L, Linn DM, Linn CL. Calcium preconditioning triggers
neuroprotection in retinal ganglion cells. Neuroscience 13(172):387-97, 2011.
Bresnick GH. Diabetic retinopathy viewed as a neurosensory disorder. Arch Ophthalmol 104:989-90,
1986.
Bringmann A, Pannicke T, Grosche J, Francke M, Wiedemann P, Skatchkov SN, Osborne NN,
Reichenbach A. Müller cells in the healthy and diseased retina. Prog Retin Eye Res 25(4):397-
424, 2006.
Referencias
168
Brøndsted AE, Lundeman JH, Kessel L. Short wavelength light filtering by the natural human lens and
IOLs - implications for entrainment of circadian rhythm. Acta Ophthalmol doi: 10.1111/j.1755-
3768.2011.02291, 2011.
Brown TM, Gias C, Hatori M, Keding SR, Semo M, Coffey PJ, Gigg J, Piggins HD, Panda S, Lucas RJ.
Melanopsin contributions to irradiance coding in the thalamo-cortical visual system. PLoS Biol
7:8(12):e1000558, 2010.
Brown TM, Wynne J, Piggins HD, Lucas RJ. Multiple hypothalamic cell populations encoding distinct
visual information. J Physiol 1:589(5):1173-94, 2011.
Bughi S, Shaw S, Bessman A. Laser damage to retinal ganglion cells: the effect on circadian rhythms. J
Diabetes Complications 20(3):184-7, 2006.
Burda J, Danielisova V, Nemethova M, Gottlieb M, Matiasová M, Domoráková I, Mechírová E, Feriková
M, Salinas M, Burda R. Delayed postconditioning initiates additive mechanism necessary for
survival of selectively vulnerable neurons after transient ischemia in rat brain. Cell Mol
Neurobiol 26(7–8):1141–1151, 2006.
Busija DW, Lacza Z, Rajapakse N, Shimizu K, Kis B, Bari F, Domoki F, Horiguchi T. Targeting
mitochondrial ATP-sensitive potassium channels--a novel approach to neuroprotection. Brain Res
Brain Res Rev 46(3):282-94, 2004.
Caldwell RB, Slapnick SM. Freeze-fracture and lanthanum studies of the retinal microvasculature in
diabetic rats. Invest Ophthalmol Vis Sci 33:1610-1619, 1992.
Cazevieille C, Osborne NN. Retinal neurones containing kainate receptors are influenced by exogenous
kainate and ischaemia while neurones lacking these receptors are not: melatonin counteracts the
effects of ischaemia and kainate. Brain Res 755: 91–100, 1997.
Chaudhry FA, Reimer RJ, Edwards RH. The glutamine commute: take the N line and transfer to the A.
The Journal of Cell Biology 157(3):349-355, 2002.
Cheung MM, Kharbanda RK, Konstantinov IE, Shimizu M, Frndova H, Li J, Holtby HM, Cox PN,
Smallhorn JF, Van Arsdell GS, Redington AN. Randomized controlled trial of the effects of
remote ischemic preconditioning on children undergoing cardiac surgery: first clinical application
in humans. J Am Coll Cardiol 6;47(11):2277-82, 2006.
Referencias
169
Cooper ML, Pettigrew JD. The decussation of the retinothalamic pathway in the cat, with a note on the
major meridians of the cat’s eye. J Comp Neurol 187: β85–311, 1979.
Crish SD, Sappington RM, Inman DM, Horner PJ, Calkins DJ. Distal axonopathy with structural
persistence in glaucomatous neurodegeneration. Proc Natl Acad Sci 16:107(11):5196-201, 2010.
Dave KR, Saul I, Prado R, Busto R, Perez-Pinzon MA. Remote organ ischemic preconditioning protect
brain from ischemic damage following asphyxial cardiac arrest. Neurosci Lett 14;404(1-2):170-5,
2006.
Deng J, Wu DZ, Gao R. Detection of glutamate and け-aminobutyric acid in vitreous of patients with
proliferative diabetic retinopathy. Yan Ke Xue Bao 16(3):199–202, 2000.
DePace DM. Distribution of intravascularly injected lanthanum ions in ganglia of the autonomic nervous
system of the rat. Journal of Autonomic Nervous System 11:339-47, 1984.
Derouiche A, Rauen T. Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine
synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in
transmitter clearance. J Neurosci Res 1:42(1):131-43, 1995.
DeVries SH. Bipolar cells use kainate and AMPA receptors to filter visual information into separate
channels. Neuron 28(3):847–856, 2000.
Di Stasi AM, Mallozzi C, Macchia G, Maura G, Petrucci TC, Minetti M. Peroxynitrite affects exocytosis
and SNARE complex formation and induces tyrosine nitration of synaptic proteins. J Neurochem
82(2):420-9, 2002.
Dräger UC, Hubel DH. Responses to visual stimulation and relationship between visual, auditory, and
somatosensory inputs in mouse superior colliculus. J Neurophysiol 38(3):690-713, 1975.
Dräger UC, Hubel DH. Topography of visual and somatosensory projections to mouse superior
colliculus. J Neurophysiol 39:91–101, 1976.
Dräger UC, Olsen JF. Origins of crossed and uncrossed retinal projections in pigmented and albino mice.
J Comp Neurol 191:383–412, 1980.
Referencias
170
Ecker JL, Dumitrescu ON, Wong KY, Alam NM, Chen SK, LeGates T, Renna JM, Prusky GT, Berson
DM, Hattar S. Melanopsin-expressing retinal ganglion-cell photoreceptors: cellular diversity and
role in pattern vision. Neuron 15:67(1):49-60, 2010.
Edelstein K, Beaulé C, D'Abramo R, Amir S. Expression profiles of JunB and c-Fos proteins in the rat
circadian system. Brain Res 7:870(1-2):54-65, 2000.
Ehimger, Falck. Autoradiography of some suspected neurotransmitter substances: GABA glycine,
glutamic acid, histamine, dopamine, and L-dopa. Brain Res 8:33(1):157-72, 1971.
El-Remessy AB, Khalifa Y, Ola S, Ibrahim AS, Liou GI. Cannabidiol protects retinal neurons by
preserving glutamine synthetase activity in diabetes. Mol Vis 4(16):1487-95, 2010.
Escartin C, Bonvento G. Targeted activation of astrocytes: a potential neuroprotective strategy. Mol
Neurobiol 38:231-41, 2008.
Ettaiche M, Heurteaux C, Blondeau N, Borsotto M, Tinel N, Lazdunski M. ATP-sensitive potassium
channels (K(ATP)) in retina: a key role for delayed ischemic tolerance. Brain Res 890(1):118-
129, 2001.
Famiglietti EV, Stopa EG,McGookin ED, Song P, LeBlancV, Streeten BW. Immunocytochemical
localization of vascular endothelial growth factor in neurons and glial cells of human retina. Brain
Res 969(1–2):195–204, 2003.
Fawcett, DW. Tratado de histología. Interamericana. McGraw-Hill. Buenos Aires, 1995.
Figueiredo TH, Aroniadou-Anderjaska V, Qashu F, Apland JP, Pidoplichko V, Stevens D, Ferrara TM,
Braga MF. Neuroprotective efficacy of caramiphen against soman and mechanisms of its action.
Br J Pharmacol 164(5):1495-505, 2011.
Foster RG, Provencio I, Hudson D, Fiske S, De Grip W, Menaker M. Circadian photoreception in the
retinally degenerate mouse (rd/rd). J Comp Physiol 169A:39–50, 1991.
Fournier AE, Beer J, Arregui CO, Essagian C, Aguayo AJ, McKerracher L. Brain-derived neurotrophic
factor modulates GAP-43 but not T alpha1 expression in injured retinal ganglion cells of adult
rats. J Neurosci Res 15;47(6):561-72, 1997.
Referencias
171
Franco PJ, Fernandez DC, Sande PH, Keller Sarmiento MI, Chianelli M, Sáenz DA, Rosenstein RE.
Effect of bacterial lipopolysaccharide on ischemic damage in the rat retina. Invest Ophthalmol
Vis Sci 49(10):4604-12, 2008.
Gastinger MJ, Kunselman AR, Conboy EE, Bronson SK, Barber AJ. Dendrite remodeling and other
abnormalities in the retinal ganglion cells of Ins2 Akita diabetic mice. Invest Ophthalmol Vis Sci
49(6):2635-42, 2008.
Gbadegesin M, Vicini S, Hewitt SJ, Wink DA, Espey M, Pluta RM, Colton CA. Hypoxia modulates
nitric-oxide induced regulation of NMDA receptor currents and neuronal cell death. Am J Physiol
277:C673–C686, 1999.
Gegelashvili G, Schousboe A. Cellular distribution and kinetic properties of high-affinity glutamate
transporters. Brain Res Bull 45:233–238, 1998.
Giarelli L, Grandi G, Delendi M, Falconieri G. Optic nerve in diabetes mellitus: a case control study.
Metab Pediatr Syst Ophthalmol 9:71-73, 1986.
Gidday JM. Cerebral preconditioning and ischaemic tolerance. Nat Rev Neurosci 7(6):437-48, 2006.
Gincel D, Shoshan-Barmatz V. The synaptic vesicle protein synaptophysin: purification and
characterization of its channel activity. Biophys J 83(6):3223–3229, 2002.
Gow AJ, Chen Q, Gole M, Themistocleous M, Lee VM, Ischiropoulos H. Two distinct mechanisms of
nitric oxide-mediated neuronal cell death show thiol dependency. Am J Physiol Cell Physiol
278(6):C1099-107, 2000.
Granfeldt A, Lefer DJ, Vinten-Johansen J. Protective ischaemia in patients: preconditioning and
postconditioning. Cardiovasc Res 15;83(2):234-46, 2009.
Greene DA, Sima AA, Stevens MJ, Feldman EL, Lattimer SA. Complications: neuropathy, pathogenetic
considerations. Diabetes Care 15:1902-1925, 1992.
Guillery RW, Walsh C. Changing glial organization relates to changing fiber order in the developing
optic nerve of ferrets. J Comp Neurol 265:203–217, 1987.
Hancock HA, Kraft TW. Oscillatory potential analysis and ERGs of normal and diabetic rats. Invest
Ophthalmol Vis Sci 45(3):1002-8, 2004.
Referencias
172
Hangai M, Yoshimura N, Hiroi K, Mandai M, Honda Y. Inducible nitric oxide synthase in retinal
ischemia-reperfusion injury. Exp Eye Res 63(5):501-9, 1996.
Harada C, Guo X, Namekata K, Kimura A, Nakamura K, Tanaka K, Parada LF, Harada T. Glia- and
neuron-specific functions of TrkB signalling during retinal degeneration and regeneration. Nat
Commun 8:2:189, 2011.
Harman AM, Jeffery G. Distinctive pattern of organization in the retinofugal pathway of a marsupial. I.
Retina and optic nerve. J Comp Neurol 325:47–56, 1992.
Hattar S, Kumar M, Park A, Tong P, Tung J, Yau KW, Berson DM. Central projections of melanopsin-
expressing retinal ganglion cells in the mouse. J Comp Neurol 497:326–349, 2006.
Hattar S, Liao HW, Takao M, Berson DM, Yau KW. Melanopsin-containing retinal ganglion cells:
architecture, projections, and intrinsic photosensitivity. Science 295(5557):1065-70, 2002.
Hattar S, Lucas RJ, Mrosovsky N, Thompson S, Douglas RH, Hankins MW, Lem J, Biel M, Hofmann F,
Foster RG, Yau KW. Melanopsin and rod-cone photoreceptive systems account for all major
accessory visual functions in mice. Nature 424(6944):76-81, 2003.
Henrikson, RC., Gordon, IK., Mazurkiewick, JE. Histology. The National Medical Series for Independent
Study. Williams and Wilkins. 1997.
Heynen H, Wachtmeister L, van Norren D. Origin of the oscillatory potentials in the primate retina.
Vision Res 25:1365–1373, 1985.
Hogins J, Crawford DC, Jiang X, Mennerick S. Presynaptic silencing is an endogenous neuroprotectant
during excitotoxic insults. Neurobiol Dis 43(2):516-25, 2011.
Hoshi A, Nakahara T, Kayama H, Yamamoto T. Ischemic tolerance in chemical preconditioning: possible
role of astrocytic glutamine synthetase buffering glutamate-mediated neurotoxicity. J Neurosci
Res 84(1):130-41, 2006.
Howell GR, Libby RT, Jakobs TC, Smith RS, Phalan FC, Barter JW, Barbay JM, Marchant JK, Mahesh
N, Porciatti V, Whitmore AV, Masland RH, John SW. Axons of retinal ganglion cells are insulted
in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. J Cell Biol 179:1523–1537, 2007.
Referencias
173
Hunt DM, Carvalho LS, Cowing JA, Davies WL. Evolution and spectral tuning of visual pigments in
birds and mammals. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 12;364(1531):2941-55, 2009.
Ibrahim AS, El-Remessy AB, Matragoon S, Zhang W, Patel Y, Khan S, Al-Gayyar MM, El-Shishtawy
MM, Liou GI. Retinal microglial activation and inflammation induced by amadori-glycated
albumin in a rat model of diabetes. Diabetes 60:1122-33, 2011.
Ikeda H, Hankins MW, Asai T, Dawes EA. Electrophysiological properties of neurones following mild
and acute retinal ischaemia. Exp Eye Res 55:435–442, 1992.
Illing RB. Axonal bifurcation of cat retinal ganglion cells as demonstrated by retrograde double labelling
with fluorescent dyes. Neurosci Lett 19: 125–130, 1980.
Ino-ue M, Ohgiya N, Yamamoto M. Effect of aminoguanidine on optic nerve involvement in
experimental diabetic rats. Brain Res 800:319-22, 1998a.
Ino-ue M, Yokogawa H, Yamamoto M, Naka H, Kuriyama H. Structural impairments in optic nerve of
diabetic rats ameliorated with the aldose reductase inhibitor. Exp Eye Res 66:397-401, 1998b.
Ino-Ue M, Zhang L, Naka H, Kuriyama H, Yamamoto M. Polyol metabolism of retrograde axonal
transport in diabetic rat large optic nerve fiber. Invest Ophthalmol Vis Sci 41:4055-4058, 2000.
Iseri PK, Karson A, Gullu KM, Akman O, Kokturk S, Yardýmoglu M, Erturk S, Ates N. The effect of
memantine in harmaline-induced tremor and neurodegeneration. Neuropharmacology 61(4):715-
23, 2011.
Iversen LL. Pharmacological approaches to the treatment of ischaemic neuronal damage. Eye 5:193–197,
1991.
Jain V, Ravindran E, Dhingra NK. Differential expression of Brn3 transcription factors in intrinsically
photosensitive retinal ganglion cells in mouse. J Comp Neurol 520(4):742-55, 2012.
Jeffery G, Cowey A, Kuypers HG. Bifurcating retinal ganglion cell axons in the rat, demonstrated by
retrograde double labelling. Exp Brain Res 44: 34–40, 1981.
Jeffery G, Harman A, Flugge G. First evidence of diversity in eutherian chiasmatic architecture: tree
shrews, like marsupials, have spatially segregated crossed and uncrossed chiasmatic pathways. J
Comp Neurol 390: 183–193, 1998.
Referencias
174
Jeffery G. Architecture of the optic chiasm and the mechanisms that sculpt its development. Physiol Rev
81(4):1393-414, 2001.
Juen S, Kieselbach GF. Electrophysiological changes in juvenile diabetics without retinopathy. Arch
Ophthalmol 108:372–375, 1990.
Kanai Y, Endou H. Heterodimeric amino acid transporters: molecular biology and pathological and
pharmacological relevance. Current Drug Metabolism 2:339-354, 2001.
Kaur C, Sivakumar V, Yong Z, Lu J, Foulds WS, Ling EA. Blood-retinal barrier disruption and
ultrastructural changes in the hypoxic retina in adult rats: the beneficial effect of melatonin
administration. J Pathol 212(4):429-39, 2007.
Kawano T, Kunz A, Abe T, Girouard H, Anrather J, Zhou P, Iadecola C. iNOS-derived NO and nox2-
derived superoxide confer tolerance to excitotoxic brain injury through peroxynitrite. J Cereb
Blood Flow Metab 27(8):1453-62, 2007.
Kern TS, Barber AJ. Retinal ganglion cells in diabetes. J Physiol 15;586(18):4401-8, 2008.
Kessel L, Lundeman JH, Herbst K, Andersen TV, Larsen M. Age-related changes in the transmission
properties of the human lens and their relevance to circadian entrainment. J Cataract Refract Surg
36(2):308-12, 2010.
Kessel L, Siganos G, Jørgensen T, Larsen M. Sleep disturbances are related to decreased transmission of
blue light to the retina caused by lens yellowing. Sleep 1:34(9):1215-9, 2011.
Klein D, Moore RY, Reppert SM. (Eds.). Suprachiasmatic Nucleus: The Mind’s Clock. Oxford
University Press, Oxford. 1991.
Kosugi T, Kawahara K, Yamada T, Nakajima T, Tanaka M. Functional significance of the
preconditioning-induced down-regulation of glutamate transporter GLT-1 in neuron/astrocyte co-
cultures. Neurochem Res 30(9):1109-16, 2005.
Kowluru RA, Engerman RL, Case GL, Kern TS. Retinal glutamate in diabetes and effect of antioxidants.
Neurochem Int 38(5):385-90, 2001.
Krout KE, Kawano J, Mettenleiter TC, Loewy AD. CNS inputs to the suprachiasmatic nucleus of the rat.
Neuroscience 110(1):73-92, 2002.
Referencias
175
Krstić, RV. Human microscopic anatomy. Springer-Verlag. 1997.
Lafuente MP, Mayor-Torroglosa S, Miralles de Imperial J, Villegas- Perez MP, Vidal-Sanz M. Transient
ischemia of the retina results in altered retrograde axoplasmic transport: neuroprotection with
brimonidine. Exp. Neurol 178:243–258, 2002.
Lashley KS. The mechanism of vision. V. The structure and image forming power of the rat’s eye. J.
comp. Psychol 13:173-200, 1932.
Laskey WK. Brief repetitive balloon occlusions enhance reperfusion during percutaneous coronary
intervention for acute myocardial infarction: a pilot study. Catheter Cardiovasc Interv 65(3):361-
7, 2005.
Lewis GP, Chapin EA, Luna G, Linberg KA, Fisher SK. The fate of Müller's glia following experimental
retinal detachment: nuclear migration, cell division, and subretinal glial scar formation. Mol Vis
15(16):1361-72, 2010.
Li B, Roth S. Retinal ischemic preconditioning in the rat: requirement for adenosine and repetitive
induction. Invest Ophthalmol Vis Sci 40(6):1200-16, 1999.
Li B, Yang C, Rosenbaum DM, Roth S. Signal transduction mechanisms involved in ischemic
preconditioning in the rat retina in vivo. Exp Eye Res 70(6):755-65, 2000.
Li CM, Zhang XH, Ma XJ, Luo M. Limb ischemic postconditioning protects myocardium from ischemia-
reperfusion injury. Scand Cardiovasc J 40(5):312-7, 2006a.
Li Q, Puro DG. Diabetes-induced dysfunction of the glutamate transporter in retinal Müller cells. Invest
Ophthalmol Vis Sci 43(9):3109-16, 2002.
Li Q, Zemel E, Miller B, Perlman I. Early retinal damage in experimental diabetes: electroretinographical
and morphological observations. Exp Eye Res 74(5):615-25, 2002.
Li RS, Chen BY, Tay DK, Chan HH, Pu ML, So KF. Melanopsin-expressing retinal ganglion cells are
more injury-resistant in a chronic ocular hypertension model. Invest Ophthalmol Vis Sci
47(7):2951-8, 2006b.
Referencias
176
Li SY, Yau SY, Chen BY, Tay DK, Lee VW, Pu ML, Chan HH, So KF. Enhanced survival of
melanopsin-expressing retinal ganglion cells after injury is associated with the PI3 K/Akt
pathway. Cell Mol Neurobiol 28(8):1095-107, 2008.
Lieth E, Barber AJ, Xu B, Dice C, Ratz MJ, Tanase D, Strother JM. Glial reactivity and impaired
glutamate metabolism in short-term experimental diabetic retinopathy. Diabetes 47(5):815–820,
1998.
Liu X, Chen H, Zhan B, Xing B, Zhou J, Zhu H, Chen Z. Attenuation of reperfusion injury by renal
ischemic postconditioning: the role of NO. Biochem Biophys Res Commun 359(3):628–634,
2007.
Loukogeorgakis SP, Panagiotidou AT, Broadhead MW, Donald A, Deanfield JE, MacAllister RJ. Remote
ischemic preconditioning provides early and late protection against endothelial ischemia-
reperfusion injury in humans: role of the autonomic nervous system. J Am Coll Cardiol
2;46(3):450-6, 2005.
Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J
Biol Chem 193:265–275, 1951.
Lu MJ, Pulido JS, McCannel CA, Pulido JE, Hatfield RM, Dundervill RF 3rd, Shippy SA. Detection of
elevated signaling amino acids in human diabetic vitreous by rapid capillary electrophoresis. Exp
Diabetes Res 2007:39765, 2007.
Lucas RJ, Freedman MS, Munoz M, Garcia-Fernandez JM, Foster RG. Regulation of the mammalian
pineal by non-rod, non-cone, ocular photoreceptors. Science 284:505–507, 1999.
Lucas RJ, Hattar S, Takao M, Berson DM, Foster RG, Yau KW. Diminished pupillary light reflex at high
irradiances in melanopsin-knockout mice. Science 299:245–247, 2003.
Lund RD, Land PW, Boles J. Normal and abnormal uncrossed retinotectal pathways in rats: an HRP
study in adults. J Comp Neurol 189(4):711-20, 1980.
Ma N, Hunt NH, Madigan MC, Chan-Ling T. Correlation between enhanced vascular permeability, up-
regulation of cellular adhesion molecules and monocyte adhesion to the endothelium in the retina
during the development of fatal murine cerebral malaria. Am J Pathol 149:1745-1762, 1996.
Referencias
177
Maciejak P, Szyndler J, Lehner M, Turzyńska D, Sobolewska A, Bidziński A, Płaźnik A. The differential
effects of protein synthesis inhibition on the expression and reconsolidation of pentylenetetrazole
kindled seizures. Epilepsy Behav 18(3):193-200, 2010.
Malone P, Miao H, Parker A, Juarez S, Hernandez MR. Pressure induces loss of gap junction
communication and redistribution of connexin 43 in astrocytes. Glia 55:1085–1098, 2007.
Martinelli V, Piatti PM, Filippi M, Pacchioni M, Pastore MR, Canal N, Comi G. Effects of
hyperglycaemia on visual evoked potentials in insulin-dependent diabetic patients. Acta Diabetol
29:34-37, 1992.
Marx JL. The fos gene as "master switch". Science 21:237(4817):854-6, 1987.
Masland RH. The fundamental plan of the retina. Nat Neurosci 4(9):877-86, 2001.
May PJ. The mammalian superior colliculus: laminar structure and connections. Prog Brain Res 151:321-
78, 2006.
Mayor-Torroglosa S, De la Villa P, Rodríguez ME, López-Herrera MP, Avilés-Trigueros M, García-
Avilés A, de Imperial JM, Villegas-Pérez MP, Vidal-Sanz M. Ischemia results 3 months later in
altered ERG, degeneration of inner layers, and deafferented tectum: neuroprotection with
brimonidine. Invest Ophthalmol Vis Sci 46(10):3825-35, 2005.
Meijer JH, Rietveld WJ. Neurophysiology of the suprachiasmatic circadian pacemaker in rodents. Physiol
Rev 69(3):671-707, 1989.
Menaker M. Circadian rhythms: Circadian photoreception. Science 299(5604):213-4, 2003.
Meyer-Rüsenberg B, Pavlidis M, Stupp T, Thanos S. Pathological changes in human retinal ganglion
cells associated with diabetic and hypertensive retinopathy. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol
245:1009-1018, 2007.
Miron VE, Kuhlmann T, Antel JP. Cells of the oligodendroglial lineage, myelination, and remyelination.
Biochim Biophys Acta 1812(2):184-93, 2011.
Moore RY, Card JP. Visual pathways and the entrainment of circadian rhythms. Ann N Y Acad Sci
453:123-33, 1985.
Morin LP, Allen CN. The circadian visual system, 2005. Brain Res Rev 51(1):1-60, 2006.
Referencias
178
Morrison JC, Defrank MP, Buskirk MV. Comparative microvascular anatomy of mammalian ciliary
process. Invest Ophthalmol Vis Sci 28:1325–40, 1987.
Mosinger JL, Price MT, Bai HY, Xiao H,Wozniak DF, Olney JW. Blockade of both NMDA and non-
NMDA receptors is required for optimal protection against ischemic neuronal degeneration in the
in vivo adult mammalian retina. Exp Neurol 113:10–17, 1991.
Mrosovsky N. Masking: history, definitions, and measurement. Chronobiol Int 16(4):415-29, 1999.
Murata T, Nakagawa K, Khalil A, Ishibashi T, Inomata H, Sueishi K. The relation between expression of
vascular endothelial growth factor and breakdown of the bloodretinal barrier in diabetic rat
retinas. Lab Invest 74(4):819–25, 1996.
Murry CE, Jennings RB, Reimer KA. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in
ischemic myocardium. Circulation 74(5):1124-36, 1986.
Mysona B, Dun Y, Duplantier J, Ganapathy V, Smith SB. Effects of hyperglycemia and oxidative stress
on the glutamate transporters GLAST and system xc- in mouse retinal Müller glial cells. Cell
Tissue Res 335(3):477-88, 2009.
Napper GA, Pianta MJ, Kalloniatis M. Reduced glutamate uptake by retinal glial cells under
ischemic/hypoxic conditions. Vis Neurosci 16:149–158, 1999.
Neal MJ, Cunningham JR, Hutson PH, Hogg J. Effects of ischaemia on neurotransmitter release from the
isolated retina. J Neurochem 62:1025–1033, 1994.
Newton I. Opticks: Or a Treaties of the Reflexions, Refractions, Inflections and Colours of Light.
London, 1718.
Ng EW, Adamis AP. Anti-VEGF aptamer (pegaptanib) therapy for ocular vascular diseases. Ann N Y
Acad Sciences 1082:151-171, 2006.
Ng YK, Zeng XX, Ling EA. Expression of glutamate receptors and calcium-binding proteins in the retina
of streptozotocin-induced diabetic rats. Brain Res 1018:66–72, 2004.
Nucci C, Tartaglione R, Cerulli A, Mancino R, Spanò A, Cavaliere F, Rombolà L, Bagetta G, Corasaniti
MT, Morrone LA. Retinal damage caused by high intraocular pressure-induced transient ischemia
is prevented by coenzyme Q10 in rat. Int Rev Neurobiol 82:397-406, 2007.
Referencias
179
O'Rourke B. Evidence for mitochondrial K+ channels and their role in cardioprotection. Circ Res
5;94(4):420-32, 2004.
Osborne NN, Block F, Sontag KH. Reduction in ocular blood flow results in glial fibrillary acidic protein
(GFAP) expression in rat Muller cells. Vis Neurosci 7(6):637– 639, 1991.
Osborne NN, Casson RJ, Wood JP, Chidlow G, Graham M, Melena J. Retinal ischemia: mechanisms of
damage and potential therapeutic strategies. Prog Retin Eye Res 23:91–147, 2004.
Ostri C, Lund-Andersen H, Sander B, La Cour M. Phacoemulsification cataract surgery in a large cohort
of diabetes patients: visual acuity outcomes and prognostic factors. J Cataract Refract Surg
37(11):2006-12, 2011.
Otis TS, Jahr CE. Anion currents and predicted glutamate flux through a neuronal glutamate transporter. J
Neurosci 18,7099-7110, 1998.
Pang IH. Protection by eliprodil against excitotoxicity in cultured rat retinal ganglion cells. Invest
Ophthalmol Vis Sci 40(6):1170-6, 1999.
Pasupathy S, Homer-Vanniasinkam S. Ischaemic preconditioning protects against ischaemia/ reperfusion
injury: emerging concepts. Eur J Vasc Endovasc Surg 29(2):106-15, 2005.
Paxinos G, Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. Amsterdam: Elsevier, 1997.
Pekny M, Nilsson M. Astrocyte activation and reactive gliosis. Glia 50(4):427– 434, 2005.
Pignataro G, Meller R, Inoue K, Ordonez AN, Ashley MD, Xiong Z, Gala R, Simon RP. In vivo and in
vitro characterization of a novel neuroprotective strategy for stroke: ischemic postconditioning. J
Cereb Blood Flow Metab 28(2):232-41, 2008.
Pittendrigh C. Circadian rhythms and the circadian organization of living systems. Cold Spring Harbor
Simposia on Quantitative Biology 25:159-182, 1960.
Pittendrigh CS. Circadian systems: Entrainment. In: Handbook of behavioural neurobiology: Biological
rhythms, J Aschoff, ed, 95-124, Plenum Press, New York, 1981a.
Pittendrigh CS. Circadian systems: General Perspective. In: Handbook of behavioural neurobiology:
Biological rhythms, J Aschoff, ed, 57-80, Plenum Press, New York, 1981b.
Referencias
180
Poitry S, Poitry-Yamate C, Ueberfeld J, MacLeish PR, Tsacopoulos M. Mechanisms of glutamate
metabolic signaling in retinal glial (Muller) cells. J Neurosci 20:1809–1821, 2000.
Pow DV. Amino acids and their transporters in the retina. Neurochemistry International 38,463-484,
2001.
Prager TC, Garcia CA, Mincher CA, Mishra J, Chu HH. The pattern electroretinogram in diabetes. Am J
Ophthalmol 109:279-84, 1990.
Prescott ED, Zenisek D. Recent progress towards understanding the synaptic ribbon. Curr Opin Neurobiol
15:431-6, 2005.
Prichard JR, Armacanqui HS, Benca RM, Behan M. Light-dependent retinal innervation of the rat
superior colliculus. Anat Rec (Hoboken) 290:341-8, 2007.
Pulido JE, Pulido JS, Erie JC, Arroyo J, Bertram K, Lu MJ, Shippy SA. A role for excitatory amino acids
in diabetic eye disease. Exp Diabetes Res 2007:36150, 2007.
Ralph M, Lehman M. Transplantation: a new tool in the analysis of the mammalian hipothalamic
circadian pacemaker. Trends Neurosci 14:362-366, 1991.
Rauen T, Wiener M. Fine tuning of glutamate uptake and degradation in glial cells: common
transcriptional regulation of GLAST1 and GS. Neurochemistry International 37:179-189, 2000.
Rea MA. Light increases Fos-related protein immunoreactivity in the rat suprachiasmatic nuclei. Brain
Res Bull 23(6):577-81, 1989.
Reese BE. The distribution of axons according to diameter in the optic nerve and optic tract of the rat.
Neuroscience 22: 1015–1024, 1987.
Rodieck RW. The vertebrate retina. Principles of structure and function. W. H. Freeman & Co, San
Francisco, California. 1973.
Romero-Aroca P. Managing diabetic macular edema: The leading cause of diabetes blindness. World J
Diabetes 2(6):98-104, 2011.
Rosenbaum DM, Rosenbaum PS, Singh M, Gupta G, Gupta H, Li B, Roth S. Functional and morphologic
comparison of two methods to produce transient retinal ischemia in the rat. J Neuroophthalmol
21:62–68, 2001.
Referencias
181
Roth S, Dreixler JC, Shaikh AR, Lee KH, Bindokas V. Mitochondrial potassium ATP channels and
retinal ischemic preconditioning. Invest Ophthalmol Vis Sci 47(5):2114-24, 2006.
Roth S, Li B, Rosenbaum PS, Gupta H, Goldstein IM, Maxwell KM, Gidday JM. Preconditioning
provides complete protection against retinal ischemic injury in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci
39(5):777–785, 1998.
Rungger-Brändle E, Dosso AA, Leuenberger PM. Glial reactivity, an early feature of diabetic
retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci 41:1971-1980, 2000.
Saggu SK, Chotaliya HP, Cai Z, Blumbergs P, Casson RJ. The spatiotemporal pattern of somal and
axonal pathology after perikaryal excitotoxic injury to retinal ganglion cells: a histological and
morphometric study. Exp Neurol 211(1):52-8, 2008.
Sakamoto K, Yonoki Y, Kubota Y, Kuwagata M, Saito M, Nakahara T, Ishii K. Inducible nitric oxide
synthase inhibitors abolished histological protection by late ischemic preconditioning in rat retina.
Exp Eye Res 82(3):512-518, 2006.
Santos AR, Comprido D, Duarte CB. Regulation of local translation at the synapse by BDNF. Prog
Neurobiol 92(4):505-16, 2010.
Sato T, Sasaki N, Seharaseyon J, O’Rourke B, Marban E. Selective pharmacological agents implicate
mitochondrial but not sarcolem- mal K(ATP) channels in ischemic cardioprotection. Circulation
101:2418–2423, 2000.
Sawada N, Murata M, Kikuchi K, Osanai M, Tobioka H, Kojima T, Chiba H. Tight junctions and human
diseases. Med Electron Microsc 36(3):147-56, 2003.
Schmidt TM, Do MT, Dacey D, Lucas R, Hattar S, Matynia A. Melanopsin-positive intrinsically
photosensitive retinal ganglion cells: from form to function. J Neurosci 9;31(45):16094-101,
2011.
Schmoll C, Tendo C, Aspinall P, Dhillon B. Reaction time as a measure of enhanced blue-light mediated
cognitive function following cataract surgery. Br J Ophthalmol 95(12):1656-9, 2011.
Schneider-Poetsch T, Ju J, Eyler DE, Dang Y, Bhat S, Merrick WC, Green R, Shen B, Liu JO. Inhibition
of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol
6(3):209-217, 2010.
Referencias
182
Scott TM, Foote J, Peat B, Galway G. Vascular and neural changes in the rat optic nerve following
induction of diabetes with streptozotocin. J Anat 144:145–152, 1986.
Seki M, Tanaka T, Nawa H, Usui T, Fukuchi T, Ikeda K, Abe H, Takei N. Involvement of brain-derived
neurotrophic factor in early retinal neuropathy of streptozotocin-induced diabetes in rats:
therapeutic potential of brain-derived neurotrophic factor for dopaminergic amacrine cells.
Diabetes 53:2412-9, 2004.
Shaked I, Ben-Dror I, Vardimon L. Glutamine synthetase enhances the clearence of extracellular
glutamate by the neural retina. Journal of Neurochemistr 83:574-580, 2002.
Sheng M, Greenberg ME. The regulation and function of c-fos and other immediate early genes in the
nervous system. Neuron 4(4):477-85, 1990.
Shimazoe T, Ishida J, Maetani M, Yakabe T, Yamaguchi M, Miyasaka K, Kono A, Watanabe S,
Funakoshi A. Entrainment function in the suprachiasmatic nucleus of streptozotocin-induced
diabetic rats. Jpn J Pharmacol 83(4):355-8, 2000.
Shimomura Y, Shimizu H, Takahashi M, Sato M, Uehara Y, Negishi M, Kobayashi I, Kobayashi S.
Ambulatory activity in streptozotocin-induced diabetic rats. Physiol Behav 47:1153–1155, 1990.
Shine HD, Readhead C, Popko B, Hood L, Sidman RL. Morphometric analysis of normal, mutant, and
transgenic CNS: correlation of myelin basic protein expression to myelinogenesis. J Neurochem
58:342-49, 1992.
Sisk DR, Kuwabara T. Histologic changes in the inner retina of albino rats following intravitreal injection
of monosodium L-glutamate. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 223:250–258, 1985.
Sokol S, Moskowitz A, Skarf B, Evans R, Molitch M, Senior B. Contrast sensitivity in diabetics with and
without background retinopathy. Arch Ophthalmol 103:51-54, 1985.
Spoerri PE, Afzal A, Li Calzi S, Shaw LC, Cai J, Pan H, Boulton M, Grant MB. Effects of VEGFR-1,
VEGFR-2, and IGF-IR hammerhead ribozymes on glucose-mediated tight junction expression in
cultured human retinal endothelial cells. Mol Vis 12(12):32-42, 2006.
Staat P, Rioufol G, Piot C, Cottin Y, Cung TT, L'Huillier I, Aupetit JF, Bonnefoy E, Finet G, André-
Fouët X, Ovize M. Postconditioning the human heart. Circulation 4;112(14):2143-8, 2005.
Referencias
183
Sucher NJ, Lipton SA, Dreyer EB. Molecular basis of glutamate toxicity in retinal ganglion cells. Vision
Res 37(24):3483-93, 1997.
Sugiyama K, Gu ZB, Kawase C, Yamamoto T, Kitazawa Y. Optic nerve and peripapillary choroidal
microvasculature of the rat eye. Invest Ophthalmol Vis Sci 40(13):3084-90, 1999.
Sumioka K, Shirai Y, Sakai N, Hashimoto T, Tanaka C, Yamamoto M, Takahashi M, Ono Y, Saito N.
Induction of a 55-kDa PKN cleavage product by ischemia/reperfusion model in the rat retina.
Invest Ophthalmol Vis Sci 41:29–35, 2000.
Sun D, Lye-Barthel M, Masland RH, Jakobs TC. The morphology and spatial arrangement of astrocytes
in the optic nerve head of the mouse. J Comp Neurol 516(1):1-19, 2009.
Sun K, Liu ZS, Sun Q. Role of mitochondria in cell apoptosis during hepatic ischemia-reperfusion injury
and protective effect of ischemic postconditioning. World J Gastroenterol 10(13):1934–1938,
2004.
Szatkowski M, Barbour B, Attwell D. Non-vesicular release of glutamate from glial cells by reversed
electrogenic glutamate uptake. Nature 348,443-446, 1990.
Tanaka K. Functions of glutamate transporters in the brain. Neurosci Res 37:15–19, 2000.
Taylor J. Mechanismus oder neue abhandl. v. d. kunstl. Zusammensetz. des menschlichen Auges.
Frankfurt, 1750.
Thessis P, Grüsser OJ. Vision and cognition in the natural philosophy of Albert the Great (Albertus
Magnus). Doc Ophthalmol 86: 123–151, 1994.
Thoreson WB, Witkovsky P. Glutamate receptors and circuits in the vertebrate retina. Prog Retin Eye Res
18,765–810, 1999.
Tissier R, Waintraub X, Couvreur N, Gervais M, Bruneval P, Mandet C, Zini R, Enriquez B, Berdeaux A,
Ghaleh B. Pharmacological postconditioning with the phytoestrogen genistein. J Mol Cell Cardiol
42(1):79-87, 2007.
Tolentino MJ, McLeod DS, Taomoto M, Otsuji T, Adamis AP, Lutty GA. Pathologic features of vascular
endothelial growth factor-induced retinopathy in the nonhuman primate. Am J Ophthalmol
133:373-385, 2002.
Referencias
184
Toriu N, Akaike A, Yasuyoshi H, Zhang S, Kashii S, Honda Y, Shimazawa M, Hara H. Lomerizine, a
Ca2+ channel blocker, reduces glutamate-induced neurotoxicity and ischemia/reperfusion damage
in rat retina. Exp Eye Res 70(4):475-84, 2000.
Trejo LJ, Cicerone CM. Cells in the pretectal olivary nucleus are in the pathway for the direct light reflex
of the pupil in the rat. Brain Res 21:300(1):49-62, 1984.
Tsang A, Hausenloy DJ, Mocanu MM, Yellon DM. Postconditioning: a form of "modified reperfusion"
protects the myocardium by activating the phosphatidylinositol 3-kinase-Akt pathway. Circ Res
95(3):230-2, 2004.
Van Cauter E, Polonsky KS, Scheen AJ. Roles of circadian rhythmicity and sleep in human glucose
regulation. Endocr Rev 18:716–738, 1997.
VanGuilder HD, Brucklacher RM, Patel K, Ellis RW, Freeman WM, Barber AJ. Diabetes downregulates
presynaptic proteins and reduces basal synapsin I phosphorylation in rat retina. Eur J Neurosci
28(1):1-11, 2008.
Verrotti A, Lobefalo L, Trotta D, Della Loggia G, Chiarelli F, Luigi C, Morgese G, Gallenga P. Visual
evoked potentials in young persons with newly diagnosed diabetes: a long-term follow-up. Dev
Med Child Neurol 42:240-44, 2000.
Vinores SA, Derevjanik NL, Mahlow J, Berkowitz BA, Wilson CA. Electron microscopic evidence for
the mechanism of blood-retinal barrier breakdown in diabetic rabbits: comparison with magnetic
resonance imaging. Pathol Res Pract 194:497-505, 1998.
Volpe JJ, Kinney HC, Jensen FE, Rosenberg PA. The developing oligodendrocyte: key cellular target in
brain injury in the premature infant. Int J Dev Neurosci 29(4):423-40, 2011.
von Bussmann KA, Garey LJ, Jen LS. Injury-resistant retinal ganglion cells that are rich in cytochrome
oxidase. Neuroreport 4:247–250, 1993.
Wachtmeister L. Oscillatory potentials in the retina: what do they reveal. Prog Retin Eye Res 17:485–
521, 1998.
Wang JY, Shen J, Gao Q, Ye ZG, Yang SY, Liang HW, Bruce IC, Luo BY, Xia Q. Ischemic
postconditioning protects against global cerebral ischemia/reperfusion-induced injury in rats.
Stroke 39(3):983-90, 2008.
Referencias
185
Wang YP, Sato C, Mizoguchi K, Yamashita Y, Oe M, Maeta H. Lipopolysaccharide triggers late
preconditioning against myocardial infarction via inducible nitric oxide synthase. Cardiovasc Res
56(1):33-42, 2002.
Ward MM, Jobling Ai, Kalloniatis M, Fletcher El. Glutamate uptake in retinal glial cells during diabetes.
Diabetologia 48(2):351–360, 2005.
Ward R, Reperant J, Hergueta S, Miceli D, Lemire M. Ipsilateral visual projections in non-eutherian
species: random variation in the central nervous system? Brain Res Rev 20:155–170, 1995.
Whitmire W, Al-Gayyar MM, Abdelsaid M, Yousufzai BK, El-Remessy AB. Alteration of growth factors
and neuronal death in diabetic retinopathy: what we have learned so far. Mol Vis 28;17:300-8,
2011.
Williams, PL., Warwick, R. Anatomía de Gray. Churchill Livingstone. 1992.
Wollnik F, Brysch W, Uhlmann E, Gillardon F, Bravo R, Zimmermann M, Schlingensiepen KH,
Herdegen T. Block of c-Fos and JunB expression by antisense oligonucleotides inhibits light-
induced phase shifts of the mammalian circadian clock. Eur J Neurosci 1:7(3):388-93, 1995.
Wolswijk G. Chronic stage multiple sclerosis lesions contain a relatively quiescent population of
oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci 18:601-9, 1998.
Wolter JR. Diabetic retinopathy. Am J Ophthalmol 51:1123–1139, 1961.
Wu KH, Madigan MC, Billson FA, Penfold PL. Differential expression of GFAP in early vs. late AMD: a
quantitative analysis. Br J Ophthalmol 87(9):1159–1166, 2003.
Xu X, Zhu Q, Xia X, Zhang S, Gu Q, Luo D. Blood-retinal barrier breakdown induced by activation of
protein kinase C via vascular endothelial growth factor in streptozotocin-induced diabetic rats.
Curr Eye Res 28(4):251-6, 2004.
Yamanouchi S, Shimazoe T, Nagata S, Moriya T, Maetani M, Shibata S, Watanabe S, Miyasaka K, Kono
A, Funakoshi A. Decreased level of light-induced Fos expression in the suprachiasmatic nucleus
of diabetic rats. Neurosci Lett 16:227(2):103-6, 1997.
Yamasaki DS, Krauthamer G, Rhoades RW. Organization of the intercollicular pathway in rat. Brain Res
300(2):368-71, 1984.
Referencias
186
Yang XL. Characterization of receptors for glutamate and GABA in retinal neurons. Prog Neurobiol
73:127-150, 2004a.
Yang XM, Proctor JB, Cui L, Krieg T, Downey JM, Cohen MV. Multiple, brief coronary occlusions
during early reperfusion protect rabbit hearts by targeting cell signaling pathways. J Am Coll
Cardiol 44(5):1103–1110, 2004b.
Yi CX, Habegger KM, Chowen JA, Stern J, Tschöp MH. A role for astrocytes in the central control of
metabolism. Neuroendocrinology 93(3):143-9, 2011.
Young MJ, Lund RD. The retinal ganglion cells that drive the pupilloconstrictor response in rats. Brain
Res 23:787(2):191-202, 1998.
Yu XH, Zhang H, Wang YH, Liu LJ, Teng Y, Liu P. Time-dependent reduction of glutamine synthetase
in retina of diabetic rats. Exp Eye Res 89(6):967-71, 2009.
Zeng K, Xu H, Chen K, Zhu J, Zhou Y, Zhang Q, Mantian M. Effects of taurine on glutamate uptake and
degradation in Müller cells under diabetic conditions via antioxidant mechanism. Mol Cell
Neurosci 45(2):192-9, 2010.
Zhang SX, Ma JX, Sima J, Chen Y, Hu MS, Ottlecz A, Lambrou GN. Genetic difference in susceptibility
to the blood-retina barrier breakdown in diabetes and oxygen-induced retinopathy. Am J Pathol
166:313-321, 2005.
Zhao H, Sapolsky RM, Steinberg GK. Interrupting reperfusion as a stroke therapy: ischemic
postconditioning reduces infarct size after focal ischemia in rats. J Cereb Blood Flow Metab
26(9):1114–1121, 2006.
Zhao ZQ, Corvera JS, Halkos ME, Kerendi F, Wang NP, Guyton RA, Vinten-Johansen J. Inhibition of
myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion: comparison with ischemic
preconditioning. Am J Physiol Heart Circ Physiol 285(2):579–588, 2003.
Zhu Y, Ohlemiller KK, McMahan BK, Park TS, Gidday JM. Constitutive nitric oxide synthase activity is
required to trigger ischemic tolerance in mouse retina. Exp Eye Res 82(1):153-163, 2006.