i
BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
------------
LÊ HƯƠNG THỦY
NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN BÃ RONG CÂU
(Gracilaria verrucosa) BẰNG ENZYM
CELLULASE TỪ VI KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG
TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN NUÔI CÁ RÔ
PHI ĐƠN TÍNH GIAI ĐOẠN THƯƠNG PHẨM
LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT
KHÁNH HÒA, 2017
------------
ii
BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
------------
LÊ HƯƠNG THỦY
NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN BÃ RONG CÂU
(Gracilaria verrucosa) BẰNG ENZYM
CELLULASE TỪ VI KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG
TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN NUÔI CÁ RÔ PHI
ĐƠN TÍNH GIAI ĐOẠN THƯƠNG PHẨM
LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT
Chuyên ngành : Công nghệ chế biến thủy sản
Mã số : 60.54.10.05
Người hướng dẫn khoa học: GS.TSKH. Nguyễn Trọng Cẩn
PGS.TS. Vũ Ngọc Bội
KHÁNH HÒA, 2017
iii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả
nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình
nào khác.
Nha Trang, Ngày tháng năm 2017
Tác giả luận văn
Lê Hương Thủy
iv
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành Luận án này
Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu, Lãnh đạo Khoa Sau đại học và Ban Chủ
nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên
cứu tại Trường trong những năm qua.
Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho Thầy GS.TSKH. Nguyễn Trọng
Cẩn - nguyên Hiệu trưởng - Trường Đại học Nha Trang và PGS.TS. Vũ Ngọc Bội -
Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt
quá trình thực hiện Luận án.
Xin cám ơn Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Hải sản và các cán bộ Phòng Nghiên cứu
Công nghệ Sau thu hoạch, Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia về Công nghệ gen
- Viện Công nghệ Sinh học, Xí nghiệp Giống thủy sản Hải Phòng, Viện Công nghệ Sinh
học và Thực phẩm - Trường Đại học Công nghiệp Tp Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ
và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian thực hiện Luận án vừa qua.
Đặc biệt, xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ, động viên của gia đình và bạn bè
luôn luôn chia sẻ cùng tôi trong quá trình nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Nha Trang, Ngày tháng năm 2017
Tác giả luận văn
Lê Hương Thủy
v
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................iv
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................... viii
DANH MỤC BẢNG ......................................................................................................ix
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................xi
DANH MỤC SƠ ĐỒ ................................................................................................... xiii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ ...............................................................................................xiv
TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ........................................... xv
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... 3
1.1. Nguyên liệu rong biển và tình hình sản xuất Agar ............................................... 3
1.1.1. Nguyên liệu rong biển ................................................................................... 3
1.1.2. Các quy trình sản xuất agar ........................................................................... 4
1.1.3. Thành phần cơ bản của bã thải agar .............................................................. 8
1.1.4. Các phương pháp xử lý bã thải agar .............................................................. 9
1.2. Tổng quan về Cellulase ..................................................................................... 11
1.3. Enzym Cellulase ................................................................................................. 13
1.3.1. Định nghĩa và phân loại ............................................................................... 13
1.3.2. Tính chất ...................................................................................................... 14
1.3.3. Cơ chế thủy phân cellulose .......................................................................... 15
1.3.4. Cơ chế tác dụng của cellulase...................................................................... 16
1.4. Vi sinh vật tổng hợp Cellulase ........................................................................... 18
1.4.1. Giới thiệu chung về các nhóm vi sinh vật tổng hợp cellulase ..................... 18
1.4.2. Một số chủng vi sinh vật được ứng dụng nhiều trong sản xuất cellulase ... 22
1.4.3. Ứng dụng của enzym cellulase vi sinh vật .................................................. 24
1.4.4. Môi trường nuôi cấy và nguồn nguyên liệu ................................................ 26
1.4. 5. Phương pháp thu nhận enzym cellulase ..................................................... 27
1.5. Sản lượng nuôi cá rô phi ..................................................................................... 30
1.6. Đặc điểm sinh học của cá rô phi ......................................................................... 32
vi
1.6.1. Phân loại ...................................................................................................... 32
1.6.2. Đặc điểm hình thái: ..................................................................................... 32
1.6.3. Đặc điểm về dinh dưỡng và sinh trưởng. .................................................... 33
1.6.4. Nhu cầu dinh dưỡng của cá rô phi ............................................................... 34
1.6.5. Nhu cầu dinh dưỡng và ảnh hưởng của thức ăn lên sinh trưởng của cá rô
phi. ......................................................................................................................... 38
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 42
2.1. Đối tượng ............................................................................................................ 42
2.1.1. Bã thải rong sau sản xuất agar ..................................................................... 42
2.1.2. Giống vi sinh vật sinh cellulase ................................................................... 42
2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 43
2.2.1. Phương pháp phân tích ................................................................................ 43
2.2.2. Các phương pháp thu nhận và xác định hoạt tính cellulase ........................ 44
2.2.3 Phương pháp nuôi cấy và đánh giá khả năng sinh tổng hợp cellulase của vi
sinh vật ................................................................................................................... 47
2.2.4. Phương pháp xây dựng mô hinh thực nghiệm ............................................ 50
2.3. Hóa chất và thiết bị chủ yếu sử dụng trong luận án ................................................ 57
2.3.1. Hóa chất ....................................................................................................... 57
2.3.2. Thiết bị ......................................................................................................... 57
2.4. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................. 58
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..................................... 59
3.1. Khảo sát đánh giá khối lượng và thành phần hóa học cơ bản của bã thải rong câu
chỉ vàng sau sản xuất agar ......................................................................................... 59
3.2. Tuyển chọn chủng vi sinh vật và nghiên cứu một số tính chất cơ bản của các
chủng vi sinh vật tuyển chọn ..................................................................................... 61
3.2.1. Kết quả nghiên cứu tuyển chọn các chủng giống vi sinh vật ...................... 61
3.2.2. Nghiên cứu một số tính chất cơ bản của các chủng vi sinh vật tuyển chọn .... 65
3.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy 2 chủng vi khuẩn B.
Subtilis VTCC B-505 và B. Lichenformis (Li) và ứng dụng thủy phân bã rong câu
(G. Verrucosa) sau sản xuất Agar .............................................................................. 72
3.3.1. Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi sản xuất enzyme cellulase
từ 2 chủng B505 và Li ........................................................................................... 72
vii
3.3.2. Đề xuất quy trình nuôi cấy và thu nhận chế phẩm cellulase thô ................. 80
3.3.3. So sánh đánh giá hoạt tính cellulase của chủng Li và B505 với chế phẩm
cellulase từ các VSV khác ..................................................................................... 84
3.3.4. Nghiên cứu thủy phân bã thải rong sau sản xuất agar bằng enzyme cellulase
từ hai chủng vi khuẩn B 505 và Li ........................................................................ 88
3.4. Thử nghiệm sử dụng chế phẩm thủy phân bã thải rong trong thức ăn nuôi cá rô
phi .............................................................................................................................. 95
3.4.1. Xây dựng công thức thức ăn nuôi cá rô phi ................................................ 95
3.4.2. Đề xuất quy trình sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi ....................................... 97
3.4.3. Điều kiện môi trường nuôi thử nghiệm cá rô phi ...................................... 100
3.4.4. Thử nghiệm nuôi cá rô phi bằng thức ăn bổ sung chế phẩm thủy phân bã rong
............................................................................................................................. 104
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 108
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN
LUẬN ÁN ................................................................................................................... 110
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 111
viii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A530 : Đo OD ở bước sóng 530nm
B26 : Vi khuẩn Bacillus subtilis VTCC-B-26
B505 : Vi khuẩn Bacillus subtilis VTCC-B-505
CMC : Carbonyl – methyl cellulose
CMCase : Carbonyl – methyl cellulase
CPF
Thailand : Tập đoàn Nông sản Charoen Pokphand Thái Lan
ĐC : Đối chứng
DNSA : 2 –hydroxyl – 3,5 dinitrobenzoic acid
DO : Hàm lượng oxy hòa tan
DWG : Tốc độ tăng trưởng tuyệt đối
FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations (Tổ Chức
Liên Hiệp Thế Giới về Lương Thực và Nông Nghiệp)
FCR : Feed convertion ratio (Hệ số chuyển đổi thức ăn)
K-Na : TartratePotassium Sodium Tartrate Tetrahydrate
Li : Vi khuẩn Bacillus lichenformis
NT : Nghiệm Thức
Nxb : Nhà xuất bản
OD : Optical Density ( mật độ quang học)
TCA : Tricloacetic axit
TLS : Tỷ lệ sống
TM & SX : Thương mại và sản xuất
TNHH : Trách nhiệm hữu hạn
USD : Đô la Mỹ
VSV : Vi sinh vật
Wt : Khối lượng cá ứng với thời điểm t
ix
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Vi sinh vật phân hủy lignocellulose ................................................................ 19
Bảng 1.2. Các vi khuẩn có hoạt tính cellulase riêng cao nhất (µmol/phút/mg) .............. 20
Bảng 1.3. Phân biệt cá đực, cá cái .................................................................................. 32
Bảng 1.4. Giới hạn các thành phần trong thức ăn có giá thành ít nhất cho cá rô phi ở các
giai đoạn ................................................................................................................ 35
Bảng 1.5. Cung cấp bổ sung vitamin và khoáng chất trong thức ăn của cá rô phi .......... 36
Bảng 1.6. Tiêu chuẩn kỹ thuật của thức ăn nuôi cá rô phi và chế độ ăn trong nuôi lồng
và ao thâm canh .................................................................................................... 37
Bảng 1.7. Thành phần hoá học cá rô phi nuôi bằng thức ăn viên có hàm lượng protein
34,2 (%) ................................................................................................................ 40
Bảng 1.8. Nuôi cá rô phi bằng thức ăn viên có hàm lượng protein (%) khác nhau. ....... 40
Bảng 1.9: Nuôi cá rô phi với tỷ lệ thức ăn (%)/thân khác nhau ...................................... 41
Bảng 2.1. Xây dựng đường chuẩn glucose ...................................................................... 46
Bảng 3.1. Khối lượng bã thải rong sau sản xuất agar từ các vùng rong nguyên liệu khác
nhau ....................................................................................................................... 59
Bảng 3.2. Hàm lượng các chất cơ bản trong bã rong câu của một số cơ sở sản xuất Agar
............................................................................................................................... 60
Bảng 3.3. Hàm lượng kim loại nặng trong bã rong câu của một số cơ sở sản xuất Agar
............................................................................................................................... 60
Bảng 3.4. Hoạt tính cellulase ngoại bào của 17 chủng vi sinh vật nghiên cứu ............... 62
Bảng 3.5. Hoạt tính enzym cellulase của chủng Li, B505, B26 và CFd ......................... 63
Bảng 3.6. Hoạt tính cellulase ngoại bào của chủng Li, B505 trên đĩa thạch có cơ chất
bột giấy 0,2% ........................................................................................................ 69
Bảng 3.7. Khả năng thủy phân bã thải agar bằng cellulase từ 2 chủng Li và B505 ........ 70
Bảng 3.8. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng B505 nuôi trong
các môi trường khác nhau ..................................................................................... 73
Bảng 3.9. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng Li nuôi cấy ở các
môi trường khác nhau ........................................................................................... 73
Bảng 3.10. Khả năng sinh trưởng và vòng hoạt tính của chủng B505 và chủng Li tại các
nhiệt độ khác nhau ................................................................................................ 76
x
Bảng 3.11. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase của chủng B505 và chủng Li ở các pH
khác nhau .............................................................................................................. 77
Bảng 3.12. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng Li theo thời gian
nuôi cấy ................................................................................................................. 78
Bảng 3.13. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng B505 theo thời
gian nuôi cấy ......................................................................................................... 79
Bảng 3.14. So sánh hoạt tính cellulase từ 5 chủng VSV (A. niger, T. konigii, Li, B505 và
T3) trên đĩa thạch có CMC 0,2% .......................................................................... 85
Bảng 3.15. So sánh hoạt tính cellulase từ 5 chủng VSV (A. niger, T. konigii, Li, B505
và T3) trên đĩa thạch có cơ chất bột giấy 0,2% .................................................... 87
Bảng 3.16. Kết quả thí nghiệm của mô hình Box-Behnken ............................................ 89
Bảng 3.17. Kết quả xử lý số liệu trên phần mềm DX6 .................................................... 89
Bảng 3.18. Kết quả dự đoán tối ưu cho tỷ lệ Naa/Nts theo mô hình Box-Behnken .......... 91
Bảng 3.19. Kết quả kiểm chứng tối ưu theo tiên đoán và thực nghiệm .......................... 92
Bảng 3.20. Thành phần hóa học của các nguyên liệu phối trộn ...................................... 95
Bảng 3.21. Thành phần nguyên liệu của các công thức thức ăn phối trộn bã rong thủy
phân. ...................................................................................................................... 99
Bảng 3.22. Dao động các yếu tố môi trường trong quá trình thí nghiệm ..................... 101
Bảng 3.23. Ảnh hưởng của công thức thức ăn đến sinh trưởng của cá rô phi trong 80 ngày
nuôi ...................................................................................................................... 104
xi
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc cellulose và mạng lưới liên kết hydrogen ...................................... 11
Hình 1.2. Sự sắp xếp các chuỗi cellulose trong thành tế bào thực vật ......................... 12
Hình 1.3. Cơ chế tác động của enzym cellulase ........................................................... 17
Hình 1.4. Cơ chế thủy phân cellulose ............................................................................ 17
Hình 1.5. Hình dạng nấm mốc A. niger ......................................................................... 23
Hình 1.6. Hình dạng nấm Trichoderma viride ............................................................. 23
Hình 2.1. Bã thải sau sản xuất agar ............................................................................... 42
Hình 2.2. Cá rô phi ........................................................................................................ 43
Hình 2.3. Bố trí các giai nuôi thử nghiệm cá rô phi ...................................................... 55
Hình 3.1. Hình ảnh về đường kính vòng thủy phân CMCcủa 4 chủng vi sinh vật lựa
chọn trên đĩa thạch chứa 1% CMC ....................................................................... 63
Hình 3.2. Điện di đồ chế phẩm cellulase thô thu nhận từ vi khuẩn B505 và Li trên gel
polyacrylamis 12,5 % theo hệ đệm Laemmi ........................................................ 68
Hình 3.3. So sánh vòng thủy phân của cellulase từ vi khuẩn Li, B505 trên đĩa thạch bổ
sung cơ chất bột giấy 0,2% ................................................................................... 69
Hình 3.4. Khả năng thủy phân bã thải agar của cellulase ngoại bào từ chủng Li và B505 ..... 71
Hình 3.5. Khả năng thủy phân bã thải agar của hỗn hợp cellulase ngoại bào từ 4 chủng
(B505, B26, Li, CFd) ............................................................................................ 71
Hình 3.6. Hình ảnh về vòng thủy phân của cellulase từ chủng B505 nuôi trong các môi
trường khác nhau .................................................................................................. 72
Hình 3.7. Hình ảnh về vòng thủy phân của cellulase từ chủng vi khuẩn Li nuôi trong
các môi trường khác nhau ..................................................................................... 74
Hình 3.8. Khả năng sinh trưởng và vòng hoạt tính của chủng B505 và chủng Li tại các
nhiệt độ khác nhau ................................................................................................ 75
Hình 3.9. Vòng hoạt tính cellulase của chủng B505 và chủng Li nuôi cấy ở các pH
khác nhau .............................................................................................................. 77
Hình 3.10. Đường kính vòng thủy phân của cellulase từ Li, B505 và T3 trên đĩa thạch
có cơ chất CMC 0,2% ........................................................................................... 84
Hình 3.11. Đường kính vòng thủy phân cellulase từ Tricoderma trên đĩa thạch có cơ
chất CMC 0,2 % .................................................................................................... 85
Hình 3.12. Hoạt tính cellulase Aspergillus trên đĩa thạch có cơ chất CMC 0,2 % ....... 85
xii
Hình 3.13. Hoạt tính cellulase của 2 chủng nấm Tricoderma và Aspergillus nuôi ở các
môi trường khác nhau trên đĩa thạch có chứa cơ chất bột giấy 0,2 %. ................. 86
Hình 3.14. Hình ảnh về đường kính vòng thủy phân cellulase từ Li, B505 và T3 trên
đĩa thạch có cơ chất bột giấy 0,2 % ...................................................................... 86
Hình 3.15. Đường đồng mức và bề mặt đáp ứng (3D) của hàm lượng đường tổng số
theo thời gian thủy phân và nồng độ enzyme ....................................................... 91
Hình 3.16. Đường đồng mức và bề mặt đáp ứng (3D) tiên đoán hàm lượng đường tổng
số theo thời gian thủy phân và nồng độ enzyme................................................... 92
xiii
DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1. Quy trình công nghệ sản xuất agar theo quy mô bán cơ giới ............................ 6
Sơ đồ 1.2 Cơ chế chuyển hóa cellulose ......................................................................... 16
Sơ đồ 1.3. Thu nhận cellulase từ A. niger ..................................................................... 28
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ................................................................. 51
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ thí nghiệm sử dụng chế phẩm bã rong thủy phân trong nuôi cá rô phi
............................................................................................................................... 53
Sơ đồ 3.3. Quy trình thủy phân bã rong bằng cellulase từ vi khuẩn ............................. 93
Sơ đồ 3.4. Quy trình sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi .................................................... 97
xiv
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 1.1. Tăng trưởng sản lượng cá rô phi, cá da trơn và cá hồi giai đoạn 1980 –
2010 ...................................................................................................................... 30
Biểu đồ 3.1. Hoạt tính enzyme cellulase của 17 chủng vi sinh vật đã thử nghiệm ....... 62
Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ enzym cellulase ngoại bào của bốn chủng
vi khuẩn Li, B26, B505, CFd ................................................................................ 65
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ enzym cellulase ngoại bào của 4
chủng Li, B26, B505, CFd .................................................................................... 66
Biểu đồ 3.4. Hoạt tính cellulase ngoại bào của chủng Li theo thời gian nuôi cấy ........ 78
Biểu đồ 3.5. Sự thay đổi hoạt tính cellulase của chủng B505 theo thời gian nuôi cấy ......... 79
Biểu đồ 3.6. Biến động nhiệt độ nước ao thí nghiệm nuôi cá rô phi. .......................... 101
Biểu đồ 3.7. Biến động DO nước ao thí nghiệm nuôi cá rô phi .................................. 102
Biểu đồ 3.8. Biến động độ pH của nước ao thí nghiệm .............................................. 103
Biểu đồ 3.9. Tốc độ sinh trưởng (g/con) và DWG (g/ngày) của cá rô phi với thức ăn
phối trộn bã rong thủy phân khác nhau sau 80 ngày nuôi. ................................. 105
Biểu đồ 3.10. Hệ số chuyển đổi thức ăn của nuôi thử nghiệm các công thức thức ăn ..... 106
xv
TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
Đề tài luận án: “Nghiên cứu thủy phân bã rong câu (Gracilaria verrucosa) bằng
enzyme cellulase từ vi khuẩn để ứng dụng trong sản xuất thức ăn
nuôi cá rô phi đơn tính giai đoạn thương phẩm”.
Ngành/Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến thủy sản
Mã số: 62540105
Nghiên cứu sinh: Lê Hương Thủy
Người hướng dẫn: 1. PGS. TSKH. Nguyễn Trọng Cẩn
2 PGS. TS. Vũ Ngọc Bội
Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang
Tóm tắt những đóng góp mới về lý luận và học thuật của luận án:
Bã thải rong từ công nghệ sản xuất agar thường giàu cellulose là hợp chất hữu
cơ rất khó bị phân hủy. Trên thế giới hiện nay, người ta đã tiến hành xử lý phế liệu rong
biển để làm thức ăn gia súc bằng một số phương pháp thủy phân trong môi trường kiềm
hoặc axit. Tuy nhiên việc phân hủy cellulose bằng phương pháp vật lý và hóa học thường
phức tạp, tốn kém và gây ô nhiễm môi trường. Trong khi đó, việc xử lý các chất thải
hữu cơ chứa cellulose bằng công nghệ vi sinh, đặc biệt sử dụng các enzyme cellulase
ngoại bào từ vi sinh vật sẽ có nhiều ưu điểm về cả mặt kỹ thuật, kinh tế và môi trường.
Thủy phân cellulose từ bã rong phế thải sẽ giúp động vật tiêu hóa và hấp thụ dễ dàng
các protein, glucide, các nguyên tố khoáng đa vi lượng có trong bã thải sau quá trình sản
xuất agar. Sự thành công của đề tài sẽ cơ sở khoa học cho việc tận dụng bã thải rong câu
trong sản xuất thức ăn nuôi động vật thủy sản.
Người hướng dẫn
(Ký và ghi rõ họ tên)
Nghiên cứu sinh
(Ký và ghi rõ họ tên)
Lê Hương Thủy
xvi
Key Findings
Thesis title: "Study on hydrolysis of seaweed wastes (Gracilaria verrucosa) by
cellulase enzyme from bacteria to apply in the production of feed for tilapia".
Mayor: Seafood processing technology
Major code: 62540105
PhD Student: Lê Hương Thủy
Supervisor:
1. Prof. PhD. Nguyen Trong Can
2 Assoc. Prof, PhD. Vu Ngoc Boi
Institution: (Nha Trang University)
Key Findings:
Seaweed waste from agar production technologies are often richly organic
cellulose that is very difficult to decompose. Todays, seaweed waste has processed to
produce animal feeds by several hydrolysis methods in alkali or acidification. However,
the processing of cellulose by physical and chemiscal methods are often complicate,
expensive and polluting the environment. while the treatment of organic waste
containing cellulose by microbial technology, especially the use of cellulase enzyme
from microbial extracellular would have advantages in technical, economic and
environmental aspects. Hydrolysis of cellulose from seaweed waste will help animals
digest and easily absorb protein, glucide, mineral elements in the waste after the
production of agar. The success of the research will be scientific basis for the utilization
of seaweed waste in feed production of aquatic animals.
Phd Student
Le Huong Thuy
1
MỞ ĐẦU
Agar là hợp chất hữu có có nguồn gốc từ rong biển và được sử dụng trong nhiều
lĩnh vực của đời sống như dùng làm môi trường nuôi cấy vi sinh, dùng trong chế biến
các sản phẩm thực phẩm,… Trên thế giới, sản lượng agar vào khoảng 7.000 - 10.000
tấn/năm [26]. Hàng năm Việt Nam sản xuất khoảng 500 tấn agar [30]. Quá trình chiết
rút agar từ rong câu thường thải ra môi trường một lượng lớn bã thải hữu cơ thải, ước
tính vào khoảng 6 - 8 tấn bã thải hữu cơ/1 tấn sản phẩm agar. Như vậy, ước tính hàng
năm lượng bã thải rong thải ra từ quá trình sản xuất agar ở nước ta vào khoảng 7.000 ÷
9.000 tấn [15]. Riêng thành phố Hải Phòng có khoảng 40 xưởng sản xuất agar từ rong
biển. Trong đó, xưởng sản xuất agar của Công ty Đồ hộp Hạ Long sản xuất 50 tấn
agar/năm và một số xưởng sản xuất agar khác tại Hải Phòng được tư nhân đầu tư sản
xuất với công suất trung bình 10 tấn/năm [30]. Trong bã thải rong có chứa protein,
carbohydrat, các khoáng chất có nguồn gốc từ biển như iod, phosphat, các nguyên tố vi
lượng cần thiết cho sự sinh trưởng phát triển của động vật nuôi. Chính vì thế, bã thải
rong nếu không được tận dụng một cách hợp lý sẽ dẫn tới lãng phí và gây ô nhiễm môi
trường nghiêm trọng. Vì vậy, việc nghiên cứu nhằm sử dụng một cách hợp lý nguồn bã
thải rong, góp phần hạn chế ô nhiễm môi trường và nâng cao giá trị cho nguồn tài nguyên
rong biển, tạo công ăn việc làm cho người dân ven biển, giúp xóa đói giảm nghèo là cần
thiết. Do vậy việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu thủy phân bã rong câu (Gracilaria
verrucosa) bằng enzyme cellulase từ vi khuẩn để ứng dụng trong sản xuất thức ăn nuôi
cá rô phi đơn tính giai đoạn thương phẩm” là hướng nghiên cứu cần thiết và có ý nghĩa
thực tiễn cao.
Mục đích của luận án
Sử dụng phế thải rong câu trong sản xuất Agar để tạo ra nguồn nguyên liệu bổ sung
vào thức ăn chăn nuôi, góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường.
Nội dung nghiên cứu của luận án
1) Đánh giá lượng bã thải rong và xác định thành phần cơ bản của bã thải rong
sau sản xuất agar.
2
2) Sàng lọc các chủng vi khuẩn sinh cellulase cao từ bộ sưu tập giống vi khuẩn
của Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội.
3) Thu nhận chế phẩm enzyme cellulase thô từ chủng vi khuẩn đã lựa chọn và ứng
dụng thủy phân bã rong câu (Gracilaria verrucosa) sau sản xuất agar.
4) Thử nghiệm sử dụng sản phẩm thủy phân bã rong bằng enzyme cellulase từ vi
khuẩn trong sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi đơn tính giai đoạn thương phẩm.
Ý nghĩa khoa học của luận án
Luận án lần đầu tiên ở Việt Nam sử dụng enzyme cellulase từ vi khuẩn trong xử
lý bã thải rong sau sản xuất agar và sử dụng dịch thủy phân bã rong làm thức ăn nuôi cá
rô phi. Luận án có ý nghĩa khoa học cao do kết quả nghiên cứu của Luận án đã khẳng
định hoàn toàn có thể ứng dụng enzyme cellulase để chuyển bã thải rong sau sản xuất
agar thành sản phẩm hữu ích dùng trong nuôi cá rô phi ở quy mô công nghiệp.
Ý nghĩa thực tiễn của luận án
Thành công của đề tài có ý nghĩa về thực tiễn cao bởi giúp giảm thiểu ô nhiễm môi
trường từ công nghệ sản xuất agar và giúp nâng cao giá trị của rau câu chỉ vàng, giảm
chi phí sản xuất trong nuôi cá rô phi và đem lại hướng mới trọng tận dụng bã thải rong
sau chế biến.
3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Nguyên liệu rong biển và tình hình sản xuất Agar
1.1.1. Nguyên liệu rong biển
Rong biển là thực vật thủy sinh có đời sống gắn liền với nước. Chúng có thể là đơn
bào, đa bào sống thành quần thể. Chúng có kích thước hiển vi hoặc có khi dài hàng chục
mét. Hình dạng của chúng có thể là hình cầu, hình sợi, hình phiến lá hay hình thù rất
đặc biệt. Rong biển là loại thực vật biển quý giá được làm nguyên liệu chế biến thành
sản phẩm có giá trị trong công nghiệp, y dược và thực phẩm. Từ lâu rong biển đã được
coi là đối tượng nghiên cứu của nhiều nước trên thế giới [10], [69]. Các ngành rong biển
được chú ý và đã đưa vào sản xuất công nghiệp và đời sống gồm: ngành rong đỏ, ngành
rong nâu, rong lục. Sản lượng lớn rong nâu được dùng sản xuất acid alginic và alginat
và quan trọng hơn là ngành rong đỏ được dùng để sản xuất agar và carrageenan.
Một số loài rong đỏ có hàm lượng cao về agar, carrageenan, furcellaran. Theo tài
liệu FAO, nhóm rong cho agar thuộc ngành rong Đỏ bao gồm các loại như: Gelidium,
Gracilaria và Acanthopeltis. Rong biển phân bố ở các vùng nước mặn, nước lợ, cửa
sông, vùng triền sâu, vùng biển cạn... Ở nước ta có một số vùng chuyên canh trồng rong
câu chỉ vàng, thuộc ngành rong Đỏ, như: Phá Tam Giang (Lăng Cô - Thừa Thiên Huế);
Đầm Thị Nại (Bình Định); Đầm Ô Loan (Phú Yên) [11], [26].
Rong biển nước ta có sản lượng lớn là rong mơ Sargasum có thành phần acid
alginic với chất dinh dưỡng cao chưa được khai thác và sử dụng, rong sụn cũng đang
được trồng và chế biến thành carrageenan. Đặc biệt là rong câu Gracilaria là loài có giá
trị kinh tế cao. Theo báo cáo điều tra khảo sát của chuyên gia tư vấn thuộc chương trình
hỗ trợ phát triển nuôi trồng thuỷ sản nước lợ SUMA, sản lượng thu hoạch rong câu
gracilaria ở nước ta mỗi năm khoảng 5000 tấn khô, còn theo con số ước tính của tổ chức
FAO thì sản lượng này là khoảng 7000 tấn. Rong câu phân bố chủ yếu ở các địa phương
như Hải Phòng, Nam Hà, Thái Bình,Thanh Hoá và Thừa Thiên Huế [26], [30], [99].
Sản lượng agar trung bình hàng năm của toàn thế giới là 7.000 – 10.000 tấn/năm.
Nam Triều Tiên cung cấp nguyên liệu sản xuất agar chiếm 40% tổng sản lượng toàn thế
giới. Sản lượng agar sản xuất tại các nước như sau: châu Á: 50% (chủ yếu là Nhật Bản
4
và Hàn Quốc); châu Âu: 30% (Pháp, Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha); châu Mỹ: 15% (Mỹ,
Achentina, Brazil, Chilê); châu Phi: 5% (Marốc) [11], [99].
Công nghệ sản xuất agar ở Việt Nam bắt đầu hình thành năm 1960, nhưng lúc đó
tốc độ phát triển chậm do hạn chế bởi kiến thức, công nghệ thiết bị và thị trường. Năm
1983 dưới sự giúp đỡ của cộng hoà dân chủ Đức, một xưởng pilot agar công suất 50
tấn/năm đựợc lắp ráp tại Nhà máy cá hộp Hạ Long nhưng khi vận hành, quy trình công
nghệ gặp nhiều khó khăn và công suất chỉ đạt 20 tấn/năm. Sau này công ty đồ hộp Hạ
Long đã thay đổi quy trình sản xuất và sử dụng từng phần thiết bị để sản xuất theo hướng
thủ công đạt công suất khoảng 50 tấn/năm. Từ 1986 đến 1990, Viện Nghiên cứu Hải sản
kết hợp với Viện Nghiên cứu nghề cá và hải dương học Thái Bình Dương Liên Xô
(TINRO) tiến hành nghiên cứu kỹ thuật trồng rong câu năng suất cao và cải tiến công
nghệ sản xuất agar cùng như áp dụng phương pháp ép tách nước gel agar bằng công
nghệ ép 2 bước: ép sơ bộ bằng trọng vật và ép lần cuối bằng máy ép vít. Đây là giai đoạn
phát triển mạnh của nghề sản xuất agar ở Việt Nam do nhu cầu đầu ra của nguyên liệu
và sản phẩm đều rất lớn; vùng Viễn đông Liên Xô nhập một lượng lớn rong câu khô từ
Hải Phòng với giá 600 USD/tấn, và khoảng 100 tấn agar bột đựợc tiêu thụ tại các tỉnh
phía Nam nước ta [11], [15], [26].
Trong giai đoạn từ 1985 – 1995 nghề sản xuất agar đã có bước phát triển rất lớn.
Hải Phòng là nơi tập trung các xưởng sản xuất agar, tính chung các quy mô khác nhau
có khoảng 40 xưởng với tổng sản lượng agar ước tính sản xuất đạt 500 tấn/năm với
tổng doanh thu khoảng 70 tỷ đồng và giải quyết công ăn việc làm cho hàng nghìn lao
động. Riêng xưởng agar của Công ty Đồ hộp Hạ Long có thể sản xuất thường xuyên với
công suất 50 tấn/năm, một số xưởng sản xuất agar được tư nhân đầu tư sản xuất với
công suất trung bình 10 tấn/năm [30].
1.1.2. Các quy trình sản xuất agar
Qua khảo sát tình hình sản xuất của một số cơ sở chế biến agar nhận thấy quy mô
công nghệ sản xuất agar rất đa dạng từ quy mô thủ công hộ gia đình có công suất từ 10
– 30kg/ngày đến quy mô bán thủ công có công suất là 100 – 300 kg/ngày [26], [30],
[73].
Quy trình sản xuất agar theo quy mô hộ gia đình: đây là quy mô sản xuất nhỏ,
vốn đầu tư nhỏ, thiết bị ít, lao động thủ công, công xuất từ 10 – 30 kg/ngày, Sản phẩm
5
agar chủ yếu là dạng sợi bán cho cơ sở thu mua trong miền Nam, và bán lẻ cho các cơ
sở sản xuất bánh kẹo. Chất lượng sản phẩm không cao, giá rẻ chủ yếu là tiêu thụ nội
địa [26], [30].
Quy trình công nghệ sản xuất agar theo quy mô thủ công: quy mô sản xuất này
phổ biến ở các cơ sở ở các tỉnh miền Trung như Huế, Nha Trang. Công suất chỉ khoảng
5 – 10 kg SP/ngày. Quy mô nhỏ làm theo mùa vụ chủ yếu là bán lẻ cho các cơ sản sản
xuất mứt, bánh kẹo, đông sương ở tỉnh. [26], [30].
Quy trình công nghệ sản xuất agar theo quy mô bán cơ giới: Đây là quy mô sản
xuất bán cơ giới, đầu tư nhiều thiết bị máy móc, công xuất 100 – 250 kg SP/ngày, tập
trung ỏ Hải Phòng như Công ty cổ phần đồ hộp Hạ Long, Công ty TNHH Hải Long,
Công ty cổ phần thương mại Duy Mai, Công ty TNHH Hải Đông, Công ty TNHH
TM&SX Hoàng Yến,……Chất lượng sản phẩm agar theo quy mô sản xuất này sức đông
cao, màu sáng trắng, chất lượng ổn định tiêu thụ trong nước và xuất khẩu sang thị trường
Hàn Quốc, Italia, Trung Quốc... giá thành sản phẩm khoảng 10 -12 USD/1kg SP. Nguồn
rong câu để sản xuất agar là do các cơ sở thu mua từ các vùng ven biển Việt Nam và
rong nhập khẩu từ Trung Quốc do đó tỷ lệ phế thải bã rong phụ thuộc rất nhiều vào lọai
rong và chất lượng rong. Rong câu chỉ vàng ở vùng Đình Vũ, Cát Hải - Hải Phòng và
rong ở Phá Tam Giang, Lăng Cô - Huế thì có hàm lượng agar cao và tỷ lệ bã thải thấp
khoảng 6,75T – 7T/ 1 T sản phẩm, nhưng nhiều loại rong ở Thái Bình và Nam Định,…
thì chất lượng rong kém hàm lượng agar thấp, tỷ lệ phế thải khoảng 9 – 14 T/1 T sản
phẩm [11], [15], [26].
6
Sơ đồ 1.1. Quy trình công nghệ sản xuất agar theo quy mô bán cơ giới
Thuyết minh sơ đồ quy trình
+ Nguyên liệu: rong câu chỉ vàng Gracilaria verrucosa được thu mua ở dạng khô
ở các khu vực thuộc vùng ven biển Việt Nam.
