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Tesis Doctoral

Estudio Estudio de mecanismos de pre yde mecanismos de pre ypost-condicionamiento comopost-condicionamiento como

estrategia de inducción de toleranciaestrategia de inducción de toleranciaisquémica retinianaisquémica retiniana

Fernandez, Diego Carlos

2012

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Fernandez, Diego Carlos. (2012). Estudio de mecanismos de pre y post-condicionamiento comoestrategia de inducción de tolerancia isquémica retiniana. Facultad de Ciencias Exactas yNaturales. Universidad de Buenos Aires.

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Fernandez, Diego Carlos. "Estudio de mecanismos de pre y post-condicionamiento comoestrategia de inducción de tolerancia isquémica retiniana". Facultad de Ciencias Exactas yNaturales. Universidad de Buenos Aires. 2012.

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

Estudio de mecanismos de pre y post-condicionamiento como

estrategia de inducción de tolerancia isquémica retiniana

Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos

Aires en el área: CIENCIAS BIOLÓGICAS

Diego Carlos Fernandez

Directora de tesis: Dra. Ruth E. Rosenstein

Consejero de estudios: Dr. Arturo Romano

Lugar de trabajo: Laboratorio de Neuroquímica Retiniana y Oftalmología

Experimental, Departamento de Bioquímica Humana, Facultad de Medicina. UBA.

Buenos Aires, marzo de 2012

Estudio de mecanismos de pre y post-condicionamiento como estrategia

de inducción de tolerancia isquémica retiniana

La isquemia es un componente central de diversas enfermedades retinianas que pueden provocar

ceguera irreversible. Al presente, no existen tratamientos efectivos frente al daño isquémico

retiniano. En este trabajo de Tesis se demostró por primera vez, que el post-condicionamiento

isquémico (PostC) inducido por la aplicación de pulsos breves de isquemia en forma posterior a una

isquemia prolongada, revierte significativamente las alteraciones funcionales e histológicas

provocadas por una isquemia retiniana deletérea. En cuanto a los mecanismos involucrados en este

fenómeno, los resultados obtenidos sugieren la participación de la síntesis de novo de proteínas y la

actividad de la isoforma inducible de la óxido nítrico sintasa. Además, se demostró que el daño

isquémico, al menos en parte, es causado por un aumento en las concentraciones sinápticas de

glutamato y que el PostC podría proteger a la retina al disminuir este parámetro. A continuación, se

realizó una caracterización del daño de la retina y la vía visual en un modelo de retinopatía diabética

experimental inducido por la inyección de estreptozotocina (STZ). A nivel retiniano, se observaron

alteraciones funcionales, vasculares y morfológicas significativas. En estadíos tempranos luego de la

inyección de STZ se observaron alteraciones axo-gliales en la porción distal del nervio óptico, que

podrían constituir el primer cambio estructural en la vía visual diabética. El condicionamiento

isquémico (aplicación de pulsos semanales de isquemia) revirtió significativamente todas estas

alteraciones, tanto a nivel de la retina como de la vía visual. Asimismo, los resultados obtenidos

sugieren que la disminución en los niveles de VEGF y la restauración de la actividad de glutamina

sintetasa podrían participar activamente en la protección inducida por el condicionamiento isquémico

frente a las alteraciones provocadas por la retinopatía diabética. Finalmente, se demostró que las

células ganglionares retinianas intrínsecamente fotosensibles en particular, y el sistema visual no

formador de imagen en general, se preservan en etapas avanzadas de diabetes.

En suma, los resultados obtenidos en este trabajo constituyen avances originales en la comprensión

de los mecanismos involucrados en la lesión retiniana inducida por isquemia aguda y por diabetes,

así como en la posibilidad de prevenir ambos procesos a través de la inducción de tolerancia

isquémica. La demostración de que el sistema visual no formador de imagen es menos susceptible al

daño diabético representa una valiosa pieza de información respecto a este sistema no canónico de

transducción de la información luminosa.

Palabras claves: retina, isquemia retiniana, retinopatía diabética, condicionamiento isquémico,

glutamato, axonopatía distal, ritmos circadianos.

Mechanisms of pre and post-conditioning as strategies

for ischemic tolerance induction

Ischemia is a central component of several retinal diseases that can result in irreversible

blindness. At present, there are no effective treatments to protect the retina from ischemic

damage. For the first time, in this Thesis work, we have demonstrated that ischemic post-

conditioning (PostC) induced by brief episodes of ischemia/reperfusion applied at the onset of

reperfusion, significantly protected the retina against functional and histological alterations

induced by ischemia. As for the involved mechanisms, the results suggest the participation of de

novo synthesis of proteins and the inducible isoform of nitric oxide synthase activity in the

protective mechanism triggered by PostC. We have also demonstrated that ischemic damage is,

at least in part, caused by an increase in glutamate synaptic concentrations and that PostC

protected the retina by decreasing this parameter. Moreover, we have analyzed the alterations at

retinal and visual pathway level provoked by experimental diabetes induced by streptozotocin

(STZ). Al retinal level, diabetes caused significant functional, vascular, and morphological

alterations. In addition, significant axo-glial alterations were observed at the distal portion of the

optic nerve at early stages of diabetes that could be the first structural change in the diabetic

visual pathway. Ischemic conditioning (weekly application of brief pulses of ischemia)

significantly reversed all these alterations. Furthermore, the results suggest that a decrease in

VEGF levels and the restoration of glutamine synthetase activity could be key aspects in the

protective mechanism triggered by ischemic conditioning against diabetic retinopathy. Finally,

we showed that intrinsically photosensitive retinal ganglion cells and the non-forming image

visual system are preserved at advanced stages of diabetes.

In summary, the results presented in this Thesis provide original insights for unraveling the

mechanisms involved in the retinal damage induced by acute ischemia and diabetes, as well as in

the possibility of preventing these processes through the induction of ischemic tolerance. The

demonstration that the non-forming image visual system is less susceptible to diabetic damage is

a valuable piece of information about this non canonical system of light transduction.

Key words: retina, retinal ischemia, diabetic retinopathy, ischemic conditioning, glutamate, distal

axonopathy, circadian rhythms.

ÍNDICE Página

ABREVIATURAS 1

INTRODUCCIÓN

1. El ojo

1.1. Características generales 3

1.2. Túnica interna nerviosa o retina 6

1.3. Células gliales retinianas 9

1.3.1. Astrocitos 10

1.3.2. Células de Müller 11

1.4. Vasculatura del ojo 12

1.5. Barreras hemato-oculares 14

2. Vía visual

2.1. Características generales 15

2.2. Nervio óptico 17

2.2.1. Oligodendrocitos 17

2.3. Colículo superior 19

3. Isquemia retiniana 21

4. Inducción de tolerancia isquémica 23

5. Retinopatía diabética 27

6. El glutamato retiniano 31

6.1. Participación del glutamato en el daño y en la protección retiniana 36

7. Los ritmos circadianos 37

7.1. Células ganglionares retinianas intrínsecamente fotosensibles 40

OBJETIVOS 44

MATERIALES Y MÉTODOS

1. Animales 45

1.1. Inducción de isquemia retiniana 45

1.2. Inducción de diabetes experimental 45

2. Inyección intravítrea 46

2.1. Inyección intravítrea de glutamato 46

3. Procesamiento histológico 47

3.1. Secciones semifinas 47

3.2. Obtención de cortes en parafina 48

3.3. Cortes por congelación 48

Índice

4. Microscopía electrónica

4.1. Análisis ultraestructural de la retina y el nervio óptico 48

4.2. Estudio de la marca de lantano 49

5. Análisis de células TUNEL(+) 49

6. Análisis de inmunomarcación y detección con isolectina GSA 50

6.1. Inmunoflourescencia 51

6.1.1. Inmunomarcación en retinas en montaje plano 51

6.2. Inmunohistoquímica 52

6.3. Detección con isolectinas 52

6.4. Análisis por microscopía confocal 52

7. Análisis de la permeabilidad vascular 52

8. Inyección de la subunidad de la toxina colérica 53

9. Procesamiento de imágenes y cuantificación 53

9.1. Evaluación morfométrica de cortes transversales de retina 53

9.2. Cuantificación de astrocitos en retinas en montaje plano 54

9.3. Análisis del nervio óptico 54

9.4. Análisis del colículo superior: densidad neuronal y área GFAP(+) 55

9.5. Análisis del transporte de la subunidad de la toxina colérica al colículo superior 55

9.6. Cuantificación de neuronas c-Fos(+) 56

9.7. Análisis de co-localización 56

10. Western blot 57

11. Estudio funcional de la retina

11.1. Electrorretinografía escotópica 58

11.2. Potenciales oscilatorios 59

11.3. Potenciales visuales evocados 59

12. Evaluación de la actividad del ciclo glutamato/glutamina a nivel retiniano

12.1. Determinación del influjo de L-3H-glutamato y L-3H-glutamina 60

12.2. Determinación de la actividad de glutamina sintetasa 60

12.3. Determinación de la liberación de L-3H-glutamato y L-3H-glutamina 61

12.4. Determinación de la actividad de glutaminasa 61

13. Actogramas y evaluación del periodograma 62

14. Evaluación del reflejo pupilar 62

15. Lentectomía 63

16. Análisis estadístico 63

RESULTADOS

1. Post-condicionamiento isquémico retiniano 64

2. Participación del glutamato en la protección retiniana inducida por post-condicionamiento 75

Índice

3. Inducción de tolerancia isquémica como estrategia terapéutica en un modelo de diabetes experimental 83

4. Axonopatía distal temprana en la diabetes experimental 94

5. Efecto del condicionamiento isquémico sobre las alteraciones axo-gliales en la vía visual diabética 101

6. Efecto de la diabetes sobre el sistema visual no formador de imagen 113

DISCUSIÓN 126

1. Post-condicionamiento como mecanismo inductor de tolerancia isquémica frente a una isquemia retiniana aguda 126

2. Participación del glutamato en el daño isquémico retiniano y en la protección inducida por post-condicionamiento 133

3. Inducción de tolerancia isquémica en la retinopatía diabética 138

3.1. Alteraciones en la retina inducidas por diabetes experimental 139

3.2. Alteraciones en la vía visual inducidas por diabetes experimental 144

3.3. Efecto protector del condicionamiento isquémico 148

4. Efecto de la diabetes sobre el sistema visual no formador de imagen 155

CONCLUSIONES 164

REFERENCIAS 165

Abreviaturas

1

ABREVIATURAS

ACPs arterias ciliares posteriores

ACR arteria central de la retina

BDNF factor neurotrófico derivado del cerebro

CCG capa de células ganglionares

CGRifs células ganglionares retinianas intrínsecamente fotosensibles

CGRs células ganglionares retinianas

CNE capa nuclear externa

CNI capa nuclear interna

CPE capa plexiforme externa

CPI capa plexiforme interna

CS colículo superior

CTB subunidad de la toxina colérica

EE error estándar

eNOS óxido nítrico sintasa endotelial

ERG electrorretinograma

FR fotorreceptores

GABA ácido け-aminobutírico

GFAP proteína glial fibrilar ácida

GS glutamina sintetasa

H-E hematoxilina-eosina

iNOS óxido nítrico sintasa inducible

LPS lipopolisacárido bacteriano

MBP proteína básica de mielina

MET microscopía electrónica de transmisión

NGL núcleo geniculado lateral

NMDA N-metil-D-aspartato

nNOS óxido nítrico sintasa neuronal

NO nervio óptico

Abreviaturas

2

NOP núcleo olivar pretectal

NOS óxido nítrico sintasa

NSQ núcleos supraquiasmáticos

OL oligodendrocitos

PBS buffer fosfato

PCI pre-condicionamiento isquémico

PDGFR- receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaqueta

PIO presión intraocular

PKC proteína quinasa C

POs potenciales oscilatorios

PostC post-condicionamiento isquémico

SGS stratum griseum superficiale

SNC sistema nervioso central

SO stratum opticum

STZ estreptozotocina

SZ stratum zonale

VEGF factor de crecimiento vascular endotelial

VEPs potenciales visuales evocados

Introducción

3

INTRODUCCIÓN

1. El ojo

1.1. Características generales

El ojo es un órgano sensorial especializado en el procesamiento de la información visual. La

córnea y el cristalino concentran la luz y enfocan la imagen sobre la retina, una estructura que en

el desarrollo embrionario deriva del diencéfalo y constituye la primera estación de relevo del

procesamiento de la información fótica. Los diferentes elementos que componen la imagen

(intensidad de luz, color, forma y movimiento) son codificados en la retina, de modo tal que las

radiaciones electromagnéticas son transformadas en impulsos nerviosos. Esta información se

transmite por fibras nerviosas que se originan en la retina y constituyen el nervio óptico (NO).

Fuera de la región intraorbital, el NO avanza hacia la base del cráneo donde atraviesa el canal

óptico. En la cavidad intracraneal, los NOs se entrecruzan parcialmente formando el quiasma

óptico y continúan como tractos ópticos a centros visuales del cerebro, que tras diversas etapas

de procesamiento en paralelo de la información, darán origen a la imagen visual consciente. En

las últimas décadas también se ha demostrado la participación de la retina en procesos visuales

no conscientes (denominado “sistema no formador de imagen”) a través de la transmisión de

información fótica a otros centros del encéfalo, lo que permite la realización de tareas reflejas

como la adaptación del tamaño pupilar, o respuestas más complejas como la regulación de los

procesos ligados al ciclo día/noche, como los ciclos de sueñovigilia y el aprendizaje, entre

muchos otros (revisado por Schmidt y col., 2011).

La pared del globo ocular está constituida por tres capas (Figura 1A):

1. Túnica externa-fibrosa o esclero-corneal: formada por la esclera, el limbo esclerocorneal y la

córnea.

2. Túnica media-vascular, úvea o tracto uveal: formada por la coroides, el cuerpo ciliar y el iris.

Introducción

4

3. Túnica interna-nerviosa o retina: formada por la porción de la retina fotosensible y el epitelio

pigmentario, la porción de la retina no fotosensible y su epitelio pigmentario, el epitelio del

cuerpo ciliar y el epitelio del iris.

La túnica externa es una capa fibrosa y gruesa que protege las delicadas estructuras internas del

ojo y junto con la presión del humor acuoso (presión intraocular (PIO)), mantienen la forma y

turgencia del globo ocular; en la mayor parte del globo ocular es opaca y se denomina esclera.

Allí se fijan los músculos extrínsecos del ojo.

En la salida del NO en primates, la esclera se reduce a una membrana fenestrada, denominada

lámina cribosa. Hacia la porción anterior, la túnica externa se diferencia en la córnea, una

estructura transparente constituida por cinco capas, que en un orden externo-interno son: epitelio,

capa de Bowman, estroma, membrana de Descemet y endotelio. Las fibras de colágeno del

estroma, principalmente de tipo I, se disponen ordenadamente (disposición hexagonal) lo que

permite disminuir la dispersión de la luz; de este modo, la córnea no sólo cumple una función de

protección sino que además, permite reducir la distorsión en la entrada de luz al ojo. Una línea

imaginaria que conecta la terminación periférica de la capa de Bowman y la membrana de

Descemet representa la zona de transición entre la córnea y la esclera (limbo esclerocorneal).

La túnica media vascular es responsable de la nutrición y el mantenimiento de la retina externa y

la esclera y de la producción de humor acuoso, que nutre la córnea y el cristalino, ambos

avasculares. Posee tres regiones diferentes: la coroides, porción más vascularizada de la úvea,

situada por fuera de la retina; el cuerpo ciliar, un engrosamiento de tejido conectivo que se

extiende hacia el interior justo por detrás de la unión esclerocorneal y el iris, que se ubica por

encima de la superficie anterior del cristalino. En el centro, el iris define un espacio circular

denominado pupila. El iris se extiende desde el cuerpo ciliar hasta el borde pupilar. La superficie

posterior del iris está cubierta por la porción irídea de la retina no fotosensible, constituida por

una doble capa de epitelio. Las células de la porción externa se diferencian en elementos

contráctiles que se disponen radialmente formando el mioepitelio del músculo dilatador de la

Introducción

5

pupila. El otro músculo del iris es el esfínter de la pupila, de disposición circular, que regula su

diámetro.

La retina es la capa más interna y es la porción del ojo sensible a la luz. Se extiende

superficialmente sobre la coroides hasta la ora serrata, donde presenta un borde festoneado;

luego se extiende como una delgada prolongación formando las porciones ciliar e irídea de la

retina. Esta prolongación anterior está constituida por una capa más externa pigmentada,

formada por células que son una continuación del epitelio pigmentario junto con un estrato más

profundo de epitelio cilíndrico, continuación de la retina no fotosensible. La retina se encuentra

firmemente unida en la papila óptica, donde se continúa con el NO y en la ora serrata, donde se

une a la coroides. Las complejas redes nerviosas que codifican la información visual envían los

impulsos al cerebro a través del NO.

Al atravesar la córnea, la luz pasa a través de dos cámaras antes de alcanzar la retina. La cámara

anterior que contiene el humor acuoso, es una cavidad pequeña rodeada por la córnea, el iris y la

porción central del cristalino. El humor acuoso es producido por las crestas del cuerpo ciliar

(procesos ciliares) en la cámara posterior (región comprendida entre el iris y el cristalino). Una

red de células especializadas y tejido conectivo, la red trabecular que se localiza en el ángulo de

unión del iris y la córnea, es responsable del drenaje del humor acuoso. El balance entre

producción y reabsorción del humor acuoso mantiene una PIO adecuada, que brinda estabilidad

mecánica.

El cristalino es un cuerpo biconvexo y elástico, rodeado por una cápsula y suspendido de la

superficie interna del cuerpo ciliar por un ligamento circular, la zónula ciliar, que junto con el

músculo ciliar son responsables de la acomodación del cristalino. El espacio entre la pared

posterior del cristalino y la retina está formado por una matriz extracelular denominada humor

vítreo o cuerpo vítreo. Esta matriz es rica en agua, ácido hialurónico, fibras colágenas muy

dispersas, otras proteínas y glicoproteínas, entre escasas células denominadas hialinocitos

(revisado por Williams y Warwick, 1992; Fawcett, 1995; Krstić, 1997).

Introducción

6

1.2. Túnica interna nerviosa o retina

La retina codifica el mundo visual, transformando los estímulos luminosos en impulsos

nerviosos que son enviados al cerebro. En la corteza, las señales son codificadas y configuran la

percepción visual: una sensación subjetiva de la forma, el color, la profundidad y el movimiento

de los objetos. La retina es una capa delgada derivada del tejido nervioso, constituida por los

siguientes tipos celulares: fotorreceptores (FR), células horizontales, células bipolares, células

amácrinas, células ganglionares retinianas (CGRs) y células gliales. En un corte transversal de

retina se observan diez capas paralelas, que comenzando desde la más externa son: 1. Epitelio

pigmentario; 2. Segmentos externos e internos de los FR; 3. Membrana limitante externa; 4.

Capa nuclear externa (CNE); 5. Capa plexiforme externa (CPE); 6. Capa nuclear interna (CNI);

7. Capa plexiforme interna (CPI); 8. Capa de células ganglionares (CCG); 9. Capa de fibras

nerviosas y 10. Membrana limitante interna (Figura 1B).

El epitelio pigmentario está constituido por células que se originan de la capa externa de la copa

óptica durante el desarrollo embrionario. De la porción apical de la célula, parten dos tipos de

prolongaciones: microvellosidades que rodean los extremos de los FR y microvellosidades que

ocupan el espacio que hay entre ellos. Una de las funciones del epitelio pigmentario es fagocitar

los discos membranosos más distales de los segmentos externos de los FR que son

constantemente removidos y reemplazados, en tanto que los discos nuevos se forman por

invaginaciones de la membrana plasmática en la base del segmento externo de los FR.

Los FR de los vertebrados son células únicas en forma y función. Existen dos tipos de FR

clásicos: los conos y los bastones. Sus segmentos externos son la porción sensible a la luz y su

morfología les da nombre a cada uno de ellos. Contienen el pigmento visual así como los demás

componentes de la cascada de fototransducción en la que participan diversos mensajeros,

enzimas y canales iónicos. El segmento externo de los bastones está formado por discos

membranosos apilados en forma ordenada y rodeados por una membrana celular. Estos discos

son estructuras saculares en los que las paredes de doble membrana quedan separadas por el

Introducción

7

espacio intradiscal. En los conos, el segmento externo está constituido por numerosos pliegues

de membrana apilados, que se abren al medio extracelular. En los discos de membrana se

encuentra el pigmento visual rodopsina en los bastones y conopsinas en los conos. En ratas,

como en la mayoría de los mamíferos, existen dos tipos de pigmentos en los conos: la opsina M

que posee un máximo de absorción a 480 - 530 nm y la opsina S que es sensible a la luz azul y

parte del espectro de radiación UV (máx 355 - 445 nm) (Hunt y col., 2009). En ambos FR, los

segmentos externos se encuentran unidos a los segmentos internos a través de un tallo estrecho o

cilio. El cuerpo celular de los FR contiene al núcleo, ubicado en la CNE. En la mayoría de las

especies de mamíferos, los bastones son aproximadamente 20 veces más numerosos que los

conos, aunque la cantidad relativa de ambos tipos celulares varía marcadamente sobre la

superficie de la retina (Masland, 2001). En el centro de la retina de primates (área denominada

fóvea), donde la agudeza visual es máxima, se observan sólo conos.

Los FR poseen un cinturón de zónulas adherentes que divide a la célula en un dominio apical y

uno basal. El aspecto de este cinturón al microscopio óptico llevó a denominar a esta región

membrana limitante externa (Rodieck, 1973). Participan también los procesos de las células de

Müller, que constituyen el principal tipo de célula glial retiniana, y rodean y dan soporte a los

elementos nerviosos. Estas células poseen un cuerpo celular delgado, que se extiende desde la

membrana limitante externa hasta la zona más interna de la retina, donde su lámina basal

constituye la membrana limitante interna.

Los FR hacen sinapsis con células bipolares y horizontales en la CPE. En estas sinapsis pueden

observarse synaptic ribbons, estructuras peculiares que se localizan en neuronas del sistema

visual, auditivo y vestibular y están formadas por vesículas que se disponen a cada lado de una

prominencia que surge del terminal presináptico (Prescott y Zenisek, 2005). Las células

horizontales conectan los FR con las células bipolares estableciendo una vía indirecta para el

flujo de información. Existen distintos tipos de células bipolares que pueden estar conectadas

exclusivamente a bastones o a conos. La CNI está constituida por los somas de células

Introducción

8

horizontales, bipolares y amácrinas. Estas últimas tienen numerosas dendritas pero carecen de

axón. Además de conectarse unas con otras, lo hacen con las terminales axónicas de células

bipolares y dendritas de las CGRs. Esta región de contacto sináptico se denomina CPI. La CPI

presenta una organización estratificada. Se diferencia una sublámina ON apical, donde proyectan

las CGRs ON y una sublámina OFF, de proyección de las CGRs OFF. En ambas capas

plexiformes, existen synaptic ribbons y sinapsis convencionales. La CCG está constituida por los

somas celulares de las CGRs cuyos axones convergen radialmente hacia el disco óptico, por

donde las fibras abandonan el globo ocular (Figura 1B). En la CCG se localizan también una

cantidad, variable según la especie, de células amácrinas desplazadas.

Estudios clásicos de Lashley y col. (1932) demostraron que en la retina central de la rata existe

una alta densidad de CGRs, denominada area centralis. Esta especialización podría representar

una zona de mayor agudeza visual, similar a lo que se observa en la fóvea de otras especies.

Según el tamaño del soma, las CGRs pueden clasificarse en: ganglionares grandes (>14 μm, con

ocasionales ganglionares gigantes >17 μm), ganglionares medianas (11 - 14 m) y ganglionares

Figura 1. Esquema que ilustra las distintas estructuras del globo ocular (A) y las distintas células y capas de la

retina (B). Nótese la presencia de vasos sólo en la región interna de la retina. C, cono; B, bastón; CB, célula

bipolar; H, célula horizontal; A, célula amácrina; CG, célula ganglionar; M, célula de Müller; AS, astrocito

Modificado de Krstić, 1997.

Introducción

9

pequeñas (5 - 11 μm). Los axones de todas las CGRs proyectan al cerebro a través del tracto

óptico, excepto las fibras que llegan a los núcleos supraquiasmáticos (NSQ). En su mayoría, las

CGRs que inervan los NSQ a través del tracto retino-hipotalámico son intrínsecamente sensibles

a la luz y expresan el pigmento visual melanopsina, también denominado opsina 4 (Opn 4). Estas

células, cuyas características se comentarán en detalle en la sección 7.1, son responsables de

sincronizar los ritmos circadianos endógenos con los estímulos ambientales de luz/oscuridad,

entre otras funciones.

En base a las conexiones anatómicas y funcionales entre los distintos tipos celulares retinianos,

se considera que la información fluye a través de la retina siguiendo dos vías: una vía directa,

desde los FR a las células bipolares y de éstas a las CGRs y una indirecta, en el que las células

horizontales se interponen entre los FR y las células bipolares y las amácrinas entre las bipolares

y las CGRs. La vía directa de transmisión de información es altamente específica; la vía

indirecta, en cambio, es más difusa.

El principal neurotransmisor excitatorio de la retina, el glutamato, es el transmisor responsable

de la vía directa de la información visual. El glutamato es liberado desde los FR a células

bipolares y horizontales y desde las células bipolares a las CGRs y amácrinas. En oscuridad, el

glutamato es liberado en forma tónica por los FR a la brecha sináptica y su liberación se

interrumpe con la exposición a luz. El glutamato induce la despolarización de las células

bipolares OFF y la hiperpolarización de las células bipolares ON. Estas células a su vez, liberan

glutamato en las sinapsis con las CGRs. Un conjunto variado de señales liberadas por células

horizontales y amácrinas, que incluyen al ácido け-aminobutírico (GABA), la glicina y la

dopamina, modulan la vía directa.

1.3. Células gliales retinianas

La retina de mamíferos contiene tres tipos de células gliales, que se clasifican en células

macrogliales (células de Müller y astrocitos) y células microgliales. La microglía se considera

Introducción

10

parte del sistema fagocítico mononuclear que reside en la retina y todo el SNC. Son células

pequeñas, con un núcleo denso, escaso citoplasma y prolongaciones finas con pequeñas espinas.

Su morfología cambia rápidamente frente a una injuria. Las células microgliales se dividen,

aumentan de tamaño y pierden sus prolongaciones (adquiriendo un aspecto ameboideo) y

adquieren capacidad fagocítica. Entre las células macrogliales retinianas se encuentran los

astrocitos, localizados en la porción más interna de la retina (capa de fibras, CCG y parte de la

CPI) y las células de Müller, que se disponen a lo largo de toda la retina según el eje vertical.

1.3.1. Astrocitos. Inicialmente, la citoarquitectura de las astrocitos fue estudiada con técnicas de

tinción de Golgi y posteriormente mediante el uso de microscopía electrónica de transmisión

(MET), inmunomarcación e inyección de colorantes a nivel de célula-única. Son células grandes,

con forma estrellada y se caracterizan por tener en su citoplasma gran cantidad de haces de

filamentos intermedios. El patrón de ramificación de los procesos celulares varía según la

ubicación en el SNC y se clasifican en astrocitos de tipo I y II. Los astrocitos tipo I se encuentran

principalmente en la sustancia gris del SNC y poseen muchas prolongaciones muy ramificadas

que suelen extenderse hasta las paredes de los vasos sanguíneos en forma de pedicelos. De esta

forma, los astrocitos tipo I participan en la regulación de las uniones estrechas de las células

endoteliales de los capilares y vénulas que conforman la barrera hemato-encefálica y la barrera

hemato-retiniana interna. Los astrocitos más superficiales emiten prolongaciones con pedicelos

hasta contactar con la piamadre, lo que origina la membrana pial-glial. Los astrocitos tipo II

emiten prolongaciones que contactan la membrana axonal en los nodos de Ranvier de axones

mielínicos y suelen encapsular las sinapsis químicas. De esta manera, la red compleja de

procesos celulares permite a la astroglía un contacto directo con el soma, axones, dendritas y

sinapsis neuronales, vasos sanguíneos y meninges. Entre sus múltiples funciones se encuentran:

el sostén estructural, la conformación de la barrera hemato-encefálica, la regulación del flujo

sanguíneo, la modulación de la función sináptica, la participación en procesos de plasticidad, la

captación de neurotransmisores, la homeostasis neuronal, el almacenamiento de glucógeno y la

Introducción

11

participación en procesos de reparación y cicatrización, entre otros (revisado por Yi y col.,

2011). Además de la red compleja de procesos celulares que pone en contacto diversos

astrocitos, existen uniones de tipo gap entre astrocitos que permiten “concebir” a la red de

astrocitos como una unidad funcional (Malone y col., 2007). Los astrocitos presentes en la retina

adulta son células que se originaron y migraron desde el NO. Se localizan en la porción más

apical de la retina, en estrecho contacto con vasos del plexo superior y cumplen un rol

fundamental en el mantenimiento de las propiedades de las barreras endoteliales.

1.3.2. Células de Müller. Las células de Müller constituyen las principales células gliales de la

retina de vertebrados. Derivan de la glía radial y se extienden a través de todo el espesor de la

retina, contactando todos los somas y procesos de células retinianas. De esta forma, constituyen

una vía de conexión anatómica y funcional entre distintas células y compartimentos, como vasos

sanguíneos y el cuerpo vítreo. Entre las numerosas funciones de las células de Müller, se

destacan: 1) su participación en el metabolismo de la glucosa y en el aporte de nutrientes a las

neuronas y remoción de productos metabólicos; 2) la regulación del flujo sanguíneo y la

participación en la formación y mantenimiento de la barrera hemato-retiniana interna; 3) la

participación en procesos de comunicación neuronal, particularmente a través de la captación

rápida del exceso de neurotransmisores y la liberación de precursores de neurotransmisores; 4) el

control de la homeostasis de iones y agua y la regulación del pH extracelular; 5) la liberación de

diversos factores que regulan la función retiniana; y 5) la participación en procesos de reparación

y reactividad frente a daños retinianos (revisado por Bringmann y col., 2006).

Frente a una alteración en la homeostasis retiniana, las células gliales sufren un proceso de

hipertrofia celular, denominado gliosis. Las células de Müller en la retina adulta no expresan la

proteína glial fibrilar ácida (GFAP), o la expresan en niveles muy bajos. Una característica de la

gliosis es la expresión de GFAP en los procesos celulares. Esta característica constituye un

reconocido indicador de alteración retiniana (Osborne y col., 1991; Wu y col., 2003). En

determinadas condiciones se ha observado que en respuesta al daño retiniano, las células de

Introducción

12

Müller pueden desdiferenciarse y entrar nuevamente en un ciclo de duplicación celular. La

proliferación de células gliales provoca la formación de cicatrices gliales, como ocurre

frecuentemente frente a un desprendimiento de retina (Lewis y col., 2010).

Las células de Müller son un sitio de producción del factor neurotrófico derivado del cerebro

(BDNF), que es clave para la supervivencia de las CGRs. El BDNF pertenece a la familia de las

neurotrofinas, que incluye el factor de crecimiento nervioso (NGF), la neurotrofina-3 y la

neurotrofina 4/5. Estas proteínas de secreción tienen efectos pleiotrópicos en el sistema nervioso

central (SNC) (revisado por Santos y col., 2010). Cada neurotrofina se une principalmente a un

receptor específico de tipo tirosín-quinasa. El BDNF se une específicamente al receptor TrkB y

constituye el principal factor neurotrófico en la retina. Además de las células de Müller, el

BDNF es producido por las CGRs y células amácrinas. Asimismo, se ha demostrado que el CS

produce BDNF que es transportado retrógradamente hasta el soma de las CGRs (Fournier y col.,

1997).

1.4. Vasculatura del ojo

Diversos autores han estudiado la arquitectura vascular del ojo de distintos mamíferos y se ha

observado una marcada variación entre especies (Morrison y col., 1987). La arquitectura

microvascular tridimensional del NO y la porción coroidea peripapilar del ojo de la rata fue

estudiada por Sugiyama y col. (1999) y Bhutto y Amemiya (2001). En la rata, la sangre llega al

ojo por la arteria ciliar posterior que nutre la retina y la capa media vascular completa. Avanza

por la vaina del NO, penetra directamente en la porción inferior de la cabeza del NO y se divide

en tres ramas: la arteria central de la retina (ACR) y las arterias ciliares posteriores (ACPs)

medial larga y lateral larga, que irrigan el iris y el cuerpo ciliar. La porción posterior de la

coroides, incluyendo la porción peripapilar, está irrigada por colaterales cortas de las ACPs. A su

vez, el NO está irrigado por arteriolas que se originan de las ACPs y capilares que llegan desde

la ACR. La ACR se divide en seis arterias radiales que nutren toda la retina hasta la base del

Introducción

13

cuerpo ciliar. La fina red vascular está formada por arteriolas delgadas que nacen de las arterias

mayores en ángulo recto. Luego, siguen un curso largo como arteriolas precapilares que en los

puntos de ramificación presentan constricciones luminales que regulan el flujo sanguíneo. La

retina presenta una doble capa vascular formada por capilares finos que drenan en vénulas post-

capilares que constituyen una segunda red venular y corre justo por debajo de la red capilar

superficial. Los FR y el epitelio pigmentario no hacen contacto directo con capilares o vénulas,

sino que reciben nutrientes por difusión, fundamentalmente desde los coriocapilares de la túnica

media. Finalmente, las vénulas de la retina se continúan en venas largas que desembocan en la

vena central de la retina, cerca del disco óptico.

La coroides está irrigada por arterias que se forman de las ACPs. Arteriolas, meta-arteriolas

cortas y capilares avanzan por toda la coroides hacia la parte anterior del ojo, donde el plexo

denso de capilares delgados y anastomosados se une a los vasos del cuerpo ciliar en la ora

serrata. Junto con el cuerpo ciliar, el iris se encuentra irrigado por el anillo arterial iridociliar,

que se origina de la arteria ciliar anterior, que a su vez, es una ramificación de las ACPs y surge

a la altura del ecuador del globo ocular.

La sangre venosa del iris y el cuerpo ciliar drena en vénulas vórtex. Cuatro venas vórtex, que se

disponen oblicuamente en el lado dorsal, ventral, nasal y temporal cerca del ecuador llegan hasta

la esclera donde se vacían en las venas epiesclerales. La sangre de la mitad posterior de la

coroides es recogida por venas ciliares posteriores. Capilares presentes en la cabeza del NO

desembocan en la vena central de la retina, en venas de la pía y en anastomosis venosas

presentes en la coroides y todos ellos desembocan finalmente en la vena ciliar posterior presente

en la vaina del NO.

Introducción

14

1.5. Barreras hemato-oculares

Al igual que otras barreras hemato-tisulares, las barreras hemato-oculares se basan en la

presencia de uniones oclusivas en diferentes capas celulares, ubicadas en distintas regiones del

ojo (Henrikson y col., 1997). Las barreras hemato-oculares son:

1. La barrera hemato-acuosa: formada por las uniones oclusivas del epitelio no pigmentado del

cuerpo ciliar.

2. La barrera hemato-iridal: formada por las uniones oclusivas del endotelio de los vasos del iris.

3. La barrera hemato-retiniana, constituida por:

a. Uniones oclusivas del endotelio de los vasos sanguíneos de la retina interna (barrera

hemato-retiniana interna).

b. Uniones oclusivas entre las células del epitelio pigmentario (barrera hemato-retiniana

externa).

c. Uniones oclusivas de la membrana limitante externa, entre las células de Müller y los FR.

Esta última barrera fue descripta por Hernrickson y col. (1997). Sin embargo, la mayoría de los

textos postulan que la relación entre estas células ocurre a través de uniones adherentes.

La barrera hemato-retiniana interna está constituida por uniones oclusivas, que constituyen el

componente más apical de las uniones endoteliales y regulan el paso de sustancias por el espacio

paracelular. Las uniones oclusivas limitan el dominio apical de la superficie baso-lateral,

manteniendo la polaridad celular. Al presente, se conocen tres grandes familias de proteínas

integrales de membrana que regulan y limitan la difusión pasiva de sustancias del lumen vascular

al parénquima retiniano: ocludinas, claudinas y proteínas de las superfamilias de las

inmunoglobulinas JAM (del inglés, junctional adhesion molecule) (revisado por Sawada y col.,

2003). Envolviendo los capilares retinianos, se encuentran los pericitos que regulan el tono

vascular.

Introducción

15

2. Vía visual

2.1. Características generales

Los axones de todas las CGRs proyectan al disco óptico por donde salen del ojo y forman el NO.

En la porción proximal del NO los axones se mielinizan. Los NOs de ambos ojos finalmente se

encuentran en el quiasma óptico. Dependiendo de la especie, una sub-población de axones de

número variable, se cruzan al lado opuesto del encéfalo, mientras otros axones continúan su

proyección en forma ipsilateral. De esta manera, los axones provenientes de ambos ojos forman

los tractos ópticos izquierdo y derecho que proyectan a núcleos subcorticales que participan en el

procesamiento visual formador de imagen y no formador de imagen.

El sistema de transporte axonal (o flujo axoplasmático) es el responsable de la comunicación

entre las CGRs y las neuronas de núcleos centrales. El transporte anterógrado, mediado por la

proteína motor quinesina, es el responsable del transporte de proteínas que son sintetizadas en el

cuerpo neuronal y están asociadas a la estructura axonal y la transmisión sináptica. El transporte

retrógrado, mediado por dineína, participa en el transporte de factores que afectan el estado

metabólico de las CGRs. Los microtúbulos son los elementos motores que participan en el

transporte. El ATP y el calcio son esenciales para este proceso.

Mediante la utilización de diversos métodos (trazadores, lesiones retinianas y electrofisiología)

se ha estudiado el grado de decusación de las fibras retinianas en diferentes especies (Cooper y

Pettigrew, 1979; Harman y Jeffery, 1992; Ward y col., 1995). La decusación óptica fue postulada

por primera vez en el siglo XIII por Alberto Magno, al notar que daños unilaterales en el cerebro

provocaban alteraciones en el campo visual contralateral (revisado por Thessis y Grüsser, 1994).

El patrón parcial de decusación fue propuesto originalmente por Isaac Newton (Newton, 1718);

sin embargo, años después fue formalmente formulado por Taylor en 1750 (Taylor, 1750;

revisado por Jeffery, 2001). El patrón básico de visión binocular es el resultado de vías

conformadas por fibras de la hemi-retina temporal de proyección ipsilateral y fibras de la hemi-

retina nasal del ojo contralateral, que se cruzan en el quiasma óptico, para formar finalmente un

Introducción

16

tracto óptico común. La línea imaginaria que divide las CGRs en dos poblaciones, pasa

verticalmente por la fóvea (división naso-temporal). Este patrón de decusación parcial resulta en

una representación continua del campo visual en estructuras centrales de procesamiento visual.

En distintas especies se han encontrado diferente patrones de proyección. Sin embargo, en todos

los casos, la proyección cruzada es mayor que la proyección ipsilateral. Se ha observado además

que en la mayoría de los mamíferos, las CGRs que proyectan de manera ipsilateral se encuentran

en la retina temporal (Cooper y Pettigrew, 1979; Dräger y Olsen, 1980; Jeffery y col., 1998).

Existe una sub-población escasa de CGRs también localizadas en la retina temporal, que

proyectan bilateralmente. La presencia de estas células con axones bifurcados se ha

documentado en roedores y gatos, pero aún no se han caracterizado con suficiente detalle para

determinar a qué tipo celular corresponden (Illing, 1980; Jeffery y col., 1981).

Las fibras de las CGRs se clasifican en tres tipos según su tamaño (grandes, medianas y

pequeñas) siguiendo la clasificación de los somas (Boycott y Wassle, 1974). En la retina de

roedores no se ha observado ningún patrón evidente en cuanto a la distribución de las CGRs.

Análogamente, se ha observado que las fibras del NO se disponen sin una organización clara en

función de su tamaño. Como consecuencia, el quiasma óptico de estos animales no presenta un

patrón interno de organización. Por el contrario, el tracto óptico de roedores presenta un patrón

claro de organización de fibras según su calibre, siendo las mayores de localización superficial,

las medianas en posición más profunda y las pequeñas, en general, localizadas en posición

próxima a la pía (Reese, 1987).

Entre los núcleos de proyección retiniana se encuentran el núcleo geniculado lateral (NGL), el

colículo superior (CS), núcleos pretectales como el núcleo olivar pretectal (NOP), los NSQ y

núcleos del sistema ocular accesorio, entre otros.

Introducción

17

2.2. Nervio óptico

En roedores, las fibras amielínicas de las CGRs se unen en la papila óptica y abandonan el globo

ocular a través de una apertura en la esclera, que en primates presenta una red de fibras de

colágeno que constituyen la lámina cribosa. Diversos estudios descartan la existencia de una

lámina cribosa clásica en ratones y ratas; por el contrario, en esta porción del NO se observa una

red compleja de procesos gliales orientados transversalmente a los axones, una estructura que

recibe el nombre de lámina glial (Howell y col., 2007; Sun y col., 2009). En esta región, los

núcleos gliales presentan una morfología en bastón en plano transversal y forman columnas

perpendiculares al eje mayor del NO. Los procesos primarios de los astrocitos organizan los

axones en fascículos. Estos procesos son mayores en la región del NO próxima a la retina y se

vuelven más delgados y menos numerosos hacia la zona mielinizada. Existen además procesos

secundarios, que subdividen los fascículos en unidades menores. Esta red compleja de procesos

tiene la potencial consecuencia funcional de permitirle a un único astrocito comunicar y regular

la función de numerosos axones y otros astrocitos (Sun y col., 2009). En ratas, la lámina glial se

extiende aproximadamente entre 80 – 85 m (en el eje longitudinal) hasta la zona de transición,

donde las fibras comienzan a mielinizarse. A partir de esta región se pierde la organización de

los axones en fascículos y disminuye el número de astrocitos, que presentan una morfología

heterogénea. Estas células se caracterizan por tener menor número de procesos que se extienden

en todas direcciones (Sun y col., 2009). En roedores se ha descripto que en la porción distal del

NO, próxima al quiasma óptico, se pierde la organización retinotópica de los axones (Baker,

1990) y se ha sugerido que esto podría deberse al cambio en la organización glial (Guillery y

Walsh, 1987).

2.2.1. Oligodendrocitos. El desarrollo del linaje oligodendrocítico ha sido ampliamente estudiado

(revisado por Miron y col., 2011; Volpe y col., 2011). Estos estudios demuestran la presencia de

un patrón claramente establecido en la maduración, que puede ser determinado mediante el uso

de marcadores de superficie celular específicos para cada estadío celular. Los precursores de

Introducción

18

oligodendrocitos (OL) son inmunopositivos para el receptor alfa del factor de crecimiento

derivado de plaquetas (PDGFR-. Estas son células multipolares, que en un estadío más

avanzado (precursores tardíos), son inmunorreactivos para el marcador O4, pero no para O1. El

OL inmaduro es una célula multipolar compleja en estado postmitótico, que se identifica con el

marcador O1. Los OL maduros poseen un cuerpo celular pequeño con un citoplasma muy denso

(son uno de los tipos celulares más electrón-densos del SNC). Presentan un retículo

endoplasmático rugoso abundante, frecuentes polirribosomas libres, complejo de Golgi

desarrollado y numerosas mitocondrias. El núcleo es esférico y contiene gran cantidad de

heterocromatina, pero es más pequeño que el de los astrocitos. A su vez, presentan menor

cantidad de prolongaciones y son menos ramificadas que los astrocitos. Los OL maduros se

disponen en columnas entre los axones y son las células responsables de la producción y

mantenimiento de la mielina en el SNC. El OL maduro se puede identificar mediante la

detección de dos componentes principales de la mielina, la proteína básica de mielina (MBP) y la

proteína proteolipídica (PLP/DM20). Los OL maduros generan grandes cantidades de membrana

que forman segmentos inter-nodales de mielina que rodean a varios axones. De esta forma, un

axón puede estar rodeado de mielina formada por diversos OL. El espacio que queda entre

vainas de mielina de distintos OL se denomina nodo de Ranvier. La mielina actúa como aislante

de alta resistencia y baja capacitancia, de manera que la corriente iónica que se transmite a través

del axón se mueve de nodo a nodo (conducción saltatoria) aumentando considerablemente la

velocidad de conducción y disminuyendo el gasto de energía. La mielina cumple además una

función protectora, ya que asegura la continuidad de la conducción del impulso nervioso. La

mielina consiste en una cubierta de membrana altamente compactada que separa los nodos de

Ranvier. La estructura de la vaina de mielina consiste en una sucesión de capas alternantes de

lípidos mixtos y proteínas. En el SNC, los nervios contienen mielina en cantidades relacionadas

con el diámetro axonal. Las vías neuronales que recorren grandes distancias presentan vainas de

Introducción

19

mielina gruesas y en consecuencia tienen mayor velocidad de conducción. Los OL pueden

formar la vaina de mielina para una cantidad variable de axones (entre 10 y 60).

2.3. Colículo superior

El CS es un centro integrador del cerebro medio que controla el movimiento reflejo de la cabeza

y el movimiento de los ojos. Es una estructura organizada en capas, según la distribución de

fibras y el tamaño y arreglo neuronal. La capa superior es delgada y prácticamente libre de

células y se denomina stratum zonale (SZ). Por debajo de ella se encuentra la capa gris

superficial, stratum griseum superficiale (SGS), que contiene numerosas neuronas pequeñas.

Esta capa suele subdividirse en superior e inferior, dado el tamaño mayor de las neuronas

inferiores. Luego sigue el stratum opticum (SO) que contiene predominantemente fibras. Estas

tres capas constituyen la porción superficial del CS que participa principalmente del

procesamiento de la información visual aferente.

El CS profundo contiene neuronas motoras de proyección. Próximo al SO se encuentra una capa

delgada con una variedad amplia de neuronas multipolares, denominado stratum griseum

intermediale (SGI). Esta capa suele dividirse a su vez, en superior e inferior según su densidad

neuronal. La capa siguiente se denomina stratum album intermediale (SAI) y contiene

numerosas fibras. Por debajo, se encuentra una capa celular denominada stratum griseum

profundum (SGP). Finalmente, la capa más profunda está formada por fibras adyacentes a la

sustancia gris periacueductal y se denomina stratum album profundum (SAP) (Figura 2). Existen

nomenclaturas alternativas según se trate de resultados obtenidos a partir de estudios

electrofisiológicos o anatómicos. La nomenclatura utilizada en este trabajo de Tesis corresponde

a una revisión de May (2006).

Las fibras de las CGRs ingresan al CS por el SO y avanzan hasta las capas más superficiales. El

principal sitio de conexión es el SGS superior y en menor medida, el SO. Se han observado

diferencias notables entre especies en las capas del CS, particularmente en la capa SGS, así como

Introducción

20

en la proporción de fibras que proyectan al CS. En animales con una región escasa de

binocularidad, como en el caso de los roedores, la gran mayoría de las terminales retinianas

proyectan del ojo contralateral. Se estima que en la rata, aproximadamente el 98% de las CGRs

proyectan al CS contralateral (Lund y col., 1980). Las fibras de proyección ipsilateral de las

CGRs de la retina temporal proyectan a la capa SO y al SGS inferior. Como se mencionó

anteriormente, un porcentaje de estas fibras son de proyección bilateral.

Las proyecciones cortico-tectales del área 17, 18 y 19 ipsilateral llegan principalmente a las

capas SGS inferior y SO y presentan una organización retinotópica. Estas proyecciones

pertenecen a neuronas piramidales de la capa V del córtex visual. Otro núcleo de conexión con el

CS es el NGL. Neuronas de la capa SGS proyectan a la porción dorsal y ventral del NGL (Figura

2D). Mediante el uso de trazadores, se ha observado que existe una red compleja de conexión

entre capas del CS (revisado por May, 2006). Asimismo, existen neuronas tecto-tectales que

comunican ambos CS (Yamasaki y col., 1984).

Las capas profundas del CS procesan información proveniente de estímulos auditivos y

somatosensoriales. Además, en estas capas se encuentran neuronas de procesamiento

multisensorial (cross-modal). Se ha observado que la frecuencia de disparos de potenciales de

acción aumenta cuando se presentan estímulos de diferente modalidad provenientes de la misma

localización espacial y en una ventana temporal estrecha (Alvarado y col., 2009).

Estudios en ratones han demostrado que las proyecciones retinianas tienen una representación

topográfica ordenada de inervación en las capas superficiales del CS: el eje nasal-temporal y el

eje dorsal-ventral de la retina tienen proyección anterior-posterior y medial-lateral en el CS,

respectivamente (Dräger y Hubel, 1975; 1976). Mediante el análisis de neuronas del CS en capas

profundas con electrodos de penetración vertical, se ha demostrado además, que los campos

visuales están alineados verticalmente con campos receptivos táctiles (vibrisas o partes del

cuerpo). Este arreglo espacial multisensorial se ha observado en menor medida con campos

receptivos auditivos, dado que estos campos son siempre mucho más grandes.

Introducción

21

Figura 2. Representación esquemática de la estructura del CS. A: esquema en vista sagital del cerebro de rata. La

línea punteada indica la zona medial del CS en corte coronal que se muestra en el panel B. B: corte coronal en la

zona medial del CS (en gris). Se muestra un detalle en C. C: detalle de las capas del CS. D: patrón de inervación de

las capas superiores del CS. Las capas superiores del CS reciben inervación de las CGRs, fibras del NGL y también

terminales de neuronas corticales (neuronas piramidales de la capa V). SZ, stratum zonale; SGS, stratum griseum

superficial; SO, stratum opticum; SGI, stratum griseum intermediale; SAI, stratum album intermediale; SGP,

stratum griseum profundum; SAP, stratum album profundum. Modificado de Paxinos y Watson, 1997; May, 2006.

3. Isquemia retiniana

El daño isquémico es un componente central de diversas enfermedades retinianas. Las isquemias

retinianas agudas ocurren como resultado de la oclusión (principalmente por trombosis) de la

ACR y en forma más crónica se asocian a la obstrucción de la vena central de la retina. La

obstrucción de la ACR es uno de los eventos más súbitos y dramáticos que se pueden encontrar

en la práctica clínica oftalmológica. La obstrucción de la ACR conlleva a una pérdida aguda y en

algunos casos permanente de la visión, debido a la afectación de las capas internas de la retina.

Entre las patologías retinianas isquémicas más frecuentes, se encuentran la retinopatía diabética

y el glaucoma, ambas enfermedades asociadas a un riesgo considerable de ceguera irreversible.

Introducción

22

Existen además causas sistémicas que generan isquemia retiniana, como la retinopatía por

hipertensión arterial u obstrucciones arteriales, como la estenosis de la arteria carótida.

No se dispone actualmente de recursos eficaces para la prevención o terapéutica del daño

isquémico retiniano debido a diversos obstáculos que han limitado el desarrollo de agentes

neuroprotectores. Uno de ellos es el tiempo; un determinado tratamiento debería ser

administrado en una ventana temporal estrecha respecto al acontecimiento isquémico, lo que

resulta frecuentemente impracticable en la clínica. En segundo lugar, las alternativas examinadas

hasta ahora han demostrado una protección incompleta, con riesgo de efectos inespecíficos y/o

adversos.

La retina es uno de los tejidos con mayor consumo de oxígeno. La constante renovación y

fagocitosis de los segmentos externos membranosos por parte de los FR y el epitelio

pigmentario, representan una elevada demanda energética. De hecho, estas células presentan un

alto número de mitocondrias. Como se mencionó anteriormente, la retina interna está irrigada

por un plexo vascular denso, mientras que la retina externa se nutre principalmente por difusión

de los capilares de la coroides, uno de los tejidos con mayor flujo sanguíneo. La retinopatía

isquémica se desencadena como resultado de la falla en la perfusión. Como consecuencia, el

flujo sanguíneo es insuficiente para compensar los requerimientos metabólicos retinianos. A

nivel celular, el daño isquémico consiste en una cascada de retroalimentación de diversos

mecanismos de daño celular, como despolarización, aumento del influjo de calcio, estrés

oxidativo y aumento de la neurotransmisión glutamatérgica, entre otros (Osborne y col., 2004).

Además, la reperfusión con sangre oxigenada después de la isquemia también tiene el potencial

de agravar el daño isquémico, un efecto conocido como lesión por reperfusión.

En condiciones de hipoxia se produce una inhibición de la síntesis proteica. Sin embargo, la

hipoxia es también un inductor del factor de transcripción HIF-1 (del inglés, hypoxia inducible

factor-1). HIF-1 desempeña un papel central en la homeostasis celular en respuesta a la hipoxia,

al unirse a regiones específicas del promotor (sitios HREs, del inglés hipoxia-response elements)

Introducción

23

de genes blanco. En respuesta a la hipoxia hay una rápida activación de HIF-1 que induce la

expresión de genes asociados a la regulación metabólica celular (como transportadores de

glucosa), angiogénesis (principalmente VEGF) y apoptosis (Bcl2 y otros factores

proapoptóticos), entre otros (revisado por Arjamaa y Nikinmaa, 2006).

4. Inducción de tolerancia isquémica

Frente al daño isquémico, y en base a la vacancia terapéutica ya mencionada, se ha sugerido

como estrategia alternativa y/o complementaria la inducción de mecanismos endógenos de

protección. El pre-condicionamiento isquémico (PCI) es un mecanismo de resistencia frente a

una injuria isquémica seguida de reperfusión, que se produce como consecuencia de la

aplicación previa de un insulto isquémico moderado/subumbral y generalmente breve. El PCI fue

originalmente descripto en el miocardio en 1986 (Murry y col., 1986) y desde entonces se ha

demostrado su efectividad en diversos sistemas, como riñón, hígado y cerebro (Pasupathy y

Homer-Vanniasinkam, 2005; Gidday, 2006). El PCI retiniano se demostró por primera vez en

1998, un hallazgo relativamente tardío en comparación con las evidencias obtenidas más de diez

años antes en otros tejidos (Roth y col., 1998). El PCI desencadena reacciones adaptativas a

nivel celular que protegen al tejido frente al daño isquémico y además contribuyen a

“reprogramar” la respuesta a la isquemia (Gidday, 2006). Cuando se exponen retinas a una

isquemia prolongada por aumento de la PIO (120 mm Hg) por encima de la presión sistólica

arterial durante 45 - 60 min, se produce una caída de la actividad electrorretinográfica y una

alteración notable e irreversible de la estructura retiniana. Si entre 24 y 72 h antes del episodio

isquémico se exponen las retinas a un aumento de la PIO de la misma magnitud pero durante

períodos cortos (~ 5 min), se observa un efecto protector significativo a nivel funcional e

histológico, que puede llegar incluso a la protección completa (Roth y col., 1998). Un aspecto

clave para la efectividad del PCI retiniano es su temporalidad. Una separación de 24 ó 72 h entre

el estímulo subumbral y la injuria isquémica induce una protección significativa, mientras que

Introducción

24

una separación de 1 h ó 7 días es inefectiva. El hecho de que sea necesario un período no menor

a 24 h podría indicar que la tolerancia inducida por PCI en la retina requiere la expresión de

proteínas con funciones protectoras. En este sentido, se ha demostrado que la inhibición de la

síntesis proteica con cicloheximida bloquea el PCI retiniano (Roth y col., 1998). Sin embargo,

resulta altamente probable que la neuroprotección retiniana incluya una serie compleja de

cambios moleculares y neuroquímicos que aún no se han identificado en forma concluyente.

Si bien una isquemia breve constituye el estímulo prototípico de PCI, es posible inducir

tolerancia isquémica por exposición a estímulos endógenos o exógenos de naturaleza no

isquémica, de forma tal que un determinado estresor puede inducir “tolerancia cruzada” respecto

a un estresor de distinta naturaleza (Gidday, 2006). La naturaleza variada de estímulos capaces

de inducir un fenotipo resistente sugiere que las vías de transducción de señales involucradas

podrían converger en un mecanismo común, finalmente responsable de la tolerancia isquémica.

En nuestro laboratorio hemos demostrado que una inflamación ocular moderada inducida por la

inyección intravítrea de 1 g de lipopolisacárido bacteriano (LPS) provoca un efecto protector

funcional e histológico significativo frente a una isquemia deletérea inducida 24 h post-inyección

de LPS (Franco y col., 2008).

Otro aspecto de interés en este área es la demostración de que una isquemia subumbral en un

determinado tejido puede inducir tolerancia isquémica en otro (Dave y col., 2006). En este

sentido, se ha demostrado que la aplicación de un torniquete breve en los miembros inferiores o

el ejercicio físico proveen protección frente a la isquemia en distintos tejidos. Este fenómeno ha

recibido la denominación de pre-condicionamiento remoto y sugiere la participación de señales

humorales o neurales que se transmiten desde el área en la que se aplicó el estímulo pre-

condicionante hacia el tejido sometido a la injuria isquémica (Loukogeorgakis y col., 2005). Las

posibles implicancias terapéuticas del pre-condicionamiento remoto han estimulado la

realización de estudios en humanos. En el año 2006 se publicó un estudio de PCI remoto en

miembros inferiores de niños sometidos a cirugía para reparación de defectos cardíacos

Introducción

25

congénitos (Cheung y col., 2006). Los pacientes expuestos a PCI remoto demostraron un menor

grado de lesión de miocardio que los controles. Estos resultados avalan sólidamente el fenómeno

de pre-condicionamiento remoto y enfatizan la necesidad de examinar la naturaleza de los

mecanismos involucrados.

Si bien el PCI podría constituir una herramienta clínica eficaz en la atenuación de los efectos

deletéreos inducidos por isquemia/reperfusión, es indudable que la posibilidad de inducir

protección con una manipulación posterior al evento isquémico, amplificaría notablemente su

potencialidad clínica. Se ha examinado la posibilidad de inducir mecanismos protectores a

posteriori del episodio de isquemia/reperfusión, es decir, mecanismos de post-condicionamiento

isquémico (PostC). El PostC consiste en la aplicación de ciclos breves de isquemia/reperfusión

durante la reperfusión que sigue a un insulto isquémico prolongado. Se ha demostrado que el

PostC en el miocardio puede ser tan eficaz como el PCI en reducir el tamaño del infarto

(Granfeldt y col., 2009). En el año 2005 se publicaron los resultados de los dos primeros estudios

clínicos sobre PostC en el miocardio, que demuestran que esta estrategia constituye una

intervención segura y eficaz para inducir protección en pacientes con enfermedad cardíaca

isquémica (Staat y col., 2005; Laskey, 2005). En forma más reciente, se ha demostrado que el

PostC es efectivo aun cuando se aplica en áreas distantes al tejido que fue previamente dañado

por isquemia, lo que se denomina PostC remoto (Li y col., 2006a).

Aunque aún se desconoce el engrama molecular de la tolerancia isquémica, se dispone de

considerable aval experimental respecto a la participación de un conjunto notablemente complejo

de señales, que incluyen neurotransmisores, neuromoduladores, canales mitocondriales de K+

sensibles a ATP, radicales libres, proteína quinasas, citoquinas y factores de transcripción, entre

muchos otros (Wang y col., 2002; Gidday, 2006). Diversos autores han evaluado la posibilidad

de reproducir farmacológicamente el efecto protector del PCI. En este sentido, la administración

de agonistas selectivos para el receptor de adenosina A1 ó A2a induce una protección

significativa frente al daño isquémico retiniano (Li y Roth, 1999). Posteriormente, estos autores

Introducción

26

demostraron la participación de los canales mitocondriales de K+ sensibles a ATP, entre otros

factores, en la cascada de señales que desencadena el PCI inducido por adenosina (Li y col.,

2000). En este contexto, se ha propuesto que la adenosina puede desempeñar, por un lado, un rol

modulatorio al activar proteínas quinasas y fosfolipasas y/o estimular la expresión de proteínas

con actividad neuroprotectora, o bien, podría desempeñar un rol directo sobre la neurona

modificando los niveles de aminoácidos excitatorios, provocar la entrada de Ca2+ y una

hiperpolarización post-sináptica (Li y col., 2000). En un trabajo reciente publicado por Brandt y

col. (2011) se ha demostrado que el aumento de los niveles intracelulares de Ca2+ constituye un

estímulo pre-condicionante que protege a las CGRs del daño por glutamato.

Diversas líneas experimentales han demostrado la participación de los canales mitocondriales de

K+ sensibles a ATP en el PCI en miocardio y en el cerebro (Sato y col., 2000; Busija y col.,

2004). La inhibición farmacológica de estos canales durante el PCI ha sido la principal

herramienta para determinar su participación en los mecanismos de tolerancia isquémica

retiniana. Sin embargo, al presente se desconoce su estructura molecular, por lo que aún existe

controversia respecto al mecanismo por el cual la apertura de estos canales induce protección

frente a un daño isquémico. Incluso se desconoce el mecanismo que desencadena la apertura de

estos canales durante el evento isquémico. Se han propuesto diversos mediadores que podrían

estimular la apertura de estos canales, como el óxido nítrico, la proteína quinasa C (PKC) o las

especies reactivas del oxígeno (ROS) (revisado por O'Rourke, 2004).

Diferencias en la intensidad, duración y/o frecuencia de un estímulo estresante determinan si este

estímulo es demasiado débil para inducir una respuesta, de magnitud suficiente para

desencadenar tolerancia, o bien demasiado robusto y por lo tanto deletéreo per se. Por lo tanto,

es posible que el PCI y el PostC provoquen cambios menores en los sistemas de señales

involucrados en el daño isquémico, desencadenando respuestas adaptativas en lugar de

deletéreas. En este marco, una orientación clave para la búsqueda de las señales involucradas

provino de la identificación de factores que participan del daño isquémico, asumiendo la

Introducción

27

hipótesis de que cambios menores en estos sistemas inducen protección. En este sentido, un

ejemplo clave es el glutamato. La participación del glutamato en el daño isquémico así como en

el mecanismo de inducción de tolerancia isquémica se discutirá en detalle en la sección 6.1.

Se ha sugerido que el óxido nítrico participa tanto en mecanismos de protección como de daño

celular. El óxido nítrico es sintetizado a partir de L-arginina por la enzima óxido nítrico sintasa

(NOS). Las isoformas de NOS presentes en neuronas (NOS neuronal (nNOS)) y en células

endoteliales (NOS endotelial (eNOS)) son enzimas de expresión constitutiva, cuya actividad

depende de los niveles de calcio intracelular. Existe además una isoforma inducible de NOS

(iNOS) independiente de calcio. Sakamoto y col. (2006) demostraron la participación de la iNOS

en el PCI retiniano, mientras que Roth y col. (2006) han caracterizado la participación de la

eNOS. Por otra parte, Zhu y col. (2006) han demostrado que la tolerancia isquémica frente a una

isquemia retiniana es tan efectiva en ratones knockout para iNOS como en los controles. Estos

autores proponen la participación efectiva de eNOS y nNOS en la respuesta adaptativa inducida

por PCI retiniano.

5. Retinopatía diabética

La retinopatía diabética es la principal causa de ceguera irreversible en adultos y sólo en EEUU

provoca más de 8.000 casos por año de nueva ceguera. Aunque no se dispone de estadísticas

actualizadas, se estima que existen ~ 1.800.000 personas con diabetes en nuestro país. A los 10

años del diagnóstico, hasta un 5% de los pacientes desarrolla amaurosis y hasta un 30% padece

una marcada disminución visual. Esta alteración es causada por un deterioro vascular retiniano

que puede provocar edema y extravasación sanguínea, que en muchos casos se ubican en la

mácula, la zona de máxima agudeza visual. La isquemia, una de las consecuencias centrales de la

disfunción, a través de la inducción de factores de crecimiento (particularmente el factor de

crecimiento vascular endotelial (VEGF)) estimula la formación de neovasos frágiles y de fácil

sangrado (retinopatía diabética proliferativa). En etapas más tardías, los neovasos (algunos

Introducción

28

fenestrados) crecen sobre la retina hacia el humor vítreo. Cuando el vítreo se desprende de la

retina, lo que ocurre frecuentemente en los diabéticos, éste tracciona los neovasos, que pueden

sangrar dentro y detrás del vítreo, provocando una hemorragia que puede obstaculizar parcial o

totalmente la visión. En el estadío final la tracción puede aumentar, separando la retina de la

pared ocular (desprendimiento de retina). También pueden crecer neovasos sobre el iris y el seno

camerular, ocasionando un aumento muy marcado de la PIO (glaucoma neovascular). El

aumento en la permeabilidad vascular es el resultado de alteraciones microvasculares tempranas,

con pérdida de pericitos, engrosamiento de la lámina basal y formación de microaneurismas.

Todas estas alteraciones han sido directamente asociadas con la hiperglucemia crónica. En

estadíos avanzados de la enfermedad, las complicaciones isquémicas se agravan, con reducción

en la perfusión de la red capilar e incluso se pueden observar zonas con ausencia completa de

perfusión.

Las estrategias terapéuticas actuales para el tratamiento de la retinopatía diabética son

esencialmente la aplicación de láser cuando aparecen signos de proliferación y la vitrectomía,

que sólo permiten prevenir la progresión de la enfermedad, pero que no logran en todos los casos

una recuperación visual significativa. Además, la fotocoagulación es un procedimiento

destructivo que puede provocar efectos secundarios adversos como pérdida de visión periférica,

visión de color o visión nocturna. Aunque el control estricto de la glucemia permite detener el

avance del déficit visual en un porcentaje considerable, la incorporación de nuevas estrategias

terapéuticas podría contribuir significativamente a disminuir la incidencia de esta disfunción o a

mejorar el cuadro.

Las posibilidades de identificar los mecanismos etiopatogénicos involucrados en el desarrollo y

progresión de la retinopatía diabética, a través de estudios que se limiten a analizar los cambios

clínicamente observables en pacientes diabéticos son limitadas y por ello, resulta imprescindible

realizar estudios invasivos más detallados, preferentemente en un modelo animal accesible. La

diabetes experimental en ratas inducida por la inyección de estreptozotocina (STZ) es un modelo

Introducción

29

ampliamente validado y por lo tanto, podría constituir una poderosa herramienta para elucidar

los mecanismos involucrados y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento de

esta enfermedad. La STZ pertenece al grupo de drogas antineoplásicas alquilantes, que

incrementa la generación del radial libre O2- por el sistema xantín-oxidasa de las células

pancreáticas y estimula la generación de H2O2 causando fragmentación del ADN y muerte

celular.

Uno de los signos característicos del daño vascular causado por la retinopatía diabética es la

disrupción de la barrera hemato-retiniana interna y el aumento de la permeabilidad vascular.

Estas alteraciones ocurren en un estadío temprano de la enfermedad, y afectan inicialmente a los

vasos de mayor calibre y luego a todo el lecho vascular. Múltiples evidencias experimentales

indican que el VEGF juega un rol central en el aumento de la permeabilidad vascular. En

muestras obtenidas de pacientes con retinopatía diabética proliferativa se ha observado un

aumento significativo de los niveles de VEGF en el cuerpo vítreo (Aiello y col., 1994; Ambati y

col., 1997). En diversos modelos experimentales de diabetes se han reproducido estos resultados

y se ha observado incluso aumento en los niveles del ARN mensajero de VEGF desde la semana

1 post-inducción de diabetes (Murata y col., 1996). Se ha postulado que el incremento en los

niveles de VEGF observado en la diabetes se debe a un aumento en la expresión que ocurre

principalmente en las CGRs y células amácrinas (Famiglietti y col., 2003). El VEGF es un factor

de crecimiento angiogénico y es también reconocido como un inductor del aumento de la

permeabilidad vascular. Se han descripto 5 isoformas diferentes de VEGF (de 121, 145, 165, 189

y 206 aminoácidos), que son resultado del splicing alternativo, siendo la isoforma VEGF165 la

más abundante. Al presente, se han identificados dos tipos de receptores de tipo tirosín-quinasa

para VEGF: VEGF-R1 (Flt-1) y VEGF-R2 (KDR/Flk-1). Aunque el mecanismo por el cual el

VEGF aumenta la permeabilidad vascular no se conoce en detalle, se ha observado que la

activación de estos receptores en células endoteliales provoca la disminución en la expresión de

ocludinas, contribuyendo a la disrupción de las uniones oclusivas (Spoerri y col., 2006). En

Introducción

30

concordancia con estos resultados, Kaur y col. (2007) han demostrado que la inhibición de la

producción de VEGF reduce el aumento de la permeabilidad vascular. En los últimos años se ha

invertido considerable esfuerzo en el desarrollo de terapias anti-VEGF. En este sentido, existe un

interés creciente en tratamientos con anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que inhiben

específicamente los efectos del VEGF. De hecho, diversos estudios clínicos se encuentran

actualmente en curso; sin embargo, se han obtenido resultados dispares según las características

particulares de los pacientes (revisado por Romero-Aroca, 2011). La complejidad de las vías

involucradas en las alteraciones vasculares sugiere que la aplicación de estrategias

complementarias es necesaria para un tratamiento eficaz frente a las alteraciones vasculares

diabéticas.

Si bien la retinopatía diabética ha sido clásicamente considerada una vasculopatía, resultados de

varios estudios indican que las neuronas retinianas también son un blanco temprano de la

diabetes. La atrofia de CGRs y la degeneración de la CNI fue inicialmente descripta por Wolter

(1961) en muestras obtenidas de pacientes diabéticos, quien sugirió además que la pérdida

gradual de neuronas comienza en etapas tempranas de diabetes y que esta degeneración puede

dar lugar a cambios vasculares secundarios. Bloodworth (1962) realizó una caracterización

histopatológica de la degeneración de las CGRs en autopsias de pacientes diabéticos y observó la

presencia de células de aspecto picnótico y con fragmentación nuclear. En un estudio posterior,

Barber y col. (1998) demostraron la muerte por apoptosis de CGRs en un modelo de diabetes

experimental. En los últimos años se han publicado diversos trabajos en los que se analizó en

detalle las alteraciones y la degeneración de las CGRs y de la capa de fibras en diversos modelos

de diabetes experimental (revisado por Kern y Barber, 2008). En base a estos resultados, se ha

postulado que la diabetes podría afectar directamente el metabolismo retiniano, provocando

apoptosis de CGRs, y estas alteraciones podrían a su vez, causar la ruptura de la barrera hemato-

retiniana interna.

Introducción

31

Además de la neurodegeneración de CGRs, se han observados otras alteraciones en las CGRs,

como degeneración axonal, disrupción del transporte retrógrado o disminución en la expresión

de proteínas asociadas a la liberación y reciclado de vesículas presinápticas, como sinaptofisina o

VAMP2 (del inglés, vesicle-associated membrane protein), en estadíos tempranos de la

enfermedad (Scott y col., 1986; Ino-Ue y col., 2000; VanGuilder y col., 2008). Como se

mencionará en detalle en la sección 6.1, se han observado también alteraciones tempranas en el

sistema glutamatérgico retiniano de animales diabéticos y se ha sugerido que el aumento en los

niveles de glutamato en la retina podría estar asociado a la neurodegeneración retiniana temprana

observada en la diabetes.

6. El glutamato retiniano

El glutamato es el principal neurotransmisor excitatorio retiniano. Proviene de la dieta y es

también sintetizado endógenamente a partir de amonio y -cetoglutarato y es utilizado en la

síntesis de proteínas y de otros aminoácidos e incluso para la síntesis de otros neurotransmisores,

como el GABA. El glutamato que actúa como neurotransmisor es incorporado en vesículas

presinápticas por un transportador, en un proceso dependiente de ATP. Una vez liberado de las

vesículas presinápticas, el neurotransmisor difunde por la brecha sináptica hasta alcanzar los

receptores postsinápticos. Existen diversos receptores glutamatérgicos que se han clasificado en

función de la respuesta celular desencadenada y su sensibilidad frente a determinados análogos

farmacológicos. Estos receptores se dividen en dos grandes grupos: los receptores ionotrópicos

(asociados a canales que permiten el flujo de iones) y los receptores metabotrópicos (acoplados a

proteínas G). A su vez, existen tres clases de receptores ionotrópicos: receptores del ácido -

amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPA), receptores de kainato y receptores de

N-metil-D-aspartato (NMDA). Estas tres clases de receptores ionotrópicos para glutamato son

complejos macromoleculares que contienen tres dominios transmembrana denominados M1, M3

y M4 y una porción reentrante en la membrana, el dominio M2, que le confiere las distintas

Introducción

32

selectividades iónicas del canal. La estimulación de los receptores NMDA es responsable del

incremento en las concentraciones de calcio intracelular y en condiciones de hiper-estimulación,

de una cascada de eventos que puede desencadenar muerte celular.

Los receptores NMDA están compuestos por un homo- o hetero-tetrámero formados a partir de

tres subunidades (Tabla 1). Presentan un sitio de unión para glutamato, glicina, magnesio, zinc y

un sitio de unión de poliaminas. Los sitios de unión para glutamato y glicina juegan un rol clave

en la activación y apertura del canal, mientras que el Mg2+ actúa como un bloqueante

dependiente de voltaje que se remueve al despolarizarse la membrana. Por su parte, los sitios de

unión para Zn2+ y poliaminas modulan la actividad del receptor.

Se han desarrollado diversos antagonistas del receptor NMDA que están siendo evaluados como

posibles agentes protectores frente a enfermedades neurodegenerativas (Iseri y col., 2011;

Figueiredo y col., 2011). A nivel retiniano, se han localizado receptores glutamatérgicos del tipo

no-NMDA y NMDA en CGRs, células amácrinas, células bipolares y horizontales (revisado por

Pulido y col., 2007).

Además de los receptores ionotrópicos, el glutamato también se une a receptores metabotrópicos

acoplados a proteínas G, modulando la producción de segundos mensajeros intracelulares y

mediando efectos lentos. Se han identificado al menos 8 subtipos de receptores metabotrópicos

de glutamato y éstos a su vez han sido clasificados en tres grupos distintos, basados en la

homología de su secuencia, su perfil farmacológico y su acoplamiento a mecanismos de

señalización intracelular. El primer grupo está integrado por el subtipo mGluR1 y mGluR5, que

activa a una fosfolipasa C, mientras que los miembros del segundo (mGluR2 y GluR3) y el tercer

grupo (mGluR4, mGluR7 y mGluR8) están acoplados negativamente a la adenilato ciclasa; el

receptor mGluR6 está acoplado a la activación de una fosfodiesterasa de GMPc y es específico

de la retina (revisado por Yang, 2004a).

El glutamato liberado al espacio sináptico es mayoritariamente captado por células de Müller y

astrocitos y en una proporción menor por neuronas presinápticas, en tanto que otra porción

Introducción

33

pequeña difunde fuera del espacio sináptico, con posible función periférica (DeVries, 2000). Los

procesos gliales que rodean las sinapsis retinianas expresan transportadores de glutamato que

captan al neurotransmisor y lo transportan al citoplasma celular, donde es amidado por la enzima

glutamina sintetasa (GS). El resultado de esta reacción es la conversión de un producto

potencialmente tóxico como el glutamato en glutamina, un producto no tóxico. La glutamina es

luego liberada de la célula glial y captada por neuronas a través de transportadores específicos.

La glutamina es finalmente hidrolizada a glutamato, por acción de la glutaminasa, completando

el ciclo glutamato/glutamina (Thoreson y Witkovsky, 1999; Poitry y col., 2000) (Figura 3). El

clearance apropiado de glutamato es crucial para una transmisión sináptica normal, así como

para evitar el posible daño por sobre-estimulación post-sináptica. La excitotoxicidad

glutamatérgica (principalmente mediada por activación de receptores NMDA) provoca la entrada

excesiva de calcio con la consecuente activación de caspasas mitocondriales. Una característica

central de este ciclo es que la perturbación de cualquiera de los procesos que lo componen podría

afectar en forma significativa el clearance y reciclado del neurotransmisor (Pow, 2001).

Los transportadores de glutamato son responsables de controlar la concentración del

neurotransmisor y por ello, desempeñan un rol primordial en la regulación del balance entre la

señalización fisiológica y la sobre-activación patológica (Rauen y Wiener, 2000). La recaptación

retiniana de glutamato es un proceso de alta afinidad, electrogénico y acoplado al gradiente de

Na+ transmembrana. Una molécula de glutamato se co-transporta con 3 de Na+ y un H+ y contra-

transporta con un K+. Por lo tanto, como consecuencia del influjo de glutamato, se produce una

translocación neta de dos cargas positivas y acidificación intracelular (Amara y Fontana, 2002).

Al presente se han descripto cinco tipos de transportadores de glutamato: GLAST (L-glutamate-

arginine transporter) o EAAT-1 (excitatory aminoacid transporter), GLT-1 (glutamate

transporter) o EAAT-2, EAAC-1 o EAAT-3, EAAT-4 y EAAT5 (Rauen y Wiener, 2000; Kanai

y Endou, 2001; Bak y col., 2006). Tanto por métodos inmunohistoquímicos como

autorradiográficos, se ha demostrado que la recaptación de glutamato tiene lugar en células de

Introducción

34

Müller, en astrocitos y en células del epitelio pigmentario y en muy bajo porcentaje en neuronas

retinianas (Ehimger y Falck, 1971; Derouiche y Rauen, 1995; Chaudhry y col., 2002). El

transportador de tipo GLAST es el principal transportador de glutamato en la retina y se expresa

en los procesos de las células de Müller y astrocitos (revisado por Tanaka, 2000); el

transportador de tipo GLT-1 se localiza en células bipolares y el EAAC-1 en células

horizontales, amácrinas y CGRs (Pow, 2001). El nivel relativo de expresión de transportadores

de glutamato en la retina de mamíferos es el siguiente: GLAST ≥ EAAC-1 > GLT-1 (Rauen y

Wiener, 2000). Diversos factores pueden regular la actividad de los transportadores de

glutamato. Por ejemplo, cambios en el estado de fosforilación de los transportadores de tipo

EAATs afectan significativamente su función, tanto a corto como a largo plazo (Pow, 2001). Por

otra parte, los transportadores de glutamato son capaces de transportar el sustrato en ambas

direcciones en función del potencial químico (Szatkowski y col., 1990) y de los gradientes

iónicos a ambos lados de la membrana, por lo que modificaciones en la concentración

intracelular de ATP influyen en el sentido del transporte (Anderson y Swanson, 2000).

Tabla 1. Receptores y transportadores de glutamato.

R

ecep

tore

s

Posibles subunidades Respuesta a la estimulación glutamatérgica

Ionotrópico

NMDA NR1, NR2A-D y NR3A-B Aumento del influjo de Ca2+ (Na+) intracelular

AMPA GluR1-4 Aumento del influjo de Na+ (Ca2+) intracelular

Kainato GluR5-7 KA1-2 Aumento del influjo Na+ (Ca2+) intracelular

Metabotrópico

Tipo I mGluR1, mGluR5 Aumento de los niveles de inositol fosfato y diacilglicerol

Tipo II mGluR2, mGlur3 Disminución de los niveles de adenosina monofosfato cíclico

Tipo III mGluR4, mGluR6-8 Modula los niveles de adenosina monofosfato cíclico

Tra

nspo

rtad

ores

Localización retiniana predominante

Glial EAAT1 (GLAST) Células de Müller y astrocitos

Neuronal

EAAT2 (GLT1) Células bipolares y conos

EAAT3 (EAAC1) Células ganglionares, bipolares, horizontales y amácrinas

EAAT4 Células ganglionares, bipolares, horizontales y amácrinas

EAAT5 Células bipolares y fotorreceptores

Modificado de Pulido y col., 2007.

Como ya se mencionó, la GS es la enzima que cataliza la conversión de glutamato y amonio en

glutamina, a través de un proceso dependiente de ATP. Se ha demostrado que los transportadores

Introducción

35

de glutamato y la GS coexisten en una misma célula de Müller, lo que ha llevado a postular que

la actividad de las proteínas que median la recaptación de glutamato y su conversión a glutamina

podrían estar concertadas (Derouiche y Rauen, 1995; Shaked y col., 2002). La actividad de GS

en células de Müller les confiere una enorme capacidad de remover glutamato extracelular, dado

que la conversión de glutamato en glutamina es muy rápida, lo que provee una fuerza motriz

para el influjo de glutamato mayor que en neuronas que tienen una concentración intracelular

mayor de glutamato libre. De esta forma, la actividad acoplada de GLAST y GS (ambos

componentes centrales del ciclo glutamato/glutamina retiniano) en las células de Müller es

crucial para el control del clearance del neurotransmisor (Rauen y Wiener, 2000).

Figura 3. Representación esquemática del ciclo glutamato/glutamina. Una vez liberado al espacio sináptico, el

glutamato interactúa con receptores post-sinápticos y luego es removido de la sinapsis a través de transportadores

específicos que permiten su acceso al interior de las células de Müller, en las que es convertido en glutamina por

actividad de la GS. La glutamina se libera de estas células y se incorpora a neuronas retinianas en las que se

reconvierte en glutamato, en una reacción catalizada por la glutaminasa.

La transferencia de glutamina entre células gliales y neuronas involucra su eflujo a través de la

membrana de las células gliales y su influjo por la membrana plasmática neuronal, ambos

Introducción

36

procesos mediados por transportadores específicos. Los transportadores de glutamina se

clasifican principalmente en 2 categorías, en función de su dependencia de Na+. Los

transportadores dependientes de Na+ utilizan la energía potencial asociada al gradiente

electroquímico transmembrana del ión, mantenido por la bomba Na+/K+ ATPasa. Una vez dentro

de la neurona, la glutamina es convertida a glutamato en una reacción catalizada por la

glutaminasa, enzima que se ubica principalmente en neuronas.

6.1. Participación del glutamato en el daño y en la protección retiniana

Diversas líneas experimentales sugieren la participación del glutamato en el daño isquémico. En

este sentido, se ha demostrado que el daño funcional y morfológico inducido por la sobre-

estimulación glutamatérgica es similar al observado luego de una isquemia retiniana deletérea

(Iversen, 1991; Ikeda y col., 1992; Nucci y col., 2007). En diversos modelos experimentales, se

ha sugerido que la toxicidad inducida por este aminoácido está mediada, al menos en parte, por

receptores NMDA, ya que agonistas específicos de este receptor reproducen los efectos del

glutamato y los antagonistas los bloquean (Sucher y col., 1997; Pang, 1999; Toriu y col., 2000).

Asimismo, la administración de inhibidores de la liberación glutamatérgica previene

significativamente el daño isquémico retiniano y la isquemia induce un aumento significativo en

los niveles de glutamato (Mosinger y col., 1991; Neal y col., 1994; Cazevieille y Ozborne,

1997).

Como se mencionó anteriormente, se han propuesto diversos factores como mediadores de la

tolerancia isquémica desencadenada por el PCI o el PostC. En este contexto, diversas evidencias

experimentales avalan la participación del glutamato en el PCI cerebral. En corteza cerebral de

rata se ha demostrado un aumento en la expresión de la GS inducido por el PCI (Hoshi y col.,

2006) y se ha sugerido la participación de transportadores de glutamato en la tolerancia

isquémica cerebral (Kosugi y col., 2005). Dado que el glutamato es el principal neurotransmisor

Introducción

37

retiniano, el estudio de la participación del sistema glutamatérgico en la inducción de tolerancia

isquémica adquiere una relevancia particular en este tejido.

En cuanto a la retinopatía diabética, se ha sugerido una posible relación causal entre el aumento

en los niveles de glutamato y la disfunción y neurodegeneración retiniana asociada a la diabetes.

Estudios realizados con muestras de pacientes con retinopatía diabética proliferativa sometidos a

vitrectomía, demostraron un aumento significativo en los niveles de glutamato (medido por

cromatografía líquida de alta presión)en el cuerpo vítreo, comparado con pacientes control de

edades similares (Ambati y col., 1997; Deng y col., 2000). Un estudio relativamente reciente de

Lu y col. (2007) ha confirmando estos resultados utilizando una técnica de electroforesis capilar

láser, que brinda mayor sensibilidad de detección aún en muestras pequeñas. Estos resultados se

han reproducido en modelos experimentales de diabetes (Lieth y col., 1998; Kowluru y col.,

2001). En estadíos tempranos luego de la inducción de diabetes en ratas, se ha observado un

aumento significativo en los niveles del receptor NMDA en células de la retina interna (Ng y

col., 2004), así como una mayor actividad de la PKC (Xu y col., 2004). En base a estos

resultados, se ha propuesto que el aumento en los niveles de calcio intracelular causado por la

sobre-activación glutamatérgica podría desencadenar, por un lado, la muerte celular y a su vez,

una cascada de eventos que involucran la activación de PKC que estimula la producción de

VEGF.

7. Los ritmos circadianos

El ciclo de luz/oscuridad causado por la rotación de la Tierra, produce cambios significativos

pero “predecibles” sobre la luz ambiental. Frente a este escenario cambiante, los organismos han

evolucionado y han adquirido la capacidad de generar una representación interna del ciclo de 24

h, o representación temporal circadiana. Este reloj circadiano interno determina el tiempo y las

fases en las cuales ocurren procesos fisiológicos y eventos conductuales en respuesta a los

cambios y señales ambientales externas. Esta adaptación ha permitido a los organismos

Introducción

38

optimizar la utilización de los recursos naturales y aprovechar las condiciones cambiantes del

ambiente tan pronto como tengan lugar, o bien, anticipándose a eventos futuros, como el cambio

de estaciones. De esta forma, determinados estímulos ambientales provocan cambios fisiológicos

en respuesta a condiciones ambientales en forma predictiva. Sin embargo, un reloj biológico

interno sólo representa una ventaja adaptativa si está sincronizado con el ambiente y más aún, si

puede adaptarse o re-sincronizarse frente a un estímulo nuevo. Por lo tanto, el oscilador

circadiano requiere una sincronización diaria, a partir de la percepción de señales externas

sincronizadoras, denominadas Zeitgebers (del alemán Zeit geber, dador de tiempo).

En ausencia de cambios ambientales definidos, es decir en condiciones constantes en las que no

hay indicios externos del paso del tiempo, un organismo se encuentra en libre curso o free

running. Bajo estas condiciones, el organismo expresa ritmos circadianos con un período

cercano, pero no exacto, al experimentado antes del aislamiento, lo que indica la existencia de un

reloj endógeno, denominado reloj circadiano, cuya periodicidad es de aproximadamente 24 h.

Los animales diurnos tienen un período circadiano de más de 24 h, mientras que ciertos animales

nocturnos, como muchos roedores, generalmente presentan un período circadiano de menos de

24 h (Aschoff, 1960; Pittendrigh, 1981a y b).

Para caracterizar un ritmo se pueden definir los siguientes parámetros: (período), A (amplitud)

y (fase). El período es el intervalo de tiempo entre dos sucesos idénticos, o sea, la duración de

un ciclo; la amplitud es la distancia entre el valor medio de la variable y el máximo valor que

alcanza ésta a lo largo del período; y por último, la fase indica a qué momento del ciclo temporal

corresponde la variable en estudio.

Los ritmos biológicos abarcan un amplio rango de períodos y pueden clasificarse de acuerdo a

ellos. La mayoría de los procesos conductuales y fisiológicos (temperatura, actividad, sueño-

vigilia, secreción de hormonas, etc.) oscila con un período cercano a las 24 h. Estos ritmos se

denominan circadianos (del latín circa, cerca de, y dies, día). Sin embargo, existen también

ritmos infradianos, que tienen un período menor a las 24 h (como el ritmo respiratorio o las

Introducción

39

distintas etapas del sueño) y ritmos con período mayor a 24 h, llamados ultradianos (como el

ciclo menstrual o el cambio de pelaje).

Las principales propiedades de los ritmos circadianos fueron originalmente definidas por Colin

Pittendrigh en 1960. Algunas de ellas son: 1) los ritmos circadianos son ubicuos, 2) los ritmos

circadianos son endógenos, 3) los ritmos circadianos son oscilaciones auto-sostenidas, 4) los

ritmos circadianos son innatos, 5) los ritmos circadianos se encuentran en todos los niveles de

organización de un organismo, 6) el período endógeno () es diferente en distintas especies, 7)

es prácticamente independiente de la temperatura, es decir que compensa sus variaciones (Q10

1) y 8) los ritmos circadianos se sincronizan por periodicidades ambientales de período T, siendo

la más importante el ciclo luz-oscuridad (Pittendrigh, 1960).

El sistema circadiano está constituido por tres componentes principales: 1) una vía de entrada del

Zeitgeber (o agente sincronizador); 2) un oscilador, formado por estructuras marcapasos que

generan la señal circadiana; y 3) vías eferentes desde los marcapasos a los sistemas efectores

(Moore y Card, 1985; Meijer y Rietveld, 1989; Morin y Allen, 2006).

El principal Zeitgeber en mamíferos es el ciclo de luz/oscuridad. Existe, sin embargo, la

posibilidad de que bajo determinadas condiciones, el Zeitgeber no sincronice al reloj sino que

afecte directamente las vías eferentes, fenómeno conocido como enmascaramiento (Mrosovsky,

1999). Además de la luz, el reloj puede ser sincronizado por un gran número de estímulos

diferentes, como la temperatura, los hábitos sociales, la actividad, los olores, etc. La luz es

percibida por el sistema circadiano a través de un sistema fotorreceptor especializado. Este

sistema fue originalmente descripto en vertebrados no mamíferos, en los que existen células

fotorreceptoras circadianas localizadas en distintas regiones del cerebro, que responden

directamente a la luz que penetra a través del cráneo (Menaker, 2003). En mamíferos, los

fotopigmentos circadianos pertenecen a la familia de las opsinas. Como se mencionará en detalle

más adelante, la principal opsina involucrada en la sincronización fótica es la melanopsina.

Tanto las CGRs que contienen melanopsina, como los FR clásicos (conos y bastones)

Introducción

40

contribuyen a la sincronización fótica (Berson y col., 2002; Hattar y col., 2003). El componente

principal del reloj biológico en mamíferos son los NSQ, dos grupos de neuronas que se

encuentran en la parte anterior del hipotálamo, en la base del tercer ventrículo y sobre el quiasma

óptico (Figura 4). Los NSQ están compuestos por una población heterogénea de células,

incluyendo múltiples clases de neuronas neuro-peptidérgicas y astrocitos (Abrahamson y Moore,

2001). En roedores, estos núcleos poseen alrededor de 20.000 neuronas y 8.000 astrocitos,

compactados en un volumen de aproximadamente 1 mm3 (Klein y col., 1991). La lesión o

ablación de los NSQ provoca la desaparición de los ritmos circadianos de actividad locomotora y

secreción hormonal, entre otros. De hecho, trasplantes de tejido hipotalámico conteniendo los

NSQ en animales con NSQ lesionados, restauran los ritmos circadianos, induciendo la ritmicidad

característica del donante en el receptor (Ralph y Lehman, 1991). Los NSQ se comunican con el

resto del organismo a través de proyecciones nerviosas y secreciones humorales, tanto para las

vías de entrada como para las de salida. Las principales aferencias provienen de la retina a través

del tracto retino-hipotalámico. Existen además aferencias desde el núcleo intergeniculado (que

recibe también inervación retiniana), el rafe, tanto del núcleo dorsal como del medial y del

núcleo paraventricular del tálamo (Krout y col., 2002). En realidad, muchos de los núcleos

hipotalámicos inervados por los NSQ establecen circuitos bidireccionales, inervando ellos

mismos a los NSQ en forma recíproca (Krout y col., 2002).

7.1. Células ganglionares retinianas intrínsecamente fotosensibles

El estudio de FR detectores de irradiancia que participan en la foto-sincronización ha permitido

la identificación de un gran número de opsinas en vertebrados y quizás el hallazgo en el área más

notorio de los últimos años, la identificación de un nuevo sistema de fotorrecepción en la retina

de mamíferos, mediado por el pigmento melanopsina presente en CGRs intrínsecamente

fotosensibes (CGRifs).

Introducción

41

En mamíferos, la fotorrecepción visual formadora de imagen y no formadora de imagen es

exclusivamente ocular. Se ha demostrado que la enucleación elimina todo tipo de respuesta

frente a un estímulo lumínico (Foster y col., 1991). En ratones dr/dr cl, que poseen una mutación

en el gen Pde6b (rd) (que codifica para una isoforma de la enzima fosfodiesterasa de bastones) y

expresan la toxina diftérica bajo regulación del promotor humano OPN1LW (cl) (que controla la

expresión de un pigmento específico de conos), lo que provoca la degeneración completa de

bastones y conos, se observó que estos animales aún podían regular múltiples procesos

fisiológicos en respuesta a la luz (Lucas y col., 1999). Estos estudios permitieron sugerir la

existencia de un sistema adicional de percepción de la luz en la retina, dado que en estos ratones

(rd/dr cl) un pulso de luz induce contracción pupilar e inhibe la actividad durante la noche

(enmascaramiento por luz). En el año 2002 se publicaron conjuntamente dos trabajos en los que

se identificó y caracterizó la respuesta de las CGRifs. En un trabajo realizado por Berson y col.

(2002) se identificaron retrógradamente estas células de proyección a los NSQ y se evaluó la

respuesta intracelular directa frente a pulsos de luz, en retinas aisladas en presencia de

bloqueantes farmacológicos de la respuesta de conos y bastones. Paralelamente, un trabajo

realizado por Hattar y col. (2002) demostró que estas células intrínsecamente fotosensibles

expresan el fotopigmento melanopsina y constituían un subset pequeño de CGRs

(aproximadamente el 1 - 2 % del total de las CGRs). Estudios posteriores demostraron que la

ablación genética de melanopsina (Opn4-/-) afecta de forma directa el reflejo pupilar y la

respuesta en los ritmos de actividad frente a estímulos de luz o cambios en las fases de

estimulación (Lucas y col., 2003). Finalmente, en animales triple-knockout (rd/dr cl Opn4-/-) se

demostró la ausencia completa de respuesta fisiológica frente a estímulos lumínicos (Hattar y

col., 2003). En suma, estos estudios demuestran que las CGRifs, que contienen melanopsina,

desempeñan un papel central en la sincronización circadiana, la regulación del período

circadiano en respuesta a luz, el reflejo pupilar, la foto-inhibición aguda de la actividad nocturna

y la regulación fótica de la biosíntesis de melatonina pineal, entre otras respuestas fisiológicas.

Introducción

42

Inicialmente, las CGRifs fueron consideradas una población relativamente uniforme de CGRs.

Estudios posteriores han permitido identificar distintas poblaciones de CGRifs con

características morfológicas y funcionales particulares, e incluso con diferentes targets de

proyección central. Utilizando diferentes métodos de marcación genética (línea Opn4tau/lacZ;

sistema Cre/LoxP) se ha demostrado que las CGRifs proyectan a núcleos que participan en

procesos formadores de imagen y no formadores de imagen. Los principales sitios de proyección

son los NSQ y la región periférica del NOP (proyección bilateral en ambos casos), que participan

en la regulación de los ritmos circadianos y el reflejo pupilar, respectivamente. Estas células

proyectan también a otras estructuras cerebrales como el núcleo intergeniculado lateral y la

región ventral del NGL, ambos vinculados al comportamiento circadiano, el núcleo supraóptico,

la zona subparaventricular y la amígdala medial (Figura 4) (Hattar y col., 2006). Estudios

posteriores han permitido identificar las proyecciones de las CGRifs al NGL dorsal y al CS,

ambos involucrados en el procesamiento de la información visual consciente. Aunque las

funciones principales de las CGRifs se hayan asociado inicialmente al procesamiento no

formador de imagen, el patrón complejo de inervación de estas células sugiere una participación

activa en el procesamiento de la imagen consciente (Brown y col., 2010 y 2011).

El estudio de las CGRifs ha transcendido ampliamente su papel inicial como pigmento visual

involucrado en la respuesta circadiana y el reflejo pupilar. Estudios recientes han comenzado a

elucidar el papel que estas células desempeñan en la formación de imagen, el desarrollo de la

retina y la maduración de las proyecciones centrales, así como su participación en diversas

patologías como desórdenes del sueño, ansiedad y depresión, entre otras. Sin embargo, a pesar

del rol central de la retina en el procesamiento de la información circadiana, existe aún escasa

información que permita vincular enfermedades oculares con alteraciones del sistema generador

de los ritmos biológicos.

Introducción

43

Figura 4. A: Representación esquemática del cerebro de roedores en corte sagital, en el que se representan los

núcleos de proyección de las CGRifs. B: Retina flatmouted de un ratón que expresa -gal bajo el promotor de

melanopsina. Se observan claramente las células melanopsina(+) y sus axones que corren hacia el disco óptico

(DO). C: Corte coronal de los NSQ. Se representa en gris la zona de proyección retiniana (región ventro-lateral) al

núcleo. 3V: tercer ventrículo; QO: quiasma óptico. D: corte coronal a la altura del NGL. En gris se observa las

proyecciones retinianas. PO: área preóptica; NSQ: núcleo supraquiasmático; ZSP: zona subparaventricular; NSO:

Núcleo supraóptico; AH; núcleo anterior hipotalámico; LH: núcleo lateral hipotalámico; AM: amígdala medial;

NGLv: núcleo geniculado lateral ventral; NGLd: núcleo geniculado lateral dorsal; NIG: núcleo intergeniculado, Cs:

colículo superior. Modificado de Hattar y col., 2006.

Objetivos

44

OBJETIVOS

Sobre la base de las consideraciones mencionadas en la Introducción, los objetivos centrales de

este trabajo de Tesis fueron:

Analizar el efecto del PostC como mecanismo protector frente al daño retiniano inducido

por isquemia aguda.

Elucidar los mecanismos involucrados en la protección inducida por PostC frente al daño

isquémico retiniano agudo.

Evaluar el efecto protector del condicionamiento isquémico retiniano en un modelo

experimental de diabetes.

Elucidar los mecanismos involucrados, en la protección inducida por el condicionamiento

isquémico frente al daño retiniano inducido por diabetes experimental.

Analizar el efecto de la diabetes experimental sobre la vía visual y las áreas cerebrales de

proyección retiniana en estadíos tempranos de la enfermedad.

Evaluar la efectividad de la inducción de tolerancia isquémica como mecanismo protector

frente a las alteraciones en la vía visual inducidas por la diabetes experimental.

Evaluar el efecto de la diabetes experimental sobre el sistema visual no formador de

imagen.

Materiales y métodos

45

MATERIALES Y MÉTODOS

1. Animales

Se utilizaron ratas Wistar macho adultas (300 - 350 g). Los animales se mantuvieron bajo

condiciones controladas de temperatura (21 ± 2°C) y humedad, bajo un fotoperíodo de 12 h de

luz (~ 300 lux en las jaulas) y 12 h de oscuridad (encendido de las luces a las 08.00 h) con agua y

alimento ad libitum. En todos los casos, los animales se anestesiaron con hidrocloruro de

ketamina (150 mg/kg) e hidrocloruro de xilacina (2 mg/kg) administradas intraperitonealmente y

en algunos casos se aplicó anestesia local (hidrocloruro de proparacaína 0.5%) en la córnea.

1.1. Inducción de isquemia retiniana. Los animales se anestesiaron y se aplicó anestesia local

en la córnea. Una vez comprobada la falta de respuesta frente a un estímulo corneal, se canuló la

cámara anterior de cada ojo con una aguja 30G conectada a un reservorio presurizado

conteniendo solución Ringer lactato. Mediante la modificación de la presión efectuada sobre el

reservorio, se modificó la PIO durante el tiempo deseado. Al momento de la canulación, se elevó

la presión en el reservorio a 60 - 80 mm Hg para evitar la pérdida de volumen de la cámara

anterior. Se elevó finalmente la PIO a 120 mm Hg (por encima de la presión sistólica, en ratas ~

90 mm Hg). De esta manera se logra una isquemia retiniana completa caracterizada por el

bloqueo total del flujo sanguíneo (observado mediante examinación del fondo de ojo con lupa de

oftalmología) y pérdida de la respuesta electrorretinográfica. Luego de completado el período de

isquemia retiniana, se retiró la aguja de la cámara anterior y se comprobó la inmediata

reperfusión y recuperación del flujo sanguíneo. En el caso del tratamiento simulado, se repitió el

mismo procedimiento pero sin el aumento de la PIO. Durante todo el procedimiento se controló

la temperatura corporal (termómetro rectal) y se mantuvo constante mediante el uso de mantas

térmicas. Se excluyeron de los experimentos aquellos animales que durante el procedimiento

sufrieron daño en el cristalino.

1.2. Inducción de diabetes experimental. Se administró de forma intraperitoneal una única dosis

de STZ (Sigma-Aldrich, USA) de 60 mg/kg (en buffer citrato 0,1 M, pH 4,5). En animales

Materiales y métodos

46

control se inyectó el mismo volumen de vehículo. Al día 3 post-inyección de STZ se controlaron

los niveles de glucosa en sangre (Contour TS, Bayer, Argentina) y aquellos animales con valores

superiores a 350 mg/dL se consideraron diabéticos. Se determinaron semanalmente los niveles

de glucosa en plasma y el peso corporal.

En todos los procedimientos se respetaron estrictamente las Guías para el Cuidado y Uso de

Animales de Laboratorio de ARVO, Association for Research in Vision and Ophthalmology.

2. Inyección intravítrea

Los animales se anestesiaron y se administró una gota de proparacaína en cada ojo, como

anestésico local. La inyección intravítrea se realizó utilizando una jeringa Hamilton de 10 l con

una aguja 30G, bajo un microscopio binocular de cirugía con luz coaxial (Colden, Argentina).

Con la ayuda de una pinza fina se sujetó el ojo y se introdujo la aguja a ~ 1 mm del limbo

esclerocorneal, a través de la pars plana (en un ángulo tal que evitara el contacto con el

cristalino). Se descargó lentamente el contenido de la solución y se dejó la aguja por 30 s para

evitar la salida de líquido de la cámara. Una vez completado el procedimiento, se realizó la

inyección intravítrea en el ojo contralateral. Luego de la inyección de volúmenes pequeños (4 - 5

l) se evaluó la PIO con un TonoPen XL (Mentor, USA) a distintos intervalos y se observó que

en ningún caso la inyección intravítrea provocó aumento de la PIO (datos no mostrados). Se

excluyeron los animales que desarrollaron cataratas o sangrado intraocular como resultado de la

inyección intravítrea.

2.1. Inyección intravítrea de glutamato. Se inyectaron 4 l de una solución 0,3 M de glutamato.

Para estimar la concentración final de glutamato (20 mM) se consideró un volumen total de

humor vítreo de 60 l (Sumioka y col., 2000). La dosis de glutamato se determinó en base a

resultados de Sisk y Kuwubara (1985).

Materiales y métodos

47

3. Procesamiento histológico

Bajo anestesia profunda, los animales se perfundieron con ~ 200 ml de solución fisiológica

seguida de ~ 300 ml de solución fijadora (paraformaldehído al 4% en buffer fosfato (PBS) 0,1

M, pH 7,4). Se disecó cuidadosamente el globo ocular con la porción intraorbital del NO y el

cerebro junto con la porción intracraneal del NO. Las muestras se post-fijaron en la misma

solución fijadora durante toda la noche.

Los ojos se procesaron, como se describirá posteriormente, y se obtuvieron cortes transversales

en parafina para el análisis morfométrico (espesor de capas retinianas y número de CGRs) e

inmunomarcación. Se disecó cuidadosamente la porción del NO proximal y distal (región

intracraneal próxima al quiasma óptico) y se procesaron, en algunos casos, para la obtención de

muestras semifinas (cortes transversales para análisis morfométrico) y en otros casos, se

incluyeron en parafina para la obtención de cortes para inmunomarcación. En este último caso,

se realizaron cortes transversales y longitudinales para evaluar las distintas poblaciones gliales.

Para el análisis de la región de la cabeza del NO, se disecó cuidadosamente la porción

intraorbital del NO (conteniendo parte de las tres túnicas de la pared ocular) y se incluyó en

parafina para la obtención de cortes transversales a distintas alturas del NO. En algunos casos,

los cerebros se cortaron coronalmente (~ 2 mm por detrás del quiasma óptico) y la porción

anterior se procesó para la obtención de cortes en parafina (sección horizontal) a la altura del

quiasma óptico. En otros casos, se realizaron secciones coronales y las distintas muestras del

cerebro anterior y posterior se procesaron para la obtención de cortes por congelación (cortes

coronales) de los distintos núcleos de proyección retiniana.

3.1 Secciones semifinas. Luego de varios lavados con PBS, las muestras se post-fijaron durante

1 h en 1% de OsO4 en el mismo buffer. Posteriormente, se realizaron varios lavados, las

muestras se deshidrataron mediante series crecientes de etanol, se aclararon en acetona y se

infiltraron en araldita. Se obtuvieron secciones semifinas (1m) mediante el uso de navajas de

Materiales y métodos

48

vidrio y un ultramicrótomo Porter-Blum MT2-B (Sorvall, USA), que se tiñeron con azul de

toluidina-bórax (Bancroft y Stevens, 1990).

3.2 Obtención de cortes en parafina. Luego de varios lavados, las muestras se deshidrataron

(serie creciente de alcohol: 70%, 90%, 100%), se aclararon en acetato de butilo y se embebieron

en parafina. Se obtuvieron secciones a lo largo del eje sagital del ojo, manteniendo la membrana

nictitante para facilitar su posterior orientación. Los cortes se utilizaron para el análisis

histológico y/o morfométrico (4 m, tinción con hematoxilina-eosina (H-E)) y para

inmunohistoquímica, inmunofluorescencia y análisis de células TUNEL(+) (7 m). Los NOs se

cortaron en sección transversal o longitudinal (7 m) y se utilizaron para estudios de

inmunofluorescencia. La porción anterior de los cerebros se incluyó en parafina y se obtuvieron

secciones horizontales (10 m) seriadas a la altura del quiasma óptico (conteniendo porciones

del NO y del tracto óptico) que se utilizaron para técnicas de inmunomarcación. Todos los cortes

se montaron sobre portaobjetos con carga electrostática (Superfrost Plus Esco, USA).

3.3 Cortes por congelación. Las muestras se sumergieron en soluciones crecientes de sacarosa

(10%, 20% y 30%), se armó un taco con solución criopreservante (Cryoblock, O.C.T, USA) y se

obtuvieron cortes coronales de cerebro (40 m) en un crióstato CM 1850 (Leica, Alemania). Las

secciones se mantuvieron en PBS/glicerol (50:50) a -20°C hasta su posterior utilización. Todos

los cortes se montaron sobre portaobjetos con carga electrostática.

4. Microscopía electrónica

4.1. Análisis ultraestructural de la retina y el nervio óptico. Se evaluó la ultraestructura de los

vasos de la retina interna y secciones transversales de distintas porciones del NO. Bajo anestesia

profunda, se expuso el corazón de los animales y se inyectó intracardiacamente 0,5 ml de

heparina (como anticoagulante) y 0,5 ml de nitroprusiato de sodio al 2,4% (como vasodilatador).

Los animales se perfundieron con ~ 200 ml de solución fisiológica seguida de ~ 300 ml de

glutaraldehído al 2% y paraformaldehído al 4% en PBS. Se disecó cuidadosamente el globo

Materiales y métodos

49

ocular y el cerebro (junto con la porción intracraneal del NO) y se post-fijó en el mismo fijador

durante 4 h a 4ºC con el agregado de sacarosa 0,2 M. Luego de la fijación, se tomaron muestran

de la pared del globo ocular (cercanas al NO) y porciones de NO de la región proximal y distal a

la papila óptica. Se obtuvieron secciones semifinas como se describió anteriormente. Luego del

análisis de las secciones semifinas, se obtuvieron secciones ultrafinas y se montaron sobre grillas

de 200 Mesh y se tiñeron con acetato de uranilo (1% en etanol al 70%) y con citrato de plomo de

Reynolds. Las secciones se analizaron en un microscopio electrónico Zeiss EM 10 del Instituto

Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA, Castelar, Buenos Aires, Argentina).

4.2. Estudio de la marca de lantano. Se analizó la integridad de la barrera hemato-retiniana

interna según el método de DePace (1984). Los animales se anestesiaron y perfundieron con ~

150 ml de 1 % NaNO3 en solución salina; luego se continuó la perfusión con ~ 300 ml de una

solución de lantano compuesta por: 20 mM de La(NO3)3.6H2O, 80 mM de NaCl, 3,5 mM de

KCl, 1 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2 y 1 mM de glucosa, pH 7,4. Luego de la solución de

nitrato de lantano, se perfundió por 10 min con ~ 300 ml de 2% de glutaraldehído y 4% de

paraformaldehído en una solución conteniendo 43 mM de Na2SO4, 16 mM de NaHCO3, 10 mM

de acetato de sodio, 3,5 mM de KCl, 1 nM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 1 mM de glucosa, 1,6

mM de Na2HPO4, 0,4 mM de NaH2PO4 y 33 mM de sacarosa, pH 7,4. En estas condiciones, el

lantano es insoluble y forma un precipitado electrón-denso que permite una clara localización

ultraestructural. Luego de la fijación, bajo lupa se tomaron muestras de las tres capas del globo

ocular cercanas al disco óptico. Las muestras permanecieron durante toda la noche en PBS con el

agregado de sacarosa 0,2 M y luego se procesaron como se describió en el punto anterior.

5. Análisis de células TUNEL(+)

Para la detección de células apoptóticas con fragmentación del ADN, se utilizó el kit de

detección in situ ApopTag (S7110, Chemicon-Millipore, USA), según las especificaciones del

fabricante. En cortes de retina se cuantificó el número total de células TUNEL(+) por sección.

Materiales y métodos

50

Los resultados obtenidos de 4 secciones separadas (a la altura de la cabeza del NO) se

promediaron y el valor promedio de 5 animales se consideró representativo de cada grupo. Para

el análisis del CS, se determinó el número de células TUNEL(+) en tres secciones coronales

(región rostral, medial y caudal) en la región retino-receptiva (capas SZ y SGS). El valor

promedio obtenido del análisis de 5 animales se consideró representativo de cada grupo

experimental.

6. Análisis de inmunomarcación y detección con isolectina GSA

Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios:

Anticuerpo Antígeno Especie y tipo Dilución Empresa

BDNF Factor neurotrófico derivado del cerebro Ratón

monoclonal 1:100

Neuromics, USA

Brn3a Factor de transcripción de alta expresión en neuronas Cabra policlonal 1:500 Millipore, USA

CD11b (OX42)

Integrina alfa M presente en macrófagos y microglía Ratón

monoclonal 1:100 Serotec, USA

c-Fos Proto-oncogén celular perteneciente a la familia de factores de transcripción de genes de expresión rápida.

Conejo policlonal

1:3000 Santa Cruz,

USA

ED1 (DC68) Glicoproteína de la superficie de la microglía activada, macrófagos, neutrófilos y basófilos.

Ratón monoclonal

1:100 Abcam, USA

GFAP Proteína ácida fibrilar glial característica de astrocitos y células de Müller reactivas

Ratón monoclonal

1:1200 cortes

1:400 montaje plano

Sigma, USA (conjugado-

Cy3)

MBP Proteína básica de mielina Conejo

policlonal ** **

Melanopsina Fotopigmento de las CGRifs Conejo

policlonal 1:1000

Affinity Bioreagent,

USA

NeuN Proteína nuclear específica de neuronas Ratón

monoclonal 1:200

Millipore, USA

O1 Componentes lipídicos de mielina de precursores de OL

Ratón policlonal IgM

** **

PDGFR- Receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaqueta

Cabra policlonal 1:100 Neuromics,

USA

Sinaptofisina Proteína integral de membrana presente en vesículas presinápticas

Ratón monoclonal

1:100 Dako, USA

VEGF Factor de crecimiento vascular endotelial Conejo

policlonal 1:800

Calbiochem, USA

Vimentina Filamento intermedio presente en células gliales Ratón

monoclonal 1:100 Dako, USA

** Los anticuerpos anti-MBP y anti-O1 fueron donados generosamente por el Dr. Campagnoni AT (Mental

Retardation Research Center, University of California, Los Angeles, CA, USA).

Materiales y métodos

51

Se utilizaron los siguientes anticuerpos secundarios:

Anticuerpo 2rio Especie Dilución Empresa Conjugado

Anti-ratón Cabra 1:500 Molecular Probes, USA Alexa Fluor 568

Anti-ratón IgM Burro 1:200 Jackson ImmunoResearch, USA Cy3

Anti-conejo Cabra 1:100 Jackson ImmunoResearch, USA Cy2

Anti-cabra Burro 1:100 Jackson ImmunoResearch, USA DyLight 488

Anti-cabra Burro 1:200 Jackson ImmunoResearch, USA Cy3

En todos los casos, se utilizaron secciones obtenidas como se describió anteriormente. Las

secciones obtenidas en parafina se trataron con xilol, serie decreciente de alcohol (rehidratación)

y PBS. Las secciones obtenidas en crióstato se lavaron varias veces con PBS para quitar el

remanente de glicerol. En algunos casos, dependiendo de las especificaciones del anticuerpo, se

realizó una recuperación antigénica en buffer citrato (pH 6,3) a 90ºC durante 40 min o una

permeabilización con 0,1% Triton X-100 en PBS por 30 minutos. Las secciones se incubaron

con suero de caballo normal al 4% por 60 min para disminuir la unión inespecífica. Para cada

tratamiento se realizaron controles negativos sin el agregado del anticuerpo primario.

6.1. Inmunoflourescencia. Las secciones se incubaron con anticuerpos primarios durante toda la

noche a 4˚C. Luego de varios lavados, se agregaron los anticuerpos secundarios por β h a

temperatura ambiente. Finalmente, las secciones se tiñeron con 4',6-diamidino-2-phenylindole

(DAPI, 0,5 g/ml en solución fisiológica) o Hoechst 33342 (5 g/ml en solución fisiológica) por

10 min y se montaron con medio de montaje para fluorescencia (Vectashield; Vector

Laboratories, USA). Se utilizó un microscopio de fluorescencia BX50 (Olympus, USA)

conectado a una cámara para microscopía 3CCD (Sony, USA). Las imágenes se obtuvieron y

procesaron con el software ImagePro Plus (Media Cybernetics, USA).

6.1.1. Inmunomarcación en retinas en montaje plano. Los animales se perfundieron como se

describió anteriormente. Se disecaron cuidadosamente los ojos y se post-fijaron en la misma

solución fijadora por 2 h a 4°C. Se aislaron cuidadosamente las retinas y se realizaron marcas

Materiales y métodos

52

que permitieron su posterior orientación. Se realizó la inmunomarcación como se mencionó en el

punto anterior, en free floating. Las retinas se incubaron con anticuerpos primarios durante toda

la noche (excepto con el anticuerpo anti-melanopsina que se incubó por 48 h) a 4˚C. Finalmente

se montaron en portas cargados (con la capa de fibras hacia arriba).

6.2. Inmunohistoquímica. Se realizó el bloqueo de la peroxidasa endógena con peróxido de

hidrógeno al 0,3% en PBS durante 20 min. Luego de varios lavado con PBS, las secciones se

incubaron con anticuerpos primarios durante toda la noche (excepto con los anticuerpos anti-

VEGF (48 h) y anti-c-Fos (72 h)) a 4˚C. La inmunorreactividad se reveló utilizando el complejo

biotina-estreptavidina-peroxidasa del kit LSAB2 System-HRP (Dako, USA). La reacción de

diaminobenzidina se acentuó posteriormente con un tratamiento con cloruro de cobalto al 0,5%

por 15 minutos. Los cortes se observaron y analizaron con un microscopio Eclipse E400 (Nikon,

USA) conectado a una cámara Coolpix s10 (Nikon, USA).

6.3. Detección con isolectinas. Para la detección de células microgliales, las secciones se

incubaron por 48 h a 4°C con la isolectina Griffonia simplicifolia I (Isolectina B4, 1:200; Vector

laboratorios, USA) acoplada a biotina. Luego de varios lavados se reveló la marcación utilizando

el método descripto en el punto anterior.

6.4. Análisis por microscopía confocal. Las muestras se procesaron como se describió en el

punto 6.1. Se utilizó un microscopio confocal Eclipse E800 (Nikon, USA).

7. Análisis de la permeabilidad vascular

Se analizó la permeabilidad vascular retiniana mediante la perfusión con el colorante azul de

Evans. Los animales se anestesiaron como ya se describió y se realizó una inyección

intracardíaca de una solución de azul de Evans (2% peso/volumen en PBS). Luego de 40 min los

animales se sacrificaron y se obtuvieron las retinas en montaje plano como se describió

previamente. El colorante se une con alta afinidad a la albúmina sérica. De esta manera, bajo

Materiales y métodos

53

excitación con luz de 620 nm (emisión 680 nm) es posible determinar la localización del

complejo.

8. Inyección de la subunidad de la toxina colérica

Los animales se anestesiaron y se les administró una gota de proparacaína en cada ojo, como

anestésico local. Se inyectaron 4 l de una solución 0,2% (en solución fisiológica) de la

subunidad de la toxina colérica (CTB) conjugada con el flouróforo Alexa 488 (Molecular

Probes, USA) en forma intravítrea, como ya se describió. Luego de 3 días de la inyección, los

animales se perfundieron, se disecaron cuidadosamente los cerebros y se post-fijaron durante

toda la noche. Se realizaron cortes coronales (40 m) seriados por congelación. Luego de varios

lavados, los cortes se tiñeron con DAPI y se montaron con medio de montaje para fluorescencia

para su posterior análisis.

9. Procesamiento de imágenes y cuantificación

Todas las imágenes obtenidas se ensamblaron y procesaron con Photoshop SC (Adobe Systems,

USA). Sólo se realizaron ajustes de brillo y contraste. Para todas las evaluaciones morfométricas,

las imágenes capturadas en formato TIFF se analizaron con el software ImageJ (NIH, USA).

Toda la nomenclatura usada corresponde al atlas de Paxinos y Watson (1997). Para todos los

estudios de inmunofluorescencia, se obtuvieron imágenes digitales en formato TIFF grabadas

con igual tiempo de exposición, brillo y contraste.

9.1. Evaluación morfométrica de cortes transversales de retina. Se obtuvieron

fotomicrografías a una distancia aproximada de 1 mm del NO (región dorsal y ventral) con un

aumento final de 200x y 400x. Se determinó el espesor total de la retina y de cada una de sus

capas y se cuantificó el número de neuronas presentes en la CCG (conteo lineal). Los resultados

se expresaron como número de células en 100 ó 200 m. Para cada ojo, se promediaron los

Materiales y métodos

54

resultados obtenidos de 4 secciones y la media de 5 ojos por grupo se consideró el valor

representativo para cada grupo.

9.2. Cuantificación de astrocitos en retinas en montaje plano. La retina se dividió en 4

cuadrantes y de cada uno se obtuvieron fotomicrografías de la región central y periférica con una

magnificación final de 200x. Las imágenes (área correspondiente a 0,125 m2) se convirtieron a

escala de grises de 8-bits, se aplicó un valor umbral a todas las imágenes determinado

inicialmente por exanimación visual y finalmente se convirtieron a modo binario. Se cuantificó

el área ocupada por astrocitos GFAP(+) y se expresó como porcentaje del área total. Para cada

retina, los resultados obtenidos de los 4 cuadrantes se promediaron y el valor promedio obtenido

de 4 ojos se consideró representativo de cada grupo.

9.3. Análisis del nervio óptico. En secciones semifinas transversales se calculó el área total del

NO a partir de fotomicrografías obtenidas con un aumento de 200x. Las secciones transversales

se dividieron en 4 cuadrantes y se tomaron fotomicrografías de cada región con una

magnificación de 1000x. Las imágenes se convirtieron a escala de grises de 8-bits, se aplicó un

valor umbral a todas las imágenes determinado inicialmente por exanimación visual y finalmente

se convirtieron a modo binario. Las fibras mielínicas se delimitaron digitalmente por el margen

interno de la vaina de mielina. Se cuantificó el número y el área de axones por imagen (Figura

5). Para cada NO se promediaron los resultados obtenidos de 4 secciones separadas y la media

obtenida de 5 nervios se consideró el valor representativo para cada grupo. Se realizaron además

histogramas de distribución de tamaño de fibras, utilizando el programa Origin (OriginLab Corp,

USA).

Se cuantificó el número y área de axones en fotomicrografías de microscopía electrónica (a un

aumento final de 3000x). Se evaluaron aproximadamente 10 fotomicrografías por NO. El g-radio

se calculó a partir de no menos de 500 axones por nervio. Para cada NO se promediaron los

resultados obtenidos de 3 secciones separadas y la media obtenida de 5 nervios se consideró el

valor representativo para cada grupo.

Materiales y métodos

55

Figura 5. Cuantificación del número y área de axones mielínicos con el programa ImageJ. A: Fotomicrografía

representativa de una sección transversal de la porción distal del NO de un animal control. Se aplicó un valor umbral

de corte en la escala de grises y se convirtió la imagen a modo binario, donde al área axonal quedó delimitada por el

borde interior de la vaina mielínica (B). Finalmente, se cuantificaron las partículas (número total y área individual)

limitando el rango de tamaño, para excluir procesos gliales y vasos sanguíneos (C).

9.4. Análisis del colículo superior: densidad neuronal y área GFAP(+). Se obtuvieron

imágenes digitales con una magnificación final de 400x (área 1000 m2) de la región superficial

retino-receptiva (SZ y SGS) del CS en corte coronal. Para el cálculo de la densidad neuronal y la

determinación del área GFAP+ (porcentaje de área ocupada por procesos de células gliales), las

imágenes se convirtieron a escala de grises de 8-bits y se aplicó en cada caso un valor umbral

que permitió binarizar las imágenes. Para cada sección se promediaron los resultados obtenidos

de 2 imágenes (área medial y lateral del CS) y el valor promedio de 3 secciones (región rostral,

medial y caudal) se consideró el valor representativo para cada animal. Finalmente los datos

obtenidos de 5 animales por grupo se promediaron y el promedio se utilizó como el valor

representativo de cada grupo.

9.5. Análisis del transporte de la subunidad de la toxina colérica al colículo superior. La

cuantificación de la marcación con CTB se realizó según el método descripto por Crish y col.

(2010) con algunas modificaciones. Se obtuvieron secciones coronales (seriado alternado,

aproximadamente 30 - 35 cortes) que se utilizaron para realizar una reconstrucción completa del

CS en vista dorsal, utilizando el programa Matlab (The MathWorks Inc, USA). Para cada

sección se delimitó y se calculó el área correspondiente a la región retinotópica. Luego se

convirtieron las imágenes digitales a escala de grises de 8-bits y se calculó la densidad óptica

Materiales y métodos

56

para la marca de CTB, que se relativizó al área total de proyección retinotópica obtenida

anteriormente. De esta forma se obtuvo un vector con la información lineal de la intensidad de

marcación relativa. Se calculó el largo total del CS (en el plano horizontal) y se dividió el vector

en bins (4 m), de la región medial a lateral. Finalmente, se aplicó una escala térmica

colorimétrica (de azul = 0% a rojo = 100%) (Figura 6). Se determinó el número de cortes y el

espesor (2x) y se realizó la reconstrucción final del mapa de proyección retinotópico al CS. Se

analizaron 5 animales por grupo.

Figura 6. Determinación del transporte de CTB al CS. A: Fotomicrografía representativa de una sección coronal del

CS de un animal control donde se observa la marca de CTB en las capas superficiales. La cuantificación de la

densidad óptica para CTB se relativizó al área total retino-receptiva (B). Finalmente se obtuvo un vector al que se le

aplicó una escala térmica según la intensidad de marcación (C).

9.6. Cuantificación de neuronas c-Fos(+). Se analizaron cortes seriados de los NSQ, el NOP y

el NGL y se cuantificó el número total de neuronas c-Fos(+) por núcleo. Finalmente, los datos

obtenidos de 5 animales por grupo se promediaron y se utilizó el promedio como el valor

representativo de cada grupo.

9.7. Análisis de co-localización. Se obtuvieron fotomicrografías seriadas con un aumento de

400x, en el plano-Z (10 m de profundidad, imágenes cada 0,5 m). Las imágenes se analizaron

para evaluar la co-localización de marcadores, utilizando el programa Olympus Fluoview

Viewer (Olympus Corporation, USA). Se utilizó el coeficiente de correlación de Pearson (r) para

determinar el grado de co-localización. Este coeficiente evalúa el grado de co-variación entre

distintas variables relacionadas linealmente. El r se mide en una escala de valores absolutos que

oscila entre 0 y 1. Un valor de r = 0 indica que no hay relación lineal entre las variables y un

Materiales y métodos

57

valor de r = 1 indica una correlación perfecta entre dos variables. Se determinó un valor umbral

de r > 0,5 para definir correlación positiva. Los resultados obtenidos de cada imagen (del Z-

stack) se promediaron y la media se registró como el valor representativo de cada muestra. Se

analizaron 2 secciones por NO y el valor de 5 animales se promedió y utilizó como valor

representativo de cada grupo.

10. Western blot

Los animales se sacrificaron y se extrajeron las retinas. Cada retina se homogeneizó en 150 l e

buffer 10 mM de HEPES, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 10 mM de KCl, 0,5% de Tritón

(v/v) pH 7,9, con el agregado de un cóctel de inhibidores de proteasas (Sigma, USA). Luego de

15 min a 4°C, los homogenatos se agitaron por 15 s y se centrifugaron a 3.000 g por 10 min. Los

sobrenadantes se utilizaron para la determinación de la concentración de proteínas. Las proteínas

(50-100 µg/ muestra) se separaron por SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida al 10 - 12 %.

Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a membranas de difluoruro de

polivinilideno durante 60 min a 15 V en un sistema Bio-Rad Trans-Blot SD (Bio-Rad

Laboratories, USA). Las membranas se bloquearon con 5% de leche en polvo descremada en

buffer Tris (pH 7,4), conteniendo 0,1% de Tween-20 durante 60 min a temperatura ambiente.

Las membranas se incubaron a 4C con los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpo

policlonal de conejo anti-VEGF (1:1000; Calbiochem, USA) por 48 h, anticuerpo policlonal de

conejo anti-melanopsina (1:1000; Affinity Bioreagent, USA) por 48 h y anticuerpo policlonal de

conejo anti-rodopsina (1:1000; Santa Cruz Biotechnology, USA) durante toda la noche.

Las membranas se lavaron con buffer Tris (pH 7,4) conteniendo 0,1% de Tween-20 y se

incubaron durante 1 h con un anticuerpo secundario anti-conejo (1:2000; Bio-Rad) acoplado a

peroxidasa. Las bandas se visualizaron por quimioluminiscencia (Western Blotting Analysis

System; Amersham Biosciences, Argentina) y se determinaron los niveles de く-actina como

control interno de carga. Las membranas se escanearon y la intensidad de las bandas se

Materiales y métodos

58

determinó utilizando el programa ImageJ. Los valores se expresaron como unidades arbitrarias

de los niveles de la proteína a determinar en cada caso respecto a los niveles de く-actina.

La concentración de proteínas se determinó por el método de Lowry y col. (1951). Se utilizó

albúmina bovina como estándar.

11. Estudio funcional de la retina

11.1. Electrorretinografía escotópica. Los animales se mantuvieron en oscuridad por 6 h y

luego se anestesiaron, como ya se describió. Se utilizó hidrocloruro de fenilefrina al 2,5% y

tropicamida al 1% (Laboratorios Alcon, Argentina) para dilatar la pupila y se administró, en

forma continua, solución salina balanceada (Laboratorios Alcon, Argentina) en la córnea, para

mantener un registro estable y prevenir una queratopatía. Los animales se colocaron frente a la

fuente luminosa, a una distancia de 20 cm. Todos los registros se realizaron dentro de los 20 min

seguidos a la inducción de la anestesia y se mantuvo constante la temperatura corporal usando

una manta térmica. Se usó un electrodo de referencia colocado en la oreja (ipsilateral), un

electrodo de tierra colocado en la porción media de la cola y un electrodo de oro en el centro de

la córnea. Para la correcta implantación de los electrodos se utilizó una luz roja de 15 W, que no

afectó la adaptación de los animales a la oscuridad. Los electrorretinogramas (ERGs) de ambos

ojos se registraron simultáneamente y en completa oscuridad. Para ello, se aplicaron 20 pulsos de

luz blanca sin atenuación (5 ms, 0,2 Hz) generados por un estimulador fótico de diodos aplicados

con una intensidad máxima de 9 cd s/ m2. Los registros se amplificaron utilizando un equipo

Akonic BIO-PC (Akonic, Argentina). La señal se registró con una ganancia de 100 V, sin

atenuación, con filtros de ruido de baja (1,5 Hz) y de alta (1000 Hz) frecuencia para optimizar el

registro. Se determinó la amplitud (en V) de la onda a (respuesta mediada por FR) como la

diferencia en amplitud entre la línea isoeléctrica y el pico negativo y la amplitud de la onda b

(respuesta mediada principalmente por células de retina interna) como la diferencia entre el pico

de onda a y el pico positivo de la onda b (Figura 7A). Se determinaron las latencias de cada

Materiales y métodos

59

onda. La respuesta electrorretinográfica se obtuvo como el promedio de los valores de cada

corrida. Se realizaron tres estímulos, con un intervalo de 5 min.

11.2. Potenciales oscilatorios. Los potenciales oscilatorios (POs) se registraron utilizando el

mismo estimulador fótico (5 ms, 0,2 Hz), con filtros de baja (100 Hz) y alta frecuencia (300 Hz).

La amplitud de los POs se calculó como el punto de máxima amplitud de cada pico en relación a

la línea de base (Figura 7B). El resultado obtenido de la suma de los tres picos de los POs se

utilizó para el análisis estadístico.

11.3. Potenciales visuales evocados. Para el registro de los potenciales visuales evocados

(VEPs) se colocaron quirúrgicamente dos electrodos de acero inoxidable, 4 mm lateral a la cisura

inter-hemisférica y 5,6 mm por detrás de bregma (electrodo activo). Se colocaron electrodos de

referencia en posición 2 mm lateral a la línea media y 2 mm antes de bregma y un electrodo de

tierra en la cola. Ambos electrodos se aislaron y fijaron con acrílico dental y la piel se suturó con

nylon 5/0. Los VEPs se evaluaron 5 días después de la implantación de los electrodos. Luego de

6 h de adaptación a la oscuridad, los animales se anestesiaron y se irrigó la córnea en forma

intermitente como ya se describió, bajo luz roja tenue. Cada ojo se registró individualmente, se

ocluyó el ojo contralateral y se registró un promedio de 70 estímulos. Los ojos se estimularon

con luz blanca sin atenuar (1 Hz) con un estimulador fótico (diodos emisores de luz), fijado a la

máxima intensidad de luz y los registros se amplificaron, filtraron (0,5 Hz filtro de baja

frecuencia, 100 Hz filtro de alta frecuencia) y promediaron. Se determinó la latencia del

componente N2-P2 desde el inicio hasta el segundo pico negativo o positivo, respectivamente

(Figura 7C).

Materiales y métodos

60

Figura 7. Se muestran registros representativos y el método utilizado para evaluar la amplitud y latencia de las

ondas a y b del ERG (A), de los picos P1, P2 y P3 de los POs (B) y la latencia del componente N2-P2 de los VEPs

(C).

12. Evaluación de la actividad del ciclo glutamato/glutamina a nivel retiniano

12.1. Determinación del influjo de L-3H-glutamato y L-3H-glutamina. El influjo de L-3H-

glutamato y L-3H-glutamina se determinó en fracciones sinaptosomales crudas de retinas. Las

retinas se homogeneizaron en sacarosa 0,32 M (1:9 P/V) y el homogenato obtenido se centrifugó

a 900 g por 10 min a 4°C. Los homogenatos libres de núcleos se centrifugaron luego a 30.000 g

durante 20 min. El precipitado se resuspendió inmediatamente en buffer HEPES-Tris,

conteniendo 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 10 mM de

HEPES y 10 mM de glucosa y ajustado a pH 7,4 con Tris-base. Alícuotas de las fracciones

sinaptosomales retinianas crudas (100-300 g de proteína/ 100 l) se incubaron a 37° C con

agitación suave, junto con 100 µl de L-3H-glutamato o L-3H-glutamina (500.000-800.000

dpm/tubo, actividad específica: 17,25 y 51 Ci/mmol, respectivamente). Luego de 5 min de

incubación, la reacción se detuvo por el agregado de 4 ml de buffer HEPES-Tris frío. La mezcla

se filtró inmediatamente bajo vacío sobre filtros Whatman GF/B. Los filtros se lavaron dos veces

con 4 ml de buffer frío. La radioactividad retenida en los filtros se determinó en un contador de

centelleo líquido. La captación inespecífica se determinó en presencia de un exceso de glutamato

o glutamina fría (10 mM).

12.2. Determinación de la actividad de glutamina sintetasa. Las retinas se homogenizaron en

forma individual en 200 µl de PBS 10 mM, pH 7,2. Alícuotas de 150 µl del homogenato se

Materiales y métodos

61

mezclaron con 150 µl de una solución stock conteniendo buffer imidazol-100 mM de HCl, 40

mM de MgCl2, 50 mM de -mercaptoetanol, 200 mM de hidroxilamina y 20 mM de ATP (sal de

sodio), ajustado a pH 7,2. Luego de una incubación a 37°C durante 15 min, se agregó 1,5 ml de

una solución 0,37 M de FeCl3, conteniendo 0,67 M de HCl y 0,20 M de ácido tricloroacético.

Las muestras se mantuvieron en hielo por 5 min, luego se removió el precipitado por

centrifugación y la absorbancia del sobrenadante se determinó a 535 nm. El blanco de la

reacción se evaluó reemplazando el tejido por buffer. Bajo estas condiciones, 1mol de -

glutamilhidroxamato tuvo una absorbancia de 0,340.

12.3. Determinación de la liberación de L-3H-glutamato y L-3H-glutamina. Se utilizaron

fracciones sinaptosomales crudas que se incubaron por 30 min a 37°C con L-3H-glutamato o L-

3H-glutamina (1.000.000 - 1.500.000 dpm/ retina) en 500 µl de buffer HEPES-Tris. Los

sinaptosomas se lavaron por centrifugación para remover el exceso de radioligando. Luego se

incubaron bajo agitación por 10 min en 500 µl del mismo buffer (5 mM de KCl) o en

condiciones de alto K+ (50 mM) conservando la osmolaridad por compensación con la

concentración de Na+. Las muestras se centrifugaron, los precipitados se digirieron con hidróxido

de hiamina y se determinó la radioactividad tanto en el medio como la incorporada en los tejidos.

La liberación fraccional se calculó como la radioactividad liberada sobre la radiactividad total

del tejido. Más del 85% de la radioactividad liberada se identificó como glutamato o glutamina

auténticos respectivamente, por cromatografía en capa delgada.

12.4. Determinación de la actividad de glutaminasa. Cada retina se homogenizó en 100 l de

7,5 mM de Tris-HCl, 0,1% Triton X-100, pH 8,8. Alícuotas de 20 l de homogenato (200 - 400

g de proteínas) se mezclaron con 100 l de una solución que contenía 20 mM de glutamina, L-

3H-glutamina (0,2 - 0,5 Ci) y buffer fosfato de potasio 45 mM, pH 8,2. Las muestras se

incubaron con agitación, por 1 h a 30°C. La reacción se frenó por el agregado de 1 ml de una

solución de 20 mM de imidazol frío, pH 7,0. Luego de una breve centrifugación, los

sobrenadantes se sembraron en una resina de intercambio aniónico de 0,6 x 3,5 cm (Dowex,

Materiales y métodos

62

AG1-X2, 200-400, Laboratorios Bio-Rad) previamente cargada con 1ml de 1 M de HCl y

lavada con agua. El exceso de sustrato de la reacción se removió con 6 ml de imidazol y el

producto final se obtuvo mediante el lavado de la resina con 3 ml de HCl 0,1 M. Alícuotas de

esta fracción se mezclaron con líquido centellante y se determinó la radioactividad. El blanco de

la reacción se determinó reemplazando el tejido por buffer. La actividad específica de

glutaminasa se expresó como moles glutamato/ mg proteína x hora

13. Actogramas y evaluación del periodograma

Los animales se mantuvieron individualmente en jaulas y se monitoreó la actividad locomotora

diaria con sensores infrarrojos ubicados sobre cada jaula. El sensor infrarrojo funciona mediante

la emisión de pulsos de luz infrarroja y luego midiendo la distancia a los objetos por el tiempo

que tarda en llegar la señal reflejada. Cada vez que cambia la distancia, el sensor abre o cierra un

interruptor. Todos los sensores se probaron para garantizar la uniformidad de la respuesta. La

actividad se registró cada 5 min y los resultados se procesaron con un software para la

adquisición de datos (ElTemps, España). Los animales se expusieron inicialmente a un

fotoperíodo de 12 h de luz (~ 200 lux en las jaulas) y 12 h de oscuridad (encendido de las luces a

las 08.00 h). Para cada animal se obtuvo un gráfico de onda (waveform) de la actividad promedio

y se calculó el ángulo de fase para el inicio de la actividad. Para ello, se determinó un valor

umbral de actividad y se calculó el tiempo (en min) desde el apagado de las luces hasta el

comienzo de la actividad (valor de bin (5 min) por encima del umbral promedio). Finalmente, los

datos obtenidos de 10 animales por grupo se promediaron y la media obtenida se utilizó como el

valor representativo de cada grupo.

14. Evaluación del reflejo pupilar

Los animales se adaptaron a la oscuridad por 1 h antes de la evaluación del reflejo pupilar. Se

aplicó un pulso de luz blanca (1200 lux) a un ojo y se registró la contracción de la pupila del ojo

Materiales y métodos

63

contralateral. Los registros se realizaron bajo luz infrarroja con una cámara de video digital

(Sony DCR-SR60, Japón). Se determinó el diámetro de la pupila antes y 30 s después de aplicar

el pulso de luz. La velocidad de muestreo fue de 30 imágenes/s. Se adquirieron las imágenes a

partir de la grabación de video digital utilizando el programa OSS Video Decompiler Software

(One Stop Soft, USA). El porcentaje de contracción de la pupila se calculó como el porcentaje

del área de la pupila a los 30 s del inicio del pulso (estado estacionario) en relación con el

tamaño de la pupila dilatada. Los datos obtenidos de 10 animales por grupo se promediaron y se

utilizó como el valor representativo de cada grupo.

15. Lentectomía

Los animales se anestesiaron como se describió, y se les aplicó anestesia local y un midriático

para dilatar la pupila (Fenilefrina 2% + tropicamida 0,5%). Se inició la cirugía con una incisión

corneo-corneal en hora doce (región dorsal). Se inyectó solución viscoelástica en la cámara

anterior para facilitar la capsulorrexis con pinza de Utrata y se realizó una hidro-disección para

facilitar el movimiento del núcleo del cristalino. Una vez completados estos pasos se amplió la

incisión corneal en 110 grados y se retiró el cristalino con una pinza de 0.12 mm. Se realizó una

irrigación/aspiración con cánula para retirar los restos de corteza y viscoelástico remanente. La

incisión corneal se suturó con puntos simples (Nylon 10-0 monofilamento). Los animales se

trataron con nepafenac 0.1% (Nevanac, Laboratorios Alcon) y moxifloxacina 0.5% (Vigamox,

Laboratorios Alcon) por 7 días (aplicación en gotas, 2 veces por día). Se realizó un control

clínico cada 36 h y se evaluó la función visual luego de 7 días post-cirugía.

16. Análisis estadístico

Para el análisis estadístico de los resultados obtenidos se utilizaron el test de Student para la

comparación entre dos grupos experimentales, o el análisis de varianza a dos vías (ANOVA),

seguido de los tests de Tukey o de Dunnett, para comparaciones múltiples.

Resultados

64

RESULTADOS

1. Post-condicionamiento isquémico retiniano

Como se mencionó en la Introducción, trabajos previos de varios grupos demostraron la alta

efectividad del PCI en la protección de la función y la estructura de la retina frente a un daño

isquémico agudo. A pesar de las eventuales ventajas que podría tener la posibilidad de inducir

protección retiniana con una maniobra realizada a posteriori del evento isquémico, al inicio de

este trabajo no se disponía de antecedentes sobre el efecto del PostC a nivel retiniano. Para

analizar la viabilidad de esta hipótesis, se evaluó el efecto protector del PostC frente a una

isquemia retiniana deletérea. Una isquemia de 40 min fue suficiente para provocar alteraciones

retinianas evidentes tanto a nivel funcional como morfológico. Se evaluó el efecto protector de la

aplicación de ciclos de isquemia/reperfusión a diferentes intervalos luego del episodio isquémico

prolongado, de acuerdo a los protocolos experimentales descriptos en la Figura 8.

La aplicación de 7 ciclos de isquemia/reperfusión (1 min/ 1 min) a los 5 min del episodio

isquémico revirtió significativamente el daño funcional (amplitud de las ondas a y b del ERG)

inducido por 40 min de isquemia. En este grupo de animales se observó una preservación

funcional completa luego de 7 días de reperfusión (Figura 9). No se observó una clara progresión

del daño funcional inducido por la isquemia de 40 min, dado que los resultados obtenidos luego

de 7 ó 14 días de reperfusión fueron esencialmente similares.

Figura 8. Protocolo y grupos experimentales utilizados para evaluar la efectividad del PostC frente al daño

isquémico agudo. Se evaluó el efecto del tiempo de isquemia, tiempo de reperfusión, número de pulsos y el efecto

de la aplicación de un único pulso de isquemia. En todos los casos, el análisis funcional y/o morfológico se realizó a

los 7 y/ó 14 días de reperfusión.

Resultados

65

Figura 9. Evaluación funcional de la protección inducida por PostC sobre el daño isquémico retiniano. En ojos

sometidos a 40 min de isquemia se observó una disminución significativa de la amplitud de las ondas a y b del ERG

luego de 7 ó 14 días de reperfusión. En ojos post-condicionados se observó una recuperación significativa de las

alteraciones funcionales inducidas por una isquemia retiniana prolongada. Se muestra la media ± error estándar (EE)

(n= 10 ojos/ grupo). **: P< 0,01 vs. control; a: P< 0,01 vs. ojos isquémicos con tratamiento simulado, test de Tukey.

En el panel inferior se muestran ERGs representativos de un ojo control, un ojo isquémico con tratamiento simulado

y un ojo isquémico con PostC, luego de 7 días de reperfusión.

La protección inducida por PostC frente al daño isquémico agudo se evaluó también a nivel

morfológico. La aplicación de 7 pulsos breves de isquemiareperfusión luego de 5 min de la

isquemia prolongada (40 min) redujo marcadamente las alteraciones histopatológicas

características del daño isquémico retiniano (Figura 10). El análisis morfométrico de retinas de

los distintos grupos experimentales indicó una preservación significativa del espesor total de la

retina y del número de células de la CCG en el grupo con PostC respecto al grupo isquémico

Resultados

66

(Tabla 2). Se obtuvieron resultados similares para el grupo isquémico y para el grupo con

isquemia y post-condicionamiento luego de 30, 45 y 60 días de reperfusión (datos no mostrados).

Figura 10. Fotomicrografías representativas de cortes transversales de retinas de los distintos grupos experimentales

luego de 14 días de reperfusión. En el panel A se muestra una retina control (detalle en B). Una isquemia de 40 min

provocó una marcada alteración en todas las capas de la retina interna (C, detalle en D), con la presencia frecuente

de pliegues de la retina externa y pérdida de FR (C, detalle en E). El PostC revirtió estas alteraciones (panel F,

detalle en G). Barras: F= 200 m; G= 50 m. CCG, capa de células ganglionares; CPI, capa plexiforme interna;

CNI, capa nuclear interna; CPE, capa plexiforme externa; CNE, capa nuclear externa, SF, segmentos internos y

externos de fotorreceptores.

Resultados

67

Con el objeto de caracterizar más detalladamente el daño morfológico inducido por la isquemia y

el efecto protector del PostC, se evaluaron los cambios macrogliales y las alteraciones a nivel de

las terminales presinápticas. En primer lugar, se analizó la respuesta glial a través de la

inmunomarcación para GFAP. En cortes transversales de retinas del grupo control, la

inmunomarcación para GFAP se limitó exclusivamente a astrocitos presentes en la capa de fibras

de las CGRs. En retinas analizadas luego de 14 días del episodio isquémico prolongado (40 min)

se observó un aumento en los niveles de GFAP en los procesos de las células de Müller

localizados a lo largo de toda la retina. Se utilizó el marcador glial vimentina (de expresión

constitutiva en células de Müller) para determinar si la gliosis caracterizada por el aumento en

los niveles de GFAP se asoció con la división y formación de nuevas células de Müller en

respuesta al daño retiniano (Figura 11). En cortes transversales de retina se cuantificó el número

de procesos gliales presentes en la CPI en diferentes regiones de la retina respecto al disco

óptico. En retinas isquémicas se observó una clara desorganización de los procesos de las células

de Müller (Figura 11), sin embargo, no se detectó un aumento significativo en el número de

procesos de células de Müller entre los grupos experimentales (datos no mostrados). La

aplicación de pulsos breves de isquemia (7 ciclos de isquemia/reperfusión, 1 min/ 1 min) luego

de 5 min de reperfusión revirtió en forma evidente las alteraciones gliales inducidas por la

isquemia prolongada (Figura 11).

La sinaptofisina es una proteína presente en las terminales presinápticas que participa en la

formación y el reciclado vesicular. En retinas control se observó una inmunomarcación intensa

para sinaptofisina en ambas capas plexiformes. En retinas isquémicas se observó una clara

disminución en la inmunorreactividad en la CPI y CPE, con zonas de ausencia completa de

marca, particularmente en la CPE. Estas alteraciones no fueron evidentes en retinas post-

condicionadas, en las que se observó una inmunomarcación intensa para sinaptofisina en ambas

capas plexiformes (Figura 11).

Resultados

68

Figura 11. Inmunomarcación para GFAP, vimentina y sinaptofisina, luego de 14 días de reperfusión. Panel

superior: En retinas control, la inmunomarcación para GFAP se observó sólo en astrocitos. En retinas isquémicas se

observó una marca intensa para GFAP en procesos de células de Müller. El PostC redujo notablemente la

inmunorreactividad para GFAP. Panel central: No se observaron diferencias en la inmunomarcación para vimentina

entre los distintos grupos experimentales. Panel inferior: En retinas control se observó una marcación intensa para

sinaptofisina en ambas capas plexiformes. En retinas de ojos isquémicos se observó una disminución marcada en los

niveles de sinaptofisina, que fue revertida por el PostC. Barra= 50 m. CCG, capa de células ganglionares; CPI,

capa plexiforme interna; CNI, capa nuclear interna; CPE, capa plexiforme externa; CNE, capa nuclear externa, SF,

segmentos internos y externos de fotorreceptores.

Resultados

69

Con el objeto de evaluar la efectividad del PostC frente a una injuria de mayor magnitud, se

analizó el efecto de la aplicación de 7 ciclos de isquemia/reperfusión (1 min/ 1 min) aplicados 5

min después de una isquemia de 60 min de duración (Figura 8). Este período de isquemia

provocó notables alteraciones funcionales y morfológicas. A nivel funcional, la isquemia de 60

min causó una disminución significativa en la amplitud de las ondas a y b del ERG, que resultó

significativamente mayor que el daño causado por una isquemia de 40 min (P< 0,01). El PostC

revirtió parcial, pero significativamente la disminución en la amplitud de las ondas a y b del

ERG inducida por la isquemia de 60 min de duración (Figura 12). Este período de isquemia

causó una disminución muy marcada del espesor total de la retina, que fue significativamente

mayor a la observada luego de 40 min de isquemia (Tabla 2). Como consecuencia de la magnitud

de las alteraciones causadas por la isquemia de 60 min, no fue posible un análisis del espesor de

las capas retinianas. Sin embargo, la aplicación de pulsos breves de isquemia revirtió

parcialmente estas alteraciones. En este caso se observó una preservación evidente de la

estructura retiniana, en comparación con retinas isquémicas con tratamiento simulado (Figura

12).

Tabla 2. Espesor total de la retina y número de células en la CCG en el grupo control (no isquémico) y en ojos con

isquemia de 40 ó 60 min, sin o con PostC, analizados luego de 14 días de reperfusión.

Tratamiento Espesor total de la retina

(en m) Número de células en la CCG

(células/ 200 m)

Control 133,8 2,5 14,2 0,6

40 min isquemia 96,6 7,7 ** 7,3 0,9 **

40 min isquemia + PostC 119,2 3,2 a 10,0 0,6 a

60 min isquemia 34,5 4,3 **, a ---

60 min isquemia + PostC 99,7 3,6 **,‡ 8,3 2,4 *

Espesor total de la retina y número de células en la CCG/ 200 m (se muestra la media ± EE, n= 10 retinas/ grupo).

* : P< 0,05, **: P< 0,01 vs. ojos no isquémicos (control), a: P< 0,01 vs. isquemia de 40 min con tratamiento

simulado, ‡: P< 0,01 vs. isquemia de 60 min con tratamiento simulado, test de Tukey.

Resultados

70

En la siguiente serie de experimentos, se analizó la influencia del número de ciclos de

isquemia/reperfusión (1 min/1 min) sobre la efectividad del PostC frente a un evento isquémico

deletéreo. Para ello, se aplicaron 3, 7 ó 10 ciclos de isquemia/reperfusión a los 5 min de una

isquemia de 40 min de duración. Luego de 7 días de reperfusión se evaluó la respuesta

electrorretinográfica. La aplicación de 7 ó 10 ciclos de isquemia/reperfusión resultó igualmente

efectiva como mecanismo protector, en tanto que 3 pulsos fueron inefectivos. Asimismo, se

Figura 12. Efecto protector del PostC frente al daño retiniano inducido por 60 min de isquemia. En retinas

isquémicas se observó una disminución significativa en la amplitud de las ondas a y b del ERG, tanto a los 7 como a

los 14 días de reperfusión. Se observaron alteraciones morfológicas en toda la retina luego de 14 días de reperfusión.

La aplicación del PostC revirtió parcialmente estas alteraciones a nivel funcional y morfológico. Media ± EE (n= 10

ojos/ grupo). **: P< 0,01 vs. control; a: P< 0,01 vs. isquemia + tratamiento simulado, Test de Tukey. Barra= 50 m.

Resultados

71

examinó el efecto de la aplicación de un único pulso de 7 min de isquemia (tiempo equivalente a

la suma de 7 ciclos de 1 min) 5 min después de la isquemia prolongada (40 min). Un único pulso

de 7 min de duración resultó igualmente efectivo en la protección frente al daño funcional

provocado por una isquemia prolongada que el inducido por los 7 ciclos de isquemia/reperfusión

(Figura 13).

En todos los casos analizados, la aplicación de pulsos breves de isquemia en ojos control (no

isquémicos) no tuvo ningún efecto evidente sobre la función electrorretinográfica (datos no

mostrados).

A continuación, se examinó la ventana temporal en la que la aplicación del PostC resulta efectiva

frente al daño isquémico. Para ello, se aplicaron 7 ciclos de isquemia/reperfusión a los 5, 10, 30,

60 min ó 24 h luego de 40 min de isquemia. Los resultados obtenidos indicaron una preservación

funcional significativa y dependiente del tiempo de reperfusión. La protección funcional resultó

máxima cuando el PostC fue aplicado 5 ó 10 min luego de la isquemia, aunque se observó una

Figura 13. Influencia del número de ciclos de isquemia/reperfusión aplicados a los 5 min de una isquemia

prolongada (40 min). Se muestra la media ± EE (n= 10 ojos/ grupo). **: P< 0,01 vs. grupo control; a: P< 0,01 vs.

isquemia + tratamiento simulado, Test de Tukey.

Resultados

72

protección menor, pero significativa aún cuando la aplicación de los pulsos de isquemia

comenzó 60 min después de la isquemia prolongada (Figura 14).

Con el objetivo de elucidar los mecanismos involucrados en la protección desencadenada por el

PostC, se evaluó la participación de la síntesis de novo de proteínas. Para ello, se inyectó

cicloheximida (0,4 mg/kg) en forma intraperitoneal. En una primera serie de experimentos, la

cicloheximida se administró 1 min antes (es decir, 4 min luego de la isquemia de 40 min) de la

aplicación de 7 ciclos de isquemia/reperfusión. La inyección de cicloheximida previa al PostC

abolió completamente la protección a nivel funcional e histológico observada en ojos post-

condicionados inyectados con vehículo (Figura 15). En contraste, la cicloheximida resultó

inefectiva cuando fue administrada luego de 6 h de finalizada la isquemia y la aplicación de los

ciclos de isquemia/reperfusión. No se observaron diferencias entre retinas isquémicas de

animales inyectados con vehículo o cicloheximida (Figura 15).

Figura 14. Influencia del tiempo de reperfusión sobre la protección funcional inducida por PostC frente a una

isquemia retiniana de 40 min. Se muestra la media ± EE (n= 10 ojos/ grupo). *: P< 0,05, **: P< 0,01 vs. control; b:

P< 0,05, a: P< 0,01 vs. ojos isquémicos con tratamiento simulado, test de Tukey.

Resultados

73

Luego, se evaluó la participación de la iNOS en la protección frente al daño isquémico retiniano

inducido por PostC. Para ello, se inyectó aminoguanidina (100 mg/kg en solución salina,

inyección intraperitoneal), un inhibidor selectivo de la iNOS, 1 min antes y 6 h después de la

aplicación de pulsos de isquemia. El protocolo de administración de aminoguanidina se

determinó en base a un estudio realizado por Kawano y col. (2007). La aminoguanidina bloqueó

completamente el efecto protector inducido por PostC (Figura 16). No se observaron cambios en

animales control inyectados con aminoguanidina o en retinas isquémicas con o sin

aminoguanidina (datos no mostrados).

Figura 15. Participación de la síntesis proteica en la protección funcional (A-C) e histológica (D-G) inducida por

PostC. Se administró cicloheximida (CHX) 4 min antes ó 6 h después del PostC (después de una isquemia de 40

min). La cicloheximida bloqueó el efecto protector del PostC a nivel funcional e histológico sólo cuando fue

administrada 1 min antes de la aplicación de los pulsos de isquemia. En los paneles B y C se muestran ERGs

representativos de un ojo isquémico con tratamiento simulado (I) y un ojo isquémico con PostC (P) luego de 7 días

de la administración de CHX. D-G: Análisis morfológico a los 14 días de reperfusión. Se muestra la media ± EE (n=

10 ojos/ grupo). **: P < 0,01 vs. grupo control; a: P< 0,01 vs. ojos isquémicos con tratamiento simulado, test de

Tukey. Barra= 50 m.

Resultados

74

Figura 16. Efecto de la aminoguanidina (AG) sobre la protección funcional inducida por PostC. A: La

administración de aminoguanidina (4 min y 6 h post-isquemia de 40 min) bloqueó completamente el efecto

protector del PostC evaluado a los 7 días de reperfusión. B: ERGs representativos de un animal con isquemia

bilateral, con PostC en el ojo derecho (OD) y tratamiento simulado en el ojo izquierdo (OI), inyectado con

aminoguanidina. Se muestra la media ± EE (n= 10 ojos/ grupo). **: P < 0,01 vs. grupo control; a: P< 0,01 vs. ojos

isquémicos con tratamiento simulado, test de Tukey.

Resultados

75

2. Participación del glutamato en la protección retiniana inducida por post-

condicionamiento

Múltiples evidencias experimentales demuestran la participación del glutamato en el daño

isquémico retiniano. En este contexto, la siguiente serie de experimentos fue diseñada con el fin

de evaluar el rol del sistema glutamatérgico en la protección inducida por PostC.

Los resultados presentados en la sección anterior demuestran la protección funcional e

histológica inducida por el PostC luego de 7 y/ó 14 días de reperfusión final. En primer lugar, se

realizó una evaluación más detallada del curso temporal de las alteraciones funcionales y

morfológicas provocadas por el daño isquémico, así como de la protección inducida por PostC.

En la Figura 17 se muestra la respuesta funcional a distintos intervalos luego de 40 min de

isquemia retiniana. A las 24 h post-isquemia se observó una disminución significativa en la

amplitud de las ondas a y b del ERG, que fue similar a la observada a los 3 ó 7 días de

reperfusión. Luego de 24 h ó 3 días de reperfusión no se observaron diferencias significativas en

la respuesta electrorretinográfica en retinas isquémicas sometidas a PostC respecto al grupo

isquémico con tratamiento simulado. Sin embargo, luego de 7 días de reperfusión, en los ojos

post-condicionados se observó una recuperación significativa de la función retiniana, de forma

tal que la amplitud de las ondas a y b del ERG fueron similares a las del grupo control (no

isquémico). En ningún caso se registraron cambios en las latencias de ambas ondas del ERG

(datos no mostrados). El análisis de los POs indicó un perfil diferente al observado para las

ondas a y b del ERG. Tanto a las 24 h como a los 3 días después de la isquemia no se observó

disminución en la amplitud de los POs; sin embargo, se observó una caída significativa en este

parámetro los 7 días post-isquemia, que fue revertida por el PostC (Figura 17C).

Resultados

76

Figura 17. Curso temporal del daño isquémico retiniano y de la protección inducida por PostC. Luego de la

isquemia prolongada sin o con PostC, se registraron ERGs y POs en los días 1, 3 y 7 de reperfusión. En todos los

intervalos evaluados, la isquemia provocó una disminución en la amplitud de las ondas a y b del ERG. El PostC

revirtió esta caída a los 7 días de reperfusión (A-B). C: ERGs representativos de los distintos grupos experimentales,

registrados al día 1, 3 y 7 post-isquemia. D: Se observaron diferencias en los POs del grupo isquémico sólo a partir

del día 7 de reperfusión. El PostC revirtió la caída en la suma de las amplitudes de los POs. E: Registros de POs

representativos de los distintos grupos experimentales, evaluados al día 1, 3 y 7 post-isquemia. Se muestra la media

EE (n= 10 retinas/ grupo). **: P< 0,01 vs. control; b: P< 0,05, a: P< 0,01 vs. ojos isquémicos con tratamiento

simulado, test de Tukey.

Resultados

77

Luego de 24 h ó 3 días de reperfusión no se observaron alteraciones morfológicas evidentes en

retinas sometidas a una isquemia prolongada (40 min), en tanto que luego de 7 días de

reperfusión se observó una disminución significativa en el espesor total de la retina, así como en

la CPI, con pérdida de células en la CCG (Figura 18 y Tabla 4 (página 82)). La aplicación de 7

ciclos de isquemia/reperfusión revirtió estas alteraciones morfológicas y no se observaron

diferencias a lo largo de todo el período de evaluación (Figura 18H).

Figura 18. Fotomicrografías representativas de cortes transversales de retinas de los distintos grupos

experimentales. Se evaluó la citoarquitectura en retinas isquémicas, sin o con PostC, luego de 1, 3 y 7 días de

reperfusión (B-D, F-H). A los 7 días de reperfusión se observó una marcada alteración morfológica en retinas

isquémicas, que afectó principalmente a la retina interna (D). El PostC revirtió estás alteraciones (H). La aplicación

de pulsos de isquemia per se (E) no tuvo efectos evidentes en comparación con retinas control (A). Barra= 50 m.

A continuación, se evaluó el curso temporal de las alteraciones macrogliales a través de la

determinación de los niveles de GFAP. Luego de 24 h ó 3 días de reperfusión, se observó un

número elevado de procesos de células de Müller inmunorreactivos para GFAP en retinas

isquémicas. A los 7 días post-isquemia se observó una inmunomarcación intensa para GFAP y

una mayor desorganización de los procesos gliales reactivos. El PostC revirtió estas alteraciones

a partir del día 3 (pero no a las 24 h) de reperfusión (Figura 19).

Resultados

78

Figura 19. Análisis por inmunoflourescencia de los niveles de GFAP. En retinas isquémicas se observó una marca

intensa para GFAP en procesos de células de Müller en todos los intervalos evaluados (B-D). En retinas isquémicas

con PostC se observó una reversión en el aumento de los niveles de GFAP a partir de los 3 días de reperfusión (F-

H). La aplicación de pulsos de isquemia (E) no modificó los niveles de GFAP en retinas control (A). Barra= 50 m.

Estos resultados demuestran que existe una progresión del daño isquémico. A nivel funcional e

histológico, la protección observada en retinas post-condicionadas resultó evidente sólo a partir

de los 7 días de reperfusión, en tanto que el análisis de las células gliales reveló cambios previos,

que fueron evidentes a los 3 días post-isquemia. Sobre la base de estos resultados y considerando

el papel central de las células de Müller en la regulación de los niveles sinápticos de glutamato,

la siguiente serie de experimentos tuvo como objetivo evaluar la actividad del ciclo de

glutamato/glutamina en retinas isquémicas, así como su participación en la protección inducida

por PostC en el mismo intervalo en el que se observaron diferencias a nivel de las células de

Müller entre el grupo isquémico y el grupo con isquemia y PostC, es decir, a los 3 días de

reperfusión. Para ello, se evaluó el uptake de glutamato en fracciones sinaptosomales obtenidas

de retina de los distintos grupos experimentales a los 3 días de la isquemia, sin o con PostC. En

retinas isquémicas se observó una disminución significativa del influjo de glutamato comparado

Resultados

79

con el grupo control (no isquémico). La aplicación del PostC (7 pulsos de isquemia/reperfusión,

1 min/ 1min) revirtió significativamente el efecto de la isquemia sobre el transporte de glutamato

(Figura 20A). A continuación, se examinó la actividad de la enzima GS en retinas de todos los

grupos experimentales. La isquemia provocó una disminución significativa en la actividad de

esta enzima, que fue completamente revertida por el PostC (Figura 20B).

Figura 20. Efecto de la isquemia, sin o con PostC, sobre el uptake de glutamato (A) y la actividad de GS (B),

evaluado a los 3 días de reperfusión. Para ambos parámetros se observó una disminución significativa en retinas

isquémicas, que fue revertida por el PostC. Se muestra la media EE (n= 10-12 retinas/ grupo). **: P<0,01 vs.

control (no isquémico); a: P<0,01 vs. isquemia con tratamiento simulado, test de Tukey.

En la Tabla 3 se muestran los resultados obtenidos en la evaluación de la liberación de glutamato

y glutamina, el uptake de glutamina y la actividad de glutaminasa. No se observaron diferencias

significativas en ninguno de estos parámetros entre los grupos experimentales. La aplicación de

pulsos de isquemia en retinas control no modificó ninguno de estos parámetros (Figura 20 y

Tabla 3).

Resultados

80

Tabla 3. Efecto de la isquemia, sin o con PostC, sobre la liberación de glutamato y glutamina, el uptake de

glutamina y la actividad de glutaminasa, a los 3 días post-isquemia.

Tratamiento

Liberación de glutamato

(% liberación)

Liberación de glutamina

(% liberación) Uptake de glutamina

(pmol/ mg prot.)

Actividad de glutaminasa

( mol glutamato/

mg prot x h) Basal Alto K+ Basal Alto K+

Control 59,6 ± 1,9 78,9 ± 1,5** 57,3 ± 1,6 81,0 ± 0,8** 43,7 ± 0,9 1,98 ± 0,31

Control + Pulsos

62,0 ± 2,0 79,0 ± 2,0** 56,6 ± 2,1 82,3 ± 1,9** 45,9 ± 0,9 1,84 ± 0,13

Isquemia 61,3 ± 1,9 80,0 ± 2,0** 60,2 ± 1,6 78,0 ± 1,4** 45,6 ± 1,2 2,12 ± 0,28

Isquemia + PostC

62,4 ± 2,9 80,3 ± 1,3** 57,5 ± 0,7 76,8 ± 2,6** 46,1 ± 1,1 1,85 ± 0,16

En condiciones de alto K+ extracelular (50 mM) se observó un aumento significativo en la liberación de 3H-

glutamato y 3H-glutamina. No se observaron diferencias significativas entre grupos experimentales para ninguno

de estos parámetros. Se muestra la media EE (n= 6 retinas/ grupo). **: P<0,01 vs. liberación basal, test de

Tukey.

Estos resultados sugieren que el daño isquémico podría involucrar un aumento en los niveles

sinápticos de glutamato y que el PostC podría proteger a la retina del daño isquémico a través de

la reducción en los niveles de este neurotransmisor. Para comprobar esta hipótesis, se inyectaron

concentraciones suprafisiológicas de glutamato en el cuerpo vítreo y se evaluó el daño retiniano.

Las consecuencias funcionales e histológicas de la inyección intravítrea de glutamato (4 l, 0,3

M, concentración final estimada: 20 mM) se representan en la Figura 21. El glutamato provocó

una caída significativa en la amplitud de las ondas a y b del ERG, así como en la amplitud de los

POs, sin modificar sus respectivas latencias. A nivel histológico se observó una marcada

alteración de la retina interna con disminución en el espesor total de la retina y de la CPI, así

como en el número de CGRs (Tabla 4). Considerando que la inyección de glutamato produjo un

daño retiniano de características similares al inducido por la isquemia, se evaluó el efecto de la

aplicación de 7 ciclos de isquemia/reperfusión (1 min/ 1 min) aplicados 5 min después de la

inyección de glutamato. Análogamente a lo observado en retinas isquémicas, la aplicación de

pulsos breves de isquemia revirtió significativamente las alteraciones funcionales y morfológicas

inducidas por la inyección intravítrea de glutamato (Tabla 4 y Figura 21).

Resultados

81

Figura 21. Evaluación funcional e histológica luego de 7 días de la inyección intravítrea de glutamato, sin o con

PostC. El glutamato provocó un daño funcional (ERG y POs) e histológico altamente significativo, que fue revertido

por la aplicación de pulsos de isquemia. Se muestra la media EE (n= 10 retinas/ grupo). *: P< 0,05, **: P< 0,01

vs. vehículo; a: P< 0,01 vs. glutamato con tratamiento simulado, test de Tukey. Barra= 50 m. CCG, capa de

células ganglionares; CPI, capa plexiforme interna; CNI, capa nuclear interna; CPE, capa plexiforme externa; CNE,

capa nuclear externa; SF, segmentos internos y externos de FR.

Resultados

82

Tabla 4. Espesor total y de las capas de la retina y número de células en la CCG en el grupo control (o vehículo), en

ojos con isquemia de 40 min, sin o con PostC, y en retinas de ojos inyectados con glutamato, sin o con PostC, luego

de 7 días de reperfusión o de la inyección de vehículo o glutamato.

Tratamiento Espesor total de

la retina ( m)

Capa plexiforme

interna ( m)

Capa nuclear

interna ( m)

Número de células en la CCG (células/ 200 m)

Control 144,2 3,8 31,9 2,2 19,9 6,1 14,9 0,9

Isquemia 119,1 5,4 ** 22,2 2,8 * 12,5 4,9 7,5 1,6 **

Isquemia + PostC 149,3 3,5 a 32,2 1,9 b 18,1 8,9 13,7 0,9 a

Glutamato 122,9 3,0 ** 20,8 2,5 ** 21,2 4,6 6,4 1,1 **

Glutamato + PostC 150,6 3,5 c 34,7 2,2 c 22,6 4,8 12,9 1,3 c

Se muestra la media EE (n= 10 retinas/ grupo). *: P<0,05, **: P<0,01 vs. control o inyección de vehículo, b: P<

0,05, a: P< 0,01 vs. isquemia de 40 min con tratamiento simulado, c: P< 0,01 vs. ojos inyectados con glutamato,

test de Tukey.

Resultados

83

3. Inducción de tolerancia isquémica como estrategia terapéutica en un modelo de

diabetes experimental

La retinopatía diabética constituye una de las principales causas de ceguera irreversible.

Actualmente no se dispone de estrategias terapéuticas completamente eficaces para disminuir la

incidencia y/o evitar la progresión de esta disfunción visual. En base a los resultados ya

presentados y considerando que el daño isquémico es un componente central de la retinopatía

diabética, el objetivo de esta etapa del trabajo de Tesis fue evaluar el efecto protector de la

tolerancia isquémica (inducida a través de la aplicación de pulsos breves de isquemia) como

estrategia terapéutica frente a las alteraciones funcionales, morfológicas y vasculares

características de la retinopatía diabética. Para ello, se utilizó un modelo experimental de

diabetes tipo I ampliamente validado en ratas, e inducido por la inyección intraperitoneal de una

dosis única de STZ. Luego de confirmada la hiperglucemia, se evaluó semanalmente la glucemia

y el peso corporal. En animales inyectados con STZ se observó un aumento significativo de la

glucemia y una caída significativa del peso corporal que progresó en el tiempo. La aplicación

semanal de pulsos de isquemia no modificó el peso corporal ni la glucemia en ratas control o

diabéticas (Tabla 5).

Tabla 5. Peso corporal y concentración de glucosa en sangre evaluados a diferentes intervalos post-inyección de STZ.

Intervalo luego de la inyección de STZ o vehículo

Peso corporal promedio (g) Concentración de glucosa en sangre (mg/dL)

Control Diabetes + pulsos de isquemia

Diabetes + tratamiento

simulado Control Diabetes + pulsos

de isquemia

Diabetes + tratamiento

simulado

3 días 315,6 ± 9,4 337,6 ± 10,0 333,7 ± 8,4 109,4 ± 6,4 484,7 ± 16,5 ** 476,0 ± 15,4**

3 semanas 404,3 ± 5,1 320,0 ± 7,9** 305,4 ± 5,2** 110,3 ± 4,3 498,1 ± 12,7** 502,3 ± 12,9**

6 semanas 432,6 ± 4,7 317,2 ± 11,1** 306,7 ± 12,2** 105,9 ± 5,3 519,8 ± 16,5** 528,3 ± 16,2**

10 semanas 461,2 ± 6,1 307,8 ± 19,2** 300,6 ± 18,5** 117,5 ± 4,3 583,4 ± 9,8** 596,3 ± 8,3**

La inyección de STZ provocó una caída significativa del peso corporal y un aumento en la glucemia. La aplicación

de pulsos de isquemia no modificó ninguno de estos parámetros. Se muestra la media EE (n= 10 animales/

grupo). **: P<0,01 vs. control (inyección de vehículo), test de Tukey.

Resultados

84

Para evaluar el efecto del condicionamiento isquémico se realizó una aplicación semanal de

pulsos breves de isquemia (5 min de isquemia por aumento de la PIO a 120 mm Hg) en un ojo y

un tratamiento simulado en el ojo contralateral de animales diabéticos. Se registraron ERGs en

forma previa al comienzo del tratamiento y luego, se realizaron registros semanales

inmediatamente antes de la aplicación de cada pulso de isquemia durante 10 semanas, de acuerdo

a los protocolos experimentales descriptos en la Figura 22.

Figura 22. Protocolo y grupos experimentales utilizados. Luego de confirmada la hiperglucemia (3 días post-

inyección de STZ), los animales recibieron semanalmente un pulso de isquemia breve (5 min) en un ojo y un

tratamiento simulado en el ojo contralateral. Las alteraciones funcionales, vasculares y morfológicas inducidas por

la hiperglucemia, así como el efecto protector del condicionamiento isquémico, se evaluaron a distintos intervalos

luego de la inyección de STZ.

Los resultados obtenidos en el análisis funcional se muestran en la Figura 23. En animales

control no se observaron diferencias significativas en la respuesta electrorretinográfica a lo largo

de las 10 semanas de evaluación. La aplicación de pulsos semanales de isquemia no afectó el

ERG en animales control (datos no mostrados). En los ojos de animales diabéticos con

tratamiento simulado se observó una disminución progresiva en la amplitud de las ondas a y b

del ERG, que fue significativa luego de 7 y 5 semanas post-inyección de STZ, respectivamente.

En los ojos contralaterales de animales diabéticos sometidos a condicionamiento isquémico se

observó una prevención significativa del daño funcional. A las 9 semanas post-inyección de STZ

la suma de las amplitudes de los POs disminuyó significativamente en ojos de animales

Resultados

85

diabéticos sometidos a un tratamiento simulado, en tanto que la aplicación de pulsos de isquemia

previno estas alteraciones (Figura 23).

Figura 23. Curso temporal de la respuesta electrorretinográfica de animales diabéticos, sin o con condicionamiento

isquémico. Se evaluaron semanalmente los ERGs (A) y los POs (C). En retinas de ojos de animales diabéticos con

tratamiento simulado (círculos negros) se observó una caída progresiva de la amplitud de las ondas a y b del ERG.

La aplicación semanal de pulsos de isquemia (círculos blancos) previno significativamente estas alteraciones, con

resultados similares a los del grupo control (no isquémico, barra gris). B: ERGs representativos de los distintos

grupos experimentales. C: Luego de 9 semanas de diabetes se observó una caída significativa en la suma de las

amplitudes de los POs. El condicionamiento isquémico revirtió esta alteración. D: Registros de POs representativos

de los distintos grupos experimentales. Se representa la media EE (n= 12 animales/ grupo). *: P<0,05, ** : P<0,01

vs. control; ‡: P<0,05, †: P<0,01 vs. ojos de animales diabéticos con tratamiento simulado, test de Tukey.

Resultados

86

El análisis histológico realizado a distintos intervalos posteriores a la inyección de STZ no reveló

cambios aparentes entre los grupos experimentales (Figura 24). En retinas de ojos con

tratamiento simulado de animales con 10 semanas de diabetes, se realizó además una evaluación

morfométrica. No se observaron diferencias en el espesor total de la retina (control: 147,5 ± 12,3

μm, diabetes + tratamiento simulado: 158,β ± 10,8 μm y diabetes + condicionamiento isquémico:

15β,0 ± 19,β μm, media ± EE), en el espesor de las capas de la retina, así como en el número de

células en la CCG entre los grupos experimentales. Análogamente, la inmunomarcación para

NeuN o Brn3a (marcadores específicos de CGRs) no reveló cambios en el número de células

entre los grupos experimentales (Figura 24D-G).

Figura 24. Análisis histológico luego de 10 semanas de diabetes. Se muestran secciones representativas de cortes

transversales de retinas con tinción de H-E o inmunomarcación para NeuN, correspondientes al grupo control (A y

D), diabetes + tratamiento simulado (B y E) y diabetes + condicionamiento isquémico (C y F). El análisis

morfométrico no reveló cambios significativos en el número de CGRs (G, evaluado mediante tinción con H-E,

Resultados

87

DAPI o inmunomarcación de células NeuN+ y Brn3a+) o en el espesor de las capas retinianas (H). Test de Tukey.

Barra: C= 50 m, E= 25 m. CCG, capa de células ganglionares; CPI, capa plexiforme interna; CNI, capa nuclear

interna; CNE, capa nuclear externa; SF, segmentos internos y externos de fotorreceptores.

A continuación, se evaluó la integridad de la barrera hemato-retiniana interna mediante la

localización del complejo azul de Evans-albúmina en retinas en montaje plano (Figura 25). En

retinas de animales control, el marcador se localizó exclusivamente en el lumen de los vasos,

marcando completamente el plexo vascular superficial y profundo, con escaso nivel de marca

inespecífica. En retinas de ojos de animales diabéticos con tratamiento simulado se observó una

marca generalizada fuera de los vasos y focos de difusión del colorante, principalmente en la

región del disco óptico y en los vasos de mayor calibre. El condicionamiento isquémico redujo

marcadamente el aumento en la permeabilidad vascular inducido por diabetes experimental y

sólo se encontraron focos aislados de difusión del colorante en vasos grandes (Figura 25).

Figura 25. Evaluación de la permeabilidad vascular mediante la perfusión del colorante azul de Evans. En retinas

control (A, detalle en D) se observó una marca intensa del colorante en el lumen vascular, en tanto que en retinas de

animales diabéticos, el colorante se localizó en el parénquima retiniano (B, detalle en E). La aplicación de pulsos de

isquemia previno marcadamente el aumento en la permeabilidad vascular inducido por diabetes experimental (C,

detalle en F). Barra: C= 500 m, F= 50 m.

Resultados

88

A continuación, se analizó la inmunomarcación para GFAP en retinas en montaje plano (Figura

26). En retinas control se observó una marca intensa en astrocitos estrellados formando una

monocapa a la altura de la membrana limitante interna, en íntimo contacto con el plexo vascular

superficial. Luego de 6 semanas de diabetes se observó una clara reducción en la

inmunorreactividad para GFAP en todas las regiones analizadas (una región central y una

periférica por cuadrante). En retinas de ojos de animales diabéticos con pulsos de isquemia, la

marcación para GFAP resultó similar a la observada en retinas control (Figura 26).

Figura 26. Inmunomarcación para GFAP a las de 6 semanas de diabetes. A: Esquema de una retina donde se

representan las regiones analizadas. En retinas control (B) se observó una marca intensa para GFAP tanto en la

región central (F) como en la periferia (J). La intensidad de la inmunomarcación para GFAP en retinas de ojos de

animales diabéticos disminuyó notablemente en todas las regiones evaluadas (C, detalle de región central en G y

periferia en K). El condicionamiento isquémico revirtió marcadamente estas alteraciones (D, detalles en H y L, de

zona central y periférica, respectivamente). Se muestran los resultados obtenidos del análisis cuantitativo del área

ocupada por astrocitos GFAP(+) en la región central (E) y periférica (I) para los distintos grupos experimentales. Se

muestra la media EE, n= 5 retinas/ grupo. *: P< 0,05, **: P< 0,01 vs. control; †: P< 0,01, vs. ojos + tratamiento

simulado, test de Tukey. Barra: A= 1 mm, D= 100 m, H y L= 50 m.

Resultados

89

Luego se analizó el estado de la barrera hemato-retiniana interna a nivel untraestructural a través

de la perfusión con nitrato de lantato. El lantano es un trazador que al precipitar forma depósitos

electrón-densos que permiten su identificación al MET. En retinas control se observaron

depósitos amorfos de lantano en el lumen de los vasos retinianos, en íntimo contacto con el

glicocálix de las células endoteliales y en el espacio apical de las uniones intercelulares hasta el

sitio de unión intercelular, lo que sugiere la presencia de uniones estrechas funcionales (Figura

27A). En vasos de retinas de ojos de animales diabéticos con tratamiento simulado se observaron

alteraciones en la integridad de la barrera sólo en un número reducido de vasos. Un análisis a

mayor aumento permitió detectar la presencia del trazador en todo el espacio intercelular y en

contacto con la lámina basal endotelial (Figura 27D). A la altura de la unión celular se observó

frecuentemente la formación de edemas (Figura 27B y E). En comparación con retinas control,

las células endoteliales de retinas de ojos de animales diabéticos presentaron un número elevado

de vesículas de micropinocitosis hacia el lumen (cara E del endotelio) así como vesículas intra-

endoteliales (0,6 - 1,1 μm de diámetro) con depósitos de lantano (Figura 27F). Estas alteraciones

se encontraron tanto en el plexo vascular superficial como en el profundo. En retinas de ojos

sometidos a condicionamiento isquémico de animales diabéticos no se observaron alteraciones a

nivel de las uniones endoteliales, aunque se detectó un número elevado de vesículas

intracelulares (Figura 27C y G).

Resultados

90

Figura 27. Evaluación ultraestructural de la integridad de la barrera hemato-retiniana interna analizada mediante la

perfusión con lantano. Se muestran secciones transversales representativas de vasos de una retina del grupo control

(A), diabetes + tratamiento simulado (B, D-F) y diabetes + condicionamiento isquémico (C y G). En todos los casos,

nótese el vaso rodeado de una lámina basal continua con un pericito (P) asociado. En retinas de animales con 6

semanas de diabetes, el trazador se localizó sobre la superficie luminal de las células endoteliales y en las uniones

intercelulares (B, flechas). Frecuentemente se observaron edemas en las zonas de unión intercelular (B, cabeza de

flecha). Sólo en algunos casos se observó disrupción de la integridad de la barrera con extravasación del trazador,

alcanzando la lámina basal (D). En el panel E se muestra un detalle de una unión entre dos células endoteliales

Resultados

91

(remarcadas en azul y rojo) con la presencia de un edema que no afectó la integridad de la barrera interna (nótese la

presencia del trazador sólo en la porción apical de la unión). La lámina basal se representa en verde. F:

Frecuentemente se observó la presencia del trazador en vacuolas de micropinocitosis y vesículas citoplasmáticas

(ver flechas) sobre la pared luminal de las células endoteliales (cara-E). G: La aplicación de pulsos de isquemia

previno la formación de edemas y la disrupción de la integridad de la barrera hemato-retiniana interna. En todos los

vasos analizados, el avance del trazador fue detenido por la unión apical intercelular (cabeza de flecha). Sin

embargo, no se observaron diferencias en cuanto a la presencia de vesículas citoplasmáticas (ver flechas). Barras: A-

C= 1,5 m; E=0,6 m; D, F, G= 0,3 m. LB: lámina basal.

A continuación, se determinaron los niveles y la localización retiniana de VEGF. A las 6

semanas de diabetes se evaluaron los niveles del VEGF por Western blot en homogenatos de

retinas de los distintos grupos experimentales. En retinas de animales diabéticos con tratamiento

simulado se observó un aumento significativo en los niveles de VEGF, en comparación con el

grupo control. La aplicación de pulsos de isquemia previno parcial, pero significativamente el

aumento en los niveles de VEGF (Figura 28A-B). A continuación, se determinaron los niveles de

VEGF a distintos intervalos luego de la aplicación de pulsos de isquemia. En retinas de ojos con

condicionamiento isquémico de animales con 6 semanas de diabetes, se observó una disminución

significativa en los niveles de VEGF luego de 3 y 7 días (pero no a las 24 h) luego del 6to pulso

de isquemia (Figura 28A-B). Estos resultados fueron confirmados mediante técnicas de

inmunohistoquímica. En retinas de animales control se observó inmunorreactividad leve para

VEGF en capas de la retina interna. A las 6 semanas de diabetes se observó un aumento marcado

en la inmunorreactividad para VEGF, particularmente en el pericarion de neuronas de la CCG y

en células presentes en la CNI. El condicionamiento isquémico revirtió el aumento en los niveles

de VEGF (Figura 28C-D). Se obtuvieron resultados similares en muestras obtenidas de animales

luego de 10 semanas de la inyección de STZ (datos no mostrados).

Resultados

92

Figura 28. Niveles retinianos de VEGF y su localización celular. A: Se analizaron los niveles de VEGF retinianos

por Western blot a las 6 semanas de diabetes. El análisis densitométrico se muestra en el panel B. Los niveles de

VEGF aumentaron significativamente en retinas de ojos de animales diabéticos con tratamiento simulado. Este

aumento fue parcialmente revertido por el condicionamiento isquémico (luego de 3 y 7 días pero no a las 24 h de la

aplicación del pulso de isquemia). Se muestra la media EE, n= 5 retinas/ grupo. *: P<0,05, **: P<0,01 vs. control;

†: P<0.01 vs. diabetes con tratamiento simulado, test de Tukey. C-E: Análisis de la inmunolocalización de VEGF en

retinas del grupo control (C), diabetes (D) y diabetes con pulsos de isquemia (E). A las 6 semanas de diabetes se

observó un marcado aumento de la inmunorreactividad para VEGF en células de la CCG (D, flechas) y de la CNI

(D, cabezas de flecha). La aplicación de pulsos de isquemia previno este aumento y sólo se observó

inmunorreactividad leve en la retina interna (E). Barra: E= 50 m. CCG, capa de células ganglionares; CPI, capa

plexiforme interna; CNI, capa nuclear interna; CNE, capa nuclear externa; SF, segmentos internos y externos de

fotorreceptores.

Finalmente, se analizó el efecto del condicionamiento isquémico sobre la progresión del daño

inducido por diabetes experimental. Para ello, se utilizó un protocolo que consistió en una

aplicación de pulsos de isquemia que comenzó a partir de la 6ta semana luego de la inyección de

STZ. Análogamente a lo ya descripto en la Figura 23, a las 6 semanas de diabetes, se observó

una disfunción visual significativa respecto a animales control, que progresó a lo largo del

estudio (Figura 29). La aplicación de pulsos breves de isquemia a partir de la 6ta semana (post-

inyección de STZ) evitó la progresión en la caída en la amplitud de las ondas a y b del ERG. Esta

Resultados

93

protección se mantuvo hasta la semana 12 post-inyección de STZ. Se obtuvieron resultados

similares en el análisis de los POs (Figura 29D).

En suma, estos resultados demuestran que el condicionamiento isquémico previno y evitó la

progresión del daño funcional retiniano característico de la diabetes experimental.

Figura 29. Curso temporal de la protección funcional inducida por la aplicación de pulsos de isquemia a partir de la

semana 6 post-inyección de STZ. A: Protocolo de aplicación de pulsos de isquemia. El condicionamiento isquémico

(círculos blancos) indujo una protección funcional significativa sobre la amplitud de las ondas a y b del ERG (panel

B-C), respecto al grupo de ojos diabéticos sometidos a un tratamiento simulado (círculos negros). Se obtuvieron

resultados similares en el análisis de los POs (D). En el panel E se muestran ERGs representativos registrados

semanalmente hasta las 12 semanas luego de la inyección de vehículo o STZ. Se muestra la media EE, n= 10

animales/ grupo. *: P<0,05, **: P<0,01 vs. diabetes con pulsos de isquemia, test de Student. En este experimento,

los parámetros electrorretinográficos de animales control (no diabéticos) fueron (en V): onda a: 82,3 6,2; onda b:

291,2 10,8; POs: 111,5 12,3 y no se modificaron a lo largo del estudio.

Resultados

94

4. Axonopatía distal temprana en la diabetes experimental

Si bien la mayor parte de la investigación en el área de la retinopatía diabética se ha focalizado

particularmente en las alteraciones vasculares retinianas, diversos autores han descripto

alteraciones funcionales en la vía visual de pacientes diabéticos en etapas tempranas de la

enfermedad. Sin embargo, al presente sólo se dispone de escasa información respecto a las

alteraciones de la vía visual en estadíos tempranos de diabetes. Por lo tanto, la serie de

experimentos que se describirá a continuación tuvo como objetivo evaluar la morfología de la

vía visual en estadíos tempranos de diabetes experimental inducida por STZ.

En primer lugar, se evaluó el transporte anterógrado de CTB a través de las proyecciones de las

CGRs al CS, en distintos intervalos posteriores a la inyección de STZ. En animales control se

observó una marcación intensa de CTB en las capas retinotópicas superficiales (SZ y SGS) del

CS (Figura 30). A las 3 semanas post-inyección de STZ no se observaron diferencias respecto al

grupo control. En cambio, a las 6 semanas de inducción de diabetes se detectó una reducción

clara en la marcación de CTB. Se realizó una reconstrucción completa (a partir de secciones

coronales seriadas) del CS en vista dorsal, en las que se cuantificó la intensidad de marca en la

región retinotópica de cada sección y finalmente se aplicó una escala térmica que permitió una

clara identificación del patrón de marcación de CTB. En animales con 6 semanas de diabetes se

observó una reducción notable de la marcación en la región central y lateral del CS, a lo largo del

eje rostro-caudal. Se observaron además frecuentes focos con ausencia completa de marca,

principalmente en la región lateral. Si bien se evidenciaron variaciones en el patrón de marcación

entre distintos animales, en todos los casos se detectó una disminución de la marca respecto a la

obtenida en animales control. En animales con 15 semanas de diabetes se observó un perfil

similar de caída en la marcación para CTB (Figura 30).

Resultados

95

Figura 30. Detección de CTB en terminales retinianas a nivel de las capas superficiales del CS. Panel superior:

Fotomicrografías representativas de secciones del CS (corte coronal) de un animal control. En el panel de la derecha

se muestra una reconstrucción en vista dorsal del mapa retinotópico de marcación para CTB. La escala térmica

aplicada indicó zonas de máxima detección de CTB (1: rojo) o ausencia del trazador (0: azul). A las 3 semanas de

diabetes no se observaron alteraciones evidentes en el transporte anterógrado. Sin embargo, a las 6 y 15 semanas

luego de la inyección de STZ se observó una clara disminución en la marcación, principalmente en la región central

y lateral del CS. Barra= 1 mm.

A continuación, se analizó el CS, el principal núcleo de proyección retiniana en roedores, a

distintos intervalos luego de la inyección de STZ. En todos los intervalos evaluados no se

observaron alteraciones evidentes en la citoarquitectura de las capas retinotópicas del CS, la

densidad neuronal o la respuesta glial (Figura 31). No se observaron células TUNEL(+) en

ninguno de los intervalos estudiados.

La alteración en el transporte de CTB en animales diabéticos observado ya a las 6 semanas post-

inyección de STZ, no parecería atribuible a alteraciones a nivel retiniano, dado que no se

observaron alteraciones en la estructura de la retina a las 10 semanas de diabetes, como ya se

mostró en la Figura 24.

Resultados

96

Figura 31. Análisis morfométrico del CS. Se evaluó el número de células y la reactividad astrocitaria (% de área

GFAP+, evaluado por densidad óptica de inmunomarcación) en la región retinotópica del CS (ver esquema,

recuadros azules en secciones coronales de la región rostral, medial y caudal) de los distintos grupos experimentales.

No se observaron diferencias significativas para estos parámetros entre los grupos experimentales. Test de Dunnett.

Barra= 50 μm. SZ, stratum zonale; SGS, stratum griseum superficial.

Por lo tanto, con el fin de identificar el sitio de disrupción del transporte axonal en la vía visual,

se realizó un análisis morfométrico en diferentes regiones del NO en el período más temprano (6

semanas de inducción de diabetes) en el que se observaron signos claros de alteración en el

transporte axonal, sin cambios evidentes a nivel retiniano o en el CS.

En la porción proximal del NO, los axones de las CGRs que salen del globo ocular están en

íntimo contacto con una red de astrocitos GFAP(+). A partir de esta zona, los axones se

mielinizan y continúan hacia el quiasma óptico (Figura 32).

Resultados

97

Figura 32. Regiones del NO analizadas. En el panel superior se muestra el esquema de un cerebro de rata en vista

ventral, donde se indica la papila óptica y la porción proximal del NO (recuadro rojo) y las porciones mielinizadas

proximal y distal del NO. Panel inferior: Esquema de la porción proximal del NO en corte sagital. Se representa la

lámina glial, la zona de transición y la región mielinizada. Las líneas horizontales (A y B) señalan la zona donde se

realizaron los cortes transversales del NO. La línea punteada representa el flujo arterial de la retina y el NO. Barra=

100 m.

Se analizaron secciones semifinas del NO en cortes transversales, en su porción mielinizada

proximal (intraorbital, próxima a la cabeza del NO) y distal (intracraneal, próxima al quiasma

óptico), como se muestra en la Figura 32. No se observaron diferencias evidentes en la porción

proximal del NO entre los grupos experimentales. En cambio, en la región distal del NO de

animales diabéticos se observó una disminución significativa en el número y en el área promedio

de los axones. El histograma de frecuencia del área axonal y la cuantificación de axones

Resultados

98

agrupados según el tamaño indicaron una alteración particular de las fibras de mayor calibre en

NOs de animales diabéticos (Figura 33). Para todas las regiones analizadas no se observaron

diferencias en el área total del NO (datos no mostrados).

Figura 33. Análisis morfométrico del NO de animales control (A-C) o de animales con 6 semanas de diabetes (F-

H). No se observaron diferencias significativas en la porción proximal del NO entre los grupos experimentales. En

secciones distales del NO de animales diabéticos se observó una clara disminución en el número (D) y en el área

promedio de los axones (E), que afectó principalmente a las fibras de mayor calibre (I). Se muestra la media ± EE

(n= 5 NOs/ grupo). **: P< 0,01 vs. control, test de Student. Barra= 25 m.

En secciones transversales de diferentes regiones del NO se analizó la morfología celular de

astrocitos GFAP(+). No se observaron diferencias en la porción proximal del NO, tanto en la

porción de la lámina glial como en la región mielinizada (Figura 34). Sin embargo, se observó un

aumento significativo de la reactividad glial en la porción distal del NO de animales diabéticos

(Figura 34).

Resultados

99

Figura 34. Inmunomarcación para GFAP en secciones transversales representativas de la región proximal (lámina

glial y porción mielinizada) y distal del NO de animales control y animales con 6 semanas de diabetes. En la porción

distal del NO diabético se observó un aumento significativo en la inmunomarcación para GFAP (densidad óptica

(DO) de marca GFAP(+) respecto al área total del NO), sin un claro aumento en el número de núcleos por sección.

Se muestra la media ± EE (n= 5 NOs/ grupo). **: P< 0,01 vs. control, test de Student. Barra= 200 m.

Finalmente, se evaluó la morfología retiniana en animales diabéticos a distintos períodos luego

de la inyección de STZ, con el objeto de determinar si las alteraciones axonales observadas en la

porción distal del NO progresan retrógradamente en la vía visual. Luego de 15 semanas de

diabetes experimental se observó una disminución significativa en el número de células en la

CCG, evaluado por tinción con H-E e inmunomarcación para dos marcadores específicos de

CGRs, NeuN y Brn3a (Figura 35). Se observó además un aumento significativo en el número de

células TUNEL(+) en la CCG (Figura 35C-D). En todos los intervalos evaluados, no se

observaron diferencias en el espesor total y de las capas internas de la retina, entre los grupos

experimentales (Tabla 6). En conjunto, estos resultados demuestran una alteración significativa

en la vía visual a las 6 semanas de inducción de diabetes experimental, particularmente en la

porción distal del NO en una etapa temprana de la enfermedad, en la que no se observaron

cambios en la porción proximal del NO y no resultaron evidentes alteraciones en la retina o el

CS.

Resultados

100

Figura 35. Análisis de CGRs en la diabetes experimental. A: Secciones transversales de retinas representativas de

los distintos grupos experimentales. A las 15 semanas de inducción de diabetes se observó una caída significativa en

el número de CGRs (B, tinción por H-E) y un aumento en el número de células TUNEL(+) presentes en la CCG (C-

D). Estos resultados se confirmaron evaluando la inmunomarcación para Brn3a (E-F). Se muestra la media ± EE (n=

5 ojos/ grupo). **: P< 0,01 vs. grupo control, test de Dunnett. Barra= 50 m. CCG, capa de células ganglionares;

CPI, capa plexiforme interna; CNI, capa nuclear interna; CNE, capa nuclear externa, SF, segmentos internos y

externos de fotorreceptores.

Tabla 6. Espesor total y capas internas de la retina.

Grupo Espesor total retina ( m) CPI ( m) CNI ( m)

Control 149,6 ± 6,2 35,6 ± 8,2 22,4 ± 8,4

Dia

bet

es 10 semanas 145,8 ± 11,2 34,5 ± 7,4 23,4 ± 5,3

12 semanas 149,1 ± 10.4 36,7 ± 5,9 20,5 ± 7,7

15 semanas 148,8 ± 9,3 37,8 ± 3,5 21,9 ± 8,4

Se muestra la media ± EE (n=10 retinas/ grupo), test de Dunnett. CPI, capa plexiforme interna; CNI, capa nuclear

interna.

Resultados

101

5. Efecto del condicionamiento isquémico sobre las alteraciones axo-gliales en la vía visual

diabética

La siguiente serie de experimentos tuvo como objetivo evaluar el efecto protector de la

inducción de tolerancia isquémica frente a las alteraciones tempranas de la vía visual diabética.

Para ello, análogamente a los descripto en el capítulo anterior, se inyectaron animales con STZ y

luego de 3 días de confirmada la hiperglucemia, se inició un protocolo de aplicación semanal de

un pulso breve de isquemia (inducida por aumento de la PIO a 120 mm Hg durante 5 min) en un

ojo y tratamiento simulado en el ojo contralateral. A las 6 semanas de tratamiento se evaluaron

las alteraciones morfológicas en distinta porciones de la vía visual.

En primer lugar, se examinó el efecto del condicionamiento isquémico sobre las alteraciones en

el transporte anterógrado de CTB. En la Figura 36 se muestran los resultados obtenidos en un

animal diabético que recibió pulsos semanales de isquemia en un ojo y tratamiento simulado en

el ojo contralateral durante 6 semanas. En el CS inervado por terminales de CGRs del ojo con

condicionamiento isquémico se observó una intensa marcación de CTB, en comparación a la

región contralateral del CS. El análisis de la reconstrucción del CS reveló que la protección

inducida por el condicionamiento isquémico fue prácticamente completa (Figura 36).

El condicionamiento isquémico previno las alteraciones axonales observadas en la vía visual

diabética. La aplicación semanal de pulsos de isquemia revirtió significativamente la caída en el

número y en el área axonal promedio en NOs de ojos de animales diabéticos (Figura 37).

Resultados

102

Figura 36. Transporte anterógrado de CTB en terminales retinianos a nivel de las capas superficiales del CS. Se

muestran tres secciones representativas (región rostral, medial y caudal) de un animal diabético con

condicionamiento isquémico en un ojo y tratamiento simulado en el ojo contralateral. Se observó una clara

disminución en la marcación para CTB en el CS inervado por el ojo con tratamiento simulado. La aplicación

semanal de pulsos de isquemia previno esta alteración y se observó un patrón de marcación similar al observado en

animales control. En el panel derecho se muestran reconstrucciones del mapa de inervación del CS en vista dorsal.

Barra= 1 mm.

Asimismo, se evaluó el efecto del condicionamiento isquémico sobre las alteraciones gliales

inducidas por diabetes experimental. En primer lugar, se realizó una inmunomarcación para

GFAP en cortes transversales de la porción distal del NO. En NOs de ojos de animales diabéticos

con condicionamiento isquémico se observó una disminución significativa en la intensidad y en

el área ocupada por procesos de astrocitos GFAP(+), en comparación a los resultados obtenidos

en la vía contralateral (diabetes + tratamiento simulado) (Figura 38). En la Figura 38E se muestra

una sección horizontal del quiasma óptico de un animal diabético en vista panorámica. En la vía

Resultados

103

óptica conformada por axones del ojo sometido a condicionamiento isquémico se observó una

clara disminución en la reactividad glial (tanto en el NO ipsilateral como en el tracto óptico

contralateral), respecto a la vía contralateral formada por axones de las CGRs del ojo con

tratamiento simulado.

Figura 37. Análisis morfométrico de la porción distal del NO. En el panel superior se muestran secciones

transversales representativas de la porción distal del NO de un animal control y un animal con 6 semanas de

diabetes, con o sin condicionamiento isquémico. Panel central: Histogramas de frecuencia del área axonal evaluado

en NOs de animales representativos de los distintos grupos experimentales. La aplicación de pulsos de isquemia

previno significativamente la caída en el número de axones y en el área axonal promedio inducida por la diabetes.

Se muestra la media ± EE (n= 6 NOs/ grupo). *: P< 0,05, **: P< 0,01 vs. grupo control; b: P< 0,05, a: P< 0,01 vs.

ojos de animales diabéticos con tratamiento simulado, Test de Tukey. Barra= 25 μm.

Resultados

104

Figura 38. Análisis de células GFAP(+) en la porción distal de la vía visual diabética. Se muestran cortes

transversales de la porción distal del NO de un animal representativo del grupo control (A), diabético + tratamiento

simulado (B) y diabético + condicionamiento isquémico (C). En NOs diabéticos con tratamiento simulado se

observó un aumento significativo en la intensidad y en el área ocupada por procesos de células gliales GFAP(+)

(densidad óptica (DO) total en al área evaluada, D). La aplicación de pulsos de isquemia revirtió este aumento. En el

panel E se muestra una sección en plano horizontal del quiasma óptico de un animal diabético representativo (ver

esquema). En la vía óptica del ojo con condicionamiento isquémico se observó una clara disminución en la

reactividad glial, respecto a la vía contralateral con tratamiento simulado. Se muestra la media ± EE (n= 6 NOs/

Resultados

105

grupo). **: P< 0,01 vs. grupo control; a: P< 0,01 vs. NOs de ojos de animales con tratamiento simulado, Test de

Tukey. Barra: C= 25 μm, E= 600 m. TO: tracto óptico.

Se evaluaron las posibles alteraciones en la mielina (OL maduros) inducidas por diabetes

experimental y el efecto del condicionamiento isquémico sobre este parámetro. En la Figura 39

se muestra la inmunomarcación para MBP en secciones horizontales de la porción distal del NO.

En NOs de animales diabéticos se observó una ligera desorganización de la mielina, con

frecuentes zonas de desmielinización. Mediante un análisis de doble marcación para MBP y

GFAP se observó claramente que las zonas de desmielinización fueron ocupadas por células

gliales GFAP(+). La aplicación de pulsos de isquemia revirtió marcadamente estas alteraciones

en la porción distal del NO de animales diabéticos (Figura 39G-I).

Figura 39. Alteraciones de la mielina en la vía visual diabética. Inmunomarcación para MBP y GFAP en secciones

horizontales del NO distal representativas del grupo control (A-C) y de un animal diabético con tratamiento

simulado (D-F) o con condicionamiento isquémico (G-I). En animales diabéticos se observaron zonas de

desmielinización y reactividad glial, que fueron prevenidas por el condicionamiento isquémico. Barra= 50μm.

Resultados

106

A nivel ultraestructural, en cortes transversales de NOs de animales diabéticos se observaron

axones en degeneración con desorganización en el empaquetamiento de la mielina, pérdida de

axones grandes y frecuentemente se observaron cuerpos lamelares membranosos (Figura 40B).

En NOs de ojos diabéticos con condicionamiento isquémico se observó una preservación

significativa de la estructura de los axones grandes y en la envoltura mielínica (Figura 40C). El

análisis morfométrico de NOs diabéticos con tratamiento simulado indicó una disminución

significativa en el área axonal promedio, que fue revertida por la aplicación de pulsos de

isquemia (Figura 40D). La disminución en el número de axones grandes y en el área axonal

promedio de NOs de animales diabéticos dio como resultado una clara alteración en la curva

obtenida del cálculo de la relación axón-mielina, con una pendiente significativamente mayor en

la recta de ajuste, respecto a NOs de animales control (P< 0,01). La aplicación de pulsos de

isquemia previno estas alteraciones (P< 0,01) (Figura 40E). Los resultados obtenidos para las

pendientes fueron: 0,22 ± 0,03 en controles, 0,33 ± 0,06 en el grupo diabetes + tratamiento

simulado; y 0,21 ± 0,05 en diabéticos + condicionamiento isquémico (media ± EE). No se

observaron diferencias entre los grupos experimentales respecto a los valores de g-radio (0,70 ±

0,04; 0,72 ± 0,05; 0,71 ± 0,04 para el grupo control, diabetes + tratamiento simulado y diabetes +

condicionamiento isquémico, respectivamente, media ± EE).

Resultados

107

Figura 40. Análisis ultrastructural de axones mielinizados de la porción distal del NO. En el grupo control (A) se

observaron paquetes compactos de axones formando fascículos. En NOs de ojos de animales diabéticos con

tratamiento simulado se encontraron signos claros de degeneración axonal y desorganización de la mielina (B,

flechas) y una disminución en el área axonal promedio (D). El condicionamiento isquémico evitó estas alteraciones

(C-D). E: Análisis de la relación fibra-mielina evaluada en animales representativos de los distintos grupos

experimentales. En un NO representativo de un animal diabéticos (trazo punteado) se observó una pendiente mayor

de la curva de ajuste respecto al grupo control (trazo continuo). El condicionamiento isquémico (trazo discontinuo)

previno estas alteraciones y se obtuvieron resultados similares a los observados en el grupo control. Se muestra la

media ± EE (n= 3 NOs/ grupo). **: P< 0,01 vs. control; b: P< 0,05 vs. NOs de ojos de animales diabéticos con

tratamiento simulado, test de Tukey. Barra= β μm.

Para analizar el efecto del condicionamiento isquémico sobre el linaje oligodendrocitario, se

evaluó la morfología celular de OL inmaduros (células O1+) y precursores de OL (células

PDGFR- +) por inmunofluorescencia. A las 6 semanas de diabetes se observó una gran

desorganización celular en las poblaciones de células O1+ y PDGFR- con la presencia de

células con cuerpos hipertrofiados (Figura 41). En cortes longitudinales de NOs de ojos de

animales diabéticos con pulsos de isquemia se observó una marcada preservación de la

Resultados

108

morfología celular de ambas poblaciones, con procesos celulares alineados paralelamente a los

paquetes de axones (Figura 41).

Figura 41. Evaluación de células del linaje oligodendrocítico. Se analizó la morfología de OL inmaduros (células

O1+) y precursores de OL (células PDGFR-+) por inmunofluorescencia. En NOs de ojos de animales diabéticos

con tratamiento simulado se observó un aumento en la inmunorreactividad para ambos marcadores (medido como

densidad óptica (DO) del área de marcación positiva), con la presencia de células hipertrofiadas. La aplicación de

pulsos de isquemia semanales previno estas alteraciones. Se muestra la media ± EE (n= 6 NOs/ grupo). *: P< 0,05,

**: P< 0,01 vs. control; a: P< 0,01 vs. NOs de ojos de animales diabéticos con tratamiento simulado, test de Tukey.

Barra= 50 m.

El análisis por microscopía confocal de las poblaciones macrogliales en NOs diabéticos reveló

una gran proximidad entre células GFAP+ y O1+, pero sin co-localización entre marcadores (r =

0,35 ± 0,12; media ± EE). En estos animales se observó un porcentaje elevado de células

PDGFR- + con morfología hipertrofiada y desorganización celular que resultaron

inmunopositivas para GFAP (Figura 42). Asimismo, se observó una alta co-localización entre

ambos marcadores (r = 0,75 ± 0,10). En la vía contralateral de animales diabéticos,

correspondiente a ojos con condicionamiento isquémico no se observó co-localización entre

marcadores (r = 0,36 ± 0,09), de manera similar a lo observado en muestras de animales control

(r = 0,29 ± 0,08).

Resultados

109

Figura 42. Análisis de co-localización por microscopía confocal. En NOs de ojos de animales diabéticos con

tratamiento simulado se observó una clara co-localización para PDGFR- y GFAP. Se muestran imágenes de la

reconstrucción en el eje-Z. La aplicación de pulsos de isquemia previno las alteraciones en la morfología de células

PDGFR- y la co-expresión de GFAP en estas células. En el panel de la derecha se muestran gráficos

representativos del análisis de co-localización para GFAP vs. PDGFR- en una sección del plano Z. Barra= 25 μm.

A continuación, se analizó la respuesta microglial mediante una marcación con isolectina GSA.

En la porción distal del NO de animales control y diabéticos, sin o con condicionamiento

isquémico, se observó una morfología celular característica de microglía en reposo, con somas

en forma de bastón y procesos celulares finos y ramificados (Figura 43). En ninguno de los

grupos experimentales se observaron células inmunorreactivas para marcadores de microglía

activada (CD11b+ y ED1+).

Resultados

110

Figura 43. Análisis de células microgliales en la vía visual diabética. Se muestran secciones horizontales de NOs de

un animal representativo del grupo control (A) y un animal con 6 semanas de diabetes (B). En todos los grupos

experimentales se observaron células microgliales en reposo. A mayor aumento se observan claramente los procesos

finos y ramificados característicos de la microglía en reposo. En animales con 6 semanas de diabetes no se

observaron diferencias entre NOs de ojos sin o con condicionamiento isquémico. Barra= 50 µm; inset= 25 µm.

Para determinar la participación del BDNF en el mecanismo de protección desencadenado por el

condicionamiento isquémico, se evaluaron los niveles y la localización retiniana de esta

neurotrofina en los distintos grupos experimentales. En retinas de animales control se observó

una marca intensa de BDNF en el pericarion de células en la CCG y en la CNI. A las 6 semanas

de diabetes no se evidenciaron diferencias en la inmunorreactividad para BDNF entre los grupos

experimentales (datos no mostrados). Sin embargo, a las 10 semanas de inducción de diabetes se

observó una caída en los niveles de BDNF en células de la CCG y la CNI (Figura 44). El

condicionamiento isquémico revirtió notablemente el efecto de la diabetes sobre los niveles de

BDNF. En este sentido, el número de células BDNF(+) presentes en la CCG resultó similar al

observado en retinas del grupo control (Figura 44B). Un análisis a mayor aumento permitió

observar una recuperación en los niveles de BDNF en las CGRs y en los procesos de las células

de Müller (Figura 44C).

Se evaluó además la inmunorreactividad para BDNF en el CS, a distintos intervalos luego de la

inducción de diabetes. En ninguno de los intervalos post-inyección de STZ analizados se

observaron diferencias en la inmunomarcación para BDNF en las capas superficiales del CS, en

comparación con resultados de animales control (datos no mostrados).

Resultados

111

Figura 44. Inmunomarcación para BDNF. A: Luego de 10 semanas de diabetes se observó una marcada

disminución en la inmunorreactividad para BDNF en células de la CCG y la CNI, respecto a retinas de animales

control. La aplicación de pulsos de isquemia revirtió estas alteraciones. B: cuantificación del número de células

BDNF+ en la CCG para los distintos grupos experimentales. C: En retinas de ojos de animales diabéticos con

condicionamiento isquémico se observó una marca intensa para BDNF en las CGRs Brn3a+ (cabezas de flecha) y en

procesos de células de Müller (flechas). Se muestra la media EE (n= 5 retinas/ grupo). **: P<0,01 vs. control; a:

P<0,01 vs. diabetes con tratamiento simulado, test de Tukey. Barra: A=50 m, C=25 m.

Con el objetivo de caracterizar los mecanismos involucrados en la protección inducida por el

condicionamiento isquémico se evaluó la actividad de GS y el uptake de glutamato luego de 6

semanas de diabetes. En retinas de ojos de animales diabéticos con tratamiento simulado se

observó una disminución significativa en la actividad de GS con respecto al grupo control. El

condicionamiento isquémico previno esta disminución (Figura 45A). No se observaron

diferencias significativas en el influjo de glutamato entre los grupos experimentales (Figura

45B). La aplicación de pulsos semanales de isquemia en ojos de animales control no afectó estos

parámetros (Figura 45).

Resultados

112

Figura 45. Efecto de la diabetes y el condicionamiento isquémico sobre la actividad de GS (A) y el uptake de

glutamato (B), evaluado a las 6 semanas de inducción de diabetes. En retinas de ojos de animales diabéticos con

tratamiento simulado se observó una disminución significativa en la actividad de GS, que fue prevenida por el

condicionamiento isquémico. No se observaron diferencias significativas en la captación de glutamato entre los

grupos experimentales. Se muestra la media EE (n= 10 retinas/ grupo). **: P<0,01 vs. control; a: P<0,01 vs.

diabetes con tratamiento simulado, test de Tukey. C+P: ojos controles con pulsos semanales de isquemia. D+P: ojos

con condicionamiento isquémico de animales diabéticos.

Resultados

113

6. Efecto de la diabetes sobre el sistema visual no formador de imagen

El siguiente objetivo del presente trabajo de Tesis fue analizar el sistema visual no formador de

imágenes en la diabetes experimental inducida por STZ. Múltiples evidencias experimentales

indican que las células que expresan melanopsina representan una sub-población reducida de

CGRs y son responsables de codificar y transmitir la información fótica a centros visuales no

formadores de imágenes, como los NSQ y el NOP. Dado que a las 15 semanas de diabetes

experimental se observó una caída significativa en el número de CGRs, así como alteraciones

marcadas en las proyecciones retinianas al CS, la serie de experimentos que se presentarán a

continuación tuvo como objetivo caracterizar el estado de las CGRifs y de las vías de proyección

de estas células a núcleos visuales no formadores de imágenes en etapas avanzadas de diabetes

experimental.

En primer lugar, se analizó la progresión del daño funcional en etapas avanzadas de diabetes. A

las 12 ó 15 semanas de diabetes no se observaron diferencias significativas en el ERG y en los

POs, respecto a los resultados obtenidos a las 10 semanas post-inyección de STZ (Figura 46A-

C). El registro de los VEPs (un indicador de la función de la vía visual) indicó un aumento

significativo en la latencia del componente N2-P2, ya evidente a partir de las 12 semanas de

diabetes (Figura 46D).

Resultados

114

Figura 46. Alteraciones funcionales retinianas en etapas avanzadas de diabetes experimental. Luego de 10, 12 y 15

semanas de diabetes se observó una caída significativa en la amplitud de las ondas a y b del ERG (A y B) y en la

suma de las amplitudes de los POs (C), sin una clara progresión del daño funcional. El análisis de los VEPs indicó

un aumento significativo en la latencia del componente N2-P2 en animales con 12 ó 15 semanas de diabetes. En los

paneles E-G se muestran registros representativos de un animal control (trazo negro) y un animal con 15 semanas de

diabetes (trazo gris). Se muestra la media ± EE (n= 10 animales/ grupo). *: P< 0,05, **: P< 0,01 vs. control, test de

Tukey.

Otra de las características que se observó en etapas más avanzadas de diabetes experimental fue

la aparición de cataratas que se hizo evidente en la mayoría de los animales luego de 11 - 12

semanas post-inyección de STZ. Considerando que la opacidad del cristalino podría afectar

directamente la entrada de luz, lo que a su vez podría modificar las variables evaluadas, se

realizó una lentectomía en un grupo de animales diabéticos luego de 6 semanas de la inyección

de STZ. Con el objetivo de reducir el daño y la inflamación ocular post-quirúrgica, se evaluaron

diferentes métodos para la remoción del cristalino. La cirugía que permitió obtener mejores

resultados consistió en una pequeña incisión en la córnea por la región dorsal y un corte de la

cápsula del cristalino, que permitió extraer la lente completa, sin alteración de la porción

posterior de la cápsula. De esta manera, se evitó el contacto con el cuerpo vítreo y un posible

desprendimiento de retina. Los animales se trataron con antiinflamatorios, como se indica en

Resultados

115

Materiales y Métodos, y se evaluaron clínicamente durante los días posteriores a la cirugía.

Luego de 7 días post-cirugía se realizó un análisis funcional para evaluar los resultados de la

operación. En ningún caso se observaron signos evidentes de alteración funcional retiniana

(datos no mostrados). Finalmente, a las 8 semanas post-operación se evaluó la respuesta

electrorretinográfica y la morfología retiniana. En la Figura 47 se muestra el análisis funcional y

morfológico realizado en animales con 15 semanas de diabetes, sometidos a lentectomía a la

semana 6 post-inyección de STZ.

Figura 47. Evaluación funcional y morfológica en animales control o con 15 semanas de diabetes, sometidos a

lentectomía (LX) en la semana 6 post-inyección de vehículo o STZ. Luego de la operación se observó una

recuperación funcional completa en animales control. En animales diabéticos de 15 semanas con cirugía de cataratas

se obtuvieron resultados similares a los observados en animales diabéticos sin cirugía. El análisis morfológico indicó

que la operación no provocó alteraciones retinianas o signos de inflamación. Nótese la cápsula posterior intacta

(flechas). Se muestra la media ± EE (n= 5 animales/ grupo). Barra= 500 m.

Resultados

116

En la siguiente serie de experimentos se evaluó el estado de las proyecciones retinianas a los

NSQ y al NOP. A las de 6, 10 y 15 semanas de inducción de diabetes se realizaron inyecciones

intravítreas de CTB y se analizó el transporte anterógrado. En todos los intervalos evaluados no

se observaron diferencias evidentes en el área y en la intensidad de la marcación observada en

toda la región retino-receptiva (porción ventral-lateral) de los NSQ y el NOP, aunque en todos

los casos se observó una clara alteración del transporte anterógrado de las CGRs de proyección

al CS. En la Figura 48 se muestran fotomicrografías representativas de un animal con 15

semanas de diabetes, en el que se observó una disminución notable en la marcación de CTB en

las distintas regiones del CS, en tanto que no se evidenciaron cambios en las terminales

retinianas que proyectan a los NSQ o al NOP.

A continuación, se cuantificó el número total de CGRifs en retinas en montaje plano de los

distintos grupos experimentales. En la Figura 49 se muestran los resultados obtenidos en el

análisis por inmunofluorescencia para melanopsina. Se identificaron claramente los cuerpos

celulares de las CGRifs y sus dendritas principales, en contacto con dendritas de células

adyacentes, formando una red de conexión que se extendió por toda la retina. A mayor aumento

se observó claramente la morfología de las dendritas “arrosariadas” con engrosamientos

puntuales intensamente reactivos para melanopsina. En retinas de animales con 15 semanas de

diabetes no se observaron diferencias en el número total de CGRifs (Figura 49A). En cortes

transversales de retinas diabéticas se identificaron CGRs melanopsina(+) en la CCG y cuerpos

celulares desplazados en la CNI, con proyecciones dendríticas principalmente en la sub-lámina

OFF de la CPI, de manera similar a lo observado en retinas de animales control (Figura 49G).

Sin embargo, tanto en montaje plano como en cortes transversales de retina (datos no

mostrados), la cuantificación reveló una caída significativa en el número de CGRs que expresan

Brn3a en retinas de animales con 15 semanas de diabetes (Figura 49D).

Resultados

117

Figura 48. Detección de CTB en terminales retinianas de proyección al CS (panel superior), a los NSQ (panel

central) y al NOP (panel inferior). Se muestran fotomicrografías representativas de un animal control y un animal

con 15 semanas de diabetes. A las 15 semanas de diabetes se observaron severas alteraciones en el transporte

anterógrado de axones que proyectan al CS. Sin embargo, no se observaron cambios en el área y la intensidad de la

marcación en núcleos visuales que participan en el sistema no formador de imágenes, como los NSQ y el NOP.

Barra: panel superior= 1 mm; panel central= 200 m; panel inferior= 500 m. Se muestran resultados de animales

representativos para cada grupo (n= 6 animales/ grupo).

Resultados

118

Figura 49. Análisis de las sub-poblaciones de CGRs en la diabetes experimental. A: Cuantificación de CGRs

melanopsina(+) en retinas de animales control y animales con 15 semanas de diabetes. B-C: Se muestran esquemas

representativos de la cuantificación de las CGRs melanopsina(+) en retinas en montaje plano de los distintos grupos

experimentales. D: Se observó una caída significativa en el número de CGRs Brn3a(+) en la región periférica de

retinas de animales diabéticos. E-F: Microfotografías representativas de la región periférica de retinas de un animal

control y un animal diabético, donde se observan CGRs Brn3a(+) y los cuerpos celulares y proyecciones dendríticas

de las CGRs melanopsina(+). En el panel G se muestra un corte transversal representativo de la retina de un animal

con 15 semanas de diabetes. Se observan CGRs Brn3a(+) y melanopsina(+) con proyecciones dendríticas en la capa

plexiforme interna. Se muestra la media ± EE (n= 5 animales/ grupo). *: P< 0,05 vs. control, test de Student. Barra:

C= 1mm, F-G= 25 m. N: nasal, T: temporal, S: superior, I: inferior.

A continuación, se evaluaron los niveles de melanopsina por Western blot en retinas de animales

control y animales diabéticos a las 15 semanas de la inyección de STZ. No se observaron

Resultados

119

diferencias significativas en ninguno de los períodos evaluados entre los grupos experimentales.

Análogamente, no se observaron diferencias para el fotopigmento rodopsina, característico de los

bastones (Figura 50).

Figura 50. Determinación por Western blot de los niveles de melanopsina y rodopsina en retinas de anímales

control y animales con 15 semanas de diabetes. Se muestra el análisis densitométrico para cada proteína

(relativizado a -actina) y geles representativos para dos animales controles (C1, C2) y dos animales con 15

semanas de diabetes (D1, D2). Se muestra la media ± EE (n= 5 animales/ grupo).

Para determinar el estado funcional de la conexión retino-hipotalámica en animales diabéticos, se

evaluó la respuesta de neuronas de los NSQ a un pulso de luz. Para ello, se aplicó un pulso de 1 h

de luz blanca brillante (1200 lux) luego de 4 h de apagada la luz (0.00 h, ZT 16). Luego de 30

min del pulso de luz, los animales se perfundieron en oscuridad y se determinaron los niveles de

c-Fos (gen de expresión temprano) por inmunohistoquímica. En animales con 15 semanas de

diabetes se observó una caída significativa en el número de células c-Fos(+) en la región retino-

receptiva de los NSQ, en comparación con animales control (Figura 51). Asimismo, se evaluó la

respuesta de neuronas de los NSQ a un pulso de luz en animales sometidos a lentectomía a la

semana 6 post-inyección de vehículo o STZ. A las 15 semanas post-inyección de STZ, se analizó

la respuesta de los NSQ frente a un pulso de luz en animales con remoción de cristalino. En este

Resultados

120

caso se observó una reversión completa de la caída del número de neuronas c-Fos(+) observada

en animales diabéticos sin cirugía (Figura 51).

Figura 51. Inducción de c-Fos en los NSQ por un pulso de luz (1 h) a ZT 16. Se cuantificó el número total de

neuronas c-Fos(+) en cortes seriados de los NSQ en animales control y animales con 15 semanas de diabetes, sin o

con lentectomía (LX) realizada a las 6 semanas de la inyección de STZ. Se muestran fotomicrografías

representativas (región rostral, medial y caudal) de los NSQ de los distintos grupos experimentales. Se muestra la

media ± EE (n= 5 animales/ grupo). **: P< 0,01 vs. control, a: P< 0,01 vs. diabetes + LX, test de Tukey. Barra= 200

m. 3V: tercer ventrículo; OX: quiasma óptico.

Se obtuvieron resultados similares en el análisis de la respuesta a un pulso de luz en el NOP y el

núcleo intergeniculado. En ambos núcleos se observó una disminución marcada del número de

Resultados

121

neuronas c-Fos(+) en animales con 15 semanas de diabetes, que fue revertida por la remoción del

cristalino (Figura 52).

Figura 52. Inducción de c-Fos en el NOP y el núcleo intergeniculado por un pulso de luz (1 h) a ZT 16. Se evaluó el

número de neuronas c-Fos(+) por inmunomarcación en cortes seriados de los núcleos, en animales control (A-C) y

animales con 15 semanas de diabetes (D-F). Se muestran secciones representativas de cortes transversales del

mesencéfalo, donde se remarcan el NOP (B y E) y el núcleo intergeniculado (C y F). A mayor aumento se observa

claramente la disminución en el número de neuronas c-Fos(+) observadas en la periferia del NOP (E) y en el núcleo

intergeniculado (F) de un animal con 15 semanas de diabetes. Barra= 500 m.

Se analizó el reflejo pupilar consensual en animales control y diabéticos luego de 6 y 10 semanas

post-inyección de STZ. Debido al desarrollo de cataras no fue posible determinar el reflejo

pupilar a intervalos posteriores. En todos los casos evaluados no se observaron diferencias

significativas en el porcentaje de contracción pupilar (Figura 53).

Resultados

122

Figura 53. Determinación del reflejo pupilar consensual en animales control y animales con 6 ó 10 semanas de

diabetes. No se observaron diferencias significativas entre los grupos experimentales. Se evaluó el porcentaje de

contracción de la pupila (respecto al área de la pupila en oscuridad) medida para cada ojo en forma individual. Se

muestra la media ± EE (n= 10 animales/ grupo).

Finalmente, se analizaron los ritmos de actividad locomotora en animales diabéticos. En una

primera etapa, se evaluó la actividad locomotora mediante un sensor infrarrojo que permite

detectar movimiento en animales expuestos a un ciclo de 12 h de luz (200 lux)/ 12 h de

oscuridad (encendido de las luces 8.00 am). En la Figura 54 se muestran los ritmos de actividad

locomotora (actogramas en doble plot) de un animal representativo del grupo control y un animal

diabético. En animales con 10 - 14 semanas de diabetes se observó un ritmo normal de actividad

en completa sincronización con el ciclo de luz/oscuridad. Sin embargo, se observó un retraso

significativo en el comienzo de la actividad respecto al apagado de las luces. El ángulo de fase

fue: control = 3,4 ± 3,1 min; diabetes = 29,13 ± 6,4 min (P< 0,01, test de Student, n= 10

animales/ grupo).

Resultados

123

Figura 54. Análisis de la actividad locomotora. En el panel superior se muestran actogramas (en doble plot)

representativos de un animal control y un animal con 10 semanas de diabetes al comienzo del experimento. Se

realizó un retraso de fase de 4 h (asterisco rojo) y se determinó el tiempo de re-sincronización. Finalmente, los

animales se sometieron a lentectomía bilateral (asterisco azul) y se evaluaron las posibles alteraciones en el patrón

circadiano de actividad. En el panel central se muestran periodogramas representativos de un animal control y un

animal diabético en una etapa previa (trazo negro) o posterior (trazo rojo) a la remoción del cristalino. En el panel

inferior se muestran gráficos de onda para la actividad promedio de un animal control y un animal diabético en una

etapa previa (trazo negro) o posterior (trazo rojo) a la lentectomía. Se muestran resultados representativos de un

animal control y un animal diabético (n= 10 animales/ grupo).

Resultados

124

Además, se analizó la capacidad de re-sincronización frente a un retraso de 4 h en la fase del

ciclo de luz/oscuridad. En animales con 14 - 15 semanas de diabetes se observó un retraso

significativo en el período necesario para resincronizar al nuevo ciclo (Figura 55). Considerando

la ya mencionada incidencia de cataratas en los animales diabéticos, se realizó una lentectomía

bilateral y luego de 14 - 20 días de recuperación, se evaluó nuevamente la capacidad de re-

sincronización. Luego de la cirugía se observó una disminución en la actividad total de los

animales que se recuperó paulatinamente. No se observaron diferencias evidentes en cuanto al

ritmo de actividad, comparado con los resultados obtenidos en forma previa a la cirugía (Figura

54). La operación no modificó el retraso en el comienzo de la actividad tras al encendido de las

luces (ángulo de fase), observado en estos animales luego de 14 - 15 semanas de diabetes. El

valor de ángulo de fase para animales diabéticos sin cristalino fue = 30,0 ± 1,4 min (media ±

EE). Sin embargo, se observó una recuperación significativa en el período necesario para re-

sincronizar a un retraso de 4 h en la fase del ciclo de luz/oscuridad, en comparación con

resultados obtenidos de animales diabéticos previa lentectomía (Figura 55).

Resultados

125

Figura 55. Efecto de un retraso de fase (4 h) en el tiempo de re-sincronización en animales control y diabéticos, sin

o con cirugía de cataratas. Se observó un retraso significativo en el tiempo necesario para re-sincronizar a la nueva

fase en animales diabéticos con cataratas (círculos blancos), respecto a animales control (círculos negros), que fue

significativamente revertido por la lentectomía (triángulos negros). Se muestra la media ± EE (n= 10 animales/

grupo). ). **: P< 0,01 vs. control, a: P< 0,01 vs. diabetes + lentectomía, test de Tukey.

Discusión

126

DISCUSIÓN

Como se mencionó en la Introducción, el daño isquémico es un componente central de diversas

enfermedades retinianas prevalentes como la retinopatía diabética, la retinopatía por hipertensión

arterial, la trombosis de la vena central de la retina y el glaucoma, que constituyen las causas más

frecuentes de ceguera irreversible. No se dispone actualmente de recursos eficaces para la

prevención o terapéutica del daño isquémico, de manera tal que esta afección retiniana

representa un aspecto de gran relevancia en el marco de la Salud Pública. En este trabajo de

Tesis se ha analizado la posibilidad de inducir protección de la retina frente al daño isquémico

agudo a través del PostC y se han analizado los posibles mecanismos involucrados en este

proceso. Asimismo, se analizó la efectividad de la tolerancia isquémica como estrategia

terapéutica frente al daño de la retina y la vía visual inducido por diabetes experimental y

finalmente, se examinó el sistema no formador de imágenes en períodos avanzados de diabetes.

A continuación, se discutirán los resultados obtenidos en este trabajo en función de los objetivos

planteados.

1. Post-condicionamiento como mecanismo inductor de tolerancia isquémica frente a una

isquemia retiniana aguda

Frente a la vacancia terapéutica en el tratamiento del daño isquémico retiniano, se ha sugerido

como estrategia alternativa y/o complementaria la inducción de mecanismos endógenos de

protección. En este sentido, se ha demostrado que el PCI induce la neuroprotección retiniana más

robusta alcanzada frente al daño inducido por isquemia/reperfusión (Roth y col., 1998). Sin

embargo, al inicio de este trabajo no se disponía de evidencias que avalaran la posibilidad de

inducir protección de la retina con una manipulación posterior al evento isquémico. Los

resultados obtenidos en este trabajo de Tesis indican que la aplicación de pulsos breves de

isquemia durante la reperfusión que sigue a un episodio isquémico deletéreo, protegió

significativamente de las alteraciones funcionales e histológicas causadas por la isquemia. Estos

Discusión

127

resultados constituyen la primera demostración experimental de la eficacia del PostC a nivel

retiniano. El PostC fue descripto originalmente por Zhao y col. (2003) en un modelo de isquemia

cardíaca. Posteriormente, se caracterizó el efecto protector del PostC en diversos modelos in vivo

e in vitro, y en otros sistemas como hígado y riñón (Tsang y col., 2004; Sun y col., 2004; Liu y

col., 2007). La efectividad del PostC a nivel cerebral se demostró por primera vez en el año 2006

(Zhao y col., 2006). Utilizando un modelo de isquemia cerebral inducido por la oclusión

permanente de la arteria cerebral media (en la porción distal) y oclusión temporal de la arteria

carótida común durante 15, 30 ó 60 min, estos autores demostraron que la aplicación de tres

ciclos de isquemia/reperfusión (30 s/ 10 s) luego de 30 s de la isquemia, revierte

significativamente el daño morfológico observado a los dos días de reperfusión. Estos resultados

sugieren que el período próximo a la isquemia (es decir, en el inicio de la reperfusión) es crítico

en la génesis del daño isquémico. Por lo tanto, la intervención en estadíos iniciales de

reperfusión podría ser clave para inducir tolerancia isquémica.

El aumento de la PIO a 120 mm Hg por 40 min provocó cambios morfológicos y funcionales

significativos a nivel retiniano. En este sentido, se observó una disminución significativa de la

amplitud de la onda a (una medida de la actividad de los FR) y de la onda b (que refleja la

respuesta de las células bipolares y células de Müller) del ERG.

En cuanto a la morfología, se observó una marcada alteración de la retina interna y pliegues a

nivel de los FR. Las alteraciones fueron evidentes a partir de los 7 días de reperfusión y se

profundizaron a los 14 días post-isquemia. La aplicación de pulsos breves de isquemia revirtió

significativamente las alteraciones funcionales y morfológicas. De hecho, en retinas post-

condicionadas no se observaron diferencias significativas respecto a lo observado en el grupo

control (no isquémico). La respuesta funcional y los cambios morfológicos se evaluaron también

luego de 30, 45 y 60 días de reperfusión (datos no mostrados) y no se observaron diferencias

respecto a lo observado luego de 14 días de reperfusión en retinas isquémicas, entre estos

períodos. Asimismo, la protección inducida por PostC fue evidente en todos los intervalos

Discusión

128

examinados, lo que indica que el PostC no retrasa meramente el daño isquémico, sino que induce

una protección persistente en el tiempo.

La isquemia indujo cambios en las células gliales y en terminales presinápticos, como lo indican

los resultados obtenidos a través del análisis por inmunofluorescencia (GFAP y sinaptofisina).

La reactividad glial ha sido ampliamente validada como un marcador de alteración retiniana

(Pekny y Nilsson, 2005). En condiciones patológicas, se han descripto cambios en los niveles

astrocitarios de GFAP y en la expresión de esta proteína en las células de Müller (Osborne y col.,

1991; Wu y col., 2003). En retinas isquémicas se observó un aumento en la expresión de GFAP

y desorganización de los procesos de células de Müller (sin cambios aparentes en el número de

células) luego de 14 días de reperfusión, en tanto que ambos fenómenos fueron revertidos por el

PostC.

La sinaptofisina es una proteína vesicular del terminal presináptico que se asocia con otras

proteínas vesiculares y participa en la biogénesis y el reciclado vesicular (Gincel y Shoshan-

Barmatz, 2002; Bonanomi y col., 2007). La disminución en los niveles de esta proteína en la CPI

y la CPE de retinas sometidas a isquemia, sugiere una severa alteración en la función sináptica y

neurotransmisión, particularmente entre la retina media y externa, que fueron revertidas por el

PostC.

Al presente, se han utilizado fundamentalmente dos modelos de isquemia retiniana. El primero,

consiste en la oclusión de la ACR a través de la ligadura del NO. El segundo modelo se basa en

el aumento de la PIO a ~ 120 mm Hg por encima de la presión sistólica arterial (~ 90 mm Hg).

La vasculatura de la coroides es responsable de la nutrición de los FR. A diferencia del ojo de

primates, toda la capa vascular media en la rata está irrigada por las ACPs, que provienen de la

arteria ciliar posterior del NO. Esta característica anatómica determina que en el modelo de

ligadura del NO, dependiendo de la fuerza aplicada, se puede lograr un bloqueo completo de la

irrigación retiniana por la ACR, pero además se afecta la irrigación de la capa coriocapilar que

nutre los FR por difusión. Por lo tanto, este modelo de isquemia difiere considerablemente de las

Discusión

129

características observadas en las retinopatías isquémicas humanas. En el modelo de isquemia

utilizado en este trabajo de Tesis, en cambio, la vasculatura coroidea no se afecta. Una posible

desventaja del modelo de isquemia inducido por aumento de la PIO es el riesgo de desencadenar

desprendimientos de retina. Sin embargo, en las condiciones experimentales utilizadas y con los

recaudos necesarios, la incidencia de esta complicación se redujo al mínimo. Cabe señalar que en

nuestras condiciones experimentales, a los 14 días de reperfusión se observaron alteraciones

considerables de la retina externa, con pérdida de células y pliegues de los segmentos externos

de los FR. En contraste con nuestros resultados, Sakamoto y col. (2006), utilizando un modelo de

isquemia similar al utilizado en este trabajo, no observaron alteraciones en la retina externa, en

tanto que Roth y col. (1998) demostraron una desorganización leve de los FR luego de una

isquemia retiniana inducida por ligadura del NO. Una posible explicación para esta discrepancia

es la utilización de distintas cepas de ratas. En los trabajos citados anteriormente se utilizaron

ratas Sprague-Dawley, en tanto que en este trabajo se utilizó la cepa Wistar. En este sentido, se

ha descripto que el daño isquémico retiniano es altamente dependiente de la cepa de rata

(Ettaiche y col., 2001). Otra diferencia de significación entre éste y los trabajos mencionados,

radica en el intervalo de análisis post-isquemia. En estos trabajos, como en la gran mayoría de

los estudios realizados sobre inducción de tolerancia isquémica en el SNC, el análisis histológico

se realizó a los 7 días de reperfusión, en tanto que en este trabajo de Tesis, los estudios

morfológicos se realizaron mayoritariamente 14 días después de la isquemia. Considerando los

resultados obtenidos junto a los antecedentes mencionados, es posible postular que existe una

progresión en el daño histológico retiniano asociado a la isquemia. De esta forma, las células de

la retina interna podrían ser más susceptibles al daño isquémico agudo, dado que se alteran

significativamente aun en un período en el cual se evidenciaron cambios comparativamente

menores en los FR. Alternativamente, es posible que la muerte de las CGRs y de células de la

retina media afecte secuencialmente a los FR, provocando la muerte de estos últimos.

Discusión

130

Ettaiche y col. (2001) caracterizaron el daño funcional retiniano en función de la duración del

evento isquémico. En concordancia con estos autores, los resultados obtenidos indican que la

aplicación de 60 min de isquemia provocó alteraciones funcionales y morfológicas que

resultaron significativamente mayores que las inducidas por 40 min de isquemia. De todas

maneras, aún en estas condiciones “más drásticas” de daño, el PostC también fue

significativamente efectivo, a pesar de que la magnitud de la recuperación funcional e

histológica fue menor.

La serie de experimentos en los que se avaluó el efecto del número de pulsos indicó que 3 pulsos

no fueron suficientes, en tanto que 7 ó 10 ciclos de isquemia/reperfusión resultaron igualmente

efectivos, un hecho no sorprendente si se tiene en cuenta que la protección inducida por 7 ciclos

fue prácticamente completa. Resultados similares se obtuvieron en un modelo de PostC frente al

daño isquémico en el miocardio (Yang y col., 2004). En la gran mayoría de los estudios sobre

PostC se aplicaron pulsos de isquemia/reperfusión, siendo la intermitencia en la perfusión post-

isquemia un factor común a la mayoría de los protocolos utilizados. Para determinar si la

alternancia de ciclos de isquemia/reperfusión es una condición necesaria para la inducción de

tolerancia isquémica, se evaluó la efectividad de la aplicación de un único episodio de isquemia

de una duración igual a la suma de la duración de los pulsos. La aplicación de un único pulso de

7 min de isquemia, 5 min después de la isquemia prolongada, constituyó una estrategia

igualmente efectiva que la obtenida con 7 pulsos de 1 min, con la ventaja adicional de que su

aplicación es más sencilla ya que requiere una menor manipulación de los animales.

Análogamente, Pignataro y col. (2008) demostraron la eficacia de un único pulso de isquemia

aplicado luego de una isquemia cerebral focal por oclusión de la arteria cerebral media.

El conjunto de resultados obtenidos demuestra que el PostC es tan efectivo como el PCI en la

protección del daño isquémico agudo. Sin embargo, las ventajas del PostC respecto al PCI son

evidentes, particularmente en lo que respecta a su eventual aplicación clínica, debido a que la

aparición de isquemia retiniana es un evento impredecible, en cambio, el inicio de la reperfusión

Discusión

131

podría ser más fácil de predecir. En este marco, resultó de particular interés determinar la

ventana temporal para la aplicación del PostC. En modelos de isquemia cardíaca y cerebral, la

aplicación de ciclos de isquemia/reperfusión a partir de 1 min después de la isquemia

prolongada, no resulta efectivo frente al daño y el PostC sólo induce protección cuanto se aplica

inmediatamente después de la isquemia (Pignataro y col., 2008; Wang y col., 2008). Estos

resultados sugieren que la ventana temporal para la efectividad del PostC depende altamente del

tejido. Los resultados obtenidos demuestran que en la retina, el PostC fue efectivo aun cuando se

aplicó a los 60 min post-isquemia. En comparación con los hallazgos obtenidos en otros tejidos

(incluido el cerebro), estos resultados sugieren que el período de intervención parece menos

crítico en la retina que en otros sistemas, lo que aumenta su eventual aplicabilidad en términos de

una potencial translación clínica.

Como se mencionó en la Introducción, diversas vías de señalización han sido asociadas a la

inducción de tolerancia isquémica. Para dilucidar el/los posible/s mecanismo/s involucrado/s, se

evaluó, en primer lugar, la participación de la síntesis de novo de proteínas. Para ello, a distintos

períodos de reperfusión se inyectó cicloheximida, un bloqueante de la translocación del ribosoma

60S, ampliamente utilizado en experimentos in vivo (Schneider-Poetsch y col., 2010; Maciejak y

col., 2010). La cicloheximida bloqueó completamente el efecto protector inducido por PostC

cuando se administró 1 min antes, pero no 6 h después de la isquemia prolongada. Estos

resultados sugieren que existe una ventana temporal estrecha (menor a 6 h), en la que ocurren

cambios traduccionales asociados a la protección inducida por el PostC. En concordancia con

estos resultados, en neuronas piramidales de la capa CA1 del hipocampo se demostró que la

inyección de cicloheximida simultáneamente con la aplicación de pulsos de isquemia suprimió el

efecto protector, pero no fue efectivo cuando se inyectó 5 h después del PostC (Burda y col.,

2006).

En base a estos resultados, se evaluó la participación de un factor de inducción temprana que

pudiera estar asociado a la protección desencadenada por PostC. Si bien los mecanismos

Discusión

132

involucrados en el PostC no se conocen en detalle, se ha sugerido que podrían ser similares a los

descriptos en el PCI (Tissier y col., 2007; Pignataro y col., 2008). El óxido nítrico ha sido

involucrado como un mediador autócrino yo parácrino de tolerancia isquémica en diversos

tejidos, incluida la retina (Zhu y col., 2006). Evidencias farmacológicas sumadas a estudios

realizados en animales knockout para las distintas isoformas de la NOS, avalan la participación

del óxido nítrico en la tolerancia isquémica. Sin embargo, existe controversia respecto a la

participación de las distintas isoformas de NOS en el PCI. Zhu y col. (2006) demostraron que la

protección del PCI es completa en ratones knockout para la iNOS, en tanto que la tolerancia

isquemia no ocurre en ratones knockout para la eNOS o nNOS. En contraposición, estudios

realizados por Sakamoto y col. (2006) demostraron que el PCI es bloqueado por la

administración de aminoguanidina y/o L-N6-(1-iminoetil) lisina (inhibidores de la iNOS), pero

no por NG-nitro-L-arginina, NG-monometil-L-arginina (inhibidores no selectivos de las

isoformas constitutivas de NOS) o 7-nitroindazol (inhibidor de la nNOS), lo que sugiere la

participación de la iNOS en la protección asociada al PCI. En nuestro laboratorio hemos

demostrado la participación de la iNOS en el mecanismo de protección inducido por pre-

condicionamiento heterólogo frente al daño isquémico retiniano (Franco y col., 2008).

Análogamente, los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que la protección inducida por

PostC retiniano podría involucrar un mecanismo dependiente de iNOS. Es necesario señalar que

la aminoguanidina no tuvo efecto sobre retinas control y no agravó el daño inducido por la

isquemia, lo que permite descartar un posible efecto deletéreo del tratamiento per se con

aminoguanidina. De acuerdo a estos resultados, es posible sugerir a la iNOS como un blanco

posible del efecto de la cicloheximida. En conjunto, sin excluir la participación de otra señales,

los resultados obtenidos sugieren que el óxido nítrico derivado de la iNOS podría desempeñar un

papel central en la protección inducida por PostC retiniano. Se discutirán más adelante las

evidencias obtenidas a favor de la participación adicional del glutamato en el PostC retiniano.

Discusión

133

En suma, estos resultados demuestran por primera vez la efectividad del PostC frente al daño

isquémico retiniano agudo. La protección histológica y funcional dependió de diversos factores,

como el período de isquemia, el número de ciclos de isquemia/reperfusión y la ventana temporal

de aplicación del PostC durante la reperfusión, con resultados positivos incluso cuando el PostC

se aplicó luego de 60 min de reperfusión. En cuanto a los mecanismos involucrados, hemos

demostrado que la síntesis proteica participa en la protección y que la iNOS podría ser una

proteína clave.

2. Participación del glutamato en el daño isquémico retiniano y en la protección inducida

por post-condicionamiento

Como se mencionó en la Introducción, se ha postulado que el PCI y el PostC podrían provocar

cambios de menor magnitud en los mismos sistemas de señales que están involucrados en el

daño isquémico, desencadenando respuestas adaptativas en lugar de deletéreas (Gidday, 2006).

Por lo tanto, una clave en la elucidación de los mecanismos involucrados en estas estrategias de

protección provino de la identificación de factores que participan del daño isquémico. En este

sentido, un conjunto considerable de evidencias avala la participación del glutamato en el daño

isquémico. Se ha demostrado que la administración intravítrea de agonistas de receptores

glutamatérgicos, en particular de tipo NMDA, provocan un daño marcado en la retina interna,

similar al observado en modelos de isquemia retiniana aguda (Iversen, 1991; Ikeda y col., 1992;

Nucci y col., 2007). Asimismo, se ha demostrado un aumento significativo en la liberación de

glutamato inducido por isquemia (Cazevieille y Osborne, 1997). Para evaluar la participación del

glutamato en la protección inducida por PostC, se consideró necesario realizar un estudio más

detallado de la progresión del daño retiniano asociado a una isquemia aguda, así como de la

protección inducida por PostC. Los resultados obtenidos sugieren la existencia de un fenómeno

de progresión del daño isquémico, al menos de acuerdo a criterios histológicos, que se hace más

evidente con el tiempo de reperfusión. En este contexto, se ha demostrado que los cambios

Discusión

134

histológicos y funcionales progresan con el tiempo post-isquemia y que la alteración del ERG es

anterior a los cambios morfológicos (Rosenbaum y col., 2001). Los resultados obtenidos en este

trabajo avalan el concepto de que la amplitud de las ondas a y b del ERG escotópico (pero no los

POs) constituyen los indicadores más sensibles del daño retiniano inducido por

isquemia/reperfusión, dado que estos parámetros funcionales revelaron una alteración en un

período en el que la morfología de la retina no difería en forma evidente del control (es decir a

las 24 h y 3 días después de la isquemia).

El origen y el sustrato neuronal responsable de los POs no han sido aún determinados con

precisión y son motivo de controversia. En general, los POs se han asociado a vías neuronales de

la retina interna, en particular a las células amácrinas. Sin embargo, también se ha demostrado la

participación de células bipolares y CGRs (Heynen y col., 1985; Wachtmeister, 1998). Además,

se demostró que la respuesta de los POs depende fuertemente de la perfusión sanguínea de la

retina interna (Wachtmeister, 1998). Contrariamente a lo esperable, la suma de la amplitud de los

POs disminuyó significativamente sólo 7 días después de la isquemia. Al presente, no se dispone

de una clara explicación para este resultado. Si bien la alta variabilidad entre animales obtenida

en el registro de los POs podría ser una causa, también es posible sugerir que la actividad de las

capas internas de la retina fueron afectadas por la isquemia en forma posterior a la alteración de

las capas media y externa (como lo reflejan las amplitudes de las ondas b y a del ERG,

respectivamente).

A pesar de que a los 3 días post-isquemia la estructura general de la retina se encontró

conservada, en este período el PostC revirtió el aumento en los niveles de GFAP en células de

Müller inducido por la isquemia/reperfusión. Dado que las células de Müller desempeñan un rol

central en el clearance de glutamato, se decidió evaluar los mecanismos involucrados en el

reciclado de glutamato sináptico en el primer período en el que fueron evidentes cambios a nivel

de las células de Müller, tanto en retinas isquémicas con tratamiento simulado como en las

Discusión

135

retinas con PostC, es decir a los 3 días post-isquemia. Los resultados obtenidos indican que el

influjo de glutamato y la actividad de GS son susceptibles del daño por isquemia/reperfusión.

El glutamato es neurotóxico en cantidades excesivas. Dado que no existen enzimas que degraden

glutamato en el medio extracelular, los transportadores de glutamato son responsables de

mantener el glutamato sináptico en concentraciones no tóxicas. Las células de Müller expresan

transportadores de glutamato de tipo GLAST, el tipo de transportador retiniano más activo para

este neurotransmisor. La isquemia provocó una disminución significativa en la captación de

glutamato. Aunque diversos trabajos han demostrado una disminución en la expresión de

transportadores gliales de glutamato en retinas isquémicas, evaluada a través de técnicas de

inmunodetección (Napper y col., 1999; Barnett y col., 2001), en estos estudios no se examinó la

capacidad funcional del transportador, en tanto que los resultados obtenidos en este trabajo

demuestran un déficit en la capacidad de remoción del glutamato sináptico en retinas isquémicas.

El glutamato captado por las células de Müller es rápidamente convertido a glutamina por la GS,

lo que genera una fuerza motriz para el transporte de glutamato mayor que en neuronas que

contienen concentraciones intracelulares de glutamato libre mucho mayores (Pow, 2001). De

hecho, aunque el influjo de glutamato es controlado por la expresión y/o modificaciones post-

traduccionales de transportadores específicos, estudios fisiológicos sugieren que el transporte de

glutamato puede ser también dependiente de su metabolismo (Gegelashvili y Schousboe, 1998;

Tanaka, 2000). Se ha demostrado que un aumento en las concentraciones intracelulares de

glutamato disminuye el transporte neto de este neurotransmisor y se ha sugerido que el

metabolismo intracelular instantáneo de glutamato podría ser necesario para una remoción

eficiente del entorno extracelular (Attwell y col., 1993; Otis y Jahr, 1998).

Una vez catalizada la reacción por la GS, la glutamina es liberada por las células de Müller y

puede ser utilizada por las neuronas como precursor para la síntesis de glutamato. Luego de 3

días de reperfusión, no se observaron alteraciones en la liberación de glutamato, la liberación y la

captación de glutamina y la actividad de glutaminasa en retinas isquémicas. Sin embargo, la

Discusión

136

disminución en el influjo de glutamato y en la actividad de GS podrían contribuir en forma

sinérgica o redundante al incremento excesivo en los niveles de glutamato a nivel de la brecha

sináptica. El PostC revirtió significativamente las alteraciones en el influjo de glutamato y en la

actividad de GS inducidas por isquemia. Dado que a los 3 días de reperfusión el PostC revirtió

las alteraciones en el clearance de glutamato pero no se observaron evidencias de protección

funcional o morfológica, estos resultados podrían sugerir que la protección inducida por el PostC

involucra la restauración de los niveles sinápticos de glutamato. Cabe señalar que la aplicación

de pulsos de isquemia en retinas de animales control no afectó ninguno de los parámetros del

ciclo glutamato/glutamina. Estos resultados concuerdan con las determinaciones morfológicas y

funcionales, que indican que el PostC carece de efectos per se. Considerando que los parámetros

del ciclo glutamato/glutamina se analizaron en retinas enteras, no resulta posible discriminar la

localización retiniana de los fenómenos observados. Sin embargo, a nivel retiniano, los

transportadores gliales que captan glutamato y la enzima GS se localizan principalmente en las

células de Müller. Por lo tanto, los resultados obtenidos sugieren a las células de Müller como el

sustrato anatómico de los efectos protectores del PostC, aunque la participación de otros tipos

celulares no puede descartarse en forma concluyente.

En conjunto, estos resultados sugieren que el daño isquémico puede ser mediado, al menos en

parte, por un aumento en las concentraciones sinápticas de glutamato y que el PostC protege del

daño isquémico revirtiendo este efecto. Existen al menos dos condiciones necesarias (aunque no

suficientes) para comprobar la viabilidad de esta hipótesis: 1) altas concentraciones de glutamato

deberían provocar un daño similar al observado en retinas sometidas a una isquemia deletérea y

2) el PostC debería proteger del daño retiniano funcional y morfológico inducido por el exceso

de glutamato. Los resultados obtenidos satisficieron estas condiciones. Luego de la inyección

intravítrea de concentraciones suprafisiológicas de glutamato se observó una alteración marcada

de la retina interna y una disfunción electrorretinográfica significativa, análogamente a lo

observado en retinas isquémicas, lo que avala la participación del glutamato en la injuria

Discusión

137

isquémica. Por otro lado, la aplicación de pulsos de isquemia revirtió las alteraciones funcionales

y morfológicas inducidas por concentraciones suprafisiológicas de glutamato, lo que a su vez,

avala la participación del glutamato en el PostC. Una interpretación alternativa para estos

resultados es que la isquemia y el exceso de glutamato involucren mecanismos diferenciales de

daño que convergen en un mecanismo final común, blanco del efecto protector del PostC. Al

presente no resulta posible discriminar entre estas alternativas. Sin detrimento de ello, los

resultados obtenidos indican que el PostC, además de proteger del daño isquémico, previene de

la injuria causada por la neurotoxicidad glutamérgica, lo que amplificaría notablemente su

espectro de acción, haciéndola extensible a diversas afecciones retinianas que cursan con un

aumento descontrolado en las concentraciones de glutamato sináptico, como es el caso de la

retinopatía diabética, que se discutirá en detalle más adelante.

El mecanismo de protección desencadenado por la tolerancia isquémica no ha sido aún

completamente elucidado. Sin embargo, en base al conjunto de antecedentes disponibles, es

posible que se trate de un proceso multifactorial que requiere la interacción de numerosos

mecanismos y vías de señalización, segundos mensajeros y vías efectoras. Se ha demostrado que

en estadíos tempranos luego de la isquemia, aumentan los niveles de óxido nítrico lo que podría

avalar su participación en el daño por isquemiareperfusión. El óxido nítrico activa diversas vías

de señalización, e incluso puede provocar la liberación de glutamato en neuronas de manera

indirecta, a través de la inhibición de la cadena respiratoria mitocondrial, o bien, directamente

activando la exocitosis vesicular, en un mecanismo independiente de calcio (Bal-Price y Brown,

2001; Di Stasi y col., 2002). Sin embargo, estos eventos sólo se activan en presencia de altas

concentraciones de óxido nítrico. En este sentido, Hangai y col. (1996) demostraron un aumento

marcado en los niveles de iNOS en células gliales durante la reperfusión. Como ya se mencionó,

existen evidencias a favor de que las mismas señales que desencadenan daño pueden ejercer

efectos protectores, dependiendo de diversos factores, como su concentración. En este sentido,

Roth y col. (2006) demostraron un aumento en los niveles de iNOS en células microgliales

Discusión

138

retinianas luego de 15 min y hasta 6 horas después de la aplicación de un estímulo pre-

condicionante. En el contexto de los efectos protectores, también se ha demostrado que el óxido

nítrico puede provocar la S-nitrosilación de los grupos tioles del receptor NMDA provocando

cambios conformacionales que inactivan al receptor (Gbadegesin y col., 1999; Gow y col.,

2000). En suma, los resultados obtenidos indican que la reducción en los niveles de glutamato en

el espacio sináptico, conjuntamente con la síntesis proteica en una determinada ventana temporal

y la inducción de la iNOS, constituyen componentes centrales en la protección retiniana inducido

por PostC. Al presente, no se dispone de evidencias que permitan vincular causalmente entre sí,

los cambios en la concentración de glutamato y la actividad de iNOS, aunque de acuerdo a los

resultados obtenidos, el curso temporal de la respuesta desencadenada por el PostC podría incluir

a la síntesis de proteínas en general y de iNOS en particular, como eventos más tempranos (en el

rango de horas) que el efecto sobre el reciclado de glutamato sináptico (en el rango de días).

Asimismo, estas diferencias en la dinámica de la respuesta al PostC podría correlacionarse con

diferencias en cuanto a los sustratos anatómicos de estos fenómenos, que aún no han sido

formalmente identificados.

3. Inducción de tolerancia isquémica en la retinopatía diabética

La efectividad de los mecanismos de tolerancia isquémica inducidos por una gran variedad de

estímulos pre- o post-condicionantes ha sido ampliamente documentada. Incluso se han

caracterizado mecanismos de protección inducidos por estímulos remotos, de aplicación distante

al sitio de la lesión isquémica, o bien a través de la administración de agentes farmacológicos, de

aplicación local o sistémica. Tanto el PCI como el PostC son altamente eficaces frente al daño

isquémico en diversos sistemas, como corazón, pulmón, hígado y SNC (Pasupathy y Homer-

Vanniasinkam, 2005; Gidday, 2006; Granfeldt y col., 2009). Sin embargo, en todos los casos, el

efecto protector de la tolerancia isquémica ha sido sistemáticamente evaluado en modelos de

isquemia aguda. En cambio, la serie de experimentos que se discutirá a continuación, tuvo por

Discusión

139

objeto evaluar el efecto protector del condicionamiento isquémico en un modelo experimental de

daño crónico, como es la retinopatía diabética inducida por la inyección de STZ. Dos aspectos

centrales avalaron este objetivo: 1) la isquemia es un componente central de la disfunción

retiniana inducida por diabetes y 2) diversos antecedentes (que se mencionarán más adelante)

señalan al glutamato como un factor clave en el daño diabético retiniano. De esta forma, la

aplicación de pulsos de isquemia podría evitar o reducir el componente isquémico asociado a la

diabetes, y además, la disminución de los niveles sinápticos de glutamato podría evitar o reducir

la neurodegeneración retiniana inducida por diabetes. Como se discutirá a continuación, los

resultados obtenidos confirmaron esta hipótesis. Para una mayor claridad, se analizará en

primera instancia el curso temporal de las alteraciones de la retina y la vía visual inducidas por

diabetes experimental y a continuación, se discutirán los resultados obtenidos con respecto al

efecto de la inducción de tolerancia isquémica en la retinopatía diabética inducida por STZ.

El modelo experimental en ratas inducido por una inyección única de STZ constituye una

herramienta ampliamente validada para el estudio de las alteraciones inducidas por diabetes, que

resultan compatibles con los cambios observados en pacientes diabéticos. A partir del 3er día

post-inyección, la STZ provoca un aumento significativo y persistente de la glucemia y una

pérdida progresiva del peso corporal. Es relevante remarcar que el efecto protector del

condicionamiento isquémico resultó independiente del perfil glucémico, dado que la aplicación

de pulsos semanales de isquemia no modificó los niveles de glucosa en plasma ni la pérdida de

peso corporal.

3.1. Alteraciones en la retina inducidas por diabetes experimental

La hiperglucemia crónica inducida por la inyección de STZ provoca una disfunción visual

progresiva, que se evidencia ya en estadíos tempranos de diabetes experimental. Se ha invertido

considerable esfuerzo en la identificación de los marcadores más tempranos de la enfermedad,

que permitan diagnosticar el daño diabético en las etapas iniciales, lo que indudablemente

Discusión

140

representaría una gran ventaja terapéutica. En este contexto, un número considerable de trabajos

han descripto alteraciones tempranas en la respuesta electrorretinográfica. Sin embargo, existe

controversia respecto a las manifestaciones más tempranas del daño funcional retiniano inducido

por diabetes. Aunque diversos autores han identificado cambios en la amplitud de la onda b del

ERG como la primera alteración en ratas inyectadas con STZ (Li y col., 2002), existe mayor

consenso en que el indicador funcional inicial corresponde a cambios en la amplitud y/o en la

latencia de los POs, incluso en pacientes diabéticos (Juen y Kieselbach, 1990; Hancock y Kraft,

2004). Los resultados obtenidos en este trabajo indican diferencias significativas en la amplitud

de las ondas a y b del ERG luego de 7 y 5 semanas de diabetes, respectivamente. También en

este caso, contrariamente a nuestras expectativas, la caída en la suma de la amplitud de los POs

en retinas de animales diabéticos, resultó significativamente menor al grupo control sólo a partir

de la semana 9 post-inyección de STZ. Como ya se mencionó, una posible explicación es la gran

dispersión obtenida en el análisis de los POs. Además, considerando que en el protocolo de

registro se utilizó una única intensidad de estímulo luminoso, es posible suponer que un análisis

más exhaustivo, a través de la estimulación con diferentes intensidades, hubiera permitido

obtener mayor información respecto al perfil de alteración de los POs en función del tiempo de

diabetes.

Las alteraciones en la morfología retiniana se observaron en un período considerablemente

posterior a los cambios funcionales. Sólo a las 15 semanas de diabetes se observó una caída

significativa en el número de CGRs, sin afectar el espesor de las capas internas de la retina. En

este sentido, Barber y col. (1998) han demostrado atrofia de la retina interna luego de 7,5 meses

de diabetes y se han descripto anormalidades en el árbol dendrítico de CGRs en muestras de

pacientes en estadíos avanzados de la enfermedad (Meyer-Rüsenberg y col., 2007). Por lo tanto,

análogamente a lo observado en el modelo de isquemia aguda, los resultados sugieren que en el

marco temporal analizado, existe un fenómeno de progresión del daño retiniano diabético, en el

Discusión

141

que las alteraciones funcionales preceden a los cambios morfológicos, al menos en función de las

herramientas disponibles para analizar ambos aspectos.

Un componente clave de la retinopatía diabética es el aumento en la permeabilidad vascular. Las

alteraciones en las propiedades de la barrera hemato-retiniana interna pueden deberse a diversos

factores, aunque el proceso por el cual la hiperglucemia induce aumento en la permeabilidad

vascular aún no se conoce en detalle. La perfusión con azul de Evans es una técnica ampliamente

utilizada para evaluar la integridad de la barrera hemato-retiniana interna (Ma y col., 1996;

Zhang y col., 2005). Una vez inyectado intracardiacamente, el colorante se une irreversiblemente

a la albúmina, de manera que es posible determinar la localización del complejo en la porción

intra- o extra-vascular. En retinas de animales control, el colorante se observó exclusivamente

restringido al compartimento vascular. Además, en estas retinas se observó una marca intensa

para GFAP en el cuerpo de astrocitos y en los procesos gliales en contacto con vasos sanguíneos

de diferente calibre. En cambio, en retinas de animales con 6 semanas de diabetes se observó un

marcado aumento en la permeabilidad vascular, con focos de fuga del colorante y marca difusa

en todo el compartimento extra-vascular y en forma concomitante, se observó una disminución

significativa de la inmunorreactividad para GFAP en astrocitos. Estos resultados podrían sugerir

una relación causal entre las alteraciones observadas en los astrocitos en contacto con los vasos

sanguíneos y el aumento en la permeabilidad vascular. En este sentido, diversos autores han

demostrado el rol de los astrocitos en el control de las propiedades de barrera de las células

endoteliales y se ha sugerido que la disfunción de astrocitos inducida por diabetes experimental

está íntimamente relacionada con el aumento en la permeabilidad vascular y la formación de

edemas (Barber y col., 2000; Rungger-Brändle y col., 2000; Asnaghi y col., 2003). Si bien

diversos procesos metabólicos y alteraciones celulares se han asociado a la pérdida de integridad

de la barrera hemato-retiniana, el sitio celular y el mecanismo preciso de este proceso resultan

aún controversiales. Estudios de inmunomarcación para albúmina a nivel ultraestructural,

indican la completa integridad de las uniones oclusivas que forman la barrera hemato-retiniana

Discusión

142

interna en retinas de animales diabéticos, con alteraciones en el transporte trans-endotelial de

proteínas séricas y un incremento en el número de vesículas citoplasmáticas de entre 0,4 - 1,0

m de diámetro. En este sentido, se ha descripto que el aumento en la permeabilidad vascular

podría estar mediado por el transporte trans-endotelial de vesículas de gran tamaño, conteniendo

proteínas como la albúmina, e incluso por la fusión de vesículas que forman canales tubulares

trans-endoteliales (sistema vesículo-tubular) (Caldwell y Slapnick, 1992; Vinores y col., 1998).

En estos trabajos, no se han documentado alteraciones de las uniones oclusivas inter-

endoteliales, salvo en casos de degeneración de células vasculares. Al presente, sólo dos trabajos

han evaluado las alteraciones en la barrera hemato-retiniana interna a nivel ultraestructural

(Caldwell y Slapnick, 1992; Vinores y col., 1998). Los resultados presentados en este trabajo de

Tesis confirman los resultados obtenidos por Caldwell y Slapnick (1992), aunque en este caso,

los estudios se realizaron en un período de diabetes mucho más avanzado (es decir, a los 5 meses

post-inyección de STZ). En animales con 6 semanas de diabetes, se observó la presencia

frecuente de edemas (sin afectar la integridad de las uniones oclusivas) y un aumento marcado en

el número de vesículas endoteliales conteniendo lantano. Estas alteraciones se observaron en

vasos localizados en el plexo superior e inferior de la retina interna. Asimismo, en estadíos

tempranos de diabetes se han descripto alteraciones en células de Müller y una disminución en

los niveles de ocludina, particularmente en capilares de la retina media, que han sido asociadas

con una disfunción de la barrera hemato-retiniana interna (Barber y col., 2000; Abukawa y col.,

2009). Estos autores sugieren que las poblaciones de células macrogliales podrían responder a la

hiperglucemia crónica, lo que podría afectar diferencialmente a los vasos de la retina interna y su

permeabilidad vascular. Considerando la relevancia de la pérdida de integridad de la barrera

hemato-retiniana en el daño diabético, un análisis más exhaustivo a diferentes intervalos post-

inyección de STZ podría contribuir a determinar el rol causal de los astrocitos y las células de

Müller en las alteraciones de la barrera hemato-retiniana interna.

Discusión

143

El aumento en la permeabilidad vascular provoca y exacerba la isquemia retiniana, la formación

de edemas y una reacción glial con daño neuronal. En el año 1994 se publicó el primer estudio

en el que se demostró un aumento en los niveles de VEGF en muestras de cuerpo vítreo de

pacientes con retinopatía diabética proliferativa (Aiello y col., 1994). A partir de entonces, una

cantidad considerable de estudios han identificado al aumento en los niveles de VEGF como un

factor clave en las alteraciones vasculares características de la diabetes (revisado por Whitmire y

col., 2011). Estudios en modelos animales han demostrado que la inyección repetida de altas

concentraciones de VEGF induce cambios vasculares y un aumento en la permeabilidad vascular

análogos a los observados en los primeros estadíos de la retinopatía diabética, posiblemente a

través de un mecanismo que involucra alteraciones post-traduccionales de ocludinas y

disminución en su expresión (Antonetti y col., 1999; Tolentino y col., 2002). Existen diversos

estudios clínicos que utilizan terapias anti-VEGF para el tratamiento de la retinopatía diabética

(Ng y Adamis, 2006; Arevalo y col., 2007). Si bien los resultados son alentadores, estas terapias

son recomendadas conjuntamente con un tratamiento con láser, según las características del

paciente. En concordancia con estos antecedentes, en este trabajo de Tesis se demostró un

aumento en los niveles retinianos de VEGF, tanto a las 6 como a las 10 semanas post-inyección

de STZ. En retinas de animales diabéticos, el VEGF se localizó preferencialmente en el

pericarion de neuronas de la CCG y en células en la CNI.

En conjunto, estos resultados permitieron caracterizar las alteraciones funcionales, vasculares e

histológicas retinianas en el modelo de retinopatía diabética experimental inducida por STZ. Este

modelo experimental reproduce considerablemente la gran complejidad de esta enfermedad

retiniana multifactorial, análogamente a lo que se observa en pacientes diabéticos. Seguramente

por estas razones, al presente, el tratamiento de la enfermedad tiene un éxito considerablemente

limitado, dado que un tratamiento terapéutico efectivo debería revertir o al menos evitar la

progresión de todas y cada una de estas alteraciones, que probablemente contribuyan

sinérgicamente a la pérdida de visión.

Discusión

144

Los estudios clínicos del efecto de la diabetes sobre la función visual mayoritariamente se han

restringido al análisis a nivel retiniano. Sin embargo, una función visual normal implica

necesariamente la integridad de toda la vía visual en su conjunto. Por lo tanto, la serie de

experimentos que se discutirá a continuación tuvo como objetivo el análisis de la vía visual en el

modelo de diabetes experimental inducido por STZ.

3.2. Alteraciones en la vía visual inducidas por diabetes experimental

En estadíos tempranos de retinopatía diabética se han descripto anormalidades en la función de

la vía visual, como la reducción en la sensibilidad al contraste, la reducción en la amplitud del

ERG pattern y aumento en la latencia de los VEPs, que fueron evidentes en forma previa a las

alteraciones vasculares (Sokol y col., 1985; Bresnick, 1986; Prager y col., 1990; Martinelli y

col., 1992). En este sentido, se ha sugerido que las alteraciones en los VEPs podrían deberse a

cambios en la velocidad de conducción de las fibras del NO (Verrotti y col., 2000). Estudios

morfológicos en autopsias de NOs de pacientes diabéticos han revelado cambios severos en

axones, gliosis y daños vasculares (Giarelli y col., 1986). Sin embargo, al comienzo de este

trabajo sólo se disponía de escasa información respecto a la vía visual en estadíos tempranos de

diabetes. Los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis demuestran por primera vez, un

déficit en el transporte axonal anterógrado y alteraciones axo-gliales en la porción distal del NO

a las 6 semanas de diabetes experimental.

La CTB es un trazador que se une específicamente a receptores de neuronas, es activamente

incorporado y transportado por el citoesqueleto del axón y ha sido ampliamente utilizado en el

estudio de la vía visual (Angelucci y col., 1996; Prichard y col., 2007). Luego de 6 semanas de

diabetes se observó una marcada disminución en los niveles de CTB en las terminales retinianas

a nivel del CS. En concordancia con este resultado, otros autores han descripto cambios en el

transporte retrógrado en estadíos tempranos de diabetes experimental (Ino-Ue y col., 2000). En

conjunto, estos resultados podrían sugerir una “desconexión” entre la retina y el CS en etapas

Discusión

145

tempranas de la enfermedad. En ninguno de los períodos evaluados se observaron alteraciones

neuronales o gliales en el CS, lo que descarta la posibilidad de que la alteración en el transporte

axonal se deba a una degeneración trans-neuronal retrógrada de las CGRs inducida por el daño

de neuronas del CS.

Con el objetivo de identificar el sitio de bloqueo del transporte anterógrado en la vía visual

diabética, se evaluó la citoarquitectura del NO en la porción intraorbital (no mielinizada y

mielinizada) e intracraneal. En la porción distal del NO de animales diabéticos se observó una

caída significativa en el número y el área promedio de los axones, que afectó particularmente a

las fibras de mayor calibre. Las alteraciones axonales observadas en la porción distal del NO

podrían ser responsables de las alteraciones en el trasporte anterógrado de CTB.

Las razones de una susceptibilidad particular de esta región del NO frente al daño diabético son

aún desconocidas. Sin embargo, existe amplia evidencia experimental en favor de que la primera

manifestación morfológica de daño en la vía axonal puede diferir del sitio “original” de daño,

como se observa en la degeneración Walleriana. La axonopatía distal ha sido ampliamente

documentada en modelos de lesión de nervios periféricos. En este contexto, se ha descripto que

el sitio inicial de lesión se encuentra alejado de las primeras alteraciones morfológicas que se

evidencian en el axón. A nivel central, las limitaciones para el análisis de las vías axonales han

dificultado el estudio de la progresión del daño axonal y la participación glial. La vía retino-

colicular ha sido utilizada como modelo para evaluar el daño axonal distal e identificar las

proyecciones de las CGRs. Sin embargo, sólo en los últimos años se ha prestado particular

atención a las distintas poblaciones axonales de proyección y a los centros de inervación

afectados por isquemia retiniana u otras enfermedades oculares. En modelos de isquemia

retiniana aguda se han observado alteraciones en el transporte anterógrado de las CGRs y

disminución de la inervación retiniana del CS, así como alteraciones trans-neuronales que

afectan neuronas de las capas superficiales del CS (Lafuente y col., 2002; Avilés-Trigueros y

col., 2003; Mayor-Torroglosa y col., 2005). Trabajos de Ino-ue y col. (1998a; 1998b y 2000) han

Discusión

146

demostrado cambios en el NO luego de 3 meses de inducción de diabetes experimental en ratas,

con caída en el número de axones y atrofia de las fibras de mayor calibre. En este trabajo de

Tesis se obtuvieron resultados similares, con cambios axonales significativos acompañados de

alteraciones gliales en la porción distal del NO, pero en un estadío considerablemente anterior de

diabetes (6 semanas post-inyección de STZ), en el que aún no se evidenciaron cambios en la

porción proximal del NO o en los somas de las CGRs.

La astrocitosis es una característica común a diversas enfermedades neurodegenerativas, que

llevan a una redistribución del citoesqueleto y en algunos casos, incluso a la proliferación celular

(revisado por Escartin y Bonvento, 2008). Se han demostrado alteraciones axonales y gliales en

nervios periféricos de pacientes diabéticos en estadíos avanzados de la enfermedad (Greene y

col., 1992). En el presente trabajo, se han observado alteraciones gliales a las 6 semanas de

diabetes, que no fueron evidentes en períodos más tempranos. Los resultados obtenidos indican

un aumento marcado en la inmunorreactividad para GFAP, conjuntamente con una disminución

en el número y el área de los axones en la porción distal del NO de animales diabéticos. Dada la

simultaneidad de los fenómenos descriptos, no es posible determinar si las alteraciones gliales,

son causa o consecuencia de las alteraciones axonales.

En la porción proximal del NO, las fibras de las CGRs se mielinizan y continúan hacia el

quiasma óptico. En la porción distal del NO de animales con 6 semanas de diabetes se

observaron alteraciones en la inmunomarcación para MBP, un componente de la mielina

madura, que cumple un rol relevante en la formación y estructura de la vaina de mielina (Shine y

col., 1992). Esta desorganización en la mielina fue confirmada por estudios de MET, en los que

se observó que las principales alteraciones se debieron a desarreglos de la mielina de los axones

de mayor calibre, algunos en vía de degeneración, con la formación frecuente de cuerpos

lamelares.

En algunos casos, luego de una lesión aguda, ocurre un proceso de remielinización mediado por

la activación de progenitores de OL. En estas condiciones, los progenitores de OL responden a

Discusión

147

señales quimioatractantes, migran a la zona que limita con la región dañada, proliferan y forman

nuevos OL que recubren los axones de nueva mielina (Arnett y col., 2004; Bondan y col., 2006).

Sin embargo, este proceso se vuelve progresivamente limitado. En pacientes y en modelos

animales de patologías desmielinizantes como la esclerosis múltiple, se ha demostrado que las

células progenitoras de OL, por razones mayormente desconocidas, pierden gradualmente su

capacidad de formar OL maduros y se acumulan en los bordes de la lesión, como células

aberrantes (revisado por Miron y col., 2011). Luego de 6 semanas de diabetes, en la porción

distal del NO se observó un aumento en la inmunomarcación para O1 y PRGFR-, marcadores

de OL inmaduros y progenitores de OL, respectivamente. En ambos casos se observaron

alteraciones en la morfología celular, con cuerpos hipertrofiados y un aumento en el número de

procesos y desorganización celular. Aún no se dispone de evidencias que permitan elucidar el rol

de estas células en la progresión de la axonopatía distal diabética. Es posible que estas células

contribuyan a una remielinización en períodos más avanzados de la enfermedad, aunque la

morfología celular alterada junto con la expresión de marcadores no característicos de células

progenitoras de OL (como GFAP), sugieren que estas células podrían avanzar hacia un fenotipo

aberrante incapaz de diferenciarse a OL maduros, como se ha observado en otras enfermedades

desmielinizantes (Wolswijk, 1998).

En diversos trabajos se han descripto alteraciones microgliales en retinas de animales diabéticos,

incluso en estadíos tempranos luego de la inyección de STZ (Rungger-Brändle y col., 2000;

Ibrahim y col., 2011). Sin embargo, luego de 6 semanas de diabetes no se observaron cambios en

la morfología de las células microgliales o signos de reactividad microglial. Al presente, no es

posible descartar la posibilidad de que las alteraciones de la microglía ocurran en etapas más

avanzadas de la enfermedad. En suma, estos resultados sugieren que en estadíos tempranos de

diabetes experimental existe un daño axo-glial en la porción distal del NO, que posiblemente sea

responsable de la falla en la comunicación retino-colicular y que precede las alteraciones

observadas en los somas de las CGRs. En este sentido, estos resultados sugieren que las

Discusión

148

alteraciones axo-gliales en la porción distal del NO podrían constituir el primer cambio

estructural en la vía visual inducido por diabetes experimental. Por lo tanto, el déficit visual en

etapas tempranas de la enfermedad, podría ser reducido a través de intervenciones que preserven

la función axonal distal, antes de la pérdida del sustrato neuronal.

3.3. Efecto protector del condicionamiento isquémico

El conjunto de resultados ya discutidos indica que la diabetes experimental (y presumiblemente

también la diabetes humana) induce una notable variedad de alteraciones, tanto a nivel de la

retina como de la vía visual. La hipótesis de trabajo que fundamentó la siguiente serie de

experimentos fue que la inducción de tolerancia isquémica es capaz de prevenir esta gama

diversa de cambios funcionales, vasculares y axo-gliales. Los resultados presentados en este

trabajo de Tesis confirman esta hipótesis y demuestran por primera vez, que la aplicación

semanal de pulsos breves de isquemia que careció de efectos per se, previene el conjunto de

alteraciones retinianas y de la vía visual inducido por diabetes experimental.

La aplicación de pulsos semanales de isquemia previno significativamente las alteraciones

funcionales retinianas (ERG y POs) inducidas por diabetes. De hecho, en retinas de ojos de

animales diabéticos con condicionamiento isquémico, se observó una reversión completa del

daño funcional, dado que se obtuvieron resultados similares a los del grupo control (no

diabético). Asimismo, la aplicación semanal de pulsos de isquemia previno las alteraciones

vasculares observadas en ojos de animales diabéticos con tratamiento simulado, lo que podría

contribuir a una recuperación del desbalance en la homeostasis retiniana. En retinas de ojos con

condicionamiento isquémico se observó una prevención del aumento en la permeabilidad

vascular (evaluado con azul de Evans) y de las alteraciones gliales. Asimismo, la aplicación de

pulsos de isquemia previno la formación de edemas, que pueden contribuir a la extravasación de

albúmina.

Discusión

149

Como ya se mencionó, las alteraciones vasculares, con el consecuente aumento en la

permeabilidad vascular y la formación de edemas, han sido estrechamente asociadas al aumento

en los niveles de VEGF. La aplicación de pulsos de isquemia provocó una disminución

significativa en los niveles de VEGF, lo que sugiere que el condicionamiento isquémico podría

actuar como una terapia anti-VEGF.

En el primer protocolo de condicionamiento isquémico utilizado, los pulsos de isquemia se

aplicaron conjuntamente con la inducción de diabetes experimental. Si bien estos experimentos

tuvieron como objetivo evaluar el efecto del condicionamiento isquémico sobre la progresión de

las alteraciones características de la diabetes, la relevancia clínica de estos resultados es

indudablemente limitada y de valor relativo en cuanto a su eventual transferencia clínica. La

retinopatía diabética en humanos es una neuropatía progresiva. En concordancia, en el modelo de

diabetes experimental inducido por STZ, se identificaron diferentes estadíos de alteración

retiniana, que presentan las siguientes características: i) 3 semanas post-inyección de STZ: sin

cambios retinianos evidentes (RD asintomática); ii) 6-10 semanas post-inyección de STZ:

alteraciones funcionales (ERG, POs) y vasculares (RD moderada); iii) 15 semanas post-

inyección de STZ: progresión de las alteraciones funcionales (ERG, POs y VEPs) y alteraciones

morfológicas (RD avanzada). En base a estas observaciones, se utilizó un protocolo de

aplicación de pulsos de isquemia a partir de la semana 6 post-inyección de STZ, un intervalo en

el que las alteraciones funcionales ya son evidentes. En estas condiciones, la tolerancia

isquémica evitó la progresión del daño funcional en ojos de animales diabéticos. En conjunto,

estos resultados indican que el condicionamiento isquémico previene y evita la progresión del

daño retiniano inducido por diabetes experimental y constituyen la primera evidencia

experimental de que la inducción de tolerancia isquémica es una estrategia de protección

retiniana no sólo frente a una injuria isquémica aguda, sino también frente a un daño crónico y

progresivo.

Discusión

150

Como ya se mencionó, luego de 6 semanas de diabetes no se observaron cambios evidentes en la

morfología retiniana, en particular a nivel de las CGRs. Sin embargo, en este período temprano

de diabetes, se observaron alteraciones en el transporte anterógrado de CTB y daños axo-gliales

en la porción distal del NO. La aplicación de pulsos semanales de isquemia también previno

significativamente estas alteraciones. En la vía visual de ojos de animales diabéticos con

condicionamiento isquémico se observó una marcada preservación del transporte anterógrado de

CTB. Asimismo, se observó una prevención significativa de las alteraciones axonales y gliales

(astrocitos y células del linaje oligodendrocítico) inducida por diabetes, lo que indica que la

tolerancia isquémica evitó el déficit en la comunicación retino-colicular.

Como se mencionó anteriormente, las alteraciones axonales observadas en la porción distal del

NO de animales con 6 semanas de diabetes, en los que no se evidenciaron alteraciones en la

citoarquitectura retiniana, podrían constituir la primera manifestación morfológica de alteración

en la vía visual diabética. Sin embargo, esta evidencia no constituye una demostración formal de

que la porción distal del NO sea el sitio primario de la lesión neuronal que provoca estas

alteraciones. Es posible que una señal subumbral en el soma de las CGRs sea el estímulo que

desencadena un daño inicialmente observable en la porción distal del NO, con la consecuente

degeneración retrógrada hacia el sitio de lesión, de forma tal que el estadío final de la progresión

del daño es la muerte celular. En este sentido, a las 15 semanas de diabetes se observó una

disminución en el número de CGRs y un aumento en el número de células apoptóticas en la

CCG. En este contexto, aún no es posible determinar el sustrato anatómico preciso de la

protección inducida por el condicionamiento isquémico. Sin embargo, considerando que la

aplicación de pulsos de isquemia afecta primariamente a la retina, es posible suponer que la

tolerancia isquémica tiene un efecto directo sobre los cuerpos celulares retinianos, que a su vez,

se manifiesta como una protección a nivel axonal. Por lo tanto, cambios neuroquímicos

retinianos podrían ser responsables del daño neuronal, así como de la protección inducida por el

condicionamiento isquémico. En animales con 6 semanas de diabetes se observó una

Discusión

151

disminución en la actividad de GS, que fue revertida por la aplicación de pulsos semanales de

isquemia. Esto sugiere que la diabetes experimental induce un aumento en los niveles de

glutamato en el espacio sináptico que podría provocar una sobre-estimulación neuronal, con el

consecuente daño por excitotoxicidad, evidenciado inicialmente en la porción distal del NO

diabético. En concordancia con estos resultados, se ha demostrado que el primer cambio evidente

luego de la inyección intravítrea de NMDA ocurre en la porción distal del NO (Saggu y col.,

2008).

Una causa posible del aumento en los niveles de glutamato podría asociarse a una disfunción del

transportador de este neurotransmisor en las células de Müller, análogamente a lo observado en

el modelo de isquemia retiniana aguda. Sin embargo, los antecedentes disponibles al respecto

son controversiales. Por un lado, trabajos de Li y Puro (2002) y Zeng y col. (2010) demuestran

una disfunción significativa en el transportador de glutamato en células de Müller aisladas de

retinas de animales diabéticos a intervalos tempranos luego de la inyección de STZ.

Contrariamente, Ward y col. (2005) demostraron un aumento en la actividad del transportador de

glutamato (evaluado a través de la captación de D-aspartato) en ratas diabéticas, en tanto que

Mysona y col. (2009) no observaron cambios en la actividad del transportador inducidos por la

hiperglucemia. En este trabajo de Tesis, no se observaron diferencias en el influjo de glutamato

en retinas de ojos de animales con 6 semanas de diabetes, sin o con condicionamiento isquémico.

Posiblemente, la utilización de distintos métodos de evaluación de la actividad del transportador,

así como la preparación utilizada y las condiciones en las que se realizaron los experimentos,

podrían explicar esta controversia. Existe mayor consenso respecto a la disfunción temprana de

la GS inducida por diabetes experimental. En períodos tempranos de diabetes experimental, se ha

observado una disminución significativa en la actividad y en los niveles del ARN mensajero

(estudios de real-time PCR) de GS e incluso se ha sugerido su utilización como posible

biomarcador para evaluar la severidad y la progresión de la retinopatía diabética (Lieth y col.,

1998; Yu y col., 2009; El-Remessy y col., 2010). Por lo tanto, el hecho de que la tolerancia

Discusión

152

isquémica indujera una recuperación total de la actividad de esta enzima podría ser un aspecto

central en el mecanismo de protección inducido por los pulsos breves de isquemia.

Seki y col. (2004) demostraron una disminución en los niveles de BDNF (a nivel de ARN

mensajero y la proteína) en células de la retina interna y en células de Müller en estadíos

tempranos de diabetes experimental. La aplicación de pulsos de isquemia evitó la caída en los

niveles de BDNF en la retina interna inducida por diabetes, aunque estos cambios fueron

evidentes a las 10 (y no a las 6) semanas post-inyección de STZ. Considerando la disminución en

la inmunorreactividad para BDNF observada en los somas de las CGRs, es posible que esta caída

se deba a una falla en el transporte retrógrado y a la pérdida de axones que afectan la llegada de

la neurotrofina al soma neuronal. Sin embargo, la recuperación inducida por el condicionamiento

isquémico sobre los niveles de BDNF en células de la retina interna y células de Müller parece

indicar que el efecto de los pulsos de isquemia podría ocurrir también a nivel local y

simultáneamente en distintos tipos celulares. Harada y col. (2011) han demostrado que el BDNF

en células de Müller induce la expresión de otros factores neurotróficos que afectan la

supervivencia de las CGRs. En conjunto, estos resultados sugieren que el condicionamiento

isquémico podría tener un efecto directo sobre los somas de las CGRs, y a su vez (en forma

paralela o secuencial), podría actuar sobre las células de Müller, induciendo un aumento en la

expresión de BDNF, y con ello contribuir a la neuroprotección de las CGRs.

Diversas líneas experimentales sugieren que la tolerancia isquémica, inducida por PCI o PostC,

es un fenómeno de adaptación frente al daño isquémico previo o subsecuente, que provee una

protección altamente significativa al evitar o prevenir la neurodegeneración. La eficacia de

mecanismos de inducción de tolerancia isquémica se ha evaluado sobre diversas poblaciones

neuronales, como neuronas de la región CA1 del hipocampo, neuronas piramidales de la corteza

cerebral o neuronas retinianas (Wang y col., 2008; Brandt y col., 2011) e incluso a nivel

sináptico (Hogins y col., 2011). Sin embargo, no existía evidencia directa acerca del efecto

protector del condicionamiento isquémico sobre la capacidad de inducir protección a nivel

Discusión

153

axonal. Los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis sugieren que la diabetes experimental

inducida por STZ podría constituir un modelo de utilidad para evaluar las alteraciones axonales

distales, así como para el desarrollo de posibles estrategias terapéuticas.

En base a los resultados obtenidos en este trabajo, es posible suponer que frente al daño inducido

por diabetes experimental, el condicionamiento isquémico desencadena una serie compleja de

eventos que se representan en la Figura 56. En este contexto, la tolerancia isquémica podría

ejercer un efecto directo sobre las CGRs y células de la CNI, a través de la prevención del

aumento en la expresión de VEGF inducido por diabetes, lo que podría evitar o reducir las

alteraciones vasculares características de la diabetes (como el aumento en la permeabilidad

vascular y la formación de edemas), que a su vez podrían evitar las alteraciones en los astrocitos,

reduciendo así el daño vascular y neuronal. Alternativamente, la aplicación de pulsos de

isquemia podría afectar en forma directa a los astrocitos, impidiendo el desarrollo de las

alteraciones vasculares. El efecto del condicionamiento isquémico sobre las CGRs se evidenció

además, a través de la recuperación del transporte anterógrado y del daño axonal temprano. De

esta forma, la prevención del daño axonal podría evitar las alteraciones gliales (astrocitos y

células del linaje oligodendrocítico) observadas en la porción distal del NO de ojos de animales

diabéticos con tratamiento simulado. Por otra parte, los pulsos de isquemia podrían afectar a las

células de Müller, modulando la actividad de GS, con la consecuente prevención del daño por

sobre-estimulación glutamatérgica, y por otro lado, estimular la síntesis de BDNF, que a su vez,

contribuye a la supervivencia de las CGRs.

Discusión

154

Figura 56. Modelo propuesto para los posibles mecanismos involucrados en la protección desencadenada por el

condicionamiento isquémico frente al daño inducido por diabetes experimental. Las líneas punteadas representan los

posibles blancos celulares del condicionamiento isquémico. (*) Otros autores han sugerido que el aumento en los

niveles de calcio intracelular causado por la sobre-activación glutamatérgica, podría desencadenar una cascada de

eventos que incluyen el aumento en la producción de VEGF en CGRs (Xu y col., 2004). La reversión inducida por el

condicionamiento isquémico de la disminución de la actividad de GS observada en retinas de animales con 6

semanas de diabetes, podría contribuir a disminuir la excitotoxicidad, y a su vez, los niveles de VEGF en las CGRs.

Como se mencionó repetidamente, la disfunción visual asociada a la diabetes involucra una serie

compleja de fenómenos que afectan distintos blancos moleculares y celulares. Considerando que

la tolerancia isquémica previene el daño diabético, no resulta sorprendente que los eventos

involucrados en la protección constituyan también un conjunto complejo de fenómenos. Todavía

no estamos en condiciones de establecer un orden secuencial de los eventos involucrados y de

hecho, aún desconocemos si efectivamente existe un orden secuencial o se trata de un conjunto

de epifenómenos que ocurren en forma paralela. Una reflexión similar es aplicable a la

retinopatía diabética en sí, para la que si bien se ha elucidado con cierto grado de detalle el curso

temporal de las alteraciones, no existen pruebas concluyentes respecto a la causalidad relativa de

estos cambios. De hecho, un número considerable de alteraciones ocurren en forma simultánea,

Discusión

155

al menos para la escala temporal analizada en este trabajo. Sin embargo, es indiscutible que todas

las alteraciones inducidas por diabetes experimental contribuyen significativamente a la

disfunción visual y que la prevención de todas estas alteraciones es un requisito sine que non

para un tratamiento exitoso de la enfermedad. En este contexto, aun cuando son muchos los

interrogantes que quedaron sin responder, el conjunto de resultados obtenidos en este trabajo de

Tesis indican que la inducción de tolerancia isquémica inducida a través de una manipulación

inocua per se, previene el complejo conjunto de alteraciones inducidas por la diabetes

experimental, tanto a nivel funcional, como vascular y morfológico.

Aunque no se dispone de estadísticas actualizadas en nuestro país, la retinopatía diabética es la

lesión retiniana que más frecuentemente requiere tratamiento oftalmológico. La terapéutica

disponible no ha alcanzado un éxito razonable más allá de evitar la progresión de la disfunción.

Además, una consecuencia probable de la progresión de la enfermedad es la ceguera total e

irreversible. La posibilidad de desarrollar con éxito nuevas estrategias terapéuticas para el

tratamiento de esta enfermedad podría beneficiar a toda la población que padece este tipo de

afección, así como a su entorno familiar y social. Si bien los resultados obtenidos en este trabajo

de Tesis en su estado actual son intransferibles a la Oftalmológica Clínica, la identificación de

los mecanismos involucrados en la tolerancia isquémica, podría permitir en un futuro no lejano

reproducir farmacológicamente el efecto protector. En este sentido, la inducción de tolerancia

isquémica podría constituir una futura avenida fértil para el desarrollo de terapias de nueva

generación en el tratamiento de esta disfunción visual prevalente e invalidante.

4. Efecto de la diabetes sobre el sistema visual no formador de imagen

El conjunto de hallazgos descriptos en las secciones anteriores demuestra que la diabetes

experimental provoca cambios altamente significativos en la retina y la vía visual, que fueron

evidentes incluso en estadíos relativamente tempranos de la enfermedad e incluyen la muerte de

CGRs por apoptosis en etapas más avanzadas.

Discusión

156

Además de su función como “órgano de la visión”, en la última década se ha identificado y

caracterizado el circuito neuronal a través del cual el ojo actúa además como un sensor de luz

ambiental, incluso en ausencia de percepción visual consciente. Estas funciones visuales, como

la regulación de los ritmos circadianos, la supresión fótica de la síntesis de melatonina pineal o el

reflejo pupilar, entre otras, están controladas por una sub-población de CGRs, que expresan un

fotopigmento retiniano novel, la melanopsina. Las CGRifs proyectan principalmente a los NSQ

y están involucradas en la modulación de los ritmos circadianos (Berson y col., 2002; Lucas y

col., 2003; Hattar y col., 2006). Considerando el rol fundamental de la información fótica en la

regulación del sistema visual no formador de imagen, es de indudable interés determinar cómo

las enfermedades oftalmológicas pueden afectar a estas funciones visuales. Sin embargo, la gran

mayoría de los estudios sobre la retinopatía diabética se han centrado en las CGRs que participan

en las funciones visuales conscientes, en tanto que el efecto de la diabetes sobre el sistema visual

no formador de imágenes ha recibido comparativamente menor atención. En este sentido, la

mayoría de los trabajos relacionados con esta temática han sido publicados más de 10 años atrás.

Estas evidencias experimentales han demostrado anormalidades en el ritmo circadiano de

diversos procesos fisiológicos (como en los niveles de corticosterona o melatonina pineal) y

conductuales (actividad locomotora o patrón de ingesta) en pacientes diabéticos, así como en

modelos de diabetes experimental (Velasco y col., 1988; Shimomura y col., 1990; Van Cauter y

col., 1997). A diferencia de otras enfermedades oculares, la influencia de la diabetes sobre el

sistema circadiano podría ser doble ya que podría ejercer un impacto a través de la pérdida de

CGRifs y además, podría tener un efecto directo sobre el reloj central o las vías eferentes. Si

bien, como ya se discutió, en estadíos avanzados de diabetes experimental (15 semanas) se

observó una caída significativa en el número de CGRs, alteraciones en el transporte anterógrado

y daño en la porción distal del NO, en estos estudios no se examinó si el tipo particular de

CGRifs era igual o diferencialmente susceptible a los efectos de la diabetes.

Discusión

157

En forma más reciente, se han descripto cambios en el árbol dendrítico de las CGRs

melanopsina(+) en ratones diabéticos (Gastinger y col., 2008), así como alteraciones en el reflejo

pupilar en pacientes con retinopatía diabética (Bughi y col., 2006), aunque el vínculo directo

entre la diabetes, las CGRifs y la fisiología circadiana no había sido hasta ahora exhaustivamente

analizado. Por lo tanto, la serie de experimentos que se discutirán a continuación se realizó con

el fin de evaluar el sistema visual no formador de imagen en un estadío avanzado de diabetes

experimental, en el cual se observaron alteraciones considerables en la retina y la vía visual.

Luego de 15 semanas de diabetes, paralelamente a una clara disminución en la marcación para

CTB a nivel del CS, se observó una preservación completa del patrón de inervación de CTB en

núcleos visuales no formadores de imagen, como los NSQ y el NOP, lo que podría indicar una

preservación preferencial de las proyecciones de las CGRifs frente al daño inducido por diabetes.

Estudios realizados por Trejo y Cicerone (1984) en ratas han demostrado que las neuronas que

inervan el NOP presentan una velocidad de conducción lenta (~ 3 m/s) y corresponderían a fibras

de menor calibre. En NOs de animales con 15 semanas de diabetes se observó una preservación

de las fibras de menor calibre (datos no mostrados), lo que sugiere que el tamaño de las fibras

podría constituir una “explicación anatómica” para la susceptibilidad diferencial de los axones de

las CGRifs. En cuanto a los cambios a nivel retiniano, se evaluó el estado de las CGRs

melanopsina(+) a las 15 semanas de diabetes, período en el que se observó una caída

significativa en el número de CGRs Brn3a(+). Recientemente se ha demostrado que la sub-

población de CGRifs son células que no expresan la proteína Brn3a (Jain y col., 2012).

Considerando que el porcentaje de CGRifs es muy pequeño (1- 2%) comparado con el resto de la

población de CGRs, esta evidencia no contradice el hecho de la proteína Brn3a sea un marcador

ampliamente utilizado para la evaluación de CGRs. Al presente, se han identificado 5 sub-

poblaciones de CGRifs (Ecker y col., 2010). Las células mejor caracterizadas son las M1, que

poseen un árbol dendrítico abundante con estratificación en la subcapa OFF de la CPI y las M2

con estratificación en la sub-lámina ON de la CPI, en tanto que las M3 presentan dendritas que

Discusión

158

llegan a ambas sub-láminas de la CPI. Además, se han descripto sub-poblaciones M4 y M5, pero

la información respecto a estas neuronas fotosensibles es aún escasa. Las células M1 presentan

un alto nivel de expresión de melanopsina y por ello, la utilización de anticuerpos anti-

melanopsina permite detectar mayoritariamente este subtipo celular, y en menor medida a las

células M2. Además, las células M1 constituyen el principal input retiniano de los NSQ y el

NOP (Ecker y col., 2010). En retinas de animales con 15 semanas de diabetes se observó una

preservación de las CGRifs, sin cambios en el número de células. En concordancia con este

resultado, no se observaron diferencias en los niveles proteicos de melanopsina. En conjunto,

estos resultados demuestran que tanto los cuerpos neuronales y los niveles de melanopsina, como

las proyecciones axonales de estas células, se encuentran preservados en estadíos avanzados de

diabetes. Por lo tanto, la siguiente serie de experimentos tuvo por objetivo evaluar el estado

funcional de la conexión entre las CGRifs y neuronas de los NSQ, el principal núcleo de

proyección de las CGRifs. Para ello, se utilizó como herramienta la expresión de cFos en los

NSQ inducida por un pulso de luz. Múltiples pruebas experimentales demuestran que la

exposición a un pulso de luz induce un rápido aumento en los niveles de la proteína c-Fos en

neuronas de la porción retino-receptiva (región ventro-lateral) de los NSQ (Rea, 1989; Edelstein y

col., 2000). Esta proteína participa en la regulación temprana de la transcripción génica mediada

por la cascada de señales que se disparan frente a un estímulo externo (Marx, 1987; Sheng y

Greenberg, 1990). En este sentido, se ha demostrado que la administración de un oligonucleótido

antisentido que bloquea la expresión de c-Fos, inhibe la respuesta inducida por un pulso de luz

en animales en libre curso (Wollnik y col., 1995). Yamanouchi y col. (1997) demostraron una

disminución significativa en el aumento de expresión de c-Fos inducida por un pulso de luz en

los NSQ de ratas con 2 meses de diabetes. Sin embargo, estos autores reconocen que dada la

posible influencia de las cataratas sobre la entrada de luz, no les fue posible determinar el

mecanismo responsable de esta alteración. Además, cabe señalar que este trabajo fue publicado

en forma previa a la identificación y caracterización de las CGRifs. En este trabajo de Tesis, se

Discusión

159

obtuvieron resultados similares en cuanto a la respuesta de los NSQ a un pulso de luz, pero se

profundizó el análisis al evaluar el estado de las CGRifs y de las vías de conexión con los NSQ

en animales con lentectomía. En animales sometidos a lentectomía luego de 6 semanas de

diabetes y expuestos a un pulso de luz a las 8 semanas post-cirugía, se observó una reversión

completa de la disminución en el número de neuronas c-Fos(+) en los NSQ frente a un pulso de

luz observada en animales diabéticos sin remoción del cristalino.

La vía central de conexión nerviosa responsable del reflejo pupilar ha sido motivo de extensa

investigación, dada la ventaja que ofrece este circuito para evaluar en forma no invasiva la

función visual y neurológica. El iris está inervado por terminales axonales cuyos cuerpos

celulares se encuentran en el ganglio ciliar que está inervado por el núcleo de Edinger-Westphal.

Aún existe controversia respecto al patrón de inervación de este núcleo y se han observado

diferencias entre especies. En roedores, cada núcleo de Edinger-Westphal recibe inervación

bilateral del NOP y a su vez, cada NOP recibe inervación retiniana de ambos ojos. Este patrón de

inervación es crítico para el reflejo pupilar consensual (revisado por Young y Lund, 1998).

Como se mencionó anteriormente, no se observaron alteraciones en el patrón de proyección

retiniana a nivel del NOP en animales diabéticos. Por lo tanto, para la evaluación del estado

funcional de la conexión entre las CGRifs y neuronas del NOP, se examinó el reflejo pupilar

consensual. En animales con 6 ó 10 semanas de diabetes (intervalos en los que aún no se han

desarrollado cataratas) no se observaron diferencias en la contracción del iris inducida por un

pulso de luz brillante, lo que sugiere que la conexión morfológica y funcional entre la retina y el

NOP se encuentra preservada del daño diabético, al menos en los períodos analizados.

En animales con 15 semanas de diabetes no se observaron diferencias en los niveles de los

pigmentos visuales rodopsina y melanopsina, presentes en FR y CGRifs, respectivamente, que

participan en el reflejo pupilar. Estos resultados son compatibles con lo observado en el análisis

del reflejo pupilar; sin embargo, es necesario remarcar que en estos intervalos, la función

retiniana, evaluada a través del ERG, se encontró significativamente disminuida en retinas de

Discusión

160

animales diabéticos. Si bien no se dispone de una interpretación clara de esta discrepancia, la

preservación de los niveles de melanospina y el número de CGRifs observada en animales

diabéticos podría indicar que en las condiciones evaluadas, las CGRifs desempeñan un rol

preponderante en el reflejo pupilar. En este sentido, se demostró un reflejo pupilar prácticamente

inalterado en animales con degeneración completa de los FR clásicos (Lucas y col., 2003).

Las variaciones en la luz ambiental representan una señal clave para la sincronización de los

ritmos circadianos. Luego de 10 - 15 semanas de diabetes, los animales presentaron ritmos de

actividad locomotora sincronizados con el ciclo de 24 h en forma similar a los animales control,

con la salvedad de una alteración significativa en el ángulo de fase (inicio de la actividad tras el

apagado de la luz). Estos resultados fueron similares a los obtenidos previamente por Shimazoe y

col. (2000) en ratas con 8 semanas de diabetes. Dado que la diabetes es una enfermedad con

múltiples manifestaciones sistémicas, los cambios en el ángulo de fase (que no fueron afectados

por la remoción de las cataratas) podrían ser una consecuencia del daño que provoca esta

enfermedad sobre los NSQ, o bien, sobre las vías de entrada yo salida del reloj central. Los

animales con 15 semanas de diabetes fueron capaces de resincronizar el ritmo de actividad

locomotora luego de un cambio de fase de 4 h, aunque el tiempo necesario para la

resincronización fue significativamente mayor que en los controles. En animales diabéticos con

lentectomía se observó una recuperación parcial, pero significativa de este parámetro, lo que

sugiere la participación de un “componente ocular” en esta alteración, más allá de otras

alteraciones sistémicas. Si bien no se realizó un análisis exhaustivo de la citoarquitectura de los

NSQ, estos resultados sugieren que luego de 15 semanas de diabetes la vía de entrada y la

respuesta post-sináptica se encuentran considerablemente preservadas. En concordancias con

estos resultados, Shimazoe y col. (2000) demostraron que luego de 2 meses de diabetes, la tasa

de disparo de potenciales de acción de neuronas de los NSQ tras un retraso de fase inducido

farmacológicamente por glutamato, no difiere de la observada en animales control.

Discusión

161

En pacientes diabéticos, la incidencia de cataratas es elevada y de una rápida progresión.

Diversos estudios realizados en pacientes con cataratas han demostrado alteraciones en la

sincronización de los ritmos circadianos y en la arquitectura del sueño (Brøndsted y col., 2011,

Kessel y col., 2011). Recientemente, Schmoll y col. (2011) demostraron trastornos en tareas

cognitivas en pacientes con cataratas, que son revertidas por la cirugía. Los resultados obtenidos

en este trabajo de Tesis, indican que la opacidad del cristalino afecta las funciones visuales no

formadoras de imagen, a pesar de la preservación del sistema neuronal. Se ha propuesto que la

opacidad del cristalino reduce la entrada de luz, en particular en el espectro del azul, afectando

preponderantemente a la melanopsina (Kessel y col., 2010), una hipótesis que ha sido al menos

indirectamente confirmada por los resultados obtenidos en este trabajo.

En un trabajo reciente se realizó un análisis oftalmológico prospectivo durante 10 años en el que

se demostró un aumento significativo en la agudeza visual luego de la remoción del cristalino en

pacientes diabéticos (Ostri y col., 2011). De esta forma, la cirugía de cataratas, una intervención

relativamente sencilla y sin efectos adversos considerables, plantea la posibilidad de mejorar

considerablemente no sólo la función visual formadora de imágenes, sino también restaurar las

alteraciones del sistema visual no formador de imagen inducidas por la diabetes, y con ello, la

calidad de vida de los pacientes.

Es necesario señalar que los resultados obtenidos en el estudio del efecto de la diabetes sobre el

sistema visual no formador de imagen, fueron sorprendentes. Considerando el conjunto de

alteraciones de la retina, la vía visual y el complejo conjunto de efectos sistémicos de la

enfermedad, resultaba esperable una alteración significativa también extensible a este sistema,

que como ya se mencionó, no había sido previamente analizado en detalle. Siguiendo la línea

argumental de este trabajo, la idea original era caracterizar estas alteraciones y evaluar los

efectos del condicionamiento isquémico sobre este sistema particular. Si bien no puede

descartarse que estos cambios puedan ocurrir en etapas aún más avanzadas de la enfermedad, los

circuitos CGRifs-NSQ y CGRifs-NOP resultaron considerablemente “insensibles” a la diabetes,

Discusión

162

en intervalos en los que ya tuvieron lugar alteraciones muy notables a nivel retiniano y en la vía

visual.

La amplia diversidad de las CGRs permite suponer que diferencias en la expresión de proteínas o

enzimas permitan a un tipo celular ser más resistente frente a un daño. A modo de ejemplo, se ha

demostrado que CGRs con altos niveles de citocromo oxidasa son más resistentes frente al daño

retiniano (von Bussmann y col., 1993). Asimismo, Li y col. han demostrado que las CGRifs son

más resistentes que el resto de las CGRs frente a un daño por lesión del NO o por hipertensión

ocular, presumiblemente a través de un aumento en la expresión de la vía de supervivencia

celular mediada por fosfatidil-inositol 3-quinasa (PI3K)/ proteína quinasa B (Akt) (Li y col.,

2008). En el terreno de la mera especulación, estos resultados podrían interpretarse a la luz de la

función central del sistema circadiano a nivel fisiológico y conductual. Las CGRifs forman parte

de un circuito neuronal evolutivamente conservado y con una alta jerarquía en la organización

fisiológica. Es posible que el hecho de que los componentes del sistema circadiano retiniano sean

más robustos y redundantes que otros tipos celulares, permita garantizar una mayor resistencia y

una organización circadiana adecuada y funcional aun frente a las alteraciones metabólicas,

vasculares y neurales provocadas por la diabetes.

EPÍLOGO

¿Qué sabemos ahora que no sabíamos cuando empezamos esta tesis?

En el transcurso de este trabajo de Tesis, hemos logrado avances originales y de consideración

en la comprensión de los mecanismos involucrados en la lesión retiniana inducida por isquemia

aguda y por diabetes, así como en la posibilidad de prevenir ambos procesos a través de la

inducción de tolerancia isquémica. Asimismo, hemos demostrado que las CGRifs en particular, y

el sistema no formador de imagen en general, tienen una menor susceptibilidad al daño

diabético, lo que representa una valiosa pieza de información respecto a este sistema no canónico

de transducción de la información luminosa. Otro aspecto central que hemos aprendido a lo largo

Discusión

163

de estos años, tiene que ver con la génesis del conocimiento científico en sí, porque

paradójicamente, esta Tesis ha generado un número mayor de interrogantes que aquellos que

logramos responder. Quizás el desarrollo científico sea ese devenir que implica cerrar algunas

puertas, con la condición inexorable de abrir nuevas puertas cada vez. Por ello, si bien los

resultados obtenidos satisficieron considerablemente los objetivos que nos propusimos al inicio,

las perspectivas futuras de esta línea de trabajo podrían ser tan inciertas (la incertidumbre es una

condición intrínseca al desarrollo científico) como estimulantes, frente al profundo deseo de

contribuir a mejorar la calidad de vida y preservar la visión de quienes podrían padecer por no

tenerla.

Conclusiones

164

CONCLUSIONES

La isquemia retiniana aguda (40 min) indujo cambios significativos a nivel funcional y

morfológico, que fueron revertidos por la aplicación de PostC (aplicación de ciclos de

isquemia/reperfusión al inicio de la reperfusión).

La síntesis proteica, en una ventana temporal estrecha, participa del mecanismo protector

desencadenado por el PostC y la iNOS podría ser una proteína clave en este mecanismo.

El daño isquémico es mediado, al menos en parte, por un aumento en las concentraciones

sinápticas de glutamato y el PostC podría proteger del daño isquémico revirtiendo este

efecto.

La diabetes experimental inducida por la inyección de STZ provocó cambios funcionales,

vasculares y morfológicos significativos a nivel retiniano. Se observó un fenómeno de

progresión del daño retiniano diabético, en el que las alteraciones funcionales precedieron a

los cambios morfológicos.

El aumento en los niveles de VEGF retiniano podría constituir una pieza clave en el daño

diabético.

En estadíos tempranos de diabetes experimental, se observaron alteraciones axo-gliales en la

porción distal del NO, que podrían constituir el primer cambio estructural en la vía visual

inducido por diabetes experimental.

El condicionamiento isquémico (pulsos semanales de isquemia) revirtió las alteraciones

observadas en la retina y la vía visual diabética.

En etapas tempranas de diabetes se observó una disminución significativa de la actividad de

GS.

La aplicación semanal de pulsos de isquemia revirtió significativamente el aumento en los

niveles de VEGF y la disminución en la actividad de GS inducidos por diabetes.

En etapas avanzadas de diabetes experimental de observó una preservación de las CGRifs en

particular, y el sistema visual no formador de imagen en general.

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