+ Xử lý kiềm: rong câu khô được xử lý trong dung dịch NaOH, nồng độ 24 g/l
0,5 g/l. Tỷ lệ dung dịch/ rong là 20/1, nhiệt độ xử lý ở 80 – 95 oC, thời gian xử lý kể từ
khi dung dịch NaOH sôi là 50 phút. Trong quy trình xử lý cần có chế độ khuấy đảo và
lưu chuyển dịch NaOH trong nồi.
Bã
rong
Nấu chiết
Xử lý axit
Xử lý kiềm
Làm nguội cắt sợi
Ép tách nước
Sấy khô, Nghiền bột
Lọc trong có trợ lọc
Tẩy màu
Lọc trong lần 1
Bao gói Bảo quản
Nguyên liệu
7
+ Rửa trung tính: rửa sạch nước đến khi nước rửa trong và có pH = 7, sau đó để
ráo. Rửa bằng máy rửa khuấy đảo trục.
+ Tẩy màu: tẩy rong bằng dung dịch Giaven 5% tỷ lệ dung dịch/rong = 10/1
+ Xử lý axit: ngâm rong trong dung dịch axit citric có nồng độ 0,3 g/l vào khuấy
đảo đều, thời gian 15 phút. Lượng axit sử dụng phụ thuộc vào màu sắc cung như độ
cứng của cây rong. Sau khi ngâm, rửa kỹ rong đến khi nước trong.
+ Nấu chiết: đun sôi nước và thả rong câu đã xử lý ở trên vào, lượng nước dùng
được tính theo công thức [10]:
Trong đó:
N: Lượng nước nấu (lit)
A: Hàm lượng Agar trong nguyên liệu (%)
D: Sức đông của Agar (g/cm3)
R: Khối lượng rong khô cho một mẻ nấu (kg)
C: Hệ số phụ thuộc sức đông
Theo kinh nghiệm của các nhà sản xuất tỷ lệ nước cho vào nấu rong là nước/rong
sạch = 5/1.
+ Lọc trong lần 1: Lọc dịch nấu chiết bằng máy ép lọc khung bản để lọc dịch và
loại bỏ bã rong. Nhiệt độ dịch lọc khoảng 80 – 900C. Sau đó, rót dịch lọc được bơm vào
bể lọc 2
+ Lọc lần 2: Bể lọc 2 có bổ sung chất trợ lọc có tác dụng hấp thụ màu. Dịch lọc
trong được rót vào các khay tôn và để nguội tự nhiên.
+ Cắt sợi: cắt sợi thạch bằng máy cắt hoặc ống cắt thủ công theo kích thước 5x5x30
cm, sau đó cho sợi thạch vào các túi vải .
+ Ép tách nước: xếp các túi thạch dưới máy ép thủy lực, ép loại bỏ nước.
+ Sấy khô: Tấm agar sau khi loại bỏ nước có độ ẩm là khoảng 30%, tiếp tục sấy
khô đến 12 – 15%.
100.
..
C
RDAN
8
+ Nghiền bột agar: Máy nghiền có đường kính mắt lưới là 1 3 mm (tùy theo
đơn đặt hàng).
+ Đóng bao: bột agar đựng trong bao polyetylen có hai lớp với kích thước trong
của túi là 270 300 mm, khối lượng tịnh của mỗi túi là 500 15g. Sau đó, được đóng
trong bao bì carton có giấy lót chống ẩm. Trên bao bì phải có đầy đủ các thông tin như:
tên xí nghiệp sản xuất, agar, loại, ngày sản xuất, khối lượng tịnh,....
1.1.3. Thành phần cơ bản của bã thải agar
Thành phần và hàm lượng các chất trong bã thải agar phụ thuộc vào quy trình
công nghệ sản xuất agar, nhưng nhìn chung chứa 15 -20% là chất khô, độ ẩm khoảng
75- 80%. Thành phần chất khô có trong bã rong bao gồm khoảng 40-50% hợp chất hữu
cơ, chủ yếu là cellulose (xơ sợi), chất dinh dưỡng, protein 4 – 5 % và 50-60% hợp chất
vô cơ, trong đó, có khoảng 55% muối vô cơ không tan trong nước và nhiều nguyên tố
vi lượng [11].
Thành phần chính của chất thải là bã rong chứa cellulose, protein và khoáng.
Cellulose là polyme mạch thẳng của hàng ngàn cấu tử glucose đuợc nối với nhau bằng
liên kết -1,4 glucosid, tạo thành dạng sợi. Cấu trúc bậc 2,3 của cellulose rất phức tạp:
dạng lớp được gắn kết bằng các liên kết hydro, lực liên kết hydro được trùng hợp nhiều
lớn nhưng rất bền vững do đó cellulose không tan và khó phân giải. Hệ enzym phân giải
cellulose bao gồm: cellobiohydrolase có tác dụng cắt đứt liên kết hydrô làm biến dạng
cellulose tự nhiên, phân giải vùng kết tinh dạng cấu trúc vô định hình. Endoglucanase
có khả năng cắt đứt các liên kết 1-4 glucozit bên trong phân tử tạo thành những chuỗi
dài. Endoglucanase tiến hành phân giải các chuỗi dài trên thành các disacarit gọi là
cellobiose – gluconase tiến hành thuỷ phân cellobiose thành glucoza [11], [26], [99].
Theo các nhà sinh học, phần lớn lượng protein của rong tồn tại ở dạng hợp chất
với gluxit.Các phân tử glucoprotein rất bền vững dưới tác dụng phân giải của enzym
protease. Do đó để sử dụng protein của rong phục vụ mục đích sản xuất thức ăn chăn
nuôi cần phá huỷ các liên kết của các nhóm ngoại gluxit với phân tử protein trong phức
hợp glucoprotein thì enzym protease trong động vật mới có thể phân giải dễ dàng protein
trong rong biển [11].
9
Chất thải rắn sinh ra từ quá trình sản xuất Agar rất lớn, trung bình khoảng 9 ÷ 10
tấn phế thải/1TSP, thành phần chính của chất thải này là bã rong (xellulose). Nhưng do
nguồn nguyên liệu ở các vùng khác nhau, do điều kiện khí hậu ảnh hưởng đến chất lượng
rong câu chỉ vàng nên cũng ảnh hưởng đến thành phần bã rong.
Trước năm 1990 thì diện tích trồng rong câu rất lớn nhưng những năm gần đây do
tính kinh tế sản xuất trên 1 đơn vị diện tích nước nên nông dân đã chuyển hết sang nuôi
tôm cá, các đầm nuôi lớn ở Phú Yên, Bình Thuận, Bình Định,… đã chuyển sang trồng
các lọại rong kinh tế như rong sụn, rong nho, nên nguyên liệu rong câu chủ yếu là thu
gom từ môi trường tự nhiên, và một số được nông dân nuôi xen kẽ tôm cá để cải tạo
môi trường nên sản lượng không cao.
1.1.4. Các phương pháp xử lý bã thải agar
a, Trên thế giới
Trên thế giới hiện nay người ta đã tiến hành thử nghiệm thành công nhiều phương
pháp tận dụng phế liệu rong biển theo phương pháp thuỷ phân trong môi trường bazơ
hay axit, bao gồm [11]:
- Phương pháp Bioca: ngâm bã rong trong dung dịch Ca(OH)2 0,05 N hay trong
dung dịch axit mạnh như H2SO4 1N, thì tất cả protein của rong sẽ bị thuỷ phân thành
axit amin và peptit dễ tiêu hoá. Sau đó trung hoà sản phẩm bằng axit hay kiềm thì sẽ thu
được chế phẩm có giá trị chăn nuôi cao. Ví dụ sản phẩm chăn nuôi sản xuất theo phương
pháp Iodua, trong dung dịch axit chứa 50 – 60% axit amin, trong đó có 4,7% axit amin
không thay thế (Lyzin) và các peptit dễ tiêu hoá cũng như các chất vô cơ khác kể cả Iot.
Chế phẩm này đã được thử nghiệm sinh học.Có thể thay thế 20 – 30% lượng protein
trong khẩu phần ăn. Nếu trộn vào thức ăn nuôi cá thì cá chóng lớn và tăng sức chịu đựng
của cơ thể [11], [26].
- Phương pháp Jimca: dùng để sản xuất sản phẩm chăn nuôi bằng phương pháp
thuỷ phân bã rong trong môi trường axit. Xử lý sơ bộ bã rong trong dung dịch axit HCl
1,5% trong 2 giờ, ở nhiệt độ 200C. Thuỷ phân nguyên liệu bằng dung dịch axit HCl
trong 2 giờ ở nhiệt độ 200C. Sau đó trung hoà sản phẩm bằng CaO khô đến pH = 5,5 –
5,6, lọc sản phẩm loại bỏ tạp chất rồi cô đặc chế phẩm. Chế phẩm dùng cho chăn nuôi
10
là dịch lỏng màu nâu chứa khoảng 30% chất khô, chứa 7 loại axit amin không thay thế,
chế phẩm này được dùng như chất phụ gia với cám chăn nuôi [11], [26].
Ngoài ra các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học công nghiệp Thực phẩm
Odeca cho thấy hydratcacbon của rong biển dễ dàng phân giải dưới tác dụng của axit do
đó các chế phẩm thuỷ phân tạo thành có thể sử dụng như các chất nền trong công nghiệp
sản xuất men chăn nuôi. Men chăn nuôi chứa 46% protein thô và nhiều loại enzym tiêu
hoá có giá trị chăn nuôi cao [11].
b, Trong nước
Đặc thù của công nghệ sản xuất Agar nước ta là lượng phế thải hữu cơ tương đối
cao khoảng 6 tấn phế thải/1 tấn sản phẩm. Qua các tài liệu và khảo sát hiện trạng xử lý
các chất thải tại các cơ sở sản xuất agar cho thấy, việc xử lý bã thải agar ít được quan
tâm. Đặc biệt là bã rong có chứa một lượng nước cao, chất hữu cơ dễ phân hủy, gây mùi
chua thối độc hại cho con người. Các bã thải này đa số là được xử lý bằng cách đào hố
chôn vùi hoặc ủ làm phân bón cho cây trồng gây ra mùi hôi thối, ô nhiễm môi trường
khu vực sản xuất và dân cư. Trong thực tế thường có 4 biện pháp xử lý [15], [26] sau:
+ Biện pháp chôn lấp: đây là biện pháp mang tính cổ điển, thủ công, đơn giản
nhưng đòi hỏi cần nhiều diện tích đất, tốn nhiều sức lao động, thời gian xử lý lâu, sinh
mùi hôi thối và khí độc, vì vậy, gây ô nhiễm môi trường không khí, môi trường đất và
nguồn nước ngầm.
+ Biện pháp đốt: bã rong rải ra phơi mưa nắng nhiều ngày rồi đem đốt, phương
pháp này gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng, gây hiệu ứng nhà kính và gây ra một
số căn bệnh về đường hô hấp.
+ Đổ ra sông hồ: bã rong tập trung lại vài ngày và thuê xe chở đổ đi, vì vậy, làm
tăng chi phí vận chuyển, gây ô nhiễm môi trường nếu vận chuyển không đúng cách, tăng
chi phí xử lý phế thải của thành phố.
+ Biện pháp sinh học: trộn với một số chất khác, ủ lại làm phân bón cho cây trồng.
Đây là biện pháp tối ưu nhất hiện nay, vừa tránh gây ô nhiễm môi trường vừa tận dụng
làm phân bón [13], [14].
11
1.2. Tổng quan về Cellulase
Cellulose là hợp chất hữu cơ chiếm tỷ lệ cao nhất trong tự nhiên, là thành phần cơ
bản cấu tạo nên thành tế bào thực vật. Năm 1838, Anselin Payen là người đầu tiên tìm
ra cellulose trong sợi bông (chiếm 98%), sau đó những nghiên cứu khác cũng cho thấy
cellulose có hàm lượng rất cao trong thực vật như ở sợi lanh (80%), gỗ (40-50%) và
50% còn lại là phức hợp polysaccharid [6], [12], [14], [42], [144].
Hình 1.1. Cấu trúc cellulose và mạng lưới liên kết hydrogen
Cellulose là một polymer mạch thẳng không cuộn xoắn, được tạo nên từ các đơn
vị là D-glucose thông qua liên kết β-1,4-glucosid. Mức độ polymer hóa được đánh giá
dựa vào số phân tử glucose trong chuỗi. Đối với cellulose tự nhiên, con số này khoảng
10.000-14.000 và trọng lượng phân tử của cả chuỗi là 1,5 x 106 Da, dài 5 mm [11], [69].
Các phân tử glucose trong chuỗi polymer có dạng ghế bành, phân tử này quay 180o so
với phân tử kia. Các nhóm β-OH glycoside đều nằm trên mặt phẳng ngang của các phân
tử glucose [99].
Liên kết β-1,4 glucoside giữa các phân tử đường trong chuỗi cellulose đóng một
vai trò quan trọng trong việc tạo nên những đặc tính riêng của cellulose và cả vi sợi.
Nhờ liên kết này mà chuỗi cellulose trở nên mở rộng, ít linh động hơn so với cấu trúc
amylose của tinh bột, điều này cần cho các chuỗi cellulose để chúng có thể kết hợp với
nhau và tạo thành cấu trúc dạng sợi. Mặt khác sự tương tác qua lại giữa các gốc đường
của hai chuỗi cellulose nằm cạnh nhau cho phép tạo nên liên kết hydrogen giữa các
12
chuỗi. Thực tế, các nhóm -OH ở các vị trí C2, C3, C6 và nhóm O-hemiacetal trong phân
tử glucose đều có thể tạo liên kết hydro với các gốc đường bên cạnh trong cùng chuỗi
cellulose hoặc chuỗi cellulose khác. Chính mạng lưới liên kết hydro mở rộng và liên kết
β-1,4 glucoside đã làm cho cấu trúc cellulose trở nên bền vững, chặt chẽ có thể tồn tại
trong các dung dịch kiềm và axit đậm đặc [67].
Bằng phương pháp phân tích sử dụng tia rơnghen, người ta đã tìm ra cấu trúc của
cellulose trong tế bào thực vật có dạng sợi. Đơn vị nhỏ nhất của cellulose có đường kính
vào khoảng 3 nm. Các sợi sơ cấp hợp lại thành vi sợi hay còn gọi là mixen. Mỗi vi sợi
thường có khoảng 60 phân tử cellulose, có đường kính từ 10 - 40 nm, dài 100-40.000
nm [11], [20], [74], [89], [143].
Hình 1.2. Sự sắp xếp các chuỗi cellulose trong thành tế bào thực vật
Cellulose có cấu trúc không đồng nhất gồm hai vùng:
- Vùng kết tinh có trật tự cao.
- Vùng vô định hình có cấu trúc không chặt chẽ, các mạch tập hợp với nhau nhờ
lực Van der Waals, dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài. Khi gặp nước, chúng có thể
hấp thu nước và trương phồng lên, nhờ vậy enzym cellulase rất dễ tác động. Trong khi
đó ở vùng kết tinh, các mạch cellulose liên kết với nhau theo một trật tự đều đặn nhờ
liên kết hydro nối nhóm –OH thứ nhất của mạch này với nhóm –OH ở C3 của mạch khác
nên đã ngăn cản được sự trương này. Nhờ đó mà enzym cũng như nhiều phân tử khác
khó có thể xâm nhập vào được bên trong phân tử cellulose để phân hủy [2], [32], [33].
13
Cellulose là một hợp chất có cấu trúc và các đặc tính lý hóa vô cùng phức tạp chỉ
bị phân hủy khi đun nóng với kiềm hoặc axit. Tuy nhiên nó có thể bị thủy phân dưới tác
dụng của cellulase của các vi sinh vật ở điều kiện bình thường [32].
1.3. Enzym Cellulase
1.3.1. Định nghĩa và phân loại
* Định nghĩa
Cellulase là hệ enzym xúc tác cho quá trình chuyển hóa cellulose thành sản phẩm
hòa tan. Phức hệ enzym cellulase là enzym khá phức tạp. Một mặt chúng như enzym
cảm ứng (mà ở đây cellulose lại là chất cảm ứng không chặt chẽ). Một mặt chúng lại
chịu tác động bởi cơ chế điều khiển bởi sản phẩm cuối và chịu sự kiểm soát bởi cơ chế
dị hóa [12], [28], [89].
Cellulose là một loại phân tử polyme với các tiểu phần là D – glucose. Các gốc D
– glucose được nối với nhau qua liên kết 1,4- ß-D-glycosid. Hệ thống enzym thủy phân
cellulose bao gồm ít nhất 3 enzym khác nhau: endoglucanase (1,4-ß-D-glucan-4-
glucanohydrolase, EC.3.2.1.4), exoglucanase (1,4-ß-D glucan-cellobiohydrolase,
EC.3.2.1.91) và ß-glucosidase (ß-D-glucosid glucohydrolase, EC.3.2.1.21). Các enzym
này có tính đặc hiệu khác nhau và hoạt động hỗ trợ nhau. Đầu tiên, endoglucanase phá
vỡ liên kết 1,4-ß-D-glucoside trong phân tử cellulose, sau đó exoglucanase tiếp tục thủy
phân cellulose thành các phân tử cellobiose và sau cùng ß-glucosidase phân cắt
cellobiose thành glucose [74].
* Phân loại [12], [133]
Theo phân loại của Hội sinh học phân tử và sinh hóa quốc tế IUBMB, hệ thống
thủy phân cellulose gồm có enzym: endoglucanase có ký hiệu EC 3.2.1.4, exoglucanase
ký hiệu EC 3.2.1.91 và ß-glucansidase có ký hiệu EC 3.2.1.21
Endoglucanase EC 3.2.1.4, enzym CMCase hay Cx
Tên thường gọi: cellulase
Tên hệ thống: 1,4-(1,3:1,4)-ß-D-glucan-4-glucannohydrolase
Đôi khi người ta cũng có thể gọi enzym này bằng tên khác: endo-1,4-ß-D-
glucanase; ß-1,4-glucanase; cellulase A; endoglucanase; alkali cellulase; cellulase A3;
celludetrinase…
14
Enzym này thường thủy phân các liên kết 1,4-ß-D- glycoside trong cellulose và
các ß-D-glucan của ngũ cốc.
Exoglucanase –EC 3.2.1.91,Tên thường gọi: cellulose 1,4-ß-cellobiosidase
Tên hệ thống: 1,4,ß-D-glucan cellobiohydrolase
Các tên khác: exo-cellobiohydrolase; exoglucanase; CBHI; cellulase C1; exo-ß-
1,4-glucan cellobiohydrolase…
Enzym này có tác dụng thủy phân các liên kết 1,4-ß-D-glycosid, giải phóng
cellobiose từ đầu không khử.
ß -glucosidase-EC 3.2.1.21
Tên thường gọi: ß-glucosidase
Tên hệ thống: ß-D-glucosid glucohydrolase
Các tên khác: cellobiase; ß-glucosid glucohydrolase; ß-1,6-glucosidase;
salicilinase; arbutinase…
Enzym này thủy phân các gốc ß-D-glucosid.Một số trường hợp cũng thủy phân ß-
D-galactosidase, ß-D-fucoside; ß-D-xyloside; a-L-arabinoside.
1.3.2. Tính chất
* Tính đặc hiệu
Tính đặc hiệu cùa enzym thể hiện ở chỗ mỗi enzym chỉ tác dụng lên một cơ chất
nhất định. Cellulase thủy phân các liên kết 1,4-ß-D-glucosid trong phân tử cellulose và
các ß- D- glucan của ngũ cốc còn exoglucanase tác động lên các đầu chuỗi mới tạo
thành để sản xuất chủ yếu là cellobiose, ß-glucosidase thủy phân các gốc ß-D-glucose
tạo nên phân tử D-glucose … [2], [20], [21].
* Đặc tính vật lý và hóa học
Theo nghiên cứu, hầu hết các cellulose có pH tối ưu, tính hòa tan và thành phần
acid amin giống nhau. Độ bền và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau.
- Nhiệt độ tối ưu: 40 – 50oC
- pH tối ưu: thường ở giữa 4 – 5
15
* Các chất ức chế
Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm của nó như glucose, cellobiose.Thủy ngân ức chế
cellulase hoàn toàn, trong khi các ion khác như Mn, Ag, Zn chỉ ức chế nhẹ.
1.3.3. Cơ chế thủy phân cellulose
Từ những nghiên cứu riêng rẽ từng loại enzym đến nghiên cứu tác động hiệp đồng
của cả ba loại enzym cellulase, nhiều tác giả đều đưa ra kết luận chung là các loại enzym
cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là
glucose. Tuy nhiên, hiện nay trật tự phản ứng của các enzym vẫn chưa có sự thống nhất
và có nhiều tác giả đã trình bày cơ chế tác động của cellulase theo nhiều cách khác nhau.
Có thể tóm tắt cơ chế của một số tác giả như sau [12], [20], [51], [69].
* Cơ chế của Reese (1950)
Reese là người đầu tiên đề xuất cơ chế thủy phân cellulose hòa tan bởi enzym Cx
và C1. Theo Reese thì enzym C1 là yếu tố tiền thủy phân, nó chỉ có tác dụng làm trương
nở cellulose tự nhiên tạo thành cellulose hoạt động có mạch ngắn hơn. Sau đó, enzym
Cx sẽ tiếp tục phân cắt các chuỗi này tạo thành các đường tan và cuối cùng tạo thành
glucose [12], [65].
* Cơ chế của Erickson (1979)
Erickson và các cộng tác viên đã đưa ra cơ chế tác dụng hiệp đồng của ba enzym
là exoglucanase, endoglucanase và β -glucosidase. Đầu tiên, những vùng có mức độ kết
tinh thấp trong sợi cellulose bị các endoglucanase tấn công tạo các đầu tự do. Tiếp đó
enzym exoglucanase sẽ bắt đầu phân cắt từ các đầu tự do để tạo thành các cellobiose,
cellooligosaccharide và glucose. Enzym β-glucosidase sẽ thủy phân tiếp và cuối cùng
tạo thành đường glucose [13], [33].
* Cơ chế cải tiến của Reese (1980)
Năm 1980, dựa vào quan niệm của Erickson, Reese và các cộng sự của ông đã đưa
ra cơ chế phản ứng mới cho phức hệ enzym cellulase. Đầu tiên, C1 tác dụng lên cellulose
kết tinh phá vỡ các liên kết đồng hóa trị và tạo ra cellulose biến tính hay cellulose trương
nở. Sau đó endoglucanase tác dụng lên đầu chuỗi và giải phóng các cellobiose. Tiếp đó
dưới tác dụng của ba enzym: endoglucanase, cellobiohydrolase và β-1,4-glucosidase,
cellulose sẽ bị phân giải hoàn toàn và tạo thành glucose [65], [66], [68]; [106], [107].
16
Cellulose kết tinh
Enzym cellulase C1
Endoglucanase Cx
Cellulose vô định hình Oligomer
Exoglucanase Các oligomer chuỗi ngắn
Cellobiose
β-1,4 glucosidase
Glucose
Sơ đồ 1.2 Cơ chế chuyển hóa cellulose
1.3.4. Cơ chế tác dụng của cellulase
Trong thiên nhiên, thủy phân cellulose có sự tham gia của tất cả ba loại enzym
cellulase như endoglucanase (Cx), exoglucanase (C1) và β–glucosidase. Một trong ba
loại enzym trên không thể tự thủy phân đến cùng phân tử cellulose.
Các loài vi sinh vật chỉ có khả năng sinh tổng hợp một loại enzym trong hệ enzym
cellulase. Hoạt tính enzym này thường mạnh hơn các enzym còn lại. Chính vì thế, trong
điều kiện tự nhiên, một loài vi sinh vật không thể tham gia thủy phân triệt để cellulose
được.
Từ những nghiên cứu riêng lẽ từng loại enzym đến nghiên cứu tác động tổng hợp
của cả 3 loại enzym cellulase, nhiều tác giả đều đưa ra kết luận chung là các loại enzym
cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là
glucose. Có nhiều cách trình bày khác nhau, nhưng cách trình bày cơ chế tác động của
cellulase do Erikson đưa ra được nhiều người công nhận hơn cả [33], [108].
Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên
thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát
triển rất mạnh, có loài lại phát triển yếu. Chính vì vậy, việc phân hủy cellulose trong tự
nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm [146].
17
Hình 1.3. Cơ chế tác động của enzym cellulase
Cơ chế cắt mạch:
Hình 1.4. Cơ chế thủy phân cellulose
18
Trong điều kiện phòng thí nghiệm hay điều kiện công nghiệp, việc phân hủy
cellulose bằng enzym, ngoài các yếu tố kỹ thuật như nhiệt độ, nồng độ cơ chất, lượng
enzym…, một yếu tố quan trọng cần phải được quan tâm, đó là tính đồng bộ của hệ
enzym cellulase từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau. Quá trình thủy phân cellulase chỉ
có thể được tiến hành đến sản phẩm cuối cùng khi sử dụng đồng bộ 3 loại enzym
cellulase trong hệ enzym cellulase. Mỗi loài vi sinh vật chỉ có khả năng sinh tổng hợp
ưu việt một loại enzym. Chính vì thế ta phải khai thác enzym cellulase từ nhiều nguồn
vi sinh vật [2].
1.4. Vi sinh vật tổng hợp Cellulase
1.4.1. Giới thiệu chung về các nhóm vi sinh vật tổng hợp cellulase
Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi vi sinh vật cả trong điều kiện
hiếu khí và kị khí. Các loài vi sinh vật thay phiên nhau phân hủy cellulose đến sản phẩm
cuối cùng là glucose. Tuy nhiên, trong thiên nhiên không có một vi sinh vật nào có khả
năng cùng một lúc sinh tổng hợp tất cả các loại enzym có trong phức hệ enzym cellulase.
Các loại này có khả năng sinh tổng hợp mạnh loại enzym này, loài khác lại tổng hợp
mạnh loại enzym khác. Chính vì thế, sự phân giải cellulose trong điều kiện tự nhiên
thường rất chậm và không triệt để [25].
Số lượng các loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzym cellulase có trong điều
kiện tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong một số
trường hợp, các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia qúa trình phân giải
này [2], [3], [20], [23], [24], [27], [69].
Nhiều nhóm nghiên cứu khác nhau đã tiến hành tìm kiếm và phân loại các chủng
vi sinh vật tham gia trong qúa trình phân hủy sinh học cellulose. Kết qủa có rất nhiều
chủng vi sinh vật được tìm thấy, trong đó các vi sinh vật dị dưỡng là chủ yếu [24], [25],
[29], [67], [91], [122].
19
Bảng 1.1. Vi sinh vật phân hủy lignocellulose
Xạ khuẩn Nấm Vi khuẩn
ctinomyces cellulose
A. Diastaticus
A. Roseus
A.thermofucus
A.roseus
Adiasstatic
Micromonospora vulgaris
Streptomyces rectus
S. thermofuscus
S. thermonitrificans
S. thermoviolaceus
S. thermovulgaris
S. violaceus-aurriu
S. diastaticus
T. vulgaris
Thermomonospora curvata
Aspergillus niger
A. oryzae
A. terreus
A. syndovii
A. flarus
Pen. notatum
Cephalosporium
Mucor pusilus
Neurospora
Trichoderman reseii
T. viridae
T. lignorum
T. hazianum
Aabasii diomycetes
Fusarium culmorum
Chrysoporium ligaorum
Pseudomonas fluorescens
B. amylogenas
B. flavefacicus
B. megaterium
B. mensenteroides
B. ruminicola
Clotridium sp
Acetobacter xylinum
Vi khuẩn dạ cỏ
Ruminococcus albus
Ruminobacter parum
Bacteroides
Amylophillus sp
C. butyricum
C. locheheadii
Cellulosemonas
20
Bảng 1.2. Các vi khuẩn có hoạt tính cellulase riêng cao nhất (µmol/phút/mg)
Enzyme Chủng Cơ chất Hoạt
tính
Nhiệt
độ tối
ưu
(oC)
pH
tối
ưu
mannan endo-1,4-
β-mannosidase
Bacillus
subtilis
Galactoglucomannan/
glucomannans/mannans
514
50-60 5-7
cellulase Clostridium
thermocellum
Avicel/carboxymethylce
llulose/
cellulosecellopentaose/
cellotetraose/cellotriose
428 75 7
1,3-β-glucan
glucohydrolase
Streptomyces
murinus Laminarin 6,7 50 6
1,3-1,4-β-D-
glucanglucanohyd
rolase
Bacillus
macerans β-D-glucan/ lichenan 5030 60- 65 6
1,3-β-D-glucan
glucanohydrolase Bacillus sp.
3-O-β-D-Glc-D-Glc-D-
Glc-D-Glc/ laminarin 369,6 60 9
Xạ khuẩn [31], [33],
Nhiều tác giả nghiên cứu về khả năng phân giải cellulase của xạ khuẩn
Streptomyces, Actinomyces… Các tác giả cũng nhấn mạnh rằng trong cùng một loài,
hoạt tính phân giải cellulose của các chủng khác nhau thì sẽ khác nhau [32].
- Loại 1: A. coelicolor, A. sulfureus, A. aureus, A. ellulosae, A. Chromogenes, A.
verne, A. glaucus ...
- Loại 2: A. hydroscoopicus, A. griseoflavus, A. albidus, A. viridans, A. griseolus
...
- Loại 3: A. thermoficus, A. xanthosromus.
- Loại 4: A. flavochromogenes, A. bovis, Act. sampsonii.
21
Vi khuẩn
Vi khuẩn chủ yếu sinh ra endoglucanase và ß- glucisudase, gần như không tạo ra
exoglucanase.
Người ta phân tích thấy rằng có đến 15 – 20 tỷ vi khuẩn/ 1cm3 chất có trong dạ cỏ
ở động vật ăn cỏ (1960 – Gorbacheva), các loài vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose
mạnh trong dạ cỏ:
- Ruminococcus albus (Berger, 1963; Curilov, 1971).
- Ruminococcus flavefaciens
- Ruminobacter parum – Butyviribrio fibrisolvens
- Cillobacterium – cellulosove
Vi khuẩn hiếu khí: Cellulomonas persica sp. (Nov). và Cellulomonas iranensis sp.
Nov (Elberson, 2000).
Vi khuẩn kị khí: Clostridium thermcellum, Clostridium cellulovorans (Murashima,
2002), Clostridium cellulotiticus (Parsiegla, 1998).
Niêm khuẩn (Myxobacteria) gồm các giống:
- Promyxobacterium
- Cytophaga
- Sporangium
- Sporocytophaga
Nấm sợi
Nhiều loại nấm sợi có khả năng sinh ra một lượng lớn cellulase thuộc giống
Alternaria, Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Cladospochung. Một số chủng nấm
mốc đã tổng hợp cellulase có hoạt tính khá cao:
- A. flavus; A. niger; A. oryzae, …
- Chaetomium globosum; C. elatum; C. fumicolum…
- Mucor pusillus
- Penicillium notatum; Pen. variabite; P. pusillum
22
- Trichoderma koningi; Trichoderma vidide…
- Sporotrichum pruinosum.
Trong điều kiện phòng thí nghiệm hay điều kiện công nghiệp, việc phân hủy
cellulose bằng enzym, ngoài các yếu tố kỹ thuật như nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất,
lượng enzym…, một yếu tố quan trọng cần phải được quan tâm, đó là tính đồng bộ của
hệ enzym cellulase từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau. Quá trình thủy phân cellulase
chỉ có thể được tiến hành đến sản phẩm cuối cùng khi sử dụng đồng bộ các loại enzym
cellulase trong hệ enzym cellulase. Mỗi loài vi sinh vật chỉ có khả năng sinh tổng hợp
ưu việt một loại enzym. Chính vì thế ta phải khai thác enzym cellulase từ nhiều nguồn
vi sinh vật.
1.4.2. Một số chủng vi sinh vật được ứng dụng nhiều trong sản xuất cellulase
Nhiều loài nấm sợi có khả năng sinh ra một lượng lớn cellulase thuộc giống
Trichoderma, Aspergillus, Penicillium,…Trong đó Trichoderma và Aspergillus đã được
nhiều nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất cellulase (Bothast & Saha, 1997). Phần lớn
các chế phẩm cellulase thương mại được sản xuất chủ yếu từ các chủng nấm. [63].
Aspergillus niger: [12]
Giống Aspergillus là nhóm nấm sợi bao gồm các loài khác nhau. Một vài loài có
khả năng gây bệnh như A. fumigatus, A. flavus, A. pasiticus. Tuy nhiên, hầu hết các
thành viên của nhóm này có ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, đặc biệt là các loài
nấm đen A. niger, A. turbingensis, A. oryzae. Nhờ khả năng sinh ra loại enzym như
amylase, cellulase, hay protease khi nuôi cấy trên một số môi trường đặc thù. Được ứng
dụng trong sản xuất các chế phẩm sinh học xử lý nước thải.
Chủng Aspergillus đều thuộc nhóm nấm bất toàn (Deuteromycetes hay Fungi
Imperfecti). Aspegillusniger cuống đính bào tử có đầu phình ra. Nhóm nấm bất toàn là
những nấm sinh sản vô tính bằng bào tử bụi mang bởi những giá bào tử có hình dạng
khác nhau xếp thành chuổi (đính bào tử) ở đầu ngọn có cuống bào tử [53].
Nấm Aspergillus còn gọi là mốc tương. Sợi nấm có vách ngăn, cuống mang bào
tử bụi phồng lên ở ngọn. Các chuổi bào tử bụi từ đầu phồng mọc tỏa khắp mọi hướng.
Bào tử bụi có thể màu vàng (Aspergillus flavus), màu đen (Aspergillus niger).
23
Aspergillus niger tiết ra nhiều endo-β-glucanase (Cx), β-glucosidae và rất thấp exo- β-
glucanase (C1) [76], [97].
Hình 1.5. Hình dạng nấm mốc A. niger
* Nhóm Trichoderma
Nhóm Trichoderma gồm Trichoderma koningii, Trichoderma reesei,
Trichoderma viride đã được nghiên cứu và ứng dụng sản xuất cellulase. Các chủng
Trichoderma tạo ra endo-β-glucanase (Cx), exo-glucanase (C1) nhưng rất ít β-
glucosidae [40], các cellulase từ Trichoderma thường hoạt động ở vùng pH 4-8 [71],
[77], [80], [112], [120], [142].
.
Hình 1.6. Hình dạng nấm Trichoderma viride
24
* Nhóm vi khuẩn [12], [13]
Rất nhiều chủng vi sinh vật chịu nhiệt có hoạt tính cellulase được tìm thấy trong
đống ủ compost. Trong nhóm vi khuẩn, các chủng thuộc chi Baccillus luôn chiếm ưu
thế (87%). Có nhiều chủng đã được phân lập và định tên đến loài bao gồm: Bacillus
amylogenas, B. flavefacicus, B. megaterium, B. mensenteroides, B. ruminicola, B.
pumilus EB3, [46], [47], [51], [61], [72], [79], [81], [82], [83], [87], [111], [116], [118],
[119], [123], [125], [130], [132], [134], [136], [138], [141]. Ngoài ra các chi
Acinetobacter, Pseudomonas, cellulomonas và Clostridium cũng được tìm thấy trong
đống ủ [28], [41], [44], [45], [90], [126], [129], [131]. Trong xử lý rác thải, các chủng
thuộc chi Baccillus vẫn là đối tượng được quan tâm nhiều nhất vì chúng là những chủng
ưa nhiệt và sinh bào tử nên có khả năng tồn tại và sinh trưởng tốt trong các đống ủ
compost có nhiệt độ cao [23], [88], [96], [123], [125].
Hiện nay các chủng vi khuẩn được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng do vi khuẩn
có nhiều ưu việt so với các nhóm nấm vì vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng nhanh và tạo
được nhiều sinh khối hơn. Tốc độ phát triển của nấm thấp hơn do đó giá thành khi sản
xuất chế phẩm sẽ cao hơn. Cellulase do vi khuẩn sinh ra thường là những chất xúc tác
có hiệu quả cao và không bị kìm hãm bởi các chất trung gian trong quá trình thuỷ phân
(kìm hãm ngược). Quan trọng nữa là các vi khuẩn dễ được tái tổ hợp theo công nghệ
gen [12], [13], [43].
1.4.3. Ứng dụng của enzym cellulase vi sinh vật
Các chủng vi sinh vật có hoạt tính cellulase rất có ý nghĩa và có nhiều ứng dụng
rộng rãi trong thực tiễn. Ngoài ứng dụng trong công nghệ xử lý rác thải, enzym cellulase
của các chủng vi sinh vật này còn được sản xuất ở quy mô công nghiệp và được sử dụng
trong nhiều lĩnh vực khác nhau của đời sống [2], [3], [16], [17], [22], [74], [75], [91].
Hiện nay, enzym cellulase được ứng dụng rất rộng rãi trong công nghiệp dệt, công
nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm gia súc. Đặc biệt các chế phẩm cellulase thô được
ứng dụng nhiều trong xử lý ô nhiễm môi trường.
Chế phẩm enzym cellulase tinh khiết được ứng dụng trong kỹ thuật di truyền.
Trong kỹ thuật tạo tế bào trần (protoplast), người ta thường dùng chế phẩm cellulase
tinh khiết để phá vỡ thành tế bào thực vật. Ứng dụng enzym cellulase phá vỡ tế bào thực
vật không làm tổn thương các cơ quan bên trong tế bào, đảm bảo sự nguyên vẹn của các
25
nhân tố di truyền. Do đó phương pháp này đã nhanh chóng thay thế các phương pháp
cơ học và hóa học.
Theo Gascoigne (1960) và Coughlan (1979) enzym cellulase của vi sinh vật được
ứng dụng trong các lĩnh vực sau :
● Chế biến thực phẩm [58], [67],:
- Cải thiện độ tiêu hóa thức ăn.
- Chiết rút các chất gây vị, dầu, dịch ép protein từ rau qủa.
- Cải thiện độ hòa tan của các nguyên liệu trong công nghệ lên men.
- Chế biến thạch từ rau câu.
- Sản xuất thực vật đơn bào.
- Sản xuất etanol, butanol, acetone, glycerol, và một số axít hữu cơ ( axit acetic,
axit citric, axit fumaric...).
● Dược phẩm [105], [127], [140]:
- Chế các chất tự tiêu hóa .
- Loại bỏ các sợi không mong muốn.
● Thức ăn gia súc [10], [16], [17], [27], [34]:
- Cải thiện khả năng tiêu hóa cỏ, rơm làm thức ăn gia súc.
- Sản xuất thức ăn giàu protein.
● Chống ô nhiễm [92], [100], [117]:
- Làm sạch các bãi rác thải thành phố, phân hủy rác thải thành phân bón.
- Xử lý phần trong các bể thải để làm khí đốt.
● Lên men [56], [62], [64], [84], , [114], [128]; [145]:
Cung cấp cơ chất lên men cho việc tổng hợp metan, ethanol, glycerol, axit citric,
axit amin, vitamin, protein đơn bào, các chất kháng sinh và các chất có hoạt tính sinh
học khác.
Một trong những vấn đề đáng quan tâm trong việc sản xuất cellulase thương mại
là giá thành của enzyme thu được. Giá của enzyme chiếm tới 50% chi phí cho quá trình
thuỷ phân cơ chất. Theo nghiên cứu của Walker và Wilson (1991) giá của 1mg cellulose
26
được sản xuất là 55 USD, trong khi đó giá của cellulase là 2665 USD/mg. Tuy nhiên giá
của enzyme đã giảm trong 20 năm qua, nhưng còn rất cao. Do đó đã có rất nhiều nỗ lực
để giảm giá thành của enzyme, có thể tổng kết trong 3 nhóm biện pháp sau: 1. Tuyển
chọn các loài có những enzyme mới; 2. Cải thiện các loài đang được sử dụng và cộng
nghệ sản xuất enzyme; 3. Tìm các nhân tố tối ưu cho quá trình sản xuất và vận hành như
cơ chất, điều kiện nuôi cấy, sử dụng lại enzyme... [48], [55], [57], [66],[70], [88], [104],
[115], 118], [121], [124], [137]
Ngoài ra để tăng hoạt tính của enzyme, người ta đã tìm ra biện pháp tạo ra hỗn
hợp enzyme bằng cách phối hợp một số enzyme riêng biệt (hoặc phân đoạn có hoạt tính)
từ các cơ thể sinh enzyme hoặc các cơ thể tái tổ hợp với nhau. Hỗn hợp này bao gồm
các enzyme tinh khiết từ các cơ thể khác nhau, hoặc là các enzyme thô với một enzyme
tinh khiết, hoặc gồm một enzyme tinh khiết với các vùng gắn cellulose từ một cơ thể
khác, hoặc với các co-factơ khác nhau ... Thêm enzyme cellobiohydrolase 1 (C1) tinh
khiết của Trichoderma reesei vào chế phẩm cellulase thô của Thermonospa fuscađã
làm tăng hoạt tính thuỷ phân giấy lọc (C1) lên gấp 2 lần khi dùng từng enzyme riêng
biệt [71], [80], [112], [120], [142].
Việc nghiên cứu tìm ra được những nhóm vi sinh vật thích hợp cho từng loại cơ
chất để cellulase có khả năng thuỷ phân tốt là một vấn đề không đơn giản. Vì thế việc
nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có hoạt tính cellulase cao để thuỷ phân
bã thải agar cho hiệu quả cao là rất cần thiết.
1.4.4. Môi trường nuôi cấy và nguồn nguyên liệu
Để sản xuất cellulase cần có môi trường nuôi cấy thích hợp, nguồn nguyên liệu
cung cấp là bông thấm nước, giấy lọc, giấy báo, các phụ phẩm chứa cellulase trong nông
nghiệp như bột rơm rạ nghiền nhỏ, cám bã, bột ngô, bột củ cải,.. nguồn cung cấp N là
muối nitrat, muối amon, ..[98], [135].
Một số môi trường thường sử dụng như:
- Môi trường nuôi nấm Tricoderma : KH2PO4: 0,2%; (NH4)2SO4: 0,14%; URE:
0,03%; MgSO4.7H2O: 0,03%; CaCl2: 0,03%; FeSO4.7H2O: 5mg/; MnSO4.H2O: 1,56
mg/l; ZnSO4.7H2O: 1,4 mg/l; CoCl2: 2mg/l; Pepton: 0,1%
- Môi trường nuôi chủng Asp.terreus: KH2PO4:0,1%; NaNO3: 0,3%; MgSO4.H2O:
0,05%; KCl: 0,05%; FeSO4.7H2O:0,01%; Cao bắp: 0,5%; Giấy lọc: 2%
27
- Môi trường khoáng chung cho loại cellulase gồm có: NH4NO3 1 g, K2HPO4 0,5
g, KH2PO4 0,5 g, MgSO4. 7H2O 0,5 g, NaCl 1 g, CaCl2 0,1 g, FeCl3 0,02 g, cao
men 0,05 g, nước cất 1000 ml, pH = 7,0 - 7,2 .
1.4. 5. Phương pháp thu nhận enzym cellulase
Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase thuộc 3 nhóm: nấm sợi, xạ khuẩn
và vi khuẩn. Trong công nghiệp sản xuất enzyme cellulase hiện nay, người ta chủ yếu
nuôi cấy nấm sợi và xạ khuẩn, người ta thường nuôi cấy theo phương pháp bề mặt bằng
môi trường xốp (còn gọi là môi trường bán rắn). Cả xạ khuẩn và nấm sợi đều phát triển
rất tốt trong môi trường xốp có độ ẩm 60-65%, có cơ chất là cellulose [2], [12], [20].
Thành phần môi trường nuôi cấy xạ khuẩn và nấm sợi rất đa dạng, trong đó vừa phải đủ
chất dinh dưỡng, vừa phải có cơ chất là cellulose và phải có độ xốp nhất định để không
khí có thể lưu thông từ bên ngoài môi trường vào bên trong khối môi trường. Cả 2 nhóm
xạ khuẩn và nấm sợi đều là những vi sinh vật hiếu khí nên trong quá trình nuôi thường
xuyên phải được cung cấp oxi.
Điểm khác biệt lớn nhất trong khi nuôi cấy nấm sợi và xạ khuẩn là xạ khuẩn phát
triển trong môi trường kiềm và môi trường axit yếu, còn nấm sợi phát triển trong môi
trường axit. Do đó khi chế tạo môi trường cần lưu ý tạo pH môi trường ban đầu cho xạ
khuẩn từ 6,2 – 7,6; còn pH môi trường ban đầu cho nấm sợi từ 4,5 – 5,5.
Thời gian phát triển và sinh tổng hợp enzyme cellulase của xạ khuẩn và nấm sợi
cũng khác nhau. Xạ khuẩn thường có thời gian phát triển và sinh tổng hợp cellulase dài
hơn nấm sợi thông thường, nấm sợi phát triển từ 36 - 48 giờ đã cho hoạt tính enzyme
cellulase rất cao. Trong khi đó xạ khuần phải mất ít nhất 72 giờ mới tổng hợp cellulase
nhiều [13], [23].
Điểm khác cuối cùng là khả năng chịu nhiệt của 2 nhóm vi sinh vật này, các loài
xạ khuẩn thường chịu nhiệt tốt hơn các loài nấm sợi. Enzyme cellulase của xạ khuẩn
cũng hoạt động ở nhiệt độ cao hơn enzyme cellulase của nấm sợi.
Sau khi nuôi cấy trong điều kiện kỹ thuật tối ưu, người ta thu được chế phẩm
cellulase ở dạng thô. Chế phẩm này chứa nước, sinh khối vi sinh vật, thành phần môi
trường và enzyme.
Công việc tiếp theo là sử dụng những phương pháp hóa, lý tách nước, sinh khối vi
sinh vật sẽ thu được enzyme dạng bán tinh khiết. Enzyme bán tinh khiết còn chứa nước,
28
protein không hoạt động và enzyme.Bằng những phương pháp hóa, lý ta sẽ loại được
nước, protein không hoạt động khi đó ta thu được chế phẩm enzyme tinh khiết.
Các loại nấm sợi như Aspergilus và Trichoderma thường được dùng làm đối tượng
để sản xuất cellulase ứng dụng nhiều trong thực tiễn. [53], [76], [97],[112], [120], [142].
Để sản xuất ra sản phẩm theo công nghệ ứng dụng vi sinh cần có những điều kiện
sau: Giống vi sinh, môi trường nuôi cấy, nguồn nguyên liệu (cơ chất) và quá trình lên
men (cấy giống, lên men và thu nhận sản phẩm).
Sau khi chuẩn bị môi trường nuôi cấy là quá trình lên men vi sinh. Đây là quá
trình sinh học diễn ra liên tục, bắt đầu từ khâu tạo giống, nhân giống sinh khối, lên men
và thu nhận sản phẩm cuối cùng. Các giai đoạn này có liên quan mật thiết và ảnh hưởng
qua lại với nhau. Để tạo được sản phẩm, quá trình lên men theo 3 giai đoạn: [2]; [12];
[54], [59], [63], [67], [74], [86]; [93], [110], [113], [133].
* Giai đoạn giữ giống gốc, nhân giống sinh khối và nhân giống sản xuất:
-Giống gốc được mua từ các Trung tâm thực nghiệm, trường Đại học, Viện nghiên
cứu…rồi nhân giống sinh khối theo môi trường thích hợp và nhân giống sản xuất đại trà.
Giống nấm mốc Aspergilus niger
- Quan sát đại thể
- Quan sát vi thể Hoạt hóa
Thử hoạt tính cellulase
Nuôi cấy trên môi trường cám gạo Nuôi cấy trên BC
Chế phẩm enzyme cellulase thô
Tinh chế enzyme cellulase
Thử hoạt tính phân giải cellulose của chế phẩm
Sơ đồ 1.3. Thu nhận cellulase từ A. niger
29
-Nếu không có giống gốc thì phải phân lập giống từ tự nhiên hoặc từ các cơ sở sản
xuất.
* Giai đoạn lên men:
Giai đoạn này có 2 quá trình lên men cơ bản là quá trình lên men hiếu khí và quá
trình lên men yếm khí (kỵ khí).
* Giai đoạn thu nhận sản phẩm lên men:
Tùy theo mục đích thu nhận sản phẩm mà có các phương pháp thu nhận sản phẩm
khác nhau. Dưới đây là một số phương pháp chủ yếu:
- Thu nhận chế phẩm enzyme vi sinh vật thô từ phương pháp nuôi cấy chìm:
phương pháp lắng tủa, lọc, ly tâm…
- Thu nhận chế phẩm enzyme vi sinh vật thô từ phương pháp nuôi cấy bề mặt
- Thu nhận chế phẩm enzyme bán tinh khiết
Trong nhiều trường hợp ứng dụng, người ta dùng chế phẩm enzyme thô và trong
nhiều trường hợp người ta dùng chế phẩm enzyme bán tinh khiết và chế phẩm enzyme
tinh khiết. Để thu nhận được chế phẩm enzyme bán tinh khiết, người ta dùng các tác
nhân gây tủa protein như: cồn, acetone, muối trung tính…, sau đó ly tâm thu chế phẩm
enzyme, theo phương pháp thu chế phẩm enzym bán tinh khiết giá thành của enzym sẽ
cao, khi ứng dụng đại trà sẽ có nhiều hạn chế.
Hiện nay, enzym cellulase được ứng dụng rất rộng rãi trong công nghiệp dệt, công
nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm gia súc.Đặc biệt các chế phẩm cellulase thô được
ứng dụng nhiều trong xử lý ô nhiễm môi trường.
Chế phẩm enzym cellulase tinh khiết được ứng dụng trong kỹ thuật di truyền.
Trong kỹ thuật tạo tế bào trần (protoplast), người ta thường dùng chế phẩm cellulase
tinh khiết để phá vỡ thành tế bào thực vật. Ứng dụng enzym cellulase phá vỡ tế bào thực
vật không làm tổn thương các cơ quan bên trong tế bào, đảm bảo sự nguyên vẹn của các
nhân tố di truyền. Do đó phương pháp này đã nhanh chóng thay thế các phương pháp
cơ học và hóa học.
Những ứng dụng của cellulase trong công nghiệp thực phẩm đã có kết quả rất tốt.
Tuy nhiên hạn chế lớn nhất là rất khó thu được chế phẩm có cellulase hoạt độ cao.
30
Hiện tại thị trường Việt Nam mới chỉ có rất ít các chế phẩm chứa các chủng nấm
có hoạt tính cellulase như: sản phẩm sinh học Trichoderma cho cây trồng của Tieu
Phong, chế phẩm BIMA của TT CNSH TP Hồ Chí Minh chứa các chủng Trichoderma
phối trộn với một số enzym để chống bệnh cho cây trồng và xử lý ô nhiễm môi
trường...Các chế phẩm cellulase ngoại có giá rất cao cho nên hiện chưa được lưu thông
trên thị trường.
1.5. Sản lượng nuôi cá rô phi
Cá rô phi hiện đang được nuôi rộng rãi trên thế giới. Ngoài mục đích cải thiện dinh
dưỡng cho người dân nghèo, nuôi cá rô phi còn tạo ra sản phẩm hàng hóa ngày càng có
sức cạnh tranh cao trên thị trường thế giới. Thị trường cá rô phi trên thế giới tăng nhanh
trong 2 thập kỉ qua, đặc biệt ở thị trường Mỹ. Thị trường nhập khẩu cá rô phi trên thế
giới năm 1992 mới đạt 2.500 tấn, đến năm 1999 đã là 100.000 tấn. Trong vòng 5 năm
qua, nhu cầu nhập khẩu cá rô phi tăng 38%/năm. Ðứng đầu các nước nhập khẩu cá rô
phi là Mỹ, tiếp sau là Nhật, một số nước châu Âu.Năm 1992, Mỹ nhập 3.400 tấn, năm
2000 nhập 40.000 tấn.Năm 2001, ước tính nhập 70.000 - 75.000 tấn, trị giá 106 - 108
triệu USD.
Cá rô phi là loài được nuôi phổ biến và có sản lượng lớn nhất trên thế giới,
cao hơn sản lượng cá da trơn và cá hồi.
Biểu đồ 1.1. Tăng trưởng sản lượng cá rô phi, cá da trơn và cá hồi giai đoạn 1980
– 2010
(Nguồn Fitzsimmons - Global Outlook for Aquaculture Leadership, Kualalumpur 2010)
31
Trong những năm gần đây sản lượng cá rô phi tăng nhanh chóng, năm 2000 đạt
1,3 triệu tấn (FAO Fishtat, 2002), trong đó Trung Quốc chiếm 50% sản lượng. Nghiên
cứu từ CPF Thái Lan đã cho thấy thức ăn viên chứa 20% protein thô có thể tiết kiệm chi
phí trong nuôi cá rô phi ao và lồng [52].
Có thể nuôi cá rô phi bằng nhiều phương pháp khác nhau, như nuôi ao bán thâm
canh có bón phân và cung cấp thức ăn, nuôi thâm canh trong bể, nuôi thâm canh lồng
và nuôi khép kín (nuôi tuần hoàn).Tuy nhiên, hiện nay có xu hướng đẩy mạnh nuôi cá
rô phi chất lượng cao thoả mãn nhu cầu tiêu dùng nội địa và xuất khẩu. Ðối tượng cá rô
phi đỏ được nuôi nhiều ở Ðông Nam Á vì chúng có giá tương đối thấp và thịt ngon nên
đã trở thành loài có tính cạnh tranh và là sản phẩm thay thế các loài cá có vây khác như
cá vược [18], [29], [49], [139].
Nuôi cá rô phi ở Việt Nam được bắt đầu từ những năm 1950 sau khi cá rô phi
đen (O.mossambicus) được nhập vào nước ta. Vào thời kỳ đó cá rô phi chủ yếu được
nuôi theo hình thức quảng canh nên năng suất thấp. Mặt khác do đặc điểm của cá rô phi
đen là chậm lớn, đẻ dày, kích thước nhỏ nên dẫn đến việc cá rô phi trong một thời gian
dài không được người nuôi chú ý. Năm 1973 cá rô phi vằn (O.niloticus) đã được nhập
vào miền Nam nước ta từ Đài Loan, cá trở thành đối tượng nuôi triển vọng, song do
công tác lưu giữ giống thuần không tốt, hiện tượng lai tạp giữa cá rô phi đen và rô phi
vằn Đài Loan là phổ biến, làm suy giảm chất lượng cá rô phi giống. Trong những năm
1990 thông qua các đề tài nghiên cứu khoa học, và các chương trình hợp tác quốc tế,
Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1 đã nhập một số giống cá rô phi có chất lượng
như: Cá rô phi vằn dòng Thái Lan, dòng Egypt – Swansea, cá rô phi dòng GIFT chọn
giống thế hệ thứ năm của ICLARM. Cá rô phi vằn dòng GIFT nhập nội đã được sử
dụng làm vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống cá rô phi tiến hành tại Viện
nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1, sau các thế hệ chọn giống theo phương pháp gia đình,
cá rô phi chọn giống có tốc độ tăng trưởng tăng thêm 29,1%.
Tổng cục thống kê năm (2005) diện tích nuôi cá rô phi của cả nước là
22.340 ha chiếm 3% tổng diện tích nuôi trồng thủy sản, trong đó nuôi nước lợ, mặn là
2.068 ha và nuôi nước ngọt là 20.272 ha. Tổng sản lượng cá rô phi ước tính đạt 54.486,8
tấn, chiếm 9,08% tổng sản lượng cá nuôi. Phần lớn diện tích nuôi tập trung ở đồng bằng
sông Cửu Long (10.129 ha chiếm 45,3%), kế đến là vùng đồng bằng sông Hồng và vùng
Đông Bắc Bộ [50], [60].
32
1.6. Đặc điểm sinh học của cá rô phi
1.6.1. Phân loại
Dựa vào đặc điểm sinh sản, người ta chia cá rô phi thành 3 giống [8], [9], [102]:
- Tilapia (cá đẻ cần giá thể)
- Sarotherodon (Cá bố hay cá mẹ ấp trứng trong miệng)
- Cá rô và Oreochromis (Cá mẹ ấp trứng trong miệng)
Cá rô phi hiện đang nuôi phổ biến ở Việt Nam thuộc :
Bộ cá vược - PerciForms
Họ - Cichlidae
Giống - Oreochromis
Loài - Cá rô phi vằn O.niloticus.
Hiện nay có 3 loài chính được phổ biến tại Việt Nam là :
- Cá rô phi cỏ Oreochromis Mossambicus, được nhập vào Việt Nam năm 1953 qua
ngã Thái Lan.
- Cá rô phi vằn ( Rô phi Đài Loan O.niloticus ) được nhập vào Việt Nam năm
1974 từ Đài Loan.
- Cá rô phi đỏ ( red Tilapia ), có màu hồng được nhập vào Việt Nam năm 1985 từ
Maliaxia.
1.6.2. Đặc điểm hình thái:
Cá rô có thân hình màu hơi tím, vảy sáng bóng, có 9-12 sọc đậm song song nhau
từ lưng xuống bụng. Vi đuôi có màu sọc đen sậm song song từ phía trên xuống phía
dưới và phân bổ khắp vi đuôi. Vi lưng có những sóc trắng chạy song song trên nền xám
đen. Viền vi lưng và vi đuôi có màu hồng nhạt [39]; [85].
Bảng 1.3. Phân biệt cá đực, cá cái
ĐẶC ĐIỂM PHÂN BIỆT CÁ ĐỰC CÁ CÁI
Đầu To và nhô cao Nhỏ, hàm dưới trề do
ngậm trứng và con
Màu sắc Vi lưng và vi đuôi sặc sỡ Màu nhạt hơn
Lỗ niệu sinh dục 2 lỗ : lỗ niệu sinh dục và
lỗ hậu môn
3 lỗ : lỗ niệu. lỗ sinh dục
và lỗ hậu môn.
33
Môi trường sống: Các loài cá rô phi hiện đang nuôi có đặc điểm sinh thái gần giống
nhau.
Nhiệt độ: Nhiệt độ cần thiết cho sự phát triển của cá rô phi từ 20-320C, thích hợp
nhất là 25-320C. khả năng chịu đựng với biến đổi nhiệt độ cũng rất cao từ 8-420C, cá
chết rét ở 5,50C và bắt đầu chết nóng ở 420C. Nhiệt độ càng thấp thì cá càng giảm ăn,
ức chế sự tăng trưởng và tăng rủi ro nhiễm bệnh.
Độ mặn: Cá rô phi là loài rộng muối, có khả năng sống được trong môi trường nước
sông, suối, đập tràn, hồ ao nước ngọt, nước lợ và nước mặn có độ muối từ 0-40%. Trong
môi trường nước lợ (độ mặn 10-25‰) cá tăng trưởng nhanh, mình dày, thịt thơm ngon.
pH: Môi trường có độ pH từ 6,5-8,5 thích hợp cho cá rô phi, nhưng cá có thể chịu
đựng trong môi trường nước có độ PH thấp bằng 4.
Oxy hoà tan: Cá rô phi có thể sống được trong ao, đìa có màu nước đậm, mật độ
tảo dày, có hàm lượng chất hữu cơ cao, thiếu Oxy. Yêu cầu hàm lượng oxy hoà tan trong
nước của cá rô phi ở mức thấp hơn 5-10 lần so với tôm sú [94], [95].
1.6.3. Đặc điểm về dinh dưỡng và sinh trưởng.
Đặc điểm dinh dưỡng: Bộ máy tiêu hoá của cá rô phi thích nghi với việc ăn tạp.
Miệng chúng khá rộng hướng lên trên, có thể ăn được những mồi lớn. Răng hàm
ngắn và nhiều xếp lộn xộn giúp cá bắt và giữ mồi tốt, lược mang ngắn và khá dày giúp
cá lọc tảo dễ dàng. Ruột cá rô phi dài và xếp thành nhiều vòng, đó là đặc điểm của loài
cá ăn thực vật [38]; [78].
Cá rô phi là loài cá ăn tạp nghiêng về thực vật, thức ăn chủ yếu là tảo và một phần
thực vật bậc cao và mùn bã hữu cơ. Ở giai đoạn cá con từ cá bột lên cá hương, thức ăn
chủ yếu là động vật phù du (ÐVPD) và một ít thực vật phù du (TVPD). Từ giai đoạn cá
hương đến cá trưởng thành thức ăn chủ yếu là mùn bã hữu cơ và TVPD. Cá rô phi có khả
năng tiêu hóa các loài tảo xanh, tảo lục mà một số loài cá khác không có khả năng tiêu hoá.
Ngoài ra cá rô phi còn ăn được thức ăn bổ sung như cám gạo, bột ngô, các loại phụ phẩm
nông nghiệp khác. Ðặc biệt cá rô phi có thể sử dụng rất có hiệu quả thức ăn tinh như: cám
gạo, bột ngô, khô dầu lạc, đỗ tương, bột cá... và các phụ phẩm nông nghiệp khác.
Nhu cầu dinh dưỡng của cá rô phi thay đổi theo từng giai đoạn phát triển. Trong các
yếu tố dinh dưỡng thì protein đóng vai trò quan trọng nhất cả về số lượng và chất lượng.
34
Các loài cá khác nhau có nhu cầu protein khác nhau. Ngay trong cùng một loài nhu cầu
protein cũng khác nhau giữa các độ tuổi và điều kiện môi trường nuôi khác nhau. Đối với
cá nhỏ nhu cầu protein trong khẩu phần thức ăn nhiều hơn cá lớn, cá nuôi trong hệ thống
nghèo thức ăn tự nhiên, đòi hỏi mức độ protein trong khẩu phần ăn cao hơn so với cá nuôi
trong môi trường giàu thức ăn tự nhiên hay trong ao bón phân [19], [36].
Tập tính ăn: Khi còn nhỏ, cá rô phi ăn sinh vật phù du ( tảo và động vật nhỏ) là
chủ yếu (cá 20 ngày tuổi , kích thước khoảng 18mm). Khi cá trưởng thành ăn mùn bả
hữu cơ lẫn các tảo lắng ở đáy ao, ăn ấu trùng, côn trùng, thực vật thuỷ sinh. Tuy nhiên
trong nuôi công nghiệp cá cũng ăn các loại thức ăn chế biến từ cá tạp, cua, ghẹ, ốc, bột
cá khô, bột bắp, bột khoai mì, khoai lang, bột lúa, cám mịn, bã đậu nành, bã đậu
phộng.Trong thiên nhiên cá thường ăn từ tầng đáy có mức sâu từ 1-2m [40].
Sinh trưởng: Khi nuôi trong ao, cá sử dụng thức ăn tự nhiên sẵn có kết hợp với
thức ăn chế biến, cá rô phi vằn đơn tính lớn nhanh từ tháng đầu đến tháng thứ 5-6.
Nuôi cá rô phi lồng: Nuôi lồng có vốn đầu tư và chi phí hoạt động thấp hơn nhiều
so với nuôi ao và nuôi bể. Cụ thể là cá được nuôi với mật độ cao và được cho ăn toàn
bộ. Mật độ nuôi phải tuỳ theo lượng ôxy có trong nước nuôi. ở Ðông Nam á, khi nuôi
thâm canh cá rô phi những người nuôi sử dụng thức ăn chứa 20 - 32% protein.
Kết hợp nuôi ao và nuôi lồng: việc kết hợp này cho phép quản lý số lượng cá thả
và thu hoạch cá. Cho cá ăn các thức ăn chế biến sẵn chứa 20 - 32% protein thô. Các cuộc
thử nghiệm nhằm xác định hiệu suất nuôi cá rô phi lồng (100m3/lồng) trong điều kiện
độ mặn 15 - 20ppt và nhiệt độ 28 - 320C, với năng suất 20,4; 20,9 và 21,2 tấn/ha/vụ
tương ứng với thời gian nuôi là 143; 154 và 167 ngày. Mật độ thả 16300; 16500 và
15300 tương ứng với trọng lượng cá là 127g; 149g và 145g. Các ao nuôi được lắp đặt
các guồng quạt nước [40].
1.6.4. Nhu cầu dinh dưỡng của cá rô phi
Giống như các loại cá khác, cá rô phi cũng cần 10 loại axít amin thiết yếu. Chúng
tiêu hoá cácbon hyđrat tốt hơn cá chép và cá trê phi. Việc cung cấp nhiều loại cácbon
hyđrat và lipit có tác dụng tăng hiệu quả của protein trong chế độ ăn, với mức protein
chiếm 18 - 22%. Rất khó xác định những vitamin và khoáng chất thích hợp trong chế
độ dinh dưỡng của cá rô phi. Ðể giải quyết vấn đề này, một số nghiên cứu đã được tiến
hành. Do cá rô phi có thói quen ăn uống đa dạng nên yêu cầu về chế độ ăn của chúng
35
cũng rất linh hoạt. Bột cá vẫn là nguồn protein động vật chủ yếu trong thức ăn của cá rô
phi, ngoài ra có thể lựa chọn các loại khác như thịt gia cầm, cá ủ xilô, bột tôm, nhuyễn
thể... Những protein thực vật được sử dụng nhiều nhất trong thức ăn cá rô phi là đỗ
tương, lạc, hạt bông, hạt hướng dương, hạt cải dầu và lá leucaena sp. Tuy nhiên, những
protein động vật và thực vật trên chỉ có thể thay thế một phần bột cá trong thức ăn của
cá rô phi. Ðiều này có thể do sự thiếu cân bằng của các chất dinh dưỡng thiết yếu như
các axit amin và các khoáng chất, do sự hiện diện của các nhân tố phi dinh dưỡng làm
giảm tính hấp dẫn của thức ăn, giảm tính ổn định của thức ăn trong nước và độ tiêu hoá
thức ăn kém. Ðối với chế độ ăn không có bột cá, để đạt được mức tăng trưởng so với
chế độ ăn tiêu chuẩn, phải bổ sung thêm 3% đicanxi phosphat và 2% lipit. [7], [8], [9],
[101], [103], [109].
Ðể đảm bảo đủ lượng thức ăn, có thể cho cá rô phi chưa trưởng thành (vài tuần
tuổi) ăn với tỷ lệ cao bằng 3 - 4% trọng lượng cơ thể trong một ngày. Cá có trọng lượng
250-400g thì lượng thức ăn hàng ngày tốt nhất là bằng 1,5% trọng lượng cơ thể. Ðối với
những loài nuôi trong nước biển thì hằng ngày nên cho ăn lượng thức ăn ít hơn 2% trọng
lượng cơ thể.
Bảng 1.4. Giới hạn các thành phần trong thức ăn có giá thành ít nhất cho cá rô
phi ở các giai đoạn
Thành phần % giới hạn Khởi điểm Bắt đầu Tăng
trưởng
Kết
thúc
Protein thô Tối thiểu (Min) 40 30 25 20
Chất béo thô Tối thiểu 4 4 4 4
Sợi thô Tối đa (Max) 4 4 4 8
Lysin Tối thiểu 2,04 1,53 1,28 1,02
Metionin + xystin Tối thiểu 1,28 0,96 0,8 0,64
Threonin Tối thiểu 1,44 1,08 0,9 0,72
Axít béo Tối thiểu 0,5 0,5 0,5 0,5
Axít béo Tối thiểu 0,5 0,5 0,5 0,5
Canxi Tối đa 2,5 2,5 2,5 2,5
Photphorơ (toàn bộ) Tối đa 1,5 1,5 1,5 1,5
36
Photphorơ (có sẵn) Tối thiểu 0,6 0,6 0,6 0,6
Tinh bột Tối thiểu 25 25 25 25
Năng lượng tiêu hoá
(Kcal/kg) Tối thiểu 2800 2800 2800 2800
Vitamin và khoáng chất Cố định 2 2 2 2
Bột cá (tối thiểu 60%
protein) Tối thiểu 15 12 10 8
Cám gạo Không hạn chế
Cám lúa mỳ Không hạn chế
Hạt cải dầu/hạt bông Tối đa - 10 12 20
Ngô/bột sắn/bột lúa
miến Tối thiểu 10 10 10 10
(Nguồn Asia Aquaculture Magarize)
Ðặc điểm kỹ thuật trong thức ăn của cá rô phi phụ thuộc vào nhu cầu dinh dưỡng
trong từng điều kiện nuôi. Ðặc điểm này phụ thuộc vào loại hình nuôi, loại thức ăn chế
biến, giá trị sản phẩm và nguồn thức ăn có nhiều ở các quốc gia Trong thành phần thức
ăn chế biến sẵn cho cá rô phi ở Thái Lan, Inđônêxia, Malaixia, Trung Quốc, những
nguyên liệu thô có sẵn ở địa phương thường chiếm tỷ lệ lớn, đặc biệt là nguồn cácbon
hyđrat ví dụ như cám gạo, cám lúa mỳ, ngô, bột sắn. Những nguyên liệu thô này có tính
mùa vụ nhưng thực tế đã chứng minh là chúng có chất lượng cao và mang lại hiệu quả
lớn.
Bảng 1.5. Cung cấp bổ sung vitamin và khoáng chất trong thức ăn của cá rô phi
Vitamin mg/kg Khoáng chất g/kg
Thiamin 20 Canxi 3
Piryđoxin 10 Photpho 7
Riboflavin 20 Magiê 0,4
B12 1 Sắt 0,03
Axít folic 5 Kẽm 0,2
Cholin 500 Ðồng 0,003
37
Pantothenic 50 Mangan 0,013
Niaxin 100 Iốt 0,0025
Axit ascorbic 375
Biotin 1
Inositol 100
K 10
A 5500IU/kg
D3 2000
Alpha-tocopherol 50
(Nguồn Asia Aquaculture Magarize)
Tỷ lệ cho ăn và tần suất cho ăn ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của cá và tỷ lệ trao
đổi thức ăn. Tỷ lệ cho ăn cao có thể làm cho cá tăng trưởng tốt nhưng không xác định
được độ chuyển hoá thức ăn. Bảng 5 chỉ ra loại thức ăn và chế độ cho ăn nên được sử
dụng rộng rãi trong nuôi thâm canh cá rô phi ao và lồng ở Ðông Nam Á. Bảng chế độ
ăn này có thể áp dụng với điều kiện nuôi có nhiệt độ nước 28 - 320C. ở điều kiện nhiệt
độ cao hơn hay thấp hơn thì cần điều chỉnh tỷ lệ và tần suất cho ăn hợp lý.
Bảng 1.6. Tiêu chuẩn kỹ thuật của thức ăn nuôi cá rô phi và chế độ ăn trong nuôi
lồng và ao thâm canh
Loại thức
ăn
Kích
thước
(mm)
Cỡ cá
(g)
Protein
(% tối
thiểu)
Chất
béo
(% tối
đa)
Chất
xơ
Tỷ lệ cho
ăn (% cân
nặng/ngày)
Số lần
cho
ăn/ngày
Vụn <0,6 <0,5 40 4 4 20 6
Vụn 0,6-1,0 0,5 40 4 4 15 6
Vụn 0,6-1,0 1 40 4 4 11 6
Vụn 0,6-1,0 1 40 4 4 9 5
Ép đùn, nổi 1,4-2,4 2 40 4 6 6,5 5
Ép đùn, nổi 2,4 10 30 4 6 6,5 5
38
Ép đùn, nổi 2,4 15 30 4 6 4,6 5
Ép đùn, nổi 2,4 15 30 4 6 4,6 5
Ép đùn, nổi 3,2 30 30 4 6 3,6 4
Ép đùn, nổi 3,2 60 30 4 6 3 4
Ép đùn, nổi 4,8 100 25 4 6 2,6 4
Ép đùn, nổi 4,8-6 175 25 4 6 2,2 3
Ép đùn, nổi 6,0-8,0 300 20 4 8 1,8 3
Ép đùn, nổi 8,0-10 400 20 4 8 1,5 3
(Nguồn Asia Aquaculture Magarize)
1.6.5. Nhu cầu dinh dưỡng và ảnh hưởng của thức ăn lên sinh trưởng của cá rô phi.
Cá rô phi là loài ăn tạp [7], [38]. Trong điều kiện tự nhiên cá rô phi ăn được các
loại thức ăn như phiêu sinh vật, sinh vật đáy, động vật không xương sống, mùn bã hữu
cơ, các loại thực vật thủy sinh có thân mềm [39]. Trong ao nuôi, cá cũng ăn thức ăn
nhân tạo, phân hữu cơ…[7]. Cá trưởng thành ăn mùn bã hữu cơ lẫn các tảo lắng ở đáy,
ấu trùng côn trùng và một phần thực vật thượng thẳng loại mềm, sinh vật phù du, có khi
ăn cả các sinh vật bơi lội. Thức ăn của cá rô phi trưởng thành trong môi trường sống tự
nhiên là thực vật nổi [8]. Trong thành phần thức ăn tự nhiên thì tảo có vai trò quan trọng
vì lược mang của cá rô phi có thể lọc tảo để làm thức ăn, nhưng khả năng lọc phiêu sinh
của lược mang cá rô phi không tốt như cá Mè trắng hoặc cá Mè hoa [39]. Cá rô phi có
ruột dài gấp 6 lần chiều dài thân. Cá có chiều dài ruột dài hơn cơ thể (chiều dài thân) thì
ăn thực vật [7]. Ở cá rô phi có thể tiêu hóa 30-60% đạm có chứa trong tảo [39]. Qua đó
ta thấy trong điều kiện tự nhiên cá rô phi ăn phiêu sinh vật, mùn bã hữu cơ, một phần
thực vật thượng đẳng loại mềm.
Các công trình nghiên cứu về dinh dưỡng của cá rô phi tập trung chủ yếu ở nhu
cầu protein, axit amin không thay thế, axit béo, vitamin và khoáng chất. Rất khó xác
định những vitamin và khoáng chất thích hợp trong chế độ dinh dưỡng của cá rô phi.Vài
cuộc thử nghiệm ở Trung tâm nghiên cứu động vật dưới nước Charoen Pokphand (Thái
Lan) đã được tiến hành để xác định loại thức ăn và tần suất cho ăn thích hợp cho sự tăng
trưởng của cá rô phi [5].
39
Chất đạm là yếu tố dinh dưỡng quan trọng cho sinh trưởng của cá rô phi. Tuy
nhiên, nhu cầu chất đạm của cá rô phi rất khác nhau trong loài và theo kích cỡ cá. Nhu
cầu đạm của rô phi vằn (Oreochromis niloticus) dao động trong khoảng 36 – 40% (Lê
Thị Quỳnh Ba, 1997), 30% (De Silva 1983). Để cá sinh trưởng tối đa thì khẩu phần ăn
của cá cần có hàm lượng đạm 45% và mức năng lượng 400kcal/100g, mức đạm kinh tế
trong khẩu phần thức ăn của cá rô phi là 25 – 35% với tỉ lệ cho ăn từ 4 – 6% trọng lượng
thân/ngày, thức ăn của cá rô phi biến thiên từ 1 – 50% đạm. Giá trị thông thường nhất
là dưới 15% đạm [37].
Yêu cầu đạm của cá rô phi có trọng lượng từ 1 – 5g là 30 – 40%, cá 5 – 25g là 20
– 30% và nặng hơn 25g yêu cầu 20 – 25% đạm. Điều này chứng tỏ cá càng lớn thì nhu
cầu về đạm trong thức ăn của cá càng giảm. Theo Winfree và Stickney (1981) cá có
trọng lượng 2,5 gam tốt nhất thì cần 36% đạm. Kubark (1980) cho biết cá rô phi tăng
trưởng từ 3 – 30 gam tốt nhất thì cần 36% đạm. Một số nghiên cứu cho biết cá rô phi
nuôi bán thâm canh thì thức ăn cần 28% đạm, nuôi thâm canh cần 30 – 36% đạm.
Mức đạm kinh tế trong khẩu phần thức ăn của cá rô phi là 25 – 35%, ở nhiệt độ
27 – 290c thì cho cá có trọng lượng từ 5 – 20g, với mức ăn là 4 – 6% trọng lượng
thân/ngày. Khi nuôi cá rô phi ở các ao, hồ gần trại chăn nuôi hoặc ven đô thị có nguồn
nước thải sinh hoạt, cá rất mau lớn và cho năng suất 6 tấn/ha vì trong phân heo, gà bài
tiết còn chứa một số cabohydrate, đạm mà heo gà không tiêu hóa hết hoặc các loại vi
sinh vật và dịch nhờn của ống tiêu hóa tiết ra, cá rô phi có thể dùng làm thức ăn.
Nguyên liệu dùng thức ăn cho cá có thể rất khác nhau như các loài thực vật thủy
sinh có thân mềm như rau muống, bèo. Bèo hoa Dâu Azolla đã được sử dụng trong khẩu
phần thức ăn của cá rô phi và đã nhận thấy sự sinh trưởng tốt của cá. Các loại thức ăn
như bột gạo, bột mì, bột bắp, bánh đầu và khoai lang, bã đậu, bã rượu, khô dầu, cám đều
có thể dùng để chế biến thức ăn cho cá rô phi [34].
Qua đó cho ta thấy nhu cầu về đạm cho cá rô phi biến động trong khoảng từ 15
– 50% tuy nhiên tập trung nhất ở mức 25 – 35% và sử dụng được các loại thức ăn ở
dạng chế phẩm trong sản xuất, chế biến nông nghiệp, chất thải sinh hoạt, chăn nuôi và
các loại thức ăn nhân tạo. Sự tăng trưởng của cá rô phi phụ thuộc vào các yéu tố như ưu
thế của di truyền, chất lượng và số lượng thức ăn được cung cấp, một số điều kiện sinh
thái của môi trường nuôi, giới tính và mật độ nuôi. Như cá rô phi đực có trọng lượng
40
ban đầu 20 – 30 gram nếu điều kiện nuôi tốt có thể đạt trọng lượng 450 – 500 gram, cá
có thể tăng trọng 4 – 5g/ngày và nếu điều kiện nuôi lí tưởng thì từ cá bột có trọng lượng
1 gram, sau 1 năm nuôi có thể đạt 800 gram.
Theo Micha (1988), cá rô phi có trọng lượng ban đầu là 5,1g sau 10 tuần nuôi cá
đạt 25g, với thức ăn viên có 34,3% đạm, FCR: 1,2 và FER: 2,4 và có thành phần hoá
học cơ thể ( % trọng lượng thô ) trước và sau thí nghiệm như sau
Bảng 1.7. Thành phần hoá học cá rô phi nuôi bằng thức ăn viên có hàm lượng
protein 34,2 (%)
Cá Độ ẩm
(%) Lipit (%) Protein (%) Tro (%)
Trước thí nghiệm (5.1g) 74.4 20.7 60.6 17.9
Sau thí nghiêm (25g) 75.0 23.6 59.7 14.9
Theo Chiayvareesajja. S và ctv (1988) cá rô phi nuôi trong lồng với 12 công thức
thức ăn có mức đạm từ 17,3 – 38,0%, sau 5 tháng nuôi, FCR của 12 công thức khác biệt
không có ý nghĩa về mặt thống kê (P<5%), sự khác biệt WG không tìm thấy qui luật nào.
Theo kết quả nghiên cứu cá rô phi của Li Zihongjie (1991) ở Trung Quốc:
Bảng 1.8. Nuôi cá rô phi bằng thức ăn viên có hàm lượng protein (%) khác nhau.
Thức ăn (% đạm) WG(%) FCR FER
32,2 85,6 1,71 1,79
27,2 97,0 1,58 2,34
25,7 84,3 1,65 2,35
- Thức ăn cho cá rô phi có FCR thường nhỏ hơn 2 [36]
- Cá rô phi có trọng lượng ban đầu 10.0 – 10.6g cho ăn thức ăn chiếm 3 – 5% trọng
lượng cá/ngày, với thức ăn là 100% cám gạo, có SGR = 0,69 và FCR = 4,7[19]. Cá có
trọng lượng ban đầu 10.0 – 10.6g cho ăn 55 trọng lượng cá, thức ăn là 50% bột cá +
50% cám gạo, có SGR = 2,03 [35].
Maerk (1975) đã phát triển đặc tính cho ăn của cá rô phi ở Israel, trọng lượng cá
(gram) thì lượng thức ăn chiếm % trọng lượng thân/ngày như sau:
41
Bảng 1.9: Nuôi cá rô phi với tỷ lệ thức ăn (%)/thân khác nhau
Trọng lượng cá (g) 5 – 10 10 - 20 20 – 50 50 - 70 70 – 100
Thức ăn 6,7 5,3 4,6 3,3 2,8
Qua các nghiên cứu trên ta thấy với lượng thức ăn khác nhau, đạm khác nhau, có
ảnh hưởng đến hệ số tiêu thốn thức ăn và sinh trưởng của cá rô phi, các kết quả trên có
SGR từ 0,69 – 2,03%/ngày và FCR từ 1,2 – 4,7
Chế độ cho ăn: Đảm bảo đủ lượng thức ăn, có thể cho cá rô phi chưa trưởng thành
(vài tuần tuổi) ăn với tỷ lệ cao bằng 3 – 4% trọng lượng cơ thể trong 1 ngày. Cá có trọng
lượng 250 – 400g thì thức ăn hàng ngày tốt nhất là bằng 15% trọng lượng cơ thể. Đối
với những loài nuôi trong nước biển thì hàng ngày nên cho ăn lượng thức ăn ít hơn 2%
trọng lượng cơ thể.
Hiện nay, tổng năng lực chế biến thức ăn thủy sản của Việt Nam ước tính
250.000 tấn/năm thức ăn nuôi tôm và 100.000 tấn/năm thức ăn nuôi cá. Điều này cho
thấy rằng năng lực chế biến hiện nay không đủ đáp ứng nhu cầu trong tương lai ước
tính cần khoảng 300.000 tấn thức ăn nuôi tôm và 200.000 tấn thức ăn nuôi cá, chủ
yếu cho cá rô phi và cá tra, basa.
Việt Nam đã có sự tăng trưởng đáng kể trong hoạt động nuôi trồng thủy sản,
đặc biệt là nuôi tôm biển. Chỉ trong thời gian ngắn, Việt Nam đã thu hút được nhiều
công ty đa quốc gia đầu tư vào các nhà máy chế biến thức ăn chăn nuôi. Cho đến
cuối năm 2003, đã có 15 công ty chế biến thức ăn lớn và 20 – 30 công ty vừa và nhỏ
đang hoạt động trong thị trường thức ăn thủy sản ở Việt Nam. Chính phủ đã chỉ đạo
chương trình mở rộng thêm các vùng nuôi tôm biển, nuôi cá nước ngọt và nuôi biển
mới. Do vậy, nhu cầu thức ăn nuôi thủy sản trở thành một vấn đề cấp bách [18].
42
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng
2.1.1. Bã thải rong sau sản xuất agar
Bã thải rong sau sản xuất agar được thu nhận từ cơ sở sản xuất agar của Công ty
TNHH SX & TM Hoàng Yến phường Lãm Hà, Quận Kiến An, thành phố Hải Phòng.
Sau quá trình nấu chiết thu agar, bã agar được loại thải qua giai đoạn lọc khung bản.
Mẫu được lấy ngẫu nhiên giữa các lần nấu chiết sau đó ép để giảm bớt hàm lượng nước
và bảo quản ở nhiệt độ lạnh. Bã rong sau khi thu mua về bảo quản có màu trắng nâu, sợi
rong mềm, có mùi tanh tự nhiên của rong biển.
Hình 2.1. Bã thải sau sản xuất agar
2.1.2. Giống vi sinh vật sinh cellulase
Các chủng vi sinh vật sinh cellulase sử dụng trong qúa trình nghiên cứu được lấy
từ bộ sưu tập giống vi sinh vật sinh cellulase của Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và bộ sưu tập giống vi sinh vật của Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội. Bao gồm các chủng sau: Bacillus
subtilis VTCC-B-26; Bacillus subtilis VTCC-B-505; Bacillus Lichenformis- Li; CFd;
43
CFh; MSM 04; MSM 11; Streptomyces sp VTCC-A-62; Sarcharomyces fibulgera
VTCC-Y-519; Sarcharomyces fibulgera VTCC-Y-529; Sarcharomyces capsularis
VTCC-Y-32; Aspergillus niger VTCC-F273; Tricoderma konigii VTCC-708; 1’; V2;
V3; V4.
2.1.3. Cá rô phi giống
Cá rô phi
Hình 2.2. Cá rô phi
Bộ cá vược Perciformes
Họ Cichlidei
Giống Oreochromis
Loài O. niloticus (Linnaeus, 1757)
Tên địa phương cá Rô phi vằn dòng Gift
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân tích
+ Xác định hàm lượng protein theo TCVN 4328-1:2007 (ISO 5983-1:2005).
+ Xác định hàm lượng nước theo TCVN 4326:2001 (ISO 6596:1999).
+ Xác định hàm lượng tro theo TCVN 4327:2007 (ISO 5984:2002).
+ Xác định hàm lượng cellulose AOAC No 973.09.1997/TCVN 4329:2007 (ISO
6865:2000).
+ Xác định hàm lượng lipit TCVN 4331:2001.
+ Xác định nấm mốc độc theo HPLC 3.19-05-2/CL1/ST.
44
+ Xác định NaCl theo TCVN 4330:1986.
+ Xác định Canxi theo TCVN 1526: 2007.
+ Xác định Phospho theo TCVN 1525 - 2001.
+ Phân tích các nguyên tố kim loại trên máy quang phổ hấp phụ nguyên tử
2.2.2. Các phương pháp thu nhận và xác định hoạt tính cellulase
2.2.2.1. Phương pháp thu nhận enzym cellulase thô
* Nguyên tắc [2], [6]
Phương pháp nuôi cấy chìm là phương pháp vi sinh vật phát triển, sinh sản và trao
đổi chất trong lòng môi trường. Môi trường dùng trong nuôi cấy chìm thường là môi
trường lỏng. Trong quá trình phát triển, sinh sản và trao đổi chất trong môi trường lỏng,
vi sinh vật sẽ tổng hợp ra các enzym thủy phân. Các enzym thủy phân là các enzym hòa
tan trong nước. Do đó việc thu nhận enzym trong trường hợp này là thu nhận dịch nuôi
cấy (sau khi đã tách sinh khối và những thành phần không hòa tan của môi trường).
Chế phẩm enzym vi sinh vật thô trong nuôi cấy chìm ở đây bao gồm enzym đã hòa
tan trong nước, nước và các sản phẩm trao đổi chất hòa tan khác.
* Thiết bị: Cân phân tích chính xác 0,0001g, miếng ami-ăng, bếp điện, nồi thanh
trùng, bình tam giác 250ml , bình tam giác , tủ cấy, máy lắc, đũa khuấy.
* Cách pha: Cho 800 ml nước cất vào bình tam giác, cân các hóa chất đúng theo
khối lượng cho vào bình. Lắc cho các chất tan hết rồi thêm nước cất cho đủ 1000ml.
Đun dung dịch trên bếp có lót miếng ami-ăng. Đun môi trường đến 90 oC thì cho CMC
vào. Dùng đũa khuấy khuấy đều để CMC tan hoàn toàn. Dùng ống đong để lấy 200 ml
dung dịch đã pha và cho vào bình tam giác 250ml. Làm nút bông và bao gói, hấp khử
trùng ở 121oC trong 20 phút.
* Lên men các chủng vi sinh vật sinh enzym cellulase
Thực hiện trong tủ cấy vô trùng bằng tia cực tím. Cho 2ml nước muối sinh lý vào
ống giống chứa khuẩn lạc của mỗi chủng. Dùng que cấy vòng cà nhẹ trên bề mặt thạch
để thu toàn bộ sinh khối tế bào. Thu dịch chuyển qua bình tam giác chứa môi trường
riêng của mỗi chủng.Đậy nút bông và nuôi cấy lắc 200 vòng/phút ở 28oC trong 48 giờ.
45
Kết thúc lên men, dịch nuôi cấy được ly tâm 12000 vòng/phút ở nhiệt độ 4oC trong
10 phút. Bỏ tủa, thu dịch nổi chính là enzym thô được bảo quản ở 4oC cho các thí nghiệm
tiếp theo.
2.2.2.2. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme cellulase bằng phương pháp xác
định đường khử
* Nguyên tắc: hoạt tính cellulase của dịch nuôi vi sinh vật được xác định theo
phương pháp xác định hàm lượng đường khử. Enzym celluase thủy phân cơ chất CMC
tạo thành sản phẩm là các đường có chứa gốc khử. Hàm lượng đường khử tạo thành
được xác định bằng cách cho phản ứng với dung dịch DNSA. Màu sinh ra sau phản ứng
được xác định bằng phương pháp so màu trên máy quang phổ ở bước sóng 530nm.
Một đơn vị hoạt độ enzym CMCase là lượng enzym phân giải cơ chất tạo thành
1mg glucose sau 1h tác dụng ở 400C, pH 5.0 [6], [12]
* Hóa chất và thiết bị: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: Glucose;
đệm acetate 0.5M, pH 5.0; DNSA, K-Na tartrate dung dịch CMC (1g/ 60ml), Folin,
TCA, casein .
Pha dung dịch cơ chất: Cân chính xác 1g CMC, hòa tan trong 80ml dung dịch đệm
acetate 0.5M, pH 5.0. Chuyển vào bình định mức, thêm dung dịch đến vạch và lắc đều.
Pha dung dịch DNSA: Cho từ từ 100g K-Na tartrate vào dung dịch NaOH 1% đang
được đun cách thủy nhẹ, nhiệt độ khoảng 50oC, khuấy đều bằng máy khuấy từ. Chờ cho K-
Na tartrate tan hết tiếp tục cho từ từ 5g DNSA vào và khuấy cho tan hoàn toàn. Làm lạnh
dung dịch DNSA đến nhiệt độ phòng. Bảo quản trong chai màu nâu có nắp ở 4oC.
Thiết bị bao gồm: tủ ấm 40 0C, Máy khuấy từ, Máy quang phổ.
* Phản ứng enzym
Mẫu thí nghiệm: cho 0.5ml dịch nuôi vi sinh vật và 0.5ml đệm acetate pH 5.0 vào
ống nghiệm, giữ 10 – 15 phút ở 400C. Thêm 1.5ml dung dịch CMC (đạt 400C), lắc đều
giữ ở 400C trong 1h. Sau đó, 0.5ml dịch sau phản ứng được lấy ra để tiến hành xác định
hàm lượng đường khử tạo thành.
Mẫu kiểm tra: sau khi trộn lẫn enzym với cơ chất, lấy ngay ra 0.5ml dịch để xác
định đường khử. Mỗi phản ứng đều đều lấy một mẫu kiểm tra riêng.
Mẫu đối chứng: thay 0.5ml dịch nuôi vi sinh vật bằng 0.5ml nước cất. Các bước
tiếp theo thực hiện như mẫu thí nghiệm.
46
* Xác định hàm lượng đường khử
Cho 0.5ml dịch sau phản ứng và 0.5ml dung dịch DNSA vào eppendof 1.5ml. Đun
sôi 5 phút, làm lạnh và ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút. Thu dịch trong và đo độ
hấp phụ tại bước sóng 530nm.
* Xây dựng đường chuẩn glucose
Chuẩn bị 20ml dung dịch glucose 1mg/ml rồi pha loãng dung dịch này với độ pha
loãng khác nhau từ 0.1 – 0.3 mg/ml. Thực hiện các thí nghiệm theo bảng sau:
Bảng 2.1. Xây dựng đường chuẩn glucose
Ống số 0 1 2 3 4 5
Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3
Dung dịch glucose (ml) 0 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3
Nước cất (ml) 1 0,9 0,85 0,8 0,75 0,7
Lấy 0.5ml từ mỗi dịch pha loãng glucose ở trên và làm phản ứng xác định hàm
lượng đường khử như phương pháp đã được mô tả ở trên.
* Công thức tính hoạt độ cellulase
Tính hiệu số giá trị mật độ quang học của mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm tra, dựa
vào đồ thị chuẩn tính lượng mg glucose tương ứng. Tính hoạt độ cellulase trong 1ml
dịch nuôi vi sinh vật theo công thức sau:
X= a.k.2,5 (mg)
Trong đó:
X: Số đơn vị hoạt độ trong 1ml dịch enzym
2,5: Thể tích của hỗn hợp phản ứng giữa enzym và cơ chất
a: Số mg glucose tương ứng với hiệu số giá trị mật độ quang học của ống thí
nghiệm và ống kiểm tra
k: Độ pha loãng dung dịch enzym.
47
2.2.3.3. Phương pháp xác định độ bền của chế phẩm enzym cellulase theo thời
gian bảo quản
Các chế phẩm enzym được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 0 ºC (có bổ sung
NaN3 0,02%) trong 1 ngày, 1 tuần, 2 tuần và 3 tuần. Ở cùng 1 điều kiện thủy phân, bằng
phương pháp DNSA xác định đầu đường khử để kiểm tra hoạt tính của chế phẩm enzym.
2.2.2.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính cellulase bằng phương pháp điện di
Xác định cellulase bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamis 12,5 % theo
Laemmi [5]
20ml dịch nuôi được tủa cồn 80% lạnh ly tâm thu tủa hòa trong 200mcl nước chạy
điện di trên gel polyacrylamis 12,5 % theo Laemmi. Sau khi điện di gel được rửa bằng
nước cất và ngâm ủ trong CMC 1% trong 2h ở 37 ºC nhuộm bằng thuốc nhuộm lugo.
Vị trí nào trên gel có cellulase sẽ cho vạch trắng ( không bắt màu với lugo).
2.2.2.6. Phương pháp xác định hoạt tính tương đối thủy phân bã agar
Sử dụng phương pháp DNSA (mục 2.2.3) để đo hoạt tính thủy phân bã agar của
các enzym cellulase. Mẫu enzym nào có so đo cao nhất được đánh giá là 100% hoạt tính
tương đối, các mẫu enzym khác có hoạt tính thấp hơn sẽ được so sánh với mẫu cao nhất
tính theo %.
2.2.3 Phương pháp nuôi cấy và đánh giá khả năng sinh tổng hợp cellulase của vi
sinh vật
2.2.3.1. Các phương pháp nuôi vi sinh vật
Cân chính xác thành phần môi trường nuôi cấy cho vào bình tam giác 1000ml chứa
sẵn khoảng 800 ml nước cất. Đun sôi nhẹ và khuấy cho CMC tan hết. Bao gói và hấp
khử trùng ở 121oC, 20 phút. (thành phần môi trường nuôi cấy ở Phụ lục II)
* Các bước tiến hành nuôi cấy vi sinh vật
Cho 2ml nước muối sinh lý vào ống nghiệm chứa khuẩn lạc của chủng vi sinh vật.
Dùng que cấy móc cà nhẹ lên môi trường thạch để sinh khối tế bào hòa vào dịch muối.
Chuyển dịch muối chứa sinh khối vi sinh vật vào bình môi trường đã pha ở trên. Nuôi
cấy trong điều kiện lắc 200 vòng/phút ở 280C trong 48h để thu enzym cellulase.
48
2.2.3.2. Đánh giá sinh trưởng của vi khuẩn
Sinh trưởng của vi khuẩn được xác định bằng cách đo mật độ quang học (OD) của
dịch nuôi cấy trên may so màu quang phổ ở bước sóng 620nm.
2.2.3.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh cellulase của vi sinh vật
Đánh giá hoạt tính sinh cellulase của vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán trên
thạch có cơ chất CMC và bột giấy.
Nguyên tắc của phương pháp là nuôi vi sinh trên môi đặc hiệu có bổ sung cơ chất
CMC như sau:
* Môi trường xác định hoạt tính
- Môi trường Cell .
Thành phần gồm có (g/l):
(NH4)2HPO4 1,5
KH2PO4 0,5
K2HPO4 0,5
MgSO4 .H2O 0,4
NaCl 0,1
MnSO40,01
FeSO4 7H2O 0,01
Bột giấy 2
Nước cất 1000ml
- Môi trường Khoáng + CMC:
Thành phần gồm có (g/l):
NH4NO3 : 1
K2HPO4 0,5
KH2PO40,5
MgSO4. 7H2O 0,5
NaCl 1
CaCl2 0,1
FeCl3 0,02
Cao men 0,05
Thạch 20
Nước cất 1000 ml ;
pH = 7,0 - 7,2
Các môi trường được khử trùng ở 121oC trong 30 phút.
Phương pháp đục lỗ: nhỏ 0,2ml dịch nuôi vào các giếng thạch có đường kính
10mm, giữ ở 4oC trong 2h để dịch khuếch tán đều xung quanh giếng thạch. Ủ ở 300C
trong 36 giờ, sau đó tráng dịch Lugol trên đĩa thạch và đo vòng phân hủy trong suốt
không bắt màu nhuộm xung quanh giếng thạch.
49
2.2.3.4. Phương pháp xác định pH tối ưu của enzym cellulase
* Hóa chất và thiết bị
Đệm acetat 0,1 M pha ở các pH 4,5 và 5,5;
Đệm phosphate 0,1 M pha ở các pH 6,5 – 9,5
Máy đo pH Corning 215 (Anh), cân điện tử Shimazu (Nhật Bản), cân kỹ thuật
CALTEX (Tây Đức), máy ly tâm eppendorf (Đức), máy so màu UV-1650PC, máy so
màu UV-1650v.v.
* Tiến hành phản ứng: Thực hiện phản ứng như mô tả ở mục 2.2.3.3 nhưng pha
cơ chất CMC và đệm phản ứng bằng các dung dịch đệm Na-acetat pH: 4,5; 5,5 và đệm
phosphate pH: 6,5; 7,5; 8,5; 9,5. Nhiệt độ phản ứng giữ nguyên ở 400C.
2.2.3.5. Phương pháp xác định nhiệt độ tối ưu của enzym cellulase
* Tiến hành phản ứng
Thực hiện phản ứng như mô tả ở mục 2.2.3.3 cơ chất CMC được pha vào đệm ở
pH tối thích. Tiến hành phản ứng enzym ở các nhiệt độ khác nhau từ: 300C – 800C.
2.2.3.6. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy 2 chủng vi khuẩn B505 và Li đã lựa chọn
+ Lựa chọn môi trường nuôi cấy
Để có thể sản xuất enzyme ở quy mô lớn, chúng tôi tiến hành lựa chọn các nguồn
cơ chất dễ kiếm, rẻ tiền. Chúng tôi tiến hành xác định khả năng sinh trưởng và tiết
enzyme cellulase ngoại bào của 2 chủng Li và B505 trên một số loại cơ chất: bột đậu
tương, bột gạo, nước mắm, môi trường giàu chất khoáng và so sánh với môi trường quy
mô phòng thí nghiệm (môi trường MT1, MT1’, MT2, MT2’, MT3, MT4, MT5, MT6)
(Môi trường nuôi cấy ở Phụ lục II)
+ Thời gian nuôi cấy
Thời gian nuôi cấy cũng là một trong những nhân tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng
và khả năng sinh enzyme của các chủng vi khuẩn. Trong quá trình nuôi cấy và xác định
hoạt tính của chủng B505 và Li được theo dõi ở các mốc thời gian sau:24, 48, 68, 72,
92, 96 h.
+ Nhiệt độ
Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng và
phát triển của vi khuẩn. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng sinh trưởng và tiết
cellulase ngoại bào của 2 chủng B505 ở nhiệt độ 28, 30, 32, 37 và 45 ºC.
50
+ pH
pH cũng là một trong các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng
và phát triển của vi khuẩn. Vì vậy chúng tôi nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của pH (4-
8) đến khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chúng.
2.2.4. Phương pháp xây dựng mô hinh thực nghiệm
2.2.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm tổng quát
Bã thải rong sau sản xuất agar được thu nhận từ cơ sở sản xuất agar của Công
ty TNHH SX & TM Hoàng Yến phường Lãm Hà, Quận Kiến An, thành phố Hải Phòng.
Sau quá trình nấu chiết thu agar, bã agar được loại thải qua giai đoạn lọc khung bản, tiến
hành phân tích đánh giá thành phần cơ bản của bã rong.
Tiến hành đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase ngoại bào của 17 chủng vi
sinh vật trong bộ sưu tập giống vi khuẩn của Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học
Quốc gia Hà Nội. Sau khi lên men, dịch lên men được ly tâm để loại tế bào và sử dụng
dịch lên men để đánh giá khả năng thủy phân cơ chất CMC để tuyển chọn chủng vi sinh
vật sinh cellulase cao. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát như sau:
51
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Tiến hành thí nghiệm tuyển chon chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme
cellulose mạnh, nghiên cứu xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi sản xuất
enzyme cellulase từ chủng vi sinh vật đã tuyển chọn. Sau khi lựa chọn điều kiện tối thích
Nhân giống
cấp 1
Chọn loại VSV thích
hợp
Nhân giống cấp
1
Giống vi sinh
vật
Thu nhận dịch cellulase ngoại bào
Lên men
Chế phẩm
cellulase ngoại
bào thô
Nhân giống
cấp 2
Cá rô phi
Xây dựng công thức
phối chế thức ăn
nuôi cá
Đánh giá hiệu quả nuôi cá
Xác định công thức phối chế
thức ăn phù hợp
Chế phẩm bã
rong thủy
phân
Thủy phân
Bã thải
Agar
Tối ưu hóa quá
trình thủy phân
Nghiên cứu chế
độ thủy phân
Khảo sát
thành phần bã
rong
52
để sản xuất chế phẩm enzyme cellulase ứng dụng để thủy phân bã thải agar để ứng dụng
phối trộn trong thức ăn nuôi cá rô phi.
2.2.4.2. Bố trí thí nghiêm tối ưu hóa quá trình thủy phân bã thải rong bằng enzym
cellulase
Sơ đồ bố trí thí nghiệm theo quy hoạch thực nghiệm để xác định các thông số cho
quá trình thủy phân bã rong:
Tiến hành quy hoạch thực nghiệm xác định ba thông số: Thời gian, nhiệt độ và
nồng độ enzyme.
Trong đó: U1: Thời gian (h)
U2: Tỷ lệ enzyme/cơ chất (ml/g)
U3: Nhiệt độ (0C)
Y: Hàm lượng đường tổng số (g)
Sau khi tiến hành thực nghiệm tối ưu xác định được thời gian, nhiệt độ và nồng độ
enzyme tối ưu cho quá trình thủy phân bã thải Agar.
2.4.4.3. Bố trí thí nghiệm thử nghiệm sử dụng chế phẩm thủy phân bã thải rong
trong thức ăn nuôi cá rô phi
Từ chế phẩm bã rong thủy phân tiến hành phối chế công thức thức ăn nuôi cá rô
phi với hàm lượng Protein là 25% với các tỷ lệ phối trộn chế phẩm bã thải thủy phân.
THỦY PHÂN
U1
U3
Y U2
53
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ thí nghiệm sử dụng chế phẩm bã rong thủy phân trong nuôi
cá rô phi
Ký hiệu các công thức thức ăn thí nghiệm như sau:
CT1: Bổ sung bã rong thủy phân với tỷ lệ 5%
CT2: Bổ sung bã rong thủy phân với tỷ lệ 10%
CT3: Bổ sung bã rong thủy phân với tỷ lệ 15%
CT4: Bổ sung bã rong thủy phân với tỷ lệ 20%
CT5: Bổ sung bã rong thủy phân với tỷ lệ 25%
Cá rô phi được nuôi trong 18 giai có kích thước (3m x 2m x 1 m) bằng 5 loại thức
ăn thí nghiệm có bổ sung bã agar thủy phân với tỷ lệ phối trộn lần lượt là 5%, 10%,
15%, 20%, 25% có có hàm lượng protein 25 %. Khối lượng trung bình cá khi bắt đầu
thí nghiệm là 205,9 ± 4,34 g/con. Trong thời gian thí nghiệm, hàng ngày cho cá ăn 2 lần
5% 20% 15% 10% 25%
Nguyên liệu phối trộn thức ăn
Công thức thức ăn có phối trộn bã rong thủy phân
Thức ăn nuôi cá
Nuôi thử nghiệm
Đánh giá tốc độ sinh trưởng, tỷ lệ sống, hệ số thức
ăn, lựa chọn công thức thức ăn phù hợp
54
vào 8h sáng và 16h. Khẩu phần ăn hàng ngày giai đoạn cá từ 40 – 100g/con là 5% khối
lượng thân, 100 – 150g/con là 4% khối lượng thân giai đoạn từ 150 – 200g/con là 3%
khối lượng thân. Khẩu phần ăn được điều chỉnh theo tăng trưởng của cá. Cứ 20 ngày
dùng vợt bắt 10 cá thể, cân rồi tính trọng lượng trung bình, làm cơ sở để ước tính lượng
cá trong ao. Dựa vào các chỉ tiêu sinh trưởng và tỷ lệ sống mà xác định được công thức
thức ăn tốt nhất.
2.2.4.3. Phương pháp xây dựng khẩu phần công thức thức ăn
Bước 1: Xác định nhu cầu dinh dưỡng, tiêu chuẩn cho gia súc, gia cầm. Nhu cầu
dinh dưỡng theo tiêu chuẩn Việt nam (TCVN) hoặc tham khảo tiêu chuẩn NRC (Mỹ),
ARC(Anh), tiêu chuẩn của Nhật Bản, Hà Lan, Ân Độ.. phù hợp với các giống gia súc
gia cầm và từng giai đoạn sinh trưởng phát triển của con vật.
Bước 2: Chọn lựa các nguyên liệu thức ăn để lập khẩu phần ăn. Phải biết giá trị dinh
dưỡng và giá thành các nguyên liệu thức ăn đó. Nguyên liệu thức ăn phải bảo đảm chất
lượng tốt và phải phù hợp với từng loại gia súc, đảm bảo tính ngon miệng của con vật.
Bước 3: Tiến hành lập khẩu phần. Phương pháp này thường theo các bước chính
sau đây:
- Xác định khối lượng các loại thức ăn bổ sung như khoáng vi lượng, premix vitamin...
Các loại thức ăn này thường chiếm tỷ lệ thấp trong khẩu phần.
- Ấn định khối lượng một số loại thức ăn giàu protein hoặc thức ăn giàu năng lượng
- Trên cơ sở thức ăn đã ấn định tính toán khối lượng các loại thức ăn còn lại. Ta có
thể xác định khối lượng của từng loại thức ăn này bằng 2 phương pháp: phương pháp
đường chéo Pearson hoặc phương pháp dùng phương trình đại số.
- Để phối trộn công thức thức ăn, sử dụng nguyên tắc đường chéo
- Để phối trộn công thức thức ăn, sử dụng nguyên tắc chéo
Protein trong nguyên liệu “A” Tỷ lệ nguyên liệu “A” cần
Mức protein mong muốn
Protein trong nguyên liêu “B” Tỷ lệ nguyên liệu “B” cần
- Dùng WUFFF DA để tính toán giá trị dinh dưỡng của khẩu phần dự kiến
55
- Điều chỉnh và bổ sung: dựa vào tiêu chuẩn ăn để điều chỉnh và bổ sung các chất dinh
dưỡng cho phù hợp với nhu cầu con vật.
2.2.4.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm thử nghiệm thức ăn bổ sung bã rong thủy
phân trong nuôi cá rô phi.
Địa điểm: Xí nghiệp Giống thủy sản
Địa chỉ; Cầu Nguyệt, Kiến An, Hải Phòng.
Hình 2.3. Bố trí các giai nuôi thử nghiệm cá rô phi
* Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của các công thức thức ăn lên sinh trưởng cá
rô phi giai đoạn nuôi thương phẩm: Cá rô phi được nuôi trong 18 giai có kích thước
(3m x 2m x 1 m) bằng 6 loại thức ăn thí nghiệm có bổ sung bã agar thủy phân với tỷ lệ
phối trộn lần lượt là 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% có có hàm lượng protein 25 %. Mỗi
nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Mật độ nuôi là 4 con/m3. Khối lượng trung bình cá khi
bắt đầu thí nghiệm là 205,9 ± 4,34 g/con. Trong thời gian thí nghiệm, hàng ngày cho cá
ăn 2 lần vào 8h sáng và 16h. Khẩu phần ăn hàng ngày giai đoạn cá từ 40 – 100g/con là
5% khối lượng thân, 100 – 150g/con là 4% khối lượng thân giai đoạn từ 150 – 200g/con
là 3% khối lượng thân. Khẩu phần ăn được điều chỉnh theo tăng trưởng của cá. Cứ 20
ngày dùng vợt bắt 10 cá thể, cân rồi tính trọng lượng trung bình, làm cơ sở để ước tính
lượng cá trong ao.
56
- Khẩu phần ăn hàng ngày giai đoạn cá từ 80 – 100g/con là 5% khối lượng thân,
giai đoạn từ 200 – 300g/con là 3% khối lượng thân, giai đoạn 300-400 g/con cho ăn 2%
khối lượng thân , và > 400g/con cho ăn 1% khối lượng thân.
Khẩu phần ăn được tính theo công thức:
X = A x D x S x 95% x F (Kg)
trong đó: A : khối lượng trung bình của cá (kg/con)
D: mật độ cá thả (con/m2)
X: khẩu phần thức ăn
S: tỷ lệ sống tại thời điểm kiểm tra
F: tỷ lệ cho ăn (%)
Khẩu phần ăn được điều chỉnh theo tăng trưởng của cá 20 ngày 1 lần. Cách làm
cụ thể như sau: Cứ 20 ngày dùng vợt bắt 10 cá thể, cân rồi tính trọng lượng trung bình,
làm cơ sở để ước tính lượng cá trong ao.
2.2.4.5. Phương pháp xác định các thông số nuôi cá rô phi
Phương pháp tiếp cận và thu thập số liệu nuôi thử nghiệm
Phương pháp thứ cấp: Thông qua tài liệu tham khảo, các báo cáo khoa học, tài
liệu có liên quan.
Phương pháp sơ cấp: Thông qua việc trực tiếp bố trí thí nghiệm.
Phương pháp trực tiếp: các thông số môi trường sử dụng các thiết bị đo trực tiếp.
Thu thập số liệu định kỳ 20 ngày/lần bằng cách cân đo cá rô phi, xác định tốc độ
sinh trưởng về chiều dài và trọng lượng [7], [8].
*Tỷ lệ sống: TLS (%)
TLS =
Tổng số cá kết thúc thí nghiệm
× 100% Tổng số cá ban đầu thí nghiệm
57
* Tốc độ sinh trưởng
Thí nghiệm tiến hành 80 ngày, tốc độ sinh trưởng của cá rô phi được tính theo
tốc độ tăng trưởng về kích thước và chiều dài.
*Tốc độ sinh trưởng phần trăm theo khối lượng:
WW(%) = Wtb2 – Wtb1
× 100% Wtb1
. * Tốc độ sinh trưởng đặc trưng trên ngày về khối lượng (SGR %/ ngày)(Specific
Growth Rate)
* Tốc độ sinh trưởng tuyệt đối trung bình ngày về khối lượng (DWG)(Daily
Weight Growth)
Wtb1, Wtb2: Khối lượng trung bình tại thời điểm T1 và T2.
Hệ số thức ăn (FCR)
Khối lượng thức ăn đã sử dụng
FCR =
Tổng khối lượng cá tăng trọng
2.3. Hóa chất và thiết bị chủ yếu sử dụng trong luận án
2.3.1. Hóa chất
Carboxymethyl cellulose (CMC), Glucose, Pepton, cao thịt, tinh bột, cao nấm men,
cao malt, MgSO4, CaCl2, K2HPO4, NaHCO3, NaCl,….. các hóa chất nhập ngoại của các
hãng có uy tín trên thế giới như Sigma, Merk, Bio-Canada,…
2.3.2. Thiết bị
Các thiết bị chủ yếu bao gồm: Tủ ủ, Tủ sấy, Thiết bị thủy phân có khuấy đảo dung
tích 30 lít, Máy ly tâm, Cân, Máy đo pH, Máy quang phổ UV vis, máy xay, máy nghiền,
máy ép viên thức ăn, ....
SGRW =
LnWtb2 – LnWtb1
× 100% T2 – T1
DWG =
Wtb2 – Wtb1
(g/ngày) T2 – T1
58
Các thí nghiệm nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Phòng Nghiên
cứu công nghệ Sau thu hoạch - Viện Nghiên cứu Hải sản và Phòng Thí nghiệm Trọng
điểm Quốc gia về Công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ Sinh học, đã có sẵn các thiết
bị, máy móc hiện đại, có độ chính xác cao của đảm bảo cho việc thực hiện đề tài.
2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Phân tích thống kê số liệu sẽ sử dụng tiêu chuẩn t-test, xử lý số liệu tối ưu bằng
phần mềm Design Expert version 6.0 (DX6), các phần mềm Excell và K-graph sẽ được
sử dụng để phân tích và vẽ đồ thị. [1], [4].
59
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát đánh giá khối lượng và thành phần hóa học cơ bản của bã thải rong
câu chỉ vàng sau sản xuất agar
Trước tiên đề tài tiến hành khảo sát và đánh giá lượng phế thải rong sau sản xuất
agar từ các vùng nguyên liệu rong câu chỉ vàng hiện đang có các cơ sở sản xuất agar ở
Việt Nam. Sau khi khảo sát lấy mẫu đánh giá thành phần hóa học cơ bản của bã thải
rong. Kết quả trình bày ở bảng 3.1 ÷3.3.
Bảng 3.1. Khối lượng bã thải rong sau sản xuất agar từ các vùng rong nguyên liệu
khác nhau
STT Vùng nguyên liệu Khối lượng bã thải
(tấn bã thải/1 tấn sản phẩm
agar)
1 Cát Hải - Hải Phòng 8,2
2 Đồ Sơn - Hải Phòng 7,5
3 Đình Vũ - Hải Phòng 7,4
4 Điêm Điềm – Thái Bình 14,3
5 Tiền Hải – Thái Bình 12,6
6 Nam Định 13,75
7 Thanh Hóa 12,8
8 Huế 6,75
9 Bình Định 8,8
10 Phú Yên 8,6
60
* Về khối lượng bã thải:
Từ số liệu ở bảng 3.1 khảo sát đánh giá lượng phế thải rong sau sản xuất agar ở
một số cơ sở sản xuất agar tại Hải Phòng, Nam Định,… cho thấy lượng phế thải rong
thải ra trong quá trình sản xuất agar khá lớn từ 6,75 tấn ÷ 14,3 tấn (tính trên 1 tấn sản
phẩm agar). Lượng phế thải bã rong phụ thuộc rất nhiều vào vùng thu mua rong để sản
xuất agar làm cho tỷ lệ bã thải/sản phẩm có sự biến động và lượng bã phát sinh rất chênh
lệch nhau. Cụ thể, rong câu chỉ vàng ở vùng Bạch Long Vĩ, Cát Hải - Hải Phòng và
vùng Phá Tam Giang, Lăng Cô - Huế thì hàm lượng agar thu được cao tức lượng bã
thải rong thu được thấp vào khoảng 6,75 tấn ÷ 7 tấn/tấn sản phẩm. Trong khi đó, rong
câu chỉ vàng nuôi trồng ở Thái Bình và Nam Định,… thì chất lượng rong kém nên hàm
lượng agar thu được thấp và lượng phế thải cao, nằm trong khoảng 9 tấn ÷ 14 tấn/tấn
agar.
Kết quả điều tra cũng cho thấy chỉ tính riêng tại Hải Phòng đã có một số Công ty
sản xuất agar lớn như Công ty Cổ phần Đồ hộp Hạ Long, Công ty TNHH Hải Long,
Công ty Cổ phần Thương mại Duy Mai, Công ty TNHH Hải Đông, Công ty TNHH
TM&SX Hoàng Yến,… mỗi công ty trung bình sản xuất từ 100 ÷ 200 kg agar/1ngày.
Như vậy hàng năm các công ty này sản xuất khoảng 350 tấn agar và lượng bã thải rong
sau sản xuất agar của các công ty này vào khoảng 3.500 tấn/năm. Như vậy bã thải rong
từ quá trình sản xuất agar khá lớn nên việc nghiên cứu xử lý nhằm tận dụng lượng bã
thải này trong chăn nuôi và hạn chế ô nhiễm môi trường là cần thiết.
Bảng 3.2. Hàm lượng các chất cơ bản trong bã rong câu của một số cơ sở
sản xuất Agar
Chỉ tiêu Protein (%) Tro (%) Cellulose (%) Cát sạn (%)
Bã rong câu 3,26 ± 0,11 12,28 ± 3,77 74,26 ± 4,68 10,2 ± 2,19
Bảng 3.3. Hàm lượng kim loại nặng trong bã rong câu của một số cơ sở sản xuất
Agar
Chỉ
tiêu
Cu
(mg/kg)
Pb
(mg/kg)
Zn
(mg/kg)
Cd
(mg/kg)
Hg
(mg/kg)
As
(mg/kg)
Fe
(mg/kg)
Mn
(mg/kg)
Bã
rong
câu
0,31 ±
0,09
0,29 ±
0,08
0,85 ±
0,16
0,06 ±
0,01
0,03 ±
0,01
0,07 ±
0,02
0,84 ±
0,27
0,48 ±
0,16
61
Từ các kết quả phân tích ở các bảng 3.2 ÷ 3.3 cho thấy:
* Về thành phần hóa học cơ bản của bã thải rong sau sản xuất agar:
Kết quả phân tích ở bảng 3.2 cho thấy bã thải rong sau sản xuất agar có hàm lượng
protein vào khoảng 3,26 ± 0,11%; hàm lượng cellulose vào khoảng 74,26 ± 4,68 %; hàm
lượng tro khá cao 12,28 ± 3,77 %.
Kết quả phân tích trên cũng cho thấy trong bã rong có hàm lượng các nguyên tố
khoáng vi lượng rất đầy đủ và hàm lượng các nguyên tố kim loại nặng (As, Pb, Cd,
Hg,…) đều dưới mức cho phép dùng trong thực phẩm theo tiêu chuẩn của EU do vậy
bã rong từ sản xuất agar hoàn toàn có thể tái sử dụng mà không sợ ảnh hưởng đến vật
nuôi cây trồng. Ngoài các loại thức ăn truyền thống, thì vai trò của các protein, các
vitamin, axit amin và chất khoáng sẽ có ý nghĩa rất lớn đến sự tăng trưởng nhất là yêu
cầu chất lượng thương phẩm đang là vấn đề được đặt lên hàng đầu hiện nay. Việc bổ
sung từng chất khoáng riêng lẻ gặp rất nhiều khó khăn, phức tạp, những chất khoáng,
nhất là khoáng vi lượng chỉ cần một số lượng rất nhỏ nên rất khó định lượng và không
chính xác. Nếu thiếu khoáng chất và vitamin bổ sung vào khẩu phần thức ăn, sẽ giảm
sức đề kháng đồng thời nẩy sinh nhiều dịch bệnh. Việc tận dụng bã rong từ sản xuất
Agar bổ sung vào thức ăn chăn nuôi vừa đảm bảo chất lượng dinh dưỡng vừa mở ra một
hướng mới trong tìm nguyên liệu đối với các nhà máy chế biến thức ăn.
Từ các phân tích ở trên cho thấy bã thải rong từ quá trình sản xuất agar có số
lượng lớn và cũng có một số thành phần dinh dương như protein, khoáng chất và có
hàm lượng kim loại nặng đạt tiêu chuẩn dùng trong thực phẩm và chăn nuôi. Do vậy
việc nghiên cứu xử lý bã thải rong dùng trong chăn nuôi là cần thiết.
3.2. Tuyển chọn chủng vi sinh vật và nghiên cứu một số tính chất cơ bản của các
chủng vi sinh vật tuyển chọn
3.2.1. Kết quả nghiên cứu tuyển chọn các chủng giống vi sinh vật
Tiến hành đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase ngoại bào của 17 chủng vi
sinh vật (6 chủng vi khuẩn, 1 chủng xạ khuẩn, 3 chủng nấm men và 2 chủng nấm sợi và
5 chủng VSV chưa được định tên) trong bộ sưu tập giống vi khuẩn của Viện Công nghệ
Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Trường Đại học Khoa
học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội. Sau khi lên men, dịch lên men được ly tâm để
loại tế bào và sử dụng dịch lên men để đánh giá khả năng thủy phân cơ chất CMC. Kết
quả đánh giá hoạt độ cellulase của 17 chủng vi sinh vật và đánh giá đường kính vòng
62
thủy phân CMC của các chủng có hoạt tinh sinh cellulase cao bằng phương pháp khuếch
tán trên đĩa thạch có cơ chất CMC 1% được trình bày ở hình 3.1, 3.2 và bảng 3.4, 3.5.
Biểu đồ 3.1. Hoạt tính enzyme cellulase của 17 chủng vi sinh vật đã thử nghiệm
Bảng 3.4. Hoạt tính cellulase ngoại bào của 17 chủng vi sinh vật nghiên cứu
STT
Tên chủng
Hoạt tính
(unit/ml) Phân loại
sơ bộ
1 Bacillus subtilis VTCC-B-26 5,20
Vi khuẩn
2 Bacillus subtilis VTCC-B-505 9,95
3 Bacillus lichenformis- Li 9,76
4 CFd 7,71
5 CFh 1,45
6 MSM 04 0,90
7 MSM 11 0,92
8 Streptomyces sp VTCC-A-62 0,90
9 Saccharomyces fibulgera VTCC-Y-519 1,35 Nấm men
10 Sarcharomyces fibulgera VTCC-Y-529 2,67
0
2
4
6
8
10
12H
oạt
tín
h c
ellu
lase
(unit
/mt)
Chủng VSV
63
11 Sarcharomyces capsularis VTCC-Y-32 1,81
12 Aspergillus niger VTCC-F273 1,08 Nấm sợi
13 Tricoderma konigii VTCC-708 0,89
14 1’ 1,32
Chưa phân
loại
15 V2 0,93
16 V3 1,10
17 V4 1,07
Hình 3.1. Hình ảnh về đường kính vòng thủy phân CMCcủa 4 chủng vi
sinh vật lựa chọn trên đĩa thạch chứa 1% CMC
Số 1 và 4: Đối chứng dương: enzyme cellulase 1mg/ml; Số 2: B505; Số3: Li; Số
5: B26 và số 6: CFd
Bảng 3.5. Hoạt tính enzym cellulase của chủng Li, B505, B26 và CFd
STT Tên vi sinh vật Đường kính vòng thủy phân (mm)
1 B505 34,0
2 Li 29,5
3 B26 26,0
4 CFd 27,5
Từ các phân tích ở hình 3.1, 3.2 và các bảng 3.4, 3.5 cho thấy:
5
4
6
1
2 3
64
* Về hoạt tính sinh cellulase
Các vi sinh vật được nuôi trong các môi trường đặc trưng có bổ sung CMC làm
cơ chất cảm ứng cho việc sinh enzym cellulase và CMC là cơ chất đặc hiệu cho cellulose
[2], [28], [32], [33], [66]. Kết quả thí nghiệm ở hình 3.1 cho thấy 4 chủng Li, B26, B505
và CFd có hoạt tính enzyme cellulase mạnh hơn các chủng khác đã thử nghiệm. Chủng
Li và chủng B505 là hai chủng có khả năng tiết cellulase mạnh nhất với hoạt tính lên
đến gần 10 unit/ml, cao gấp 6-7 lần so với các chủng khác. Bốn chủng B26, B505, Li và
CFd sinh cellulase mạnh thuộc nhóm vi khuẩn, trong đó các chủng B26, B505 và Li
thuộc chi Baccillus (bảng 3.5). Kết quả nghiên cứu của đề tài phù hợp với các nghiên
cứu của một số tác giả nước ngoài. Chẳng hạn, Peter đã nghiên cứu và cho rằng trong số
các loại vi khuẩn thủy phân cellulose, 87% là các vi khuẩn thuộc chi Baccillus [100];
Nghiên cứu của Mawadza C, Hatti-Kaul R. (2000) và Seung Hwan Park, Ha Keun Kim
(1991) cho thấy B. subtilis có khả năng sản xuất enzym cellulase mạnh [91], [100], [123];
Howard và cộng sự, Singh C.P. và cộng sự cũng chỉ ra rằng có nhiều chủng khuẩn thuộc
chi Bacillus như: B. subtilis, B. macerans, B. sp, B. lichenformis, B. sphaericus có khả
năng sinh enzyme cellulase cao [75], [118], [119].
* Về đánh giá đường kính vòng thủy phân cellulase
Kết quả kiểm tra đường kính vòng thủy phân cellulase của 4 chủng vi sinh vật (Li,
B505, B26 và CFd) bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch với cơ chất CMC 1%
cho thấy B505 và Li là hai chủng có khả năng tiết cellulase mạnh nhất có đường kính
vòng thủy phân là 34 mm và 29,5 mm, cao hơn đường kính vòng thủy phân của B26 và
CFd kết quả tương tự với phương pháp đánh giá hoạt tính cellulase. Kết quả ở hình 3.2
và bảng 3.5 cho thấy chủng vi khuẩn B505 có hoạt tính cellulase cao nhất, cao gấp 1,15
÷ 1,3 lần so với đường kính vòng thủy phân CMC của các chủng Li, B26 và CFd.
Từ kết quả đánh giá hoạt độ của enzyme cellulase và phương pháp đánh giá đường
kính vòng thủy phân bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch có cơ chất CMC 1%
đã cho thấy 4 chủng sinh cellulase ngoại bài cao là:Bacillus lichenformis (Li), Bacillus
subtilis VTCC-B-505, Bacillus subtilis VTCC-B-26 và CFd. Vì thế 4 chủng này được
lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu ở các phần sau.
65
3.2.2. Nghiên cứu một số tính chất cơ bản của các chủng vi sinh vật tuyển chọn
3.2.2.1. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của các
chủng vi khuẩn đã lựa chọn
Tiến hành 4 lô thí nghiệm, mỗi lô 24 thí nghiệm nghiên cứu đánh giá khả năng
sinh cellulase của 4 chủng đã lựa chọn có hoạt tính sinh cellulase cao ở các pH khác
nhau từ 4,5 ÷9,5. Lô thí nghiệm 1: nghiên cứu khả năng sinh cellulase của chủng vi
khuẩn Li; Lô thí nghiệm 2: nghiên cứu khả năng sinh cellulase của chủng vi khuẩn B505;
Lô thí nghiệm 3: nghiên cứu khả năng sinh cellulase của chủng vi khuẩn B26 và Lô thí
nghiệm 4: nghiên cứu khả năng sinh cellulase của chủng vi khuẩn CFd. Các thí nghiệm
đều tiến hành ở môi trường nuôi cấy vi khuẩn (CMC:10g; Pepton:0.5g; Cao thịt:0.2g;
NaCl:1g; Nước cất:1lít) có cơ chất CMC và đệm phản ứng bằng các dung dịch đệm Na-
acetat pH: 4,5; 5,5 và đệm phosphate pH: 6,5; 7,5; 8,5; 9,5, ở cùng điều kiện nhiệt độ ở
400C và thời gian 48 h. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh cellulase
được trình bày ở hình 3.3.
Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ enzym cellulase ngoại bào của bốn
chủng vi khuẩn Li, B26, B505, CFd
Từ các kết quả phân tích ở các hình 3.3 cho thấy ảnh hưởng của pH lên hoạt độ
enzym cellulase của bốn chủng Li, B505, B 26, CFd cho thấy enzyme cellulase ngoai
0
2
4
6
8
10
12
4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5
Ho
ạt đ
ộ (
unit
/ml.
h )
pH
Li B 505 B 26 CFd
66
bào của chủng Li, B505 và CFd có hoạt tính cao nhất tại pH 5,5; riêng enzyme cellulase
ngoai bào của chủng B26 có hoạt tính cao nhất tại pH 6,5. Như vậy enzyme cellulase
ngoại bào của 4 chủng trên hoạt động mạnh trong vùng pH trung tính (pH = 5,5÷ 6,5).
3.2.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp khả năng sinh tổng
hợp enzyme cellulase của các chủng vi khuẩn đã lựa chọn
Tiến hành 4 lô thí nghiệm, mỗi lô 24 thí nghiệm nghiên cứu đánh giá khả năng
sinh cellulase của 4 chủng vi khuẩn đã lựa chọn có hoạt sinh cellulase cao ở nhiệt độ
khác nhau từ 300C ÷800C. Lô thí nghiệm 1: nghiên cứu khả năng sinh cellulase của
chủng vi khuẩn Li; Lô thí nghiệm 2: nghiên cứu khả năng sinh cellulase của chủng vi
khuẩn B505; Lô thí nghiệm 3: nghiên cứu khả năng sinh cellulase của chủng vi khuẩn
B26 và Lô thí nghiệm 4: nghiên cứu khả năng sinh cellulase của chủng vi khuẩn CFd.
Các thí nghiệm đều tiến hành ở môi trường nuôi cấy vi khuẩn (CMC:10g; Pepton:0.5g;
Cao thịt:0.2g; NaCl:1g; Nước cất:1lít) có cơ chất CMC và đệm phản ứng bằng cùng
nồng độ dung dịch đệm Na-acetat pH: 5,5, thời gian 48 h, thay đổi nhiệt độ của phản
ứng enzym từ 30-80C. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh
cellulase được trình bày ở hình 3.4.
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ enzym cellulase ngoại bào của 4
chủng Li, B26, B505, CFd
0
5
10
15
20
25
30
35
30 40 50 60 70 80
Ho
ạt đ
ộ (
unit
/ml.
h)
Nhiệt độ
Li
B 505
B 26
CFd
67
Từ các kết quả phân tích ở hình 3.4 cho thấy mỗi enzyme có hoạt đông tối ưu ở
một nhiệt độ thích hợp. Hoạt tính enzyme sẽ mạnh nhất khi hoạt động tại vùng nhiệt độ
tối thích và giảm dần khi quá ngưỡng nhiệt độ này. Trên hình 3.4 cho thấy enzyme
cellulase ngoại bào của chủng Li có hoạt tính cao nhất tại nhiệt độ 50C, enzyme
cellulase ngoai bào của chủng B505, B26 và CFd có hoạt tính cao nhất tại nhiệt độ 60C.
Rất nhiều loại enzyme cellulase của vi sinh vật đã được nghiên cứu, phần lớn các enzyme
của các vi sinh vật được sử dụng trong xử lý rác thải có vùng nhiệt độ hoạt động tối
thích khá cao khoảng từ 50-70C [3]. Các enzyme cellulase ngoại bào của 4 chủng vi
sinh vật mà chúng tôi sàng lọc được hoạt động mạnh trong vùng nhiệt độ từ 50-60C,
đây là vùng nhiệt độ rất thích hợp cho quá trinh xử lý bã agar vì nhiệt độ này không làm
mất hoạt tính các khoáng vi lượng, protein va acid amin có trong thành phần bã rong để
sử dụng làm thức ăn gia súc.
Qua kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ enzym cellulase ngoại
bào của 4 chủng: Bacillus lichenformis (Li), Bacillus subtilis VTCC-B-505, Bacillus
subtilis VTCC-B-26 và CFd). Với các điều kiện pH (5,5) và nhiệt độ (50-60oC) tối ưu
cho thấy 2 enzym cellulase ngoại bào của chủng Li và B505 có hoạt tính Cx mạnh nhất.
3.2.2.3. Sơ bộ đánh giá trọng lượng phân tử của cellulase của 2 chủng Li và B505
bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamis
Để sơ bộ đánh giá trọng lượng phân tử của enzyme cellulase ngoại bào thu được
từ 2 chủng Li và B505 bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamis12,5% theo
Laemmi. Kết quả điện di được trình bày trong hình 3.5.
68
Hình 3.2. Điện di đồ chế phẩm cellulase thô thu nhận từ vi khuẩn B505 và Li trên
gel polyacrylamis 12,5 % theo hệ đệm Laemmi
Kết quả điện di trên gel polyacrylamis chế phẩm cellulase thu nhận từ môi trường
nuôi cấy 2 chủng vi khuẩn Li và B505 trình bày ở hình 3.5 cho thấy 2 chế phẩm enzyme
ngoại bào thu được từ chủng Li và B505 đều cho một băng hoạt tính protein có hoạt tính
cellulase. Kết quả trên điện di cũng cho thấy enzyme cellulase từ 2 chủng Li và B505
trên có trọng lượng phân tử tương đương với nhau. So sánh băng điện di chế phẩm
enzyme thu nhận từ 2 chủng vi khuẩn Li và B505 với trọng lượng phân tử của protein
chuẩn thì 2 enzyme cellulase này có trọng lượng phân tử nằm trong khoảng 115 Kda.
Từ các phân tích ở trên cho thấy enzyme cellulase từ hai chủng vi khuẩn Li và B505
có trọng lượng phân tử nằm trong khoảng 115 Kda, kết quả này phù hợp với một số kết
quả nghiên cứu của Begunin (1990); Gilkes và cộng sự (1991)cho rằng trọng lượng phân
tử của enzyme cellulase nằm trong khoảng 30-110 Kdal.
3.2.2.4. So sách hoạt tính cellulase của 2 chủng Li và B505 với hoạt tính cellulase
của Tricoderma konigii
Tiến hành đánh giá khả năng thủy phân cellulose bột giấy của cellulase từ hai
A B
14,4
KDa
20,1
30
45
66
96
120 KDa
~ 115 kda A. Phổ điện di cellulase
của chế phẩm enzym
ngoại bào từ chủng Li và
B505
B. Phổ điện di protein
của chế phẩm enzym
ngoại bào từ chủng Li và
B505
Li B505 Li B505
69
chủng B505 và Liso sánh khả năng thủy phân bột giấy của cellulase ngoại bào được tiết ra
từ chủng nấm Trichoderma konigii, là chủng nấm thường được dùng để sản xuất cellulase
ứng dụng nhiều trong thực tiễn. Kết quả được trình bày trong hình 3.6 và bảng 3.6.
Hình 3.3. So sánh vòng thủy phân của cellulase từ vi khuẩn Li, B505 trên đĩa
thạch bổ sung cơ chất bột giấy 0,2%
1. Cellulase của chủng Tricoderma konigii nuôi trên môi trường cell
2. Cellulase của chủng Bacillus lichenformis (Li)
3. Cellulase của chủng Bacillus subtilis VTCC-B-505
Bảng 3.6. Hoạt tính cellulase ngoại bào của chủng Li, B505 trên đĩa thạch có cơ
chất bột giấy 0,2%
STT Nguồn cellulase
Đường kính vòng
thủy phân bột giấy
(cm)
1 Cellulase từ T. konigii nuôi trên môi trường Cell 1,4
2 Cellulase từ B. lichenformis (Li) 1,3
3 Cellulase từ B. subtilis VTCC-B-505 1,2
Từ các kết quả phân tích ở các hình 3.6 và bảng 3.6 cho thấy:
1
2
3
70
Kết quả từ hình 3.6 và bảng 3.6 cho thấy 2 chủng vi khuẩn B505 và Li cũng sinh
cellulase ngoại bào thủy phân bột giấy mạnh (1,2-1,3 cm) gần bằng chủng nấm
Tricoderma konigii (1,4 cm).
Các kết quả khảo sát hoạt tính cellulase và sàng lọc các chủng cho thấy 2 chủng
vi khuẩn B. subtilis VTCC-B-505 và B. lichenformis (Li) có cả hai hoạt tính thuỷ phân
CMC (Cx) và bột giấy cao, rất thích hợp cho việc thuỷ phân cellulose.
3.2.2.4. Thử nghiệm khả năng thủy phân bã agar bằng enzyme cellulase từ chủng
Li và B505.
Tiến hành 3 mẫu thí nghiệm thử nghiệm khả năng thủy phân bã thải agar, mỗi mẫu
cho 5 gram bả thải agar và 5 ml chế phẩm enzyme thu nhận được từ Li, B505, và hỗn
hợp chế phẩm enzym của 4 chủng vi sinh vật B505, B26, Li, CFd. Kết quả nghiên cứu
thử nghiệm khả năng thủy phân bã thải agar và qui trình thu nhận chế phẩm sinh học từ
2 chủng Li và B505 từ các chế phẩm enzyme cellulase ngoại bào của 2 chủng Li và
B505 được trình bày ở bảng 3.7 và các hình 3.7 ÷3.8.
Bảng 3.7. Khả năng thủy phân bã thải agar bằng cellulase từ 2 chủng Li và B505
STT Chế phẩm cellulase ngoại bào Đối
chứng
Độ mủn
của mẫu
Hoạt tính
tương đối
(%)
1
5ml enzym của B505 + 5gr bã thải agar +
15ml đệm acetate 0.01M, pH 5.5 (lắc
200v/p, 500C, 60giờ)
- xxxxx 100,0
2
5ml enzym của Li + 5gr bã thải agar + 15ml
đệm acetate 0.01M, pH 5.5 (lắc 200v/p,
500C, 60giờ)
- xxxxx 96,0
3
5 ml enzym của 4 chủng vsv (B505, B26, Li,
CFd) + 5 gr bã thải agar + 15 ml đệm acetate
0.01M, pH 5.5 ( lắc 200v/p, 500C, 60giờ)
- xxxx 83,0
Đối chứng: Mỗi mẫu có một mẫu đối chứng. Mẫu đối chứng chỉ bao gồm bả thải agar và đệm
hoặc nước, lắc trong cùng điều kiện nhiệt độ và thời gian như mẫu xử lý.
71
Hình 3.4. Khả năng thủy phân bã thải agar của cellulase ngoại bào từ chủng Li và B505
Hình 3.5. Khả năng thủy phân bã thải agar của hỗn hợp cellulase ngoại bào
từ 4 chủng (B505, B26, Li, CFd)
Từ các kết quả phân tích ở trên bảng 3.7, hình 3.7, hình 3.8cho thấy enzyme
cellulase ngoại bào của 2 chủng Li và B505 có khả năng thủy phân bã agar rất tốt và
hiệu quả hơn khi sử dụng hỗn hợp của 4 enzym ngoại bào mạnh nhất đã sàng lọc
được.Hiệu quả thủy phân bã gar của hai chủng Li và B505 cũng dễ dàng nhận ra bằng
cảm quan. Các mẫu bã agar bị loãng ra khi bổ sung enzym cellulase của chủng Li và
B505 so với mẫu đối chứng.
Điều này cho thấy khả năng ứng dụng của hai chủng vi khuẩn B. subtilis VTCC-
B-505 và B. lichenformis (Li) này để xử lý bã agar trong công nghiệp là rất khả thi.
72
3.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy 2 chủng vi khuẩn B.
Subtilis VTCC B-505 và B. Lichenformis (Li) và ứng dụng thủy phân bã rong câu
(G. Verrucosa) sau sản xuất Agar
3.3.1. Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi sản xuất enzyme cellulase
từ 2 chủng B505 và Li
3.3.1.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy
Tiến hành 2 lô thí nghiệm mỗi lô 6 thí nghiệm nuôi cấy vi khuẩn sinh cellulase
trên các môi trường nuôi cấy khác nhau: bột đậu tương, bột gạo, nước mắm, môi trường
giàu chất khoáng và so sánh với môi trường quy mô phòng thí nghiệm (môi trường MT1,
MT1’, MT2, MT2’, MT3, MT4, MT5, MT6). Lô 1 nuôi cấy chủngvi khuẩn B. subtilis
VTCC-B-505 và Lô 2 nuôi cấy chủng B. lichenformis (Li). Sau khi nuôi cấy đánh giá
khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulose bằng phương pháp đo mật độ quang
học (OD) của dịch nuôi cấy trên máy so màu quang phổ ở bước sóng 620nm. Và xác
định hoạt tính cellulase bằng phương pháp khuếch tán trên thạch có cơ chất CMC. 0,2ml
dịch enzyme thô nhỏ vào các giếng thạch có đường kính 10mm, ủ ở 300C, sau 24 giờ
tráng lên đĩa dịch lugol, đo vòng phân hủy trong suốt không bắt màu thuốc nhuộm xung
quanh giếng thạch. Kết quả trình bày trong bảng 3.8÷ 3.9, và hình 3.9 ÷ 3.10.
Hình 3.6. Hình ảnh về vòng thủy phân của cellulase từ chủng B505 nuôi trong các
môi trường khác nhau
MT1
MT1, MT 3
MT4 MT5
MT 6
73
Bảng 3.8. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng B505 nuôi
trong các môi trường khác nhau
STT Môi trường OD (620 nm) Đường kính vòng thủy phân
CMC (cm)
1 MT1 1,62 0,88
2 MT1’ 2,38 0,9
3 MT3 1,49 0,8
4 MT4 0,98 0,67
5 MT5 1,38 0,9
6 MT6 0,82 0,78
Bảng 3.9. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng Li nuôi cấy
ở các môi trường khác nhau
STT Môi trường OD (nm) Đường kính vòng thủy phân
CMC (cm)
1 MT2 2,56 0,9
2 MT2’ 1,13 0,88
3 MT3 1,11 0,78
4 MT4 0,7 0,88
5 MT5 0,94 1,12
6 MT6 0,36 0,78
74
Hình 3.7. Hình ảnh về vòng thủy phân của cellulase từ chủng vi khuẩn Li nuôi
trong các môi trường khác nhau
Từ các kết quả phân tích ở trên bảng 3.8÷ 3.9 và các hình 3.9 ÷ 3.10 cho thấy:
+ Về hoạt tính cellulase của chủng B. subtilis VTCC-B-505: Kết quả bảng 3.8,
hình 3.9 cho thấy ở điều kiện dinh dưỡng trong môi trường MT1’ và MT5 chủng B505
có khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase cao nhất có đường kính vòng thủy
phân là 0,9 cm cao gấp 1,02 lần so với MT1; cao gấp 1,125 lần so với MT3; 1,37 lần so
với MT4 và cao gấp 1,153 lần so với MT6. Môi trường nuôi cấy nuôi cấy vi khuẩn hỗn
hợp của nhiều thành phần có thể đáp ứng yêu cầu về dưỡng chất như nguồn C, nguồn
N, vitamin, khoáng. Môi trường MT1’ (CMC 2g; CaCl2 0,2g; NaCl 2g; Cao thịt 1g,
nước cất 1lit) có nguồn C và nguồn N từ môi trường tổng hợp nên giá thành cao. Còn
môi trường nuôi cấy MT5: (CMC 2g; bột đậu tương 2g, bột gạo 2g; NH4Cl 0,4g,
KH2PO4 0,6g; K2HPO4 1g; nước cất 1lit) có nguồn C và nguồn N từ môi trường tự nhiên
là bột đậu tương, bột gao và có giá thành rẻ hơn. Do đó để sản xuất quy mô lớn, môi
trường nuôi cấy MT5: (CMC 2g; bột đậu tương 2g, bột gạo 2g; NH4Cl 0,4g, KH2PO4
0,6g; K2HPO4 1g; nước cất 1lit) là môi trường kinh tế hơn môi trường MT1’.
+ Về hoạt tính cellulase của chủng B. lichenformis (Li): Kết quả nghiên cứu
trình bày ở bảng 3.9 và hình 3.10 cho thấy ở điều kiện dinh dưỡng trong môi trường
MT5 (CMC 2g; bột đậu tương 2g, bột gạo 2g; NH4Cl 0,4g, KH2PO4 0,6g; K2HPO4 1g;
nước cất 1lit) chủng Li có khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase cao nhất có
MT2
MT2’
MT3
MT4
MT5 MT6
75
đường kính vòng thủy phân là 1,12 cm cao gấp 1,24 lần so với MT2; cao gấp 1, 27 lần
so với MT2’ và MT4; và cao gấp 1,33 lần so với MT3 và MT6.
Như vậy môi trường MT5 là môi trường thích hợp cho cả hai chủng Li và B505,
trên cơ sở đó đề tài đã tiến hành xác định các điều kiện nuôi cấy tối ưu của 2 chủng vi
khuẩn Bacillus subtilis VTCC-B-505 và Bacillus lichenformis (Li).
3.3.1.2.Xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu
Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát
triển của vi khuẩn. Vì vậy thí nghiệm tiến hành khảo sát khả năng sinh trưởng và tiết
cellulase ngoại bào của 2 chủng B505 và Li ở nhiệt độ 25, 30, 35, 40, 45 và 50ºC. Kết
quả trình bày trong bảng 3.10 và hình 3.11.
250C
300C
35oC
40ºC
45ºC
Hình 3.8. Khả năng sinh trưởng và vòng hoạt tính của chủng B505 và chủng Li
tại các nhiệt độ khác nhau
B505 Li Li B505
Li B505 B505 Li Li B505
76
Bảng 3.10. Khả năng sinh trưởng và vòng hoạt tính của chủng B505 và chủng Li
tại các nhiệt độ khác nhau
STT
Nhiệt độ
(0C)
Chủng B505 Chủng Li
OD (nm) Vòng hoạt tính (cm) OD(nm) Vòng hoạt tính (cm)
1 25 2,206 0,68 0,969 0,65
2 30 2,321 0,85 1,125 0,9
3 35 2,38 0,75 0,905 0,75
4 40 2,2 0,78 1,027 0,8
5 45 2,12 0,80 1,14 1,1
6 50 2,1 0,75 1,1 1,0
Nhiệt độ của môi trường cũng có ảnh hưởng rất lớn đối với sự sinh trưởng của vi
sinh vật. Trên thực tế, do vi sinh vật thường là các sinh vật đơn bào cho nên chúng rất
mẫn cảm với sự biến hóa của nhiệt độ, và thường bị biến hóa cùng với sự biến hóa về
nhiệt độ của môi trường. Trong phạm vi nhiệt độ thấp, khi nhiệt độ tăng lên sẽ làm tăng
tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật, vì các phản ứng trong tế bào đều tăng cho nên toàn
bộ hoạt động trao đổi chất sẽ tăng lên khi nhiệt độ cao hơn, và vi sinh vật sẽ sinh trưởng
nhanh hơn. Lúc nhiệt độ tăng lên đến một mức độ nhất định thì nhiệt độ càng tăng tốc
độ sinh trưởng càng giảm. Khi nhiệt độ tăng quá cao vi sinh vật sẽ chết. Khi nhiệt độ
quá cao sẽ gây ra sự biến tính của enzym, của các thể vận chuyển (transport carriers) và
các protein khác. Màng sinh chất sẽ bị tổn thương vì hai lớp lipid sẽ bị hòa tan, tế bào
bị tổn thương đến mức khó hồi phục và dẫn đến việc ức chế sinh trưởng. Qua kết quả
trên cho thấy các chủng vi khuẩn sẽ sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở trong khoảng
nhiệt độ thích hợp.
Từ các phân tích ở trên cho thấy, nhiệt độ thích hợp cho chủng B505 sinh trưởng
và tiết cellulase là 300C và nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn Li sinh trưởng phát triển,
sinh cellulase 450C.
3.3.1.3. Xác định pH nuôi cấy tối ưu
pH cũng là một trong các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng
và phát triển của vi khuẩn. Vì vậy chúng tôi nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của pH đến
77
khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào. Kết quả trình bày trong bảng 3.11 và
hình 3.12.
Bảng 3.11. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase của chủng B505 và chủng Li ở
các pH khác nhau
STT
pH Chủng B505 Chủng Li
OD (nm) Vòng hoạt tính (cm) OD (nm) Vòng hoạt tính (cm)
1 4 0,97 0,2 1,87 0,25
2 5 1,05 0,3 2,26 0,5
3 6 1,37 0,4 2,11 0,4
4 7 1,63 0,47 1,97 0,37
5 8 1,13 0,3 1,87 0,48
B505
Li
Hình 3.9. Vòng hoạt tính cellulase của chủng B505 và chủng Li nuôi cấy ở các pH
khác nhau
pH có ảnh hưởng rõ rệt đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật. Mỗi vi sinh vật
đều có một phạm vi pH sinh trưởng nhất định và pH sinh trưởng tốt nhất. Phần lớn vi
khuẩn và động vật nguyên sinh là ưa trung tính là pH 5,5-8,0.
Kết quả ở bảng 3.11 và hình 3.9 cho thấy khả năng tiết cellulase ngoại bào của
chủng B505 và chủng Li cũng chịu ảnh hưởng của các nồng độ pH khác nhau một cách
rõ rệt. Chủng B505 nuôi ở môi trường pH 7 tiết cellulase mạnh nhất trong khi đó chủng
7
4
5 8
6
5
6
8
7
4
78
Li tiết cellulase mạnh nhất khi nuôi trong môi trường có pH 5
3.3.1.4. Thời gian nuôi cấy tối ưu
Thời gian nuôi cấy cũng là một trong những nhân tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng
và khả năng sinh enzyme của các chủng vi khuẩn. Trong quá trình nuôi cấy và xác định
hoạt tính của B. subtilis VTCC-B-505 và B. lichenformis (Li) được theo dõi ở các mốc
thời gian được trình bày ở bảng 3.12 ÷ 3.13 và hình 3.13 ÷3.14.
Bảng 3.12. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng Li theo
thời gian nuôi cấy
STT Thời gian (giờ) Li
OD (620 nm) Hoạt tính cellulase tương đối (%)
1 24 0,502 88,9
2 48 0,797 97,8
3 60 0,828 100
4 72 0,769 97,8
5 96 0,804 97,8
Biểu đồ 3.4. Hoạt tính cellulase ngoại bào của chủng Li theo thời gian nuôi cấy
60
70
80
90
100
24 48 60 72 96
Họ
a tí
nh t
ươ
ng đ
ối
(%)
Thời gian nuôi cấy (h)
79
Bảng 3.13. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng B505 theo
thời gian nuôi cấy
STT Thời gian (giờ) B505
OD (620 nm) Hoạt tính cellulase tương đối (%)
1 8 0,3412 62,1
2 24 0,4215 73,4
3 48 0,5287 93,6
4 60 0,5594 99
5 72 0,5721 100
6 96 0,5854 99,6
Biểu đồ 3.5. Sự thay đổi hoạt tính cellulase của chủng B505 theo thời gian nuôi cấy
Từ các kết quả phân tích ở các bảng 3.12 ÷ 3.13 và hình 3.13 ÷3.14 cho thấy chủng
Li sau 60 giờ nuôi cấy tiết cellulase ngoại bào mạnh nhất và sau 60 giờ nuôi cấy chủng
B505, enzyme CMCase ngoại bào thô thu được có hoạt tính đạt 99 % so với hoạt tính
enzyme CMCase ngoại bào thu được tại 72 giờ nuôi cấy. Như vậy 60 giờ nuôi cấy chủng
B505 thu dịch enzyme cho hiệu quả kinh tế cao nhất, tiết kiệm được giá thành sản xuất.
60
70
80
90
100
24 48 60 72 96
Ho
ạt t
ính t
ươ
ng đ
ối
của
cell
ula
se
(% s
o v
ới
cực
đại
)
Thời gian nuôi cấy (giờ)
80
Các kết quả nghiên cứu ghi nhận được như sau: các điều kiện tối ưu cho sinh
trưởng và sinh cellulase có hoạt tính của 2 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis VTCC-B-
505 và Bacillus lichenformis (Li), môi trường MT5; pH 5-7; nhiệt độ 30 – 450C, thời
gian 60 phút.
3.3.2. Đề xuất quy trình nuôi cấy và thu nhận chế phẩm cellulase thô
Từ những kết quả nghiên cứu ở trên, đề tài đưa ra quy trình nuôi cấy và thu nhận
sinh khối enzym thô từ chủng B. substilis VTCC-B-505 hoặc chủng Bacillus
licheniformis Li.
A. Quy trình nuôi cấy và thu nhận sinh khối enzym thô từ chủng B. substilis VTCC-
B-505
Sơ đồ 3.1. Quy trình thu nhận chế phẩm cellulase thô từ chủng B. substilis VTCC-
B-505
Nhân giống cấp 1
(pH=5; T=12-14h; to=28oC)
Nhân giống cấp 2
(pH= 5; T=12-14h; to = 28oC)
Thu nhận dịch cellulase ngoại bào
(Ly tâm 12000 v/ph; T= 10 ph; to = 4oC)
Chế phẩm cellulase ngoại bào thô
(B505 hoạt độ 72 UI/ml;
Giống vi sinh vật
VTCC-B-505 và Li
Lên men
(B505: T= 60h, to = 30oC, 200v/ph;
81
* Thuyết minh quy trình:
+ Giống vi sinh vật
Chủng giống B. substilis VTCC-B-505 là chủng vi khuẩn Việt Nam được phân
lập từ đất và được lưu giữa tại Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật - Viện Vi sinh vật và
Công nghệ Sinh học.
Chủng giống vi sinh vật được bảo quản trong ống thạch nghiêng giữ ở nhiệt độ 40C.
+ Nhân giống
- Nhân giống cấp 1
Giống được cấy từ ống thạch nghiêng vào 5ml môi trường lỏng trong ống nghiệm.
+ Môi trường nhân giống chủngBacillus subtilis VTCC-B-505:
CMC 10g; Pepton 0.5g; Cao thịt 0.2g; NaCl 1g, Tinh bột 1g, Cao nấm men 0.2g,
Nước cất 1lít.
Môi trường nuôi cấy được thanh trùng ở 121ºC thời gian 20 phút.
Điều kiện nuôi cấy: lắc 200 vòng/phút ở 28ºC thời gian 12-14 giờ.
- Nhân giống cấp 2
Cấy chuyển 1% từ dịch nuôi cấy giống cấp 1 sang môi trường nhân giống cấp 2. Môi
trường và điều kiện nuôi cấy như môi trường và điều kiện nuôi cấy nhân giống cấp 1.
+ Lên men
- Môi trường lên men:
- Môi trường lên men chủng Bacillus substilis VTCC-B-505 (môi trường M1):
Thành phần môi trường M1: CMC 2g; bột đậu tương 2g, bột gạo 2g; NH4Cl 0,4g,
KH2PO4 0,6g; K2HPO4 1g; nước cất 1lít; pH 7,0. Môi trường nuôi được thanh trùng ở
121ºC trong 20 phút.
- Qui mô lên men: quy mô phòng thí nghiệm. 1 lit môi trường lên men trong bình
tam giác thể tích 5 lít.
- Tỉ lệ cấy giống:1% giống cấp 2 cấy chuyển vào môi trường lên men
Điều kiện lên men:
- Chủng vi khuẩn B505 lên men ở điều kiện nhiệt độ 30ºC, thời gian 60giờ; tốc độ
lắc 200v/phút.
82
+ Thu nhận dịch cellulase ngoại bào
Sau khi kết thúc lên men, dịch lên men được ly tâm để loại tế bào vi khuẩn và thu
dịch cellulase ngoại bào.
Điều kiện ly tâm: 12.000 vòng/phút, thời gian 10 phút, nhiệt độ 4ºC.
+ Chế phẩm cellulase ngoại bào thô B. substilis VTCC-B-505
Các chế phẩm cellulase ngoại bào thu được từ chủng B505 được bảo quản trong
tủ lạnh ở điều kiện nhiệt độ 4ºC (có bổ sung NaNO3 0,02% để diệt vi khuẩn). Chế phẩm
cellulase ngoại bào thô dùng để thủy phân bã thải từ sản xuất agar.Hoạt tính của chế
phẩm cellulase ngoại bào của chủng Bacillus substilis VTCCB-505: 72UI/ml.
B. Quy trình nuôi cấy và thu nhận sinh khối enzym thô từ chủng Bacillus
licheniformis Li.
Sơ đồ 3.2. Quy trình thu nhận chế phẩm cellulase thô từ chủng Bacillus
licheniformis Li.
Nhân giống cấp 1
(pH=5; T=12-14h; to=28oC)
Nhân giống cấp 2
(pH= 5; T=12-14h; to = 28oC)
Thu nhận dịch cellulase ngoại bào
(Ly tâm 12000 v/ph; T= 10 ph; to = 4oC)
Chế phẩm cellulase ngoại bào thô
Li hoạt độ 54 UI/ml
Giống vi sinh vật Li
Lên men
(Li: T= 72h, to = 45oC, 200v/ph)
83
* Thuyết minh quy trình:
+ Giống vi sinh vật
Chủng giống B. lichenformis Li được phân lập từ ruột tằm do Trung tâm Biolap
phân lập và cung cấp.
Chủng giống vi sinh vật được bảo quản trong ống thạch nghiêng giữ ở nhiệt độ 40C.
+ Nhân giống
- Nhân giống cấp 1
Giống được cấy từ ống thạch nghiêng vào 5ml môi trường lỏng trong ống nghiệm.
+ Môi trường nhân giống chủng Bacillus licheniformis Li:
CMC 10g, Tinh bột 1g, MgSO4 0.2g, NaHCO3 0.2g, K2HPO4 5g, CaCl2 0.2g, NaCl
0.2g, Pepton 2g, Nước cất 1lít.
Môi trường nuôi cấy được thanh trùng ở 121ºC thời gian 20 phút.
Điều kiện nuôi cấy: lắc 200 vòng/phút ở 28ºC thời gian 12-14 giờ.
- Nhân giống cấp 2
Cấy chuyển 1% từ dịch nuôi cấy giống cấp 1 sang môi trường nhân giống cấp 2. Môi
trường và điều kiện nuôi cấy như môi trường và điều kiện nuôi cấy nhân giống cấp 1.
+ Lên men
- Môi trường lên men:
- Môi trường lên men chủng Bacillus licheniformis Li (môi trường M2): Thành
phần môi trường M2: CMC 2g; bột đậu tương 2g, bột gạo 2g; NH4Cl 0,4g, KH2PO4
0,6g; K2HPO4 1g; nước cất 1lit; pH 5,0. Môi trường lên men được thanh trùng ở 121ºC
trong 20 phút.
- Qui mô lên men: quy mô phòng thí nghiệm. 1 lit môi trường lên men trong bình
tam giác thể tích 5 lít.
- Tỉ lệ cấy giống: 1% giống cấp 2 cấy chuyển vào môi trường lên men
Điều kiện lên men:
- Chủng vi khuẩn Li lên men ở điều kiện nhiệt độ 45ºC, thời gian 60 giờ,
84
+ Thu nhận dịch cellulase ngoại bào
Sau khi kết thúc lên men, dịch lên men được ly tâm để loại tế bào vi khuẩn và thu
dịch cellulase ngoại bào.
Điều kiện ly tâm: 12.000 vòng/phút, thời gian 10 phút, nhiệt độ 4ºC.
+ Chế phẩm cellulase ngoại bào thô
Các chế phẩm cellulase ngoại bào thu được từ chủng Li được bảo quản trong tủ
lạnh ở điều kiện nhiệt độ 4ºC (có bổ sung NaNO3 0,02% để diệt vi khuẩn). Chế phẩm
cellulase ngoại bào thô dùng để thủy phân bã thải từ sản xuất agar. Hoạt tính của chế
phẩm cellulase ngoại bào của chủng Bacillus lichenformis Li: 54 UI/ml.
3.3.3. So sánh đánh giá hoạt tính cellulase của chủng Li và B505 với chế phẩm
cellulase từ các VSV khác
So sánh hoạt tính cellulase ngoại bào của 2 chủng Li và B505 với enzym ngoại bào
của 2 chủng nấm Tricoderma và Aspergillus và enzym cellulase của chủng Bacillus T3
do Viện Công nghệ Sinh học cung cấp bằng phương pháp xác định hoạt tính cellulase
trên môi trường chứa cơ chất CMC (môi trường tối ưu để phát hiện enzym Cx) và môi
trường cell có bổ sung bột giấy (môi trường tốt cho enzym C1 hoạt động). Kết quả được
trình bày ở bảng 3.14 ÷ 3.15 và hình 3.16 ÷ 3.20.
Hình 3.10. Đường kính vòng thủy phân của cellulase từ Li, B505 và T3 trên đĩa
thạch có cơ chất CMC 0,2%
85
Hình 3.11. Đường kính vòng thủy phân
cellulase từ Tricoderma trên đĩa thạch có
cơ chất CMC 0,2 %
Hình 3.12. Hoạt tính cellulase Aspergillus
trên đĩa thạch có cơ chất CMC 0,2 %
Ghi chú: Mẫu 1: Cellulase từ A. niger nuôi trên môi trường Cell; Mẫu 2: Cellulase
từ T. konigii nuôi trên môi trường Cell; Mẫu 3: Cellulase từ A. niger nuôi trên môi trường
Zapek; Mẫu 4: Cellulase từ T. konigii nuôi trên môi trường Zapek; Mẫu 5: Cellulase từ
T. konigii nuôi trên môi trường riêng cho chủng; Mẫu 6: Cellulase từ A. niger nuôi trên
môi trường riêng cho chủng.
Bảng 3.14. So sánh hoạt tính cellulase từ 5 chủng VSV (A. niger, T. konigii, Li,
B505 và T3) trên đĩa thạch có CMC 0,2%
STT Nguồn cellulase Đường kính vòng
thủy phân CMC(cm)
1 Cellulase từ A. niger nuôi trên môi trường Cell 0,1
2 Cellulase từ T. konigii nuôi trên môi trường Cell 0,2
3 Cellulase từ A. niger nuôi trên môi trường Zapek 0,1
4 Chủng T. konigii nuôi trên môi trường Zapek 0,2
5 Cellulase từ T. konigii nuôi trên môi trường riêng cho chủng 0,1
6 Cellulase từ A. niger nuôi trên môi trường riêng cho chủng 0,2
7 Cellulase từ B. substilis VTCC-B-505 0,65
8 Cellulase từ B. lichenformis Li 0,6
9 Cellulase từ Bacillus T3 0,7
86
Ghi chú: Mẫu 1: Cellulase từ A. niger nuôi trên môi trường Cell; Mẫu 2: Cellulase từ T.
konigii nuôi trên môi trường Cell;
Mẫu 3: Cellulase từ A. niger nuôi trên môi trường Zapek; Mẫu 4: Cellulase từ T.
konigii nuôi trên môi trường Zapek;
Mẫu 5: Cellulase từ T. konigii nuôi trên môi trường riêng cho chủng; Mẫu 6:
Cellulase từ A. niger nuôi trên môi trường riêng cho chủng.
Hình 3.14. Hình ảnh về đường kính vòng thủy phân cellulase từ Li, B505 và T3
trên đĩa thạch có cơ chất bột giấy 0,2 %
Hình 3.13. Hoạt tính cellulase của 2 chủng nấm Tricoderma và Aspergillus nuôi ở
các môi trường khác nhau trên đĩa thạch có chứa cơ chất bột giấy 0,2 %.
87
Bảng 3.15. So sánh hoạt tính cellulase từ 5 chủng VSV (A. niger, T. konigii, Li,
B505 và T3) trên đĩa thạch có cơ chất bột giấy 0,2%
STT Nguồn cellulase
Đường kính vòng thủy
phân bột giấy (cm)
1 Cellulase từ A. niger nuôi trên môi trường Cell 0,2
2 Cellulase từ T. konigii nuôi trên môi trường Cell 1,4
3 Cellulase từ A. niger nuôi trên môi trường Zapek 0,8
4 Chủng T. konigii nuôi trên môi trường Zapek 1,6
5 Cellulase từ T. konigii nuôi trên môi trường riêng cho
chủng 1,5
6 Cellulase từ A. niger nuôi trên môi trường riêng cho
chủng
0,6
7 Cellulase từ B. substilis VTCC-B-505 1,2
8 Cellulase từ B. lichenformis Li 1,3
9 Cellulase từ Bacillus T3 1,3
Từ các phân tích ở 3.14 ÷ 3.15 và hình 3.19 ÷ 3.22 cho thấy:
Về hoạt tính cellulase của 5 chủng VSV trên đĩa thạch có cơ chất CMC 0,2%
Kết quả phân tích ở hình 3.19, 3.20 và bảng 3.14 cho thấy 2 chủng nấm Aspergillus
niger, Tricoderma konigii mặc dù được nuôi cấy ở các điều kiện môi trường tối ưu cho
nấm nhưng hoạt tính cellulase (Cx) thủy phân cơ chất CMC vẫn yếu hơn 3 chủng vi
khuẩn B505, Li và T3. Enzym Cx của chủng B505 có hoạt tính gần tương đương với
hoạt tính Cx của chủng T3 (một chủng Bacillus sinh cellulase đã được sử dụng trong
chế phẩm của Viện Công nghệ Sinh học). Như vậy chủng B505 và chủng Li tiết ra 2
enzym cellulase Cx ngoại bào mạnh hơn rất nhiều so với cellulase ngoại bào của 2 chủng
nấm Tricoderma và Aspergillus.
Về hoạt tính cellulase của 5 chủng VSV trên đĩa thạch có cơ chất bột giấy
0,2%
Kết quả hình 3.20; 3.21 và bảng 3.15 cho thấy chủng nấm Tricoderma konigii nuôi
trên môi trường Zapek cho hoạt tính cellulase ngoại bào thủy phân bột giấy mạnh nhất.
88
Tuy nhiên 2 chủng vi khuẩn B505, Li cũng sinh cellulase ngoại bào thủy phân bột giấy
mạnh gần bằng chủng nấm Tricoderma konigii. Các số liệu thu được cũng phù hợp với
các kết quả của các tác giả khác, cellulase của các chủng nấm thường có hoạt tính C1
cao hơn, trong khi đó hoạt tính Cx thấp hơn cellulase của các chủng vi khuẩn [24], [63].
Như vậy 3 chủng vi khuẩn T3, B505 và Li là có khả năng thủy phân cơ chất CMC
và bột giấy có hiệu quả cao. Việc nuôi cấy vi khuẩn thu chế phẩm enzym thường đơn
giản và rẻ tiền hơn so với nuôi cấy các chủng nấm. Trong nhóm vi khuẩn, các chủng
thuộc chi Baccillus luôn chiếm ưu thế (87%) khi ứng dụng vào xử lý phế thải , bởi các
chủng này là những vi khuẩn ưa nhiệt và sinh bào tử nên có khả năng tồn tại và sinh
trưởng tốt trong các đống ủ phế thải có nhiệt độ cao [56].
Giá thành để sản xuất 1lit chế phẩm enzym thô ở dạng lỏng mà đề tài nghiên cứu
cần 40.000 ÷45.000 đồng. Trong khi đó chế phẩm cellulase thô do Công ty Phát triển
Sinh học 186 Ngô Gia Tự, Hà Nội sản xuất giá 250.000 đồng/1 lit chế phẩm. Các chế
phẩm cellulase nhập ngoại thì giá thành rất cao, không thể sử dụng để thuỷ phân bã thải
agar đại trà. Việc nghiên cứu thu nhận enzym cellulase từ vi sinh vật giúp đề tài có thể
chủ động trong khâu thu nhận enzym, giá thành sản xuất lại rẻ hơn so với enzym thương
mại được sản xuất trong nước.
Từ kết quả phân tích ở trên cho thấy cellulase từ hai chủng B505 và Li có hoạt
tính Cx và C1 cao so với cellulase từ các chủng nấm Aspergillus niger, Tricoderma
konigii, không kém chủng T3 trong chế phẩm của Viện Công nghệ sinh học. Như vậy có
thể sử dụng từng chủng B505 hoặc Li riêng biệt, hay đồng thời cả hai chủng để thu nhận
cellulase làm chế phẩm sinh học để thuỷ phân bã thải agar cho hiệu quả cao. Việc
nghiên cứu thu nhận các enzym cellulase có khả năng thủy phân bã agar từ 2 chủng
B505 và Li giúp chủ động trong khâu thu nhận enzym, giá thành sản xuất rẻ hơn nhiều
so với enzym thương mại được sản xuất trong nước.
3.3.4. Nghiên cứu thủy phân bã thải rong sau sản xuất agar bằng enzyme cellulase
từ hai chủng vi khuẩn B 505 và Li
3.3.4.1. Tối ưu hóa quá trình thủy phân bã rong bằng cellulase vi khuẩn
Trên cơ sở thí nghiệm thăm dò để chọn vùng ảnh hưởng của các yếu tố (nồng độ
enzyme so với cơ chất, thời gian thuỷ phân, pH, nhiệt độ) đến quá trình thủy phân, tiến
89
hành tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng, sử dụng mô hình thiết kế Box-
Behnken quá trình thủy phân bã thải agar với các thông số biên như sau: nồng độ enzyme
với cơ chất (1% - 3%), thời gian thủy phân (24 ÷ 48 giờ), nhiệt độ 40 ÷ 600C. Cố định
các yếu tố: pH 5,5. Kết quả tối ưu hóa được thể hiện trong bảng 3.16 ÷ 3.19 và hình 3.23
÷ 3.24.
Bảng 3.16. Kết quả thí nghiệm của mô hình Box-Behnken
STT
Thời gian
(giờ) Tỷ lệ E/S (%)
Nhiệt độ
(0C)
Hàm lượng đường
tổng số (mg/g)
1 24 1 50 2,05
2 48 1 50 2,64
3 24 3 50 2,61
4 48 3 50 2,76
5 24 2 40 2,61
6 48 2 40 2,69
7 24 2 60 2,59
8 48 2 60 2,98
9 36 1 40 2,34
10 36 3 40 2,98
11 36 1 60 2,57
12 36 3 60 2,94
13 36 2 50 2,92
14 36 2 50 2,91
15 36 2 50 2,78
16 36 2 50 2,56
17 36 2 50 2,67
Bảng 3.17. Kết quả xử lý số liệu trên phần mềm DX6
90
Source Sum of
Squares df
Mean
Square F Value
p-value
Prob > F
Model 0.81 9.00 0.09 5.28 0.0196 significant
A - Thời gian 0.18 1.00 0.18 10.69 0.0137
B - Nồng độ E 0.36 1.00 0.36 20.86 0.0026
C - Nhiệt độ 0.03 1.00 0.03 1.55 0.2538
AB 0.05 1.00 0.05 2.83 0.1365
AC 0.02 1.00 0.02 1.40 0.2748
BC 0.02 1.00 0.02 1.06 0.3364
A2 0.06 1.00 0.06 3.63 0.0984
B2 0.07 1.00 0.07 4.25 0.0781
C2 0.02 1.00 0.02 1.24 0.3022
Residual 0.12 7.00 0.02
Lack of Fit 0.02 3.00 0.01 0.33 0.8081
not
significant
Pure Error 0.10 4.00 0.02
Cor Total 0.93 16.00
Kết quả thí nghiệm cho thấy có mối liên hệ hàm bậc 2 giữa hàm lượng đường tổng
số (mg/kg) với thời gian thủy phân (giờ), nồng độ Enzyme so với cơ chất (%) và nhiệt
độ thủy phân (0C) (P F lack of fit = 0,8081).
Y= 2,77 + 0,15 X1 + 0,21X2 + 0,058X3 - 1,12X12 - 0,13X2
2 + 0,071 X32 – 0,11X1X2
+ 0,078 X1X3 – 0,068 X2X3
Trong đó: Y: hàm lượng đường tổng số (mg/g)
X1: Thời gian thủy phân (giờ)
X2: Tỷ lệ hỗn hợp enzyme so với cơ chất (%)
X3: Nhiệt độ (0C).
91
Kết quả xử lý thống kê cho thấy trong khoảng nghiên cứu hai yếu tố ảnh hưởng
đến hàm lượng đường tổng số (mg/g) là thời gian thủy phân (p=0.0137) và nồng độ
enzyme so với cơ chất (p= 0,0026). Thời gian thủy phân và nồng độ enzyme càng tăng
thì hàm lượng đường tổng số (mg/g) càng tăng. Kết quả xử lý thống kê cũng cho thấy
nhiệt độ thủy phân ảnh hưởng không đáng kể đến quá trình thủy phân (p=0,2538), hay
nói cách khác trong khoảng nhiệt độ nghiên cứu từ 40 – 60 0C việc nhiệt độ thủy
phânkhông làm tăng hàm lượng đường tổng số (mg/g).
Hình 3.15. Đường đồng mức và bề mặt đáp ứng (3D) của hàm lượng đường tổng
số theo thời gian thủy phân và nồng độ enzyme
Kết quả dự đoán vùng tối ưu cho hàm lượng đường tổng số (mg/kg) được thể hiện
trên bảng 3.17 và hình 3.21. Kết quả chỉ ra một vùng tối ưu và hàm lượng đường tổng
số (mg/kg) là 2,98 (mg/kg).
Bảng 3.18. Kết quả dự đoán tối ưu cho tỷ lệ Naa/Nts theo mô hình Box-Behnken
Điểm
tiên
đoán
Thời gian
thủy phân
(giờ)
Nồng độ Enzyme so
với cơ chất (%)
Nhiệt độ
(0C)
Hàm lượng
đường tổng số
(mg/g)
1 41,57 2,40 59,48 2,98184
2 42,90 2,60 59,89 2,9869
3 45,53 2,33 59,07 2,98437
4 46,14 2,28 59,01 2,98327
5 34,19 3,00 40,00 2,93145
92
Hình 3.16. Đường đồng mức và bề mặt đáp ứng (3D) tiên đoán hàm lượng đường
tổng số theo thời gian thủy phân và nồng độ enzyme
Từ bảng 3 chọn được thí nghiệm tối ưu cho quá trình thủy phân là mẫu 7 tương
ứng với chế độ thủy phân là: thời gian thủy phân 42 giờ, nồng độ enzyme so với cơ chất
2,6% và nhiệt độ là 60 0C. Trên cơ sở các điểm tiên đoán từ mô hình, tiến hành thí
nghiệm để kiểm chứng. Kết quả thí nghiệm kiểm chứng được trong bảng 3.19.
Bảng 3.19. Kết quả kiểm chứng tối ưu theo tiên đoán và thực nghiệm
Điểm tiên
đoán
Thời gian
thủy phân
(giờ)
Tỷ lệ enzyme (%) Nhiệt độ
(0C)
Hàm lượng
đường tổng số
(mg/g)
Điểm tiên
đoán 42,90 2,60 59,89 2,9869
Thực
nghiệm 42,90 2,60 59,89 2,68 ± 0,09
Kết quả kiểm chứng thực nghiệm cho thấy có sự tương thích giữa lý thuyết và thực
nghiệm. Hàm lượng đường tổng số 2,68 ± 0,09 (%) khi thủy phân bã thải agar bằng chế
phẩm enzyme thô ở nhiệt độ 600C, pH = 5,5 thời gian thủy phân 42 giờ, tỷ lệ hỗn hợp
enzyme so với cơ chất 2,6 %. Kết quả đánh giá cảm quan cho thấy bã rong mềm, bóp
93
nhẹ thì bã rong nát, màu nâu sáng, mùi tanh của rong. Sản phẩm thủy phân protein thu
được từ bã thải agar có thể được sử dụng để phối trộn sản xuất thức ăn chăn nuôi.
Từ các phân tích ở trên cho phép chọn các thông số tối ưu cho hoạt động thủy
phân bã rong sau sản xuất agar: nhiệt độ thích hợp 600C, pH tối thích 5,5, thời gian
thủy phân thích hợp 42 giờ, tỷ lệ enzyme là 2,6 %.
3.3.4.2. Đề xuất quy trình thủy phân bã rong bằng cellulase từ vi khuẩn
Từ các kết quả nghiên cứu trên đề tài rút ra quy trình sản xuất chế phẩm thủy phân
bã rong dạng bột như sau:
Sơ đồ 3.3. Quy trình thủy phân bã rong bằng cellulase từ vi khuẩn
Thủy phân (pH=5,5; E/S= 2,6 %, to
= 60oC)
Phối trộn
Làm khô
Xay nghiền
Chế phẩm thủy phân bã rong dạng bột
Cám gạo (10%)
Enzym cellulase
Bã thải Agar
94
* Thuyết minh quy trình
+ Bã thải agar
Bã thải agar là bã thải của các cơ sở sản xuất agar (bả thải được lấy sau quá trình
xử lý và nấu chiết thu agar, bã thải agar được lọc bằng máy ép khung bản). Thành phần
bã thải agar là hàm lượng protein 3,26 ± 0,11%; hàm lượng cellulose 74,26 ± 4,68%;
hàm lương tro 12,28 ± 3,77 %
+ Thủy phân
Tiến hành thủy phân bã thải agar với độ pH thích hợp là 5,5, là nhiệt độ 600C, thời
gian thủy phân 42 giờ, tỷ lệ hỗn hợp enzyme so với cơ chất 2,6 %, bổ sung dung dịch
đệm acetat pH 5,5 (dd đệm/bã thải agar) 10%, thủy phân trong bình thủy phân dung tích
30 lít có khuấy đảo. Enzym cellulase sử dụng là chế phẩm cellulase ngoại bào thô thu
được từ 2 chủng Bacillus substilis B505 và Bacillus lichenformis Li được bảo quản trong
tủ lạnh ở nhiệt độ 4ºC.
+ Phối trộn
Bã thải agar sau khi thủy phân đem phối trộn với cám gạo theo tỷ lệ 10%/ bã thải
agar thủy phân. Cám gạo có màu trắng ngà, dạng bột. Thành phần của cám gạo protein
10- 13,3%, hàm lượng xơ thô 7,7-9,4%, lipit 12 - 15%. Phối trộn hỗn hợp trong máy
quấy đảo thời gian 2 –3 phút.
+ Làm khô
Sau khi phối trộn bã rong thủy phân làm khô trong tủ sấy đối lưu ở chế độ thời
gian 4 giờ, nhiệt độ sấy 70oC, độ dày 5 cm.
+ Xay nghiền
Sau khi sấy khô thì tiến hành xay nghiền bằng máy xay nghiền tạo sản phẩm dạng
bột. Độ mịn của sản phẩm là 1,0 – 1,5 mm.
+ Chế phẩm thủy phân dạng bột
Sản phẩm bã rong thủy phân dạng bột có màu vàng sáng, chế phẩm thủy phân dạng
bột có độ mịn và tơi, mùi đặc trưng của rong biển khô có hàm lượng protein 4,55 %, xơ
95
thô 23,12%, độ ẩm 12,97 %. Đóng gói sản phẩm trong túi ni lông, bảo quản ở nhiệt độ
phòng, nơi khô ráo, thoáng mát.
3.4. Thử nghiệm sử dụng chế phẩm thủy phân bã thải rong trong thức ăn nuôi cá
rô phi
3.4.1. Xây dựng công thức thức ăn nuôi cá rô phi
Công thức thức ăn nuôi cá rô phi được xây dựng dựa vào đặc điểm sinh học và nhu
cầu dinh dưỡng theo từng giai đoạn phát triển, nhu cầu protein và lipit của cá rô phi làm
chuẩn để thay đổi công thức thích hợp. Bên cạnh đó, việc tính toán các tỷ lệ cho phù
hợp để đáp ứng nhu cầu năng lượng và protein cho thức ăn nuôi cá rô phi cũng được
quan tâm.
Nguyên liệu thức ăn đưa vào phối trộn cũng được lựa chọn nguyên liệu từ các căn
cứ trên. Thêm vào đó, các nguyên liệu phối trộn đầu vào được tiến hành xác định thành
phần hóa học . Mặc khác, thành phần dinh dưỡng của công thức thức ăn phối trộn thức
ăn cho cá rô phi được tính toán dựa vào phần mềm WUFFF DA.
Bảng 3.20. Thành phần hóa học của các nguyên liệu phối trộn
WUFFF DA
Cost Min. Max. Weight Dry Matter M.E. Protein E.E. C18:3 C.F
ACTIVE INGREDIENT COMPOSITION MATRIX
Bột cá lạt 58% CP 21000 1 90.7 3.22 58.43 6.17 1.89
Đậu nành rang 35000 1 90.9 3.74 39.64 15.5 9.03
Bột mì 20000 1 89 1.3 15.7 3 1.7 11
Cám gạo mịn 8% 7000 1 89.8 2.45 12.57 7.36 6.48
Bã rong khô 4000 1 88.5 2.478
Hạt bắp vàng 9 %CP 7000 1 88.8 3.31 9.42 4.15 1.95
Premix KVTM 46284 0 0 1 96 0 0 0 0 0
Vitamin ADE 342000 0 0 1 96
Binder 60000 0 0 1 95
96
WUFFF DA
Calcium Total
Phos. Avail.Phos. K Cl Mn Na Zn Biotin Choline Folate
ACTIVE INGREDIENT COMPOSITION MATRIX
Bột cá lạt 58% CP 4.55 2.11 2.11 2.9
Đậu nành rang 0.27 0.63 0.21
Bột mì 0.14 1.15 0.34 1.19 0.06 113 0.05 133 0.48 1.88 1.2
Cám gạo mịn 8% 0.17 0.91 0.3
Bã rong khô
Hạt bắp vàng 9
%CP 0.14 0.37 0.12
Premix KVTM 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Vitamin ADE 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Binder 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
WUFFF DA
ARG GLY SER
GLY
&SER HIS ILE LEU LYS MET
ACTIVE INGREDIENT COMPOSITION MATRIX
Bột cá lạt 58% CP 2.95 3.91 1.87 5.78 1.41 1.94 3.82 3.8 1.39
Đậu nành rang 2.42 1.51 0.49 2 0.85 1.45 2.66 2.17 0.54
Bột mì 0.98 0.9 0.9 1.8 0.34 0.59 0.91 0.59 0.17
Cám gạo mịn 8% 0.74 0.36 0.43 0.79 0.18 0.33 0.68 0.27 0.27
Bã rong khô 0.09 0.22 0.24 0.461 0.14 0.41 0.645 0.314 0.183
Hạt bắp vàng 9 %CP 0.44 0.35 0.45 0.8 0.31 0.32 1.15 0.24 0.24
WUFFF DA
ARG CYS TSAA PHE TYR TAAA THR TRP VAL
ACTIVE INGREDIENT COMPOSITION MATRIX
Bột cá lạt 58% CP 2.95 0.55 1.94 1.61 2.1 3.71 0.21 0.56 2.38
Đậu nành rang 2.42 0.59 1.13 1.63 1.11 2.74 1.35 0.5 1.49
Bột mì 0.98 0.25 0.42 0.49 0.4 0.89 0.42 0.3 0.73
Cám gạo mịn 8% 0.74 0.22 0.49 0.44 0.38 0.82 0.3 0.1 0.47
Bã rong khô 0.43 0.24 0.19
Hạt bắp vàng 9 %CP 0.44 0.24 0.48 0.43 0.32 0.75 0.32 0.08 0.43
97
Từ kết quả phân tích thành phần của các nguyên liệu lựa chọn để phối trộn trong
các công thức thức ăn nuôi cá rô phi thì thây thành phần của của các nguyên liệu phối
trộn trong thức ăn nuôi có đầy đủ thành phần dinh dưỡng: protein, lipit, xơ, vitamin và
khoáng chất ,… Các nguồn nguyên liệu này rất nhiều, dễ kiếm, …., giá thành rẻ, ..,
không bị biến đổi chất lượng trong quá trình sản xuất thức ăn chăn nuôi.
3.4.2. Đề xuất quy trình sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi
Từ các kết quả nghiên cứu lựa chọn nguyên liệu phối trộn thức ăn, thử nghiệm phối
trộn theo các tỷ lệ tính toán của các công thức thức ăn có phối trộn tỷ lệ bã thải agar với tỷ
lệ khác nhau (Phụ lục IV), ép viên, sấy khô, phân tích thành phần dinh dưỡng của các công
thức phối chế, …, đề xuất quy trình sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi như sau:
Sơ đồ quy trình:
Sơ đồ 3.4. Quy trình sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi
Xử lý
Bã thải AgarNguyên liệu
Phối trộn
Ép viên
Sấy khô
Thức ăn nuôi cá
Enzym cellulase
Thủy phân
Chế phẩm bã thải agar thủy phân
98
Thuyết minh quy trình
1. Nguyên liệu
- Bột cá : bột cá loại I có hàm lượng Protein 55-60%, hàm lượng lipit : 4,92 -7,89%,
hàm lượng xơ thô 2,4 – 3,5% . Màu xám đen, mùi thơm nhẹ, vị hơi mặn, trạng thái mịn,
xốp. Nguyên liệu bột cá mua của Công ty TNHH chế biến Thủy sản – xuất nhập khẩu
Việt Trường.
- Bột đậu tương: hạt đậu tương được sấy chín ở 1300C trong 20-30 phút, rồi nghiền
mịn, có màu vàng nhạt, mùi thơm đặc trưng. Thành phần của đậu tương protein 38,4 -
42%, hàm lượng xơ thô 5,9-7,5%, lipit 16,3 -18,4%.
- Bột cám gạo :màu trắng ngà, dạng bột, mùi thơm. Thành phần của cám gạo
protein10- 13,3%, hàm lượng xơ thô 7,7-9,4%, lipit 12 - 15%.
- Bột ngô có màu vàng, dạng bột mịn, mùi thơm đặc trưng. Thành phần của cám
ngô protein 8- 9,8%, hàm lượng xơ thô 2,2-3%, lipit 4,0 – 5,1%.
- Rỉ mật: có màu nâu, trạng thái dịch keo sánh và có mùi thơm đặc trưng. Thành
phần của rỉ mật protein 11%, tro 7,5%.
- Ngoài ra còn có Premix khoáng, Vitamin tổng hợp (gồm Vitamin A, D3 E , K3
Vitamin B1, Vitamin B2 B6, B12, Vitamin C, axit Nicotinic, Calcium D- Pantothenate,
axit Folic , Cholin Chloride, Biotin, Fe, Cu, Co, Mg, Zn, Mn, I, Se,
Inositol, Methionin, lysin, sulfathiazole)
2. Bã thải agar
Bã thải agar là bã thải của công ty sản xuất agar (bả thải được lấy sau quá trình xử
lý và nấu chiết thu agar, bã agar được loại thải qua giai đoạn lọc bằng máy ép khung
bản). Thành phần bã thải agar có hàm lượng protein 3,26 ± 0,11%; hàm lượng cellulose
74,26 ± 4,68%; hàm lương tro 12,28 ± 3,77 %.
Thủy phân bã thải agar
Bã thải agar được tiến hành thủy phân với độ pH thích hợp là 5,5, nhiệt độ 48-50
ºC, thời gian 42 h, tỷ lệ enzyme celulase thô (E/S) 2,6 %, bổ sung dung dịch đệm acetat
pH 5,5 (dd đệm/S) 10%, thủy phân trong bình thủy phân có khuấy đảo. Enzym cellulase
99
sử dụng là chế phẩm cellulase ngoại bào thô thu được từ 2 chủng Bacillus substilis B505
và Bacillus lichenformis Li được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4ºC.
3. Xử lý nguyên liệu
Nguyên liệu sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi phải được nghiền mịn: qua mắt sàng
có đường kính 1-1,5mm, độ mịn của nguyên liệu ảnh hưởng rất nhiều đến kết cấu, độ
tan của viên thức ăn, đặc biệt là khả năng tiêu hóa của thức ăn. Bột cá phải có độ đạm
đạt 53 – 57%, không có mùi ôi khét, mùi tanh tự nhiên của cá, không hôi thối. Cám ngô,
đậu tương, cám gạo phải được xử lý nhiệt để tạo tăng khả năng tiêu hóa của thức ăn và
tăng độ dẫn dụ mồi của thức ăn nuôi cá rô phi.
4. Phối trộn
Việc phối trộn các nguyên liệu bằng cách quấy đảo đều hỗn hợp bằng máy đảo
trộn. Bã thải agar sau khi thủy phân được phối trộn với rỉ mật, cám ngô, cám gạo, đậu
tương,....theo tỷ lệ công thức phối trộn 6 công thức thức ăn như sau:
Bảng 3.21. Thành phần nguyên liệu của các công thức thức ăn phối trộn bã rong
thủy phân.
STT Nguyên liệu CT 1 CT2 CT 3 CT 4 CT 5 CT6
1 Bột cá (%) 19,0 19,0 20,0 20,0 21,0 21,5
2 Bột đậu tương (%) 19,0 20,0 20,0 21,0 20,5 21,5
3 Bột mì (%) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
4 Bột cám gạo (%) 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 16,0
5 Bột cám ngô (%) 34,75 28,75 22,75 16,75 11,25 8,75
6 Bã rong thủy phân
khô (%) 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0
7 Premix (%) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
8 Vitamin (%) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
9 Chất kết dính (%) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
100
5. Ép viên
Hỗn hợp sau khi đảo trộn đều đưa vào máy ép viên, tùy theo kích cỡ của cá mà
chọn mắt sàng cho phù hợp, cá cỡ 200 – 500g/con thì viên thức ăn có đường kính không
quá 4 mm. Trong quy mô sản xuất phòng thí nghiệm có thể sử dụng máy ép đùn trục vít
với mắt sàng từ 4 – 6 mm. Trong sản xuất công nghiệp sử dụng máy ép đùn với áp lực
cao để tạo viên thức ăn nổi với chế độ ép 150 ºC, áp suất 121,0 bar, tốc độ trục vít 250
rpm, tốc độ cắt 1000 vòng/phút, tốc độ nạp liệu 25 kg/h, hàm lượng nước 47%.
6. Sấy khô
Thức ăn được sấy khô ở nhiệt độ 70 – 80ºC, độ dày thức ăn 3 cm, đến khi độ ẩm
viên thức ăn vào khoảng 10 – 12%. Thiết bị sấy khô thức ăn là tủ sấy không khí đối lưu.
Thức ăn sau khi sấy khô được làm nguội và bao gói trong túi ni lông, bảo quản ở nơi
khô ráo, thoáng mát.
3.4.3. Điều kiện môi trường nuôi thử nghiệm cá rô phi
3.4.3.1. Điều kiện môi trường nước
Cá rô phi đơn tính có nhiều ưu điểm hơn so với cá rô phi thường, như lớn nhanh,
ăn tạp nên dễ nuôi. Khi nuôi loại cá này người nuôi có thể quyết định được cỡ cá thương
phẩm, kiểm soát được mật độ thả… Cá rô phi chịu ảnh hưởng rất lớn của các yếu tố môi
trường sống. Các yếu tố môi trường sống có tác động đến tốc độ sinh trưởng và phát
triển của cá thông qua những ảnh hưởng tới khả năng bắt mồi, khả năng tiêu thụ thức
ăn, khả năng đề kháng và miễn dịch với bệnh. Do đó quản lý môi trường nuôi tốt, thích
hợp và ổn định là rất cần thiết đặc biệt là trong các thí nghiệm. Dưới đây là các yếu tố
thủy lý, thủy hóa chủ yếu được theo dõi và quản lý trong suốt quá trình thí nghiệm.
101
Bảng 3.22. Dao động các yếu tố môi trường trong quá trình thí nghiệm
Descriptive Statistics
Minimum Maximum Mean Std. Deviation
Nhiệt độ sáng (oC) 26,5 29 27,99 0,51
Nhiệt độ chiều (oC) 27 29,5 28,61 0,57
DO sáng (mg/l) 4,5 6 5,23 0,29
DO chiều (mg/l) 5 6 5,40 0,36
pH sáng 6,6 7,4 7,04 0,21
pH chiều 7,2 7,8 7,49 0,16
3.4.3.2. Nhiệt độ nước
Nhiệt độ nước ao thí nghiệm được đo 2 lần trong ngày vào lúc 8 giờ và 14 giờ
bằng nhiệt kế thủy ngân. Kết quả được trình bày ở Hình 3.25.
Biểu đồ 3.6. Biến động nhiệt độ nước ao thí nghiệm nuôi cá rô phi.
Qua kết quả Hình 3.25 cho thấy nhiệt độ nước ao nuôi trong suốt quá trình thí
nghiệm có sự biến động nhẹ, dao động quanh mức 28 ± 0,5oC vào buổi sáng và 28,5 ±
0,6oC vào buổi chiều, sự biến thiên nhiệt độ trong quá trình thí nghiệm dao động từ 25,5
25,0
25,5
26,0
26,5
27,0
27,5
28,0
28,5
29,0
29,5
30,0
1 7
13
19
25
31
37
43
49
55
61
67
73
79
85
91
97
103
109
115
121
127
133
139
145
151
157
163
169
175
181
Nhiệ
t độ (
0C
)
Ngày
Nhiệt độ sáng (0C) Nhiệt độ chiều (0C)
102
– 29,5oC nằm trong ngưỡng nhiệt độ thích hợp cho cá rô phi. Do đó, nhiệt độ không ảnh
hưởng xấu đến hoạt động sống và bắt mồi của cá rô phi. Nhiệt độ nước được xem là một
trong những yếu tố ảnh hưởng lớn đến các loài thủy sản. Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp
đến hoạt động sinh lý của cá hoặc gián tiếp thông qua các yếu tố môi trường khác. Nhiệt
độ nước không những ảnh hưởng đến diễn biến các quá trình sinh thái thủy vực
(Kinniburgh, 1998), tác động đến chất lượng nước (Kennish, 1992) mà còn chi phối sức
khỏe của động vật thủy sản (Valiela, 1991; Swann, 1997). Vì vậy việc theo dõi biến
động nhiệt độ nước ao thí nghiệm là cần thiết để đánh giá ảnh hưởng của nó đến kết quả
thí nghiệm. Kock và Kramer (1994) cho rằng mỗi loài có một khoảng nhiệt độ tối ưu
riêng cho sự sống của chúng. Vì thế, nếu nhiệt độ vượt khỏi khoảng tối ưu này sẽ gây
bất lợi cho sinh trưởng và sinh lý của chúng.
3.4.3.3. Hàm lượng oxy hòa tan (DO)
Trong quá trình sống cá cần một lượng oxy nhất định để sống, để cung cấp cho
hoạt động trao đổi chất. Hàm lượng oxy là yếu tố quyết định đến hoạt động sống và sự
sinh trưởng của cá. Do đó hàm lượng oxy được kiểm tra hàng ngày trong quá trình thí
nghiệm đo bằng bộ test kit của Thái Lan . Kết quả được trình bày trong hình 3.26.
Biểu đồ 3.7. Biến động DO nước ao thí nghiệm nuôi cá rô phi
0
1
2
3
4
5
6
7
1 7
13
19
25
31
37
43
49
55
61
67
73
79
85
91
97
103
109
115
121
127
133
139
145
151
157
163
169
175
181
DO
(m
g/l
)
Ngày
DO sáng ( mg/l) DO chiều ( mg/l)
103
Kết quả phân tích ở hình 3.26 cho thấy oxy hòa tan trong nước ao chênh lệch
tương đối lớn giữa thời điểm 8 giờ và 14 giờ, DO vào buổi sáng dao động quanh mức
5,23 ± 0,29 mg/L và vào buổi chiều là 5,4 ± 0,36 mg/L. Sự biến đổi hàm lượng oxy nằm
trong ngưỡng thích hợp cho sự sinh trưởng của cá rô phi, dao động trong khoảng 4,5 –
6,0 (mg/l).
3.4.3.4. Độ pH
Độ pH cũng là một trong những yếu tố tác động mạnh đến đời sống của cá. Độ pH
quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng tới đời sống của cá và có thể gây chết cá. Độ pH
được đo bằng Test kit do Thái Lan sản xuất với độ chính xác là 0,3. Kết quả thí nghiệm
được trình bày ở Hình 3.27.
Biểu đồ 3.8. Biến động độ pH của nước ao thí nghiệm
Theo kết quả ở Hình 3.27 cho thấy, pH của nước ao cũng biến động trong khoảng
thuận lợi cho sự phát triển của cá, với dao động ngày đêm không quá lớn, cụ thể là quanh
mức 7,0 ± 0,2 vào buổi sáng và 7,5 ± 0,2 vào buổi chiều. Khoảng biến động của pH như
vậy đều nằm trong khoảng thích hợp (6,6 đến 7,8) cho hầu hết các loài cá nuôi sinh
trưởng (Mason, 2001).
06
06
06
07
07
07
07
07
08
08
08
1 7
13
19
25
31
37
43
49
55
61
67
73
79
85
91
97
103
109
115
121
127
133
139
145
151
157
163
169
175
181
Độ p
H
Ngày
pH sáng pH chiều
104
3.4.4. Thử nghiệm nuôi cá rô phi bằng thức ăn bổ sung chế phẩm thủy phân bã rong
3.4.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của công thức thức ăn đến sinh trưởng của cá rô phi
Nghiên cứu ảnh hưởng của protein đến sự sinh trưởng của cá rô phi được tiến hành
thử nghiệm. Cá rô phi được nuôi trong 18 giai có kích thước (3m x 2m x 1 m) bằng 6
loại thức ăn thí nghiệm có bổ sung bã agar thủy phân với tỷ lệ phối trộn lần lượt là 0%,
5%, 10%, 15%, 20%, 25% có hàm lượng protein 25% tương ứng với 6 nghiệm. Mỗi
nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Số đơn vị thí nghiệm tương ứng là 18 đơn vị thí nghiệm
(18 giai nuôi). Mật độ nuôi là 4 con/m2. Khối lượng trung bình cá khi bắt đầu thí nghiệm
là 205,9 ± 4,3 g/con. Cá được cho ăn hàng ngày 2 lần vào 8h sáng và 16h và được cho
ăn trong suốt thời gian thí nghiệm. Khẩu phần cho ăn hàng ngày tùy thuộc vào giai đoạn
cá: từ 40 – 100g/con là 5% khối lượng thân, 100 – 150g/con là 4% khối lượng thân giai
đoạn từ 150 – 200g/con là 3% khối lượng thân. Khẩu phần cho ăn được điều chỉnh theo
tăng trưởng của cá bằng cách bắt ngẫu nhiên 10 cá thể cá đem cân sau 20 ngày nuôi để
có khối lượng trung bình làm cơ sở ước tính lượng cá trong các nghiệm thức thí nghiệm
Tốc độ sinh trưởng khối lượng của cá thí nghiệm sau 80 ngày nuôi được trình bày
trong Hình 3.28 và Bảng 3.23.
Bảng 3.23. Ảnh hưởng của công thức thức ăn đến sinh trưởng của cá rô phi trong 80
ngày nuôi
Chỉ tiêu Nghiệm thức
CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 CT 6
Khối lượng
đầu (g) 206,0± 3,2 206,7 ± 2,71 207,6 ± 2,59 204,7 ± 5,58 205,8 ± 6,2 205,0 ± 5,73
Khối lượng
cuối (g) 630,1 ± 4,6a 652,3 ± 4,1b 675,0 ± 6,9 c 765 ±4,2d 735,1±3,8e 685±5,3f
Tỉ lệ sống (%) 76,4± 6,3 80,6 ± 2,4 81,9 ± 2,4 87,5 ± 4,2 88,5±4,8 86,11±6,3
DWG (g/ngày) 5,3 ± 0,06a 5,7 ± 0,07b 5,8 ± 0,08c 7,0±0,08d 6,81±0,09e 6,0±0,08f
Hệ số thức ăn 2,67 2,38 1,92 1,57 1,69 1,84
Ghi chú: Số liệu được trình bày dưới dạng GTTB±độ lệch chuẩn. Các ký tự chữ trên
cùng hàng giống nhau biểu thị sự khác nhau của các giá trị trung bình không có ý nghĩa
thống kê (P>0,05) và ngược lại.
105
Biểu đồ 3.9. Tốc độ sinh trưởng (g/con) và DWG (g/ngày) của cá rô phi với thức
ăn phối trộn bã rong thủy phân khác nhau sau 80 ngày nuôi.
Qua kết quả hình 3.26 cho thấy khối lượng cá ở cả sáu công thức đều có sự tăng lên về
khối lượng. Khối lượng trung bình ở các giai nuôi thử nghiệm từ 652 đến 765 g. Công
thức thức ăn có hàm lượng protein là 25% với tỷ lệ phối trộn bã rong thủy phân là 15%/
khối lượng có sự tăng trọng tốt nhất với trọng lượng cao nhất là 765 ±4,2 (g và tốc độ
tăng trưởng cao nhất là 4,65±0,03 (g/ngày). Thức ăn có hàm lượng protein là 25%
(Pr25) với công thức đối chứng không phối trộn bã rong thủy phân có tốc độ tăng trưởng
thấp hơn trong suốt quá trình nuôi thí nghiệm, trung bình tăng trưởng là 3,52 ± 0,04
(g/ngày). Theo Jauncey và Ross; Santiago và Laron khẩu phần thích hợp cho cá rô phi
cỡ 200 gam đến cỡ thương phẩm cần khẩu phần protein thích hợp khoảng 20-25%. Các
nghiên cứu cũng đều chỉ ra số lần cho cá rô phi ăn giảm đi khi cá lớn, cá rô phi giống
nên ăn nhiều lần/ngày hơn cá trưởng thành [40], [50], [52],[68], [73], . Các số liệu thực
tế trong nuôi ở Thái Lan cho thấy, nuôi cá rô phi có trọng lượng ban đầu 58 - 89g, nuôi
với mật độ khác nhau và cho ăn thức ăn công nghiệp chứa 20 - 32% protein thô. Sau
120 ngày cá đạt cân nặng 650 - 700g với năng suất thu hoạch 50kg/m. Các số
liệu tương tự cũng thu được từ nuôi cá rô phi ở Malayxia và Inđônêxia. [94],
[95], [139].
Kết quả cho thấy mức tăng trưởng trung bình của cá nuôi ở công thức CT4 (15%)
và CT5 (20%) lại vượt trội hơn so với công thức khác là do trong quá trình thủy phân
bã thải rong bằng enzyme cellulase, các polyme như cellulose, hemicellulose, ... sẽ bị
thủy phân thành các đơn phân như đường glucose, các loại đường đơn thường dễ được
106
hấp thu qua thành ruột. Bên cạnh đó trong bã rong còn chứa hàm lượng chất xơ rất cao.
Chất xơ kích thích nhu động co bóp của ống tiêu hoá làm cho thức ăn di chuyển dễ dàng
để tống cặn bã, độc hại ra ngoài. Chất xơ có tác dụng làm gia tăng tốc độ thức ăn đi qua
đường tiêu hóa nên nó tác dụng làm tăng lượng thức ăn động vật thủy sản ăn vào. Tuy
nhiên sự gia tăng chất xơ đến một mức sẽ làm giảm khả năng tiêu hóa thức ăn do chất
xơ giảm tỉ lệ tiêu hoá thức ăn bằng cách ngăn giữ dưỡng chất bên trong các tế bào, thay
vì chúng phải được tiếp xúc trực tiếp với các men tiêu hoá của đường ruột. Chính vì vậy
cho thấy có tỷ lệ phối trộn bã thải rong câu thích hợp trong thức ăn nuôi cá là 15% đến
20% , do đó công thức thức ăn CT4 (15%) và CT5 (20%) có mức tăng trưởng trung bình
của cá nuôi vượt trội hơn các công thức khác.
Biểu đồ 3.10. Hệ số chuyển đổi thức ăn của nuôi thử nghiệm các công thức thức ăn
Tỷ lệ sống và hệ số thức ăn của cá sau thời gian nuôi thử nghiệm ở nghiệm thức
đối chứng (CT1) không có phối trộn bã rong thủy phân lần lượt là 76,4 % và 2,67. Trong
khi đó các nghiệm thức bằng thức ăn có phối trộn thêm bã rong thủy phân thì có hệ số
thức ăn từ 1,57 đến 2,4 và tỷ lệ sống từ 80,6% - 88,5%. Nếu so sánh với một số kết quả
nuôi của các tác giả đã công bố thì tỷ lệ sống này cao hơn nhiều. Theo kết quả nghiên
cứu của Viện Nuôi trồng Thủy sản I, nghiên cứu của Phạm Anh Tuấn, với chu kỳ nuôi
277 ngày tỷ lệ sống đạt 64,7 – 65,7 %, Nguyễn Văn Tiến với chu kỳ nuôi 190 ngày tỷ
lệ sống cá là 74,7 – 88,6 % [18] . Kết quả nuôi cá rô phi của Vũ Văn Tân bằng thức ăn
công nghiệp có khối lượng trung bình là 535 g/con và tỷ lệ sống trung bình là 81,3%
[19], [40].
2,67
2,38
1,92
1,571,69
1,84
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
CT1 Ct 2 CT 3 CT 4 CT 5 CT 6
Hệ
số
th
ức
ăn
Công thức thức ăn đã thử nghiệm
107
Kết quả thử nghiệm nuôi cá rô phi bằng công thức thức ăn CT4 và CT5 cho thấy
công thức thức ăn CT4 và CT5 cho kết quả nuôi tốt hơn các công thức khác là do: trong
quá trình thủy phân bã thải rong bằng enzyme cellulase, các polyme như cellulose,
hemicellulose,.. sẽ bị thủy phân thành các đơn phân như đường glucose, các loại đường
đơn thường dễ được hấp thu qua thành ruột. Mặt khác, trong chế phẩm thủy phân từ bã
thải rong còn chứa các khoáng chất, nguyên tố vi lượng và các chất khác từ bã thải rong.
Do vậy, thức ăn nuôi cá rô phi có bổ sung chế phẩm thủy phân từ bã thải rong, sẽ cung
cấp đủ khoáng chất, các nguyên tố vi lượng có nguồn gốc từ biển hơn các thức ăn bình
thường. Mặt khác loại thức nuôi cá rô phi có bổ sung chế phẩm thủy phân từ bã thải
rong lại chứa các chất thủy phân dạng đơn phân (ví dụ glucose) nên dễ hấp thụ. Do vậy,
khi nuôi cá rô phi bằng thức ăn có bổ sung chế phẩm thủy phân từ bã thải rong, cá lớn
nhanh hơn, hệ số thức ăn sẽ thấp hơn.
108
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. KẾT LUẬN
Từ các kết quả nghiên cứu ở trên cho phép rút ra một số kết luận sau:
1) Kết quả khảo sát đánh giá về bã thải rong sau sản xuất agar của một số doanh
nghiệm sản xuất agar từ rong câu tại Hải phòng và một số địa phương khác cho thấy
hàng năm các doanh nghiệp sản xuất agar tại Hải Phòng thải ra trên 3.500 tấn bã thải
rong có thành phần như sau: hàm lượng protein 3,26 ± 0,11%; hàm lượng cellulose
74,26 ± 4,68%; hàm lương tro 12,28 ± 3,77 % và có hàm lượng kim loại nặng dưới mức
cho phép của Bộ Y tế.
2) Đã tiến hành nghiên cứu, sàng lọc khả năng sinh enzyme cellulase của 17 chủng
vi sinh vật trong sưu tập giống vi sinh vật của Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học
Quốc gia Hà Nội và lựa chọn được 2 chủng: B. subtilis VTCC-B-505 (B505) và B.
lichenformis (Li) có hoạt tính sinh cellulase cao.
3) Khi nuôi cấy ở các điều kiện tối ưu để 2 chủng vi khuẩn B. subtilis VTCC-B-
505 và B. lichenformis (Li) sinh enzyme cellulase với hoạt tính cao: môi trường MT5
(CMC 2g; bột đậu tương 2g, bột gạo 2g; NH4Cl 0,4g, KH2PO4 0,6g; K2HPO4 1g; nước
cất 1lit); pH 5-7; nhiệt độ 30 – 450C, thời gian 60 phút, hai chủng vi khuẩn B. substilis
VTCC-B-505 và B. lichenformis Li có khả năng sinh cellulase với nồng độ rất cao,
tương ứng là 72UI/ml và 54 UI/ml.
4) Xác định được một số điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân bã rong câu
sau sản xuất agar bằng chế phẩm cellulase từ 2 chủng vi khuẩn (B. substilis VTCC
B505 và B. lichenformis Li): nhiệt độ thích hợp 600C, pH thích hợp 5,5, thời gian thủy
phân tối ưu 42 giờ, tỷ lệ hỗn hợp enzyme so với cơ chất 2,6 %. Sản phẩm thủy phân bã
thải agar dạng bột có độ mịn và tơi, mùi đặc trưng của rong biển khô có hàm lượng
protein 4,55 %, xơ thô 23,12%, độ ẩm 12,97 %.
5) Bước đầu có thể khẳng định rằng bả thải rong câu được xử lý thích hợp bằng chế
phẩm enzyme cellulase từ vi khuẩn có thể sử dụng để bổ sung (khoảng 15%) vào thành
phần thức ăn nuôi cá rô phi đơn tính, mang lại hiệu quả về kinh tế cao (tỷ lệ cá sống
109
cao trên 80 %, hệ số thức ăn thấp 1,57 - 1,94), đồng thời góp phần xử lý chất thải làm
sạch môi trường.
2. KIẾN NGHỊ
Từ những nghiên cứu ở trên cho phép đề xuất kiến nghị:
1) Tiến hành sản xuất cellulase từ 2 chủng B. subtilis VTCC-B-505 (B505) và B.
lichenformis (Li) ở qui mô lớn để thu chế phẩm enzym cellulase dùng trong công nghiệp
thủy phân bã rau câu sau sản xuất agar.
2) Thử nghiệm sản xuất thức ăn bổ sung chế phẩm bã thải agar thủy phân theo
công thức của Luận án đã đề xuất để triển khai nuôi cá rô phi và một số loài cá nước
ngọt ở quy mô công nghiệp.
110
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN
LUẬN ÁN
1. Lê Hương Thủy (2009), “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học tận dụng
bã thải từ sản xuất agar phục vụ sản xuất thức ăn chăn nuôi”,Hội thảo Khoa học Đánh
giá kết quả thực hiện đề tài, dự án Công nghệ Sinh học Nông nghiệp -Thủy sản giai
đoạn 2007 - 2008,Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, Tr. 193-195.
2. Võ Hoài Bắc, Lê Hương Thủy, Lê Thị Lan Oanh (2010), “Sàng lọc chủng vi
sinh vật sinh cellulase sử dụng trong thủy phân bã thải agar”, Bản tin Viện Nghiên cứu
Hải sản, Số 15, tr 20 – 24.
3. Lê Hương Thủy, Võ Hoài Bắc, Lê Thị Lan Oanh (2011), “Tối ưu hóa các điều
kiện sinh cellulase ngoại bào từ 2 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis B-505 và Bacillus
lichenformis Li trên môi trường lên men công nghiệp”, Bản tin Viện Nghiên cứu Hải
sản, Số 19, tr. 20 - 25.
4. Lê Hương Thủy (2011), “Nghiên cứu ứng dụng bã rong thủy phân trong sản
xuất thức ăn nuôi cá rô phi”, Bản tin Viện Nghiên cứu Hải sản,Số 22, tr. 19 -26.
5. Lê Hương Thủy, Võ Hoài Bắc (2011), “Nghiên cứu sàng lọc và tối ưu hóa điều
kiện nuôi cấy các chủng vi sinh vật sinh cellulase sử dụng trong thủy phân bã thải agar”,
Tạp chí KHCN Nông nghiệp và phát triển nông thôn, Tr. 140 – 148.
6. Lê Hương Thủy (2013), Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học tận dụng bã
thải sản xuất agar phục vụ sản xuất thức ăn chăn nuôi. Tạp chí KHCN Nông nghiệp và
phát triển nông thôn. Tr 275 - 284.
111
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Cảnh, Nguyễn Đình Soa (1994), Tối ưu hoá thực nghiệm trong hoá học
và kỹ thuật hoá học, Trường Đại học Kỹ thuật TP. HCM.
2. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1997),
Công nghệ enzyme, Nxb. Nông nghiệp, Hà Nội.
3. Nguyễn Lân Dũng (1987), Men và thức ăn gia súc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà
Nội.
4. Đặng văn Giáp (1997), Phân tích dữ liệu khoa học bằng chương trình M-S Excel,
Nxb. Giáo dục, Hà Nội.
5. Đoàn Giang (2003), «Công thức mới trong thức ăn của cá rô phi», Thông tin Khoa
học và kinh tế Thủy sản, Nông nghiệp Việt Nam.
6. Phạm Thị Ánh Hồng (2003), Kỹ thuật sinh hóa, Nxb. Đại học quốc gia TP. HCM.
7. Lại Văn Hùng (2004), Dinh dưỡng và thức ăn nuôi trồng thuỷ sản, Nxb Nông
nghiệp, Tp HCM.
8. Khoa thuỷ sản Trường đại học cần thơ (1994), Kỹ thuật nuôi thuỷ sản nước lợ ,
Nxb Nông nghiệp, Hà Nội .
9. Khoa Thuỷ Sản , Đại học cần Thơ (1994), Kỹ thuật nuôi cá nước ngọt, Nxb Nông
nghiệp, Hà Nội.
10. Lê Văn Liễn, Nguyễn Hữu Tào (2004), Kỹ thuật chế biến phụ phẩm nông nghiệp
làm thức ăn cho gia súc, Viện Chăn nuôi Quốc gia, Nxb Lao Động – Xã hội, Hà Nội.
11. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa (2004),
Chế biến rong biển, Nxb Nông Nghiệp, Tp. HCM.
12. Nguyễn Đức Lượng (2001), Công nghệ sinh học, Nxb Đại học Quốc gia, Tp
HCM.
13. Nguyễn Đức Lượng (1996), Nghiên cứu tính chất của một số vi sinh vật có khả
năng tổng hợp cellulase cao và ứng dụng trong công nghệ xử lý chất thải hữu cơ, Luận văn
tiến sĩ khoa học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Hà Nội.
112
14. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2003), Thí Nghiệm
Công nghệ Sinh học, Nxb Đại học Quốc gia, Tp HCM.
15. Đỗ Văn Nam (2004), Nghiên cứu, đánh giá hiện trạng môi trường các cơ sở chế
biến Agar – Agar, đề xuất các biện pháp quản lý , Báo cáo khoa học, Viện nghiên cứu Hải
sản, Hải Phòng.
16. Nguyễn Thị Minh Nguyệt (2009), Nghiên cứu chế biến bã cơm dừa làm nguyên
liệu để sản xuất thức ăn cho gia súc, Báo cáo khoa học, Viện Nghiên cứu Dầu và Cây có
dầu.
17. Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Phan Văn Sỹ (2008), Nghiên cứu hiệu quả sử dụng
chế phẩm bã cơm dừa lên men trong chăn nuôi, Báo cáo khoa học, Viện Nghiên cứu Dầu
và Cây có dầu.
18. Nguyễn Hữu Ninh (2003), Tình hình nuôi cá rô phi trên thế giới, Báo cáo Trung
tâm Quốc gia giống thuỷ sản nước ngọt miền Bắc, Hải Dương.
19. Nguyễn Thị Diệu Phương, Phạm Anh Tuấn, (2005), Ảnh hưởng của hàm lượng
protein trong thức ăn và số lần cho ăn đến sinh trưởng, môi trường nuôi cá rô phi, Báo cáo
khoa học, Viện Nuôi trồng Thủy sản 1, Bắc Ninh.
20. Lương Đức Phẩm (2004), Công nghệ vi sinh vật, Nxb. Khoa học và Kỹ thuật, Hà
Nội.
21. Lương Đức Phẩm, Hồ Sưởng (1978), Vi sinh tổng hợp, Nxb Khoa học và Kỹ
Thuật, Hà Nội.
22. Lê Thị Bích Phượng (2002), Nghiên cứu sử dụng bã khoai mì làm thức ăn cho
chăn nuôi, Báo cáo khoa học Viện Sinh học Nhiệt đới, Tp. HCM.
23. Lê Hồng Phú (2003), Nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme pectinase và cellulase từ
Aspergillus niger và ứng dụng để xử lý vỏ cà phê để sản xuất trong phân bón, Luận văn
thạc sỹ, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp. HCM.
24. Lê Hồng Phú (2012), Nghiên cứu thu nhận chế phẩm vi sinh vật enzyme pectinase
và cellulase và ứng dụng trong sản xuất cà phê nhân theo phương pháp lên men, Luận án
Tiến sĩ, Trường Đại học khoa học tự nhiên, Đại học quốc gia Tp HCM .
25. Võ Vân Phước Quế, Cao Ngọc Diệp (2011), «Phân lập và nhận diện vi khuẩn
113
phân giải Cellulose», Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ, Trang 177 - 184.
26. Đỗ Văn Khương, (1995), Final workshop of the regional study on the taxonomy,
Ecology and processing of commercially important seaweeds. Country status report of Việt
Nam.
27. Hoàng Văn Tiến (1970), Cơ sở sinh hoá trong việc sản xuất và sử dụng nấm men
cho gia súc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà nội.
28. Nguyễn Tiến Thắng, Ngô Kế Sương, Trần Hạnh Phúc, Võ Hồng Nhân, (1994),
Công nghệ sinh học và một số ứng dụng tại Việt Nam, Tập 1, Nxb Nông nghiệp.
29. Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Như Trí, Phạm Minh Anh (2012), «Đánh giá ảnh
hưởng của nấm men (Kluyveromyces marxianus) đến tốc độ tăng trưởng, tỷ lệ sống, hiệu
quả sử dụng thức ăn và khả năng miễn dịch của cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus)
giống», Tạp chí Khoa học kỹ thuật Nông Lâm nghiệp, Đại học Nông Lâm Tp HCM
30. Nguyễn Văn Thục (2003), Nghiên cứu công nghệ sản xuất agar chất lượng cao,
Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học cấp Nhà nước, Viện nghiên cứu Hải sản, Hải
Phòng.
31. Lê Thị Tú (2003), Nghiên cứu xử lý toàn diện phế liệu dừa nhà máy chế biến đồ
hộp bằng công nghệ vi sinh. Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, Trường Đại học Khoa học
tự nhiên, Tp HCM
32. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng (1982). Enzyme
vi sinh vật, Tập 2, Nxb. Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
33. Lê Ngọc Tú và các tác giả (1997), Hoá sinh học công nghiệp, Nxb. Khoa học và
Kỹ thuật, Hà Nội .
34. Trần Lê Cẩm Tú, Nguyễn Hữu Bon, Trần Thị Thanh Hiền (2008), “Đánh giá khả
năng sử dụng khoai ngọt (Dioscorea alata) làm thức ăn cho cá rô phi (Oreochromis
niloticus)”, Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, Trang 141 – 146.
35. Phạm Anh Tuấn, (2003), «Công nghệ phục vụ nuôi cá rô phi xuất khẩu- Thuận
lợi và khó khăn», Tạp chí Khoa học công nghệ thủy sản, Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy
sản I, Bắc Ninh
36. Nguyễn Như Trí, Nguyễn Hồng Lây (2012), «Đánh giá hiệu quả kinh tế việc sử
114
dụng thức ăn với hàm lượng Protein khác nhau trên cá rô phi đỏ (Oreochromis spp)»,
Trường Đại học Nông Lâm, Tp HCM. Trang 90 – 95.
37. Tuyển tập Tiêu chuẩn Quốc gia về thức ăn chăn nuôi (2007).
38. Mai Đình Yên (1983), Cá kinh tế nước ngọt ở miền nam, Nxb Khoa học và kỹ
thuật , Hà Nội.
39. Mai Đình Yên, Vũ Trung Tạng , Bùi Lai , Trần Mai Thiên (1979), Ngư loại học,
Nxb Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội .
40. «Các nghiên cứu mới trong việc cho cá rô phi ăn» (2003), Asian Aquaculture
Magazine 1,2/2003).
TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI
41. Aboul Enein, A. Abou Elalla, F. Serour, E. Hussien T, (2010), “Purification
and characterization of a novel thermoactive cellulase from Thermophilic actinomycetes
isolated from soil sample of Egypt”, Int. J. Acad. Res. 2, pp 81–86.
42. Adegunloye D. V., Adetuyi F. C., Akinyosoye F. A., Doyeni M. O., (2007),
“Microbial analysis of compost using cowdung as booster”, Pak. J. Nut. 6, pp 506 – 510.
43. Annamalai N., Rajeswari M. V., Balasubramanian T. (2014), Enzymatic
saccharification of pretreated rice straw by cellulase produced from Bacillus
carboniphilus CAS 3 utilizing lignocellulosic wastes through statistical optimization,
Biomass Bioen. 68, pp 151–160.
44. Annamalai N, Rajeswari M.V, Elayaraja S, Balasubramanian T, (2013),
Thermostable, haloalkaline cellulase from Bacillus halodurans CAS 1 by conversion of
lignocellulosic wastes, Carbohy. Polym. 94, pp 409–415.
45. Assareh R, Zahiri H.S, Noghabi K.A, Aminzadeh S, Khaniki G.B, (2012),
Characterization of the newly isolated Geobacillus sp. T1, the efficient cellulase-
producer on untreated barley and wheat straws, Biores. Technol. 120, pp 99–105.
46. Ancharida Akaracharanya, Thanawan Taprig, Jaruwan Sitdhipol and Somboon
Tanasupawat (2014), «Characterization of cellulase producing Bacillus and Paenibacillus
strains from Thai soils», JAPS. 40502
47. Ariffim H, Abdulah N, Umi K.M.S, Shirai Y and Hassam MA, (2006),
115
«Production and characterisation of cellulase by Bacillus pulmilus EB3”, International
Journal of Engineering and Technology. Vol. 3, No 1, pp 47-53.
48. Akasaka H, T Izawa, K. Ueki and A. Ueki. (2002), Phylogeny of numerically
abundant culturable anaerobic bacteria associated with degradation of rice plant residue
in Japanese paddy feld soil. Faculty of Agriculture, Yamagata University, Tsuruoka, pp
997-8555.
49. Arbor Acres (1995), Management manual and broiler feeding, Arbor Acres farm
inc, pp.20.
50. Arkom Choomthi (1997), Polyculture of Nile Tilapia (Orechromis niloticus),
Asian Institute of Technology, pp 8-11.
51. Alef K., Nannipieri P. (1995), “Enzymee activities”, Methods in Applied
Soil Microbiology and Biochemistry, pp.311-373.
52. Balarin J.D and Haler, R.D (1982), «Imn Recent Aquaculture» (J.F Muir and
R.J.Robert,eds), Croom Helem, London, pp 265-356.
53. Bansal N., Tewari R., Soni R., Soni S.K., (2012), “Production of cellulases
from Aspergillus niger NS-2 in solid state fermentation on agricultural and kitchen
waste residues”, Waste Manage, 32, pp 1341–1346.
54. E.A. Bayer, H. Chanzy, R. Lamed, Y. Shoham (1998), “Cellulose, cellulases and
cellulosomes», Curr. Opin. Struct. Biol. 8 , pp 548–557.
55. Binod P., Palkhiwala P., Gaikaiwari R., Nampoothiri K.M., Duggal A., Dey
K., Pandey A., (2013), “Industrial enzymes – present status and future perspectives for
India”, J. Sci. Ind. Res. 72, pp 271–286.
56. Cen P.L., Xia L.M., (1999), “Production of cellulase by solid-state
fermentation”, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 65, pp 68–92.
57. Cherry J.R., Fidantsef A.L., (2003), “Directed evolution of industrial enzymes:
an update”, Curr. Opin. Biotechnol. 14, pp 438–443.
58. Coughlan M.P., Folan M.A (1979), “Cellulose and cellulase: food for throught,
food for future”, InT.J.Biochem, (10), pp 103-168.
59. Coughlan M.P., (1988), “Methods In Enzymology (Wood Ed.) ”, Vol. 160 ,
116
Academic Press, New York, pp. 135- 144
60. Copland J.W. and Alders R.G. (2005), “The Australian poultry development
programme in Asia and Africa”, World Poultry Science Journal 61, pp 31-37.
61. Das, A., Bhattacharya, S., Murali, L., (2010), “Production of cellulase from
Thermophilic bacillussp isolated from cow dung”, Am. Eurasian J. Agric. Environ. Sci.
8, pp 685–691.
62. Dhillon, G.S., Oberoi, H.S., Kaur, S., Bansal, S., Brar, S.K., (2011). “Value-
addition of agricultural wastes for augmented cellulase and xylanase production through
solid state tray fermentation employing mixed-culture of fungi” Ind. Crops Prod. 34, pp
1160–1167.
63. Dhillon, G.S., Brar, S.K., Kaur, S., Sabrine, M., M’hamdi, N., (2012a).
“Lactoserum as a moistening medium and crude inducer for fungal cellulases and
hemicellulose induction through solid-state fermentation of apple pomace”, Biomass
Bioen. 41, pp 165–174.
64. Dhillon, G.S., Brar, S.K., Kaur, S., Brar, S.K., Verma, M., (2012b). “Potential
of apple pomace as a solid substrate for fungal cellulase and hemicellulose
bioproduction through solid-state fermentation”, Ind. Crops Prod. 38, pp 6–13.
65. Fan L.T and Lee L.H (1983), “Kinetic studies of enzymatic hydrolysis of
insoluble cellulose, a mechannistic kinetic model Biotech”, Bioeng (15), pp 2707-2733.
66. Fields, M. W., J. B. Russell and D. B. Wilson. (1998). “The role of ruminal
carboxymethylcellulases in the degradation of β-glucans from cereal grain”, FEMS
Microbiol. Ecol. 27:261–268.
67. Gascoigne J. and Gascoigne M.M (1960), “Biological degradation of cellulose”,
Butterwozch and Co.Limited, London, pp 17-21.
68. Guerrero. R.D (1980), “Studies on the feeding of Tilapia nilotica in floating
cages”, Aquaculture 20, pp 169-175.
69. Gupta, V.K., M.P.S. Bakshi, and P.N. Langar (1987), “Microbiological Changes
During Natural Fermentation of Urea-wheat Straw”, Biological Wastes 21.
70. El-Bakry, M., Abraham, J., Cerda, A., Barrena, R., Ponsá, S., Gea, T.,
117
Sánchez, T., (2015), “From wastes to high value added products: novel aspects of SSF
in the production of enzymes”. Crit. Review. Environ. Sci. Technol. 45 (18), pp 1999–
2042.
71. Hao, X.C., Yu, X.B., Yan, Z.L., (2006), “Optimization of the medium for the
production of cellulase by the mutant Trichoderma reesei WX-112 using response
surface methodology”, Food Technol. Biotechnol. 44, pp 89–94.
72. Hakamada. Y, K. Endo, S. Takizawa, T. Kobayashi, T. Shirai, T. Yamane, S. Ito
(2002), “Enzymatic properties, crystallization, and deduced amino acid sequence of an
alkaline endoglucanase from Bacillus circulans”, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)
Gen. Subj. 1570 (2002) 174–180.
73. Hayer J.F. and Mc Carthy J.C (1970), “The effect of selection at different ages
for high and low weigh are the pattern of deposition in mice”, Gienet. Res.
74. Helmul Uhlig (1998), Ph. D. Industrial enzym and theor applications. John Wiley
and Sons, inc. New York.
75. Howard R.L., Abotsi E., Jansen van Rensburg and Howard S (2003),
“Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production”, African
Journal of Biotechnology Vol. 2 (12), pp. 602-619, December 2003.
76. Hurst. PL, Nielsen J, Sullivan PA and Shepherd MG, (1977), “Purification and
Properties of a Cellulase from Aspergillus niger”. Biochem. J. 165, pp 33-41
77. Hart, T.D., Leij, D.F., Kinsey, G., Kelley, J., Lynch, J.M., (2002), “Strategies
for the isolation of cellulolytic fungi for composting of wheat straw”, World J.
Microbiol. Biotechnol. 18, pp 471–480.
78. John E. Halver, (1989), “Fish nutrition”, Academic press. Inc,588, pp 117.
79. Jorgensen, H., Olsson, L., (2006), “Production of cellulases by Penicillium
brasilianum IBT 20888—effect of substrate on hydrolytic performance”, Enzyme
Microb. Technol. 38, pp 381–390.
80. Kansoh, A., Essam, S.A., Zeinat, A.N., (1999), “Biodegradation and
utilization of bagasse with Trichoderma reesei”, Polym. Degrad. Stab. 63, pp 273–278.
81. Karim, A., Nawaz, M.A., Aman, A., Ul Qader, S.A., (2015), “Hyper
118
production of cellulose degrading endo (1,4) b-d-glucanase from Bacillus licheniformis
KIBGE-IB2”, J. Radiation Res. Appl. Sci. 8, pp 160–165.
82. Kim, H., Pack, M.Y., (1988), “Endo-b-1,4-glucanase encoded by Bacillus
subtilisgene cloned in Bacillus megaterium”, Enzyme Microb. Technol. 10, pp 347–
351.
83. Kim, B.-K., Lee, B.-H., Lee, Y.-J., Jin, I.-H., Chung, C.-H., Lee, J.-W., (2009),
“Purification and characterization of carboxymethylcellulase isolated from a marine
bacterium,Bacillus subtilissubsp. subtilis A-53”, Enzyme Microb. Technol. 44 (6–7), pp
411–416.
84. Kurup, R.S.C., Snishamol, C., Prabhu, G.N., (2005), “Cellulase production by
native bacteria using water hyacinth as substrate under solid state fermentation”,
Malaysian J. Microbiol. 1 (2), pp 25–29.
85. Kubaryk.J.M (1980), “Effect of diet, feeding schedule, ser on food consumption
, growth and retention of protein and energy by tilapia”, Ph.D. Dissertation , Auburn,
Alabama. pp 51.
86. Lee, R. L., P. J. Weimer, W. H. Zyl and I. S. Pretorius. (2002), “Microbial
Cellulose Utilization: Fundamentals and Biotechnology”, Microbiology and Molecular
biology reviews. pp 506–577.
87. Lee, Y.-J., Kim, B.-K., Lee, B.-H., et al., (2008), “Purification and
characterization of cellulase produced by Bacillus amyoliquefaciens DL-3 utilizing rice
hull ”, Biores. Technol. 99 (2), pp 378–386.
88. Leticia, M., S. Herrera, A. Ramos and M. Salgado (2007), “Differential
expression of cellulases and xylanases by Cellulomonas flavigena grown on different
carbon sources”, Applied Microbiology and Biotechnology. 77, pp 0175-7598.
89. L. M. Robson and G. H. Chambliss, J. Bacteriol, 165, 612 (1986); Biol. Chem.
90. Lucas, R., Robles, A., Garcia, M.T., Alvarez De Cienfuegos, G., Galvez, A.,
(2001), “Production, purification, and properties of an endoglucanase produced by the
hyphomycete Chalara (syn.Thielaviopsis) paradoxa CH32”, J. Agric. Food Chem. 49,
pp 79–85.
119
91. Mawadza, C., Hatti-Kaul, R., Zvauya, R., Mattiasson, B., (2000), “Purification
and characterization of cellulases produced by two Bacillusstrains”, J. Biotechnol. 83,
pp 177–187.
92. Muthuvelayudham R., Viruthagiri T, (2010), “Application of central
composite design based response surface methodology in parameter optimization and
on cellulase production using agricultural waste”, Int. J. Chem. Biol. Eng. 3, pp 97–104.
93. Maxwell G.S, Cole A.L, Tong C.C. (1988), “Methods In Enzymology”,
(Wood Ed.), Vol. 160 Academic Press, New York, pp 300-307.
94. Micha. J.C, T . Antoine , p . Wery and Van Hove (1988), “Growth. ingestion
capacity, comparative appetency and biochemical compossition of Oreochromis niloticus
and Tilapia rendalli fed with Azolla”, pp. 347-355.
95. Michael B.New (1987), “Feed and feeding of fish and shrimp”, Food and
agriculture organnization of the united nation, pp 109.
96. Muhammad Irfan, Asma Safdar, Quratulain Syed, Muhammad Nadeem
(2012), “Isolation and screening of cellulolytic bacteria from soil and optimization of
cellulase production and activity”, Turkish Journal of Biochemistry–Turk J Biochem;
37 (3) ; pp 287–293 .
97. Narra, M., Dixit, G., Divecha, J., Madamwar, D., Shah, A.R., (2012),
“Production of cellulases by solid state fermentation with Aspergillus terreusand
enzymatic hydrolysis of mild alkali-treated rice straw”, Biores. Technol. 121, pp 355–
361.
98. Nelson, N. (1944), “A photometric adaption of the Somogyi method for the
determination of glucose”, J. Bio. Chem. 153: pp 375-380.
99. Ole Rasmussen, Olave Jansen, Đỗ Văn Khương, Nguyễn Văn Thục (2001).
Seaweed processing and market for Viet Nam, Report for SUMA programe.
100. Peter f. Strom (1985), “Identification of Thermophilic Bacteria in Solid-Waste
Composting”, Applied and environmental microbiology, pp 906-913.
101. Popma, T.J and Lovshin, LL (1996), “Worldwide prospects for commercial
production of Tilapia”, Research and development Series No.41 International center for
120
aquaculture and aquatic environment, pp. 4-14.
102. Pullin R.S.V and R.H.Lowe. Mc Cornell (1982), “The biology and culture of
Tilapias”, International center for ling aquatic resources management.
103. Pullin R.S.V, T.Bhukaswan, K. Tonguthai, J.L. Macllean (1998), “The second
international symposium on Tilapia in aquaculture”, Deparment of fisheries Bangkok,
Thailan, pp 388-395.
104. Rajoka, M.I., Malik, K.A., (1997), “Cellulase production by Cellulomonas
biazotea cultured in media containing different cellulosic substrates”, Biores. Technol.
59, pp 21–27.
105. Rashid, S.S., Alam, M.Z., Karim, M.I.A., Salleh, M.H., (2009),
“Optimization of the nutrient supplements for cellulase production with the basal
medium palm oil mill effluent”, World Acad. Sci. Eng. Technol. 3, pp 12–24.
106. Reese E.T., and Siu R.G.H (1950), “Giological degration of solube cellulose
derities”, Biotech. J., (59), pp 485.
107. Reese E.T (1963), “Advances in enzymatic hydrolysis of cellulose and related
material”, Perganom press, London, pp 394-420.
108. R. M. Mackay, A. Lo, G. Willick, M. Zuker, S. Baird, M. Dove, F. Moranelli
and V. Seligy, (1986), Nucleic Acids Res., 14, 9159.
109. Saha, S., R. Roy, S. Sen and A. Ray. (2006), “Characterization of cellulase-
producing bacteria from the digestive tract of tilapia”, Oreochromis mossambica (Peters)
and grass carp, Ctenopharyngodon idella (Valenciennes), Aquaculture Research. 37: pp
380-388.
110. Sasidharan Sreedevi, Sreedharan Sajith, Sailas Benjamin (2013), “Cellulase
Producing Bacteria from the Wood-Yards on Kallai River Bank”, Advances in
Microbiology, 3, pp 326-332.
111. Sadhu, S., Ghosh, P.K., Aditya, G., Maiti, T.K., (2014), “Optimization and
strain improvement by mutation for enhanced cellulase production by Bacillussp.
(MTCC10046) isolated from cow dung”, J. King. Soud. Univ.-Sci. 26, pp 323–332.
112. Salwee Yasmin, R. L. Mattoo and F. A. Nehvi (2013), “Isolation,
121
Characterization and Molecular weight determination of Cellulase from Trichoderma
viride”, Academic Journals Vol. 12(28), pp. 4512-4518.
113. Schwarz, W.H. (2001), “The cellulosome and cellulose degradation by
anaerobic bacteria”, Appl. Microbiol. Biotechnol. 56, pp 634-649
114. Shafique, S., Asghier, M., Sheikh, M.A., Asad, M.J., (2004), “Solid state
fermentation of banana stalk for exoglucanase production”, Int. J. Agri. Biol. 6, pp 488–
491.
115. Shanmughapriya, S., Kiran, G.S., Selvin, J., Thomas, T.A., Rani, C., (2010),
“Optimization, purification, and characterization of extracellular mesophilic alkaline
cellulose from sponge-associated Marinobactersp. MSI032”, Appl. Biochem.
Biotechnol. 162, pp 625–640.
116. Shu-bin, L., Ren-Cha, Z., Xia, L., Chu-Yi, C., Ai-lin, Y., (2012), “Solid-state
fermentation with Okara for production of cellobiase-rich cellulases preparation by a
selected Bacillus subtilis Pa5”, Afr. J. Microbiol. 11 (11), pp 2720–2730.
117. Singh C.P (1987), “Preparation of High grade Compost by an enviroment on
organic matter decomposition”, Biol. Agric. Hort., (5), pp 41-49.
118. Singh, J., Batra, N. and Sobti, R.C. (2004), “Purification and characterisation of
alkaline cellulase produced by a novel isolate, Bacillus sphaericus JS1”, Journal of
Industrial Microbiology and Biotechnology, 31: pp 51-56.
119. Singh, K., Richa, K., Bose, H., Karthik, L., Kumar, G., Rao, K.V.B., (2014),
“Statistical media optimization and cellulase production from marine Bacillus
VITRKHB”, Biotech 4, pp 591–598.
120. Singhania, R.R., Sukumaran, R.K., Pandey, A., (2007), “Improved cellulase
production by Trichoderma reesei RUT C30 under SSF through process optimization”,
Appl. Biochem. Biotechnol. 142, pp 60–70.
121. Singhania, R.R., Saini, R., Adsul, M., Saini, J.K., Mathur, A., Tuli, D.,
(2015), “An integrative process for bio-ethanol production employing SSF produced
cellulase without extraction”, Biochem. Eng. J. 102, pp 45.
122. Song, J.-M., Wei, D.-Z., (2010), “Production and characterization of
122
cellulases and xylanases of Cellulosimicrobium cellulans grown in pretreated and
extracted bagasse and minimal nutrient medium M9”, Biomass Bioen. 34, pp 1930–
1934.
123. Seung Hwan Park, Ha Keun Kim and Moo Young Pack, (1991),
“Characterization and Structure of the Cellulase Gene of Bacillus subtilis BSE616”, Agric.
Biol. Chem., 55 (2), pp 441-448,
124. S. Landaud, P. Piquerel and J. Pourquie’ ( 1995), “Screening for bacilli
producing cellulolytic enzyme active in the neutral pH range”, Letters in Applied
Microbiology, 21, pp 319-321.
125. P. Sas Pereira, M. Costa-Ferreira, M.R. Aires-Barros (2002), “Enzymatic
properties of a neutral endo-1,3(4)-[beta]-xylanase Xyl II from Bacillus subtilis”, J.
Biotechnol. 94, pp 265–275.
126. Pratima Gupta, Kalpana Samant, and Avinash Sahu (2012), “Isolation of
Cellulose-Degrading Bacteria and Determination of Their Cellulolytic Potential”,
International Journal of Microbiology, Article ID 578925,.
127. Teather, R.M., Wood, P.J., (1982), “Use of Congo red-polysaccharide
interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine
rumen”, Appl. Environ. Microbiol. 43, pp 777–780.
128. Thomas, L., Larroche, C., Pandey, A., (2013), “Current developments in
solid-state fermentation”, Biochem. Eng. J. 81, pp 146–161.
129. Trivedi, N., Gupta, V., Reddy, C.R., Jah, B., (2013), “Detection of ionic
liquid stable cellulase produced by the marine bacterium Pseudoal teromonassp isolated
from brown alga Sargassum polycystum C”, Agardh. Biores. Technol. 132, pp 313–319.
130. Trivedi, N., Gupta, V., Kumar, M., Kumari, P., Reddy, C.R.K., Jha, B.,
(2011), “Solvent tolerant marine bacterium Bacillus aquimaris secreting organic solvent
stable alkaline cellulase”, Chemosphere 83, pp 706–712.
131. Ulrich A., G. Klimke, S. Wirth. (2008), “Diversity and Activity of Cellulose-
Decomposing Bacteria, Isolated from a Sandy and a Loamy Soil after Long-Term Manure
Application”, Microb Ecol. 55, pp 512–522.
123
132. Deliang Yang, Haibo Weng, Minge Wang, Weihua Xu, Yaozhao Li, Huiling
Yang (2010), “Cloning and expression of a novel thermostable cellulose from newly
isolated Bacillus subtilis strain I15”, Mol Biol Rep, (2010)37:pp 1923-1929
133. Y. Koide, A. Nakamura, T. Uozumi and T. Beppu (1986), Agric. Biol. Chem.,
50, pp 233 .
134. Vinay K. Singh and Anil Kumar (1998), “Production and purification of an
extracellular cellulase from Bacillus brevis VS-1”, Biochemistry and Molecular biology
International, Vol. 45, No. 3, pp 443-452.
135. Verma, V., Verma, A., Kushwaha, A., (2012), “Isolation and production of
cellulose enzyme from bacteria isolated from agricultural fields in district Hardoi”,
Uttar Pradesh, India. Adv. Appl. Sci. Res. 3, pp 171–174.
136. Vijayaraghavan, P., Vincent, S.G.P., (2012), “Purification and
characterization of carboxymethyl cellulase from a Bacillussp. isolated from a paddy
field”, Polish J. Microbiol. 61 (1), pp 51–55.
137. Wang, G., Zhang, X., Wang, L., Wang, K., Peng, F., Wang, L., (2012), “The
activity and kinetic properties of cellulases in substrates containing metal ions and acid
radicals”, Adv. Biol. Chem. 2, pp 390–395.
138. Wang Li, Wei-Wei Zhang, Ming-Ming Zang, Yu-Lin Chen (2008),
“Cloning of Thermostable Cellulase Gene from newly isolated Bacillus subtilis and its
expression in Escherichia coli”, Mol Biotechnol, 40: pp 195-201.
139. Walter J . Rainboth (1996), “Fish of the Cambodian Mekong”, Agriculture
organization . pp 6.
140. L. Westers, H. Westers, W.J. Quax (2004), “Bacillus subtilis as cell factory for
pharmaceutical proteins: a biotechnological approach to optimize the host organism”,
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Mol. Cell Res. 1694, pp 299 – 310.
141. W. Li, W.-W. Zhang, M.-M. Yang, Y.-L. Chen (2008), “Cloning of the
thermostable cellulase gene from newly isolated Bacillus subtilis and its expression in
Escherichia coli”, Mol. Biotechnol. 40, pp 195–201.
142. Wood. TM and Mccrae. SI, (1972), “The Purification and Properties of the C1
Component of Trichoderma koningii Cellulase”, Biochem. J. 128, pp 1183-1192).
124
MỘT SỐ TRANG WEB ĐÃ TRA CỨU
143. http://www.chem. qmul.ac.uk/iubmb/enzym/EC 3/2/1/4.html.
144. http://www.doitpoms.ac.uk/tlplib/wood/figures/cellulose.png
145. http://botit.botany.wisc.edu/toms_fungi/thanks.html
146. http://www.fao.org/docrep/w7241e/w7241e08.htm#3.2.1%20cellulase)
1
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1:HÌNH ẢNH MỘT SỐ HOẠT ĐỘNG CỦA ĐỀ TÀI ....................... 2
PHỤ LỤC 2: LÝ LỊCH CÁC CHỦNG VI SINH VẬT ......................................... 5
PHỤ LỤC 3 : MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................... 11
PHỤ LỤC 4: KẾT QUẢ NUÔI THỬ NGHIỆM CỦA ĐỀ TÀI.......................... 14
2
PHỤ LỤC 1
HÌNH ẢNH MỘT SỐ HOẠT ĐỘNG CỦA ĐỀ TÀI
Máy thủy lực ép tách nước Thiết bị thủy phân có khuấy đảo
Nuôi cấy chủng VSV Ly tâm thu dịch cellulase ngoại bào
3
Nuôi thử nghiệm cá rô phi
Khảo sát vùng nguyên liệu sản xuất agar ở cơ sở sản xuất agar
Bã thải agar và chế phẩm bã thải agar dạng bột
4
Máy ly tâm Máy lắc nuôi vi sinh vật
Cân phân tích Máy quang phổ UV – Vis
Thiết bị ổn nhiệt Memmert Buồng cấy vi sinh
5
PHỤ LỤC 2
1. LÝ LỊCH CÁC CHỦNG VI SINH VẬT
* Chủng vi khuẩn Bacillus substilis VTCC-B-505 do Viện Vi sinh vật và Công
nghệ Sinh học, Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật cung cấp. (Địa chỉ: 144 Xuân Thủy,
Cầu Giấy, Hà nội). Đây là chủng vi khuẩn Việt Nam được phân lập từ đất.
Chủng vi khuẩn này là những vi khuẩn hình que, Gram dương. Các điều kiện
sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào tối ưu đã được Viện Công nghệ Sinh học nghiên
cứu là: (60h, 30ºC, pH 7, 200v/phút).
Trình tự gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn này đã được giải trình tự và phân
tích
(http://biotechvnu.edu.vn/vtcc/index.php?page=shop.product_details&flypage=flypage
.tpl&product_id=1949&category_id=6&option=com_virtuemart&Itemid=47)
VTCC No. VTCC-B-505
Scientific Name of this Strain Bacillus subtilis
Product etc. 16S rDNA
>VTCC-B-505
GAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGA
TGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACT
GGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAG
GTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACC
AAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGAC
TCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGA
GTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGT
ACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTG
GCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCC
CCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCC
ACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTA
ACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAA
CGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCC
TGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATG
TGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAG
GACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGG
GTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGA
6
CTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTA
CACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCT
GTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCA
GCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACA
CCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGT
CGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTT
* Chủng Li. là chủng vi khuẩn Bacillus lichenformis được phân lập từ ruột tằm .
do Trung tâm Biolap phân lập và cung cấp.
Phương pháp xác định hình thái khuẩn lạc trên kính hiển vi điện tử quét JEOL
5410 LV
Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng có chứa nguồn
cơ chất thích hợp. Hình thái tế bào được quan sát sau hai ngày. Sinh khối được lấy từ
đĩa thạch tách khuẩn lạc, lọc qua giấy lọc rồi đem ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút,
rửa tách lấy tế bào. Tế bào được hòa tan trong glutaraldehyt 2,5% trong đệm
photphatnatri 100mM (pH 7,2) trong 30 phút. Lấy một giọt tế bào đã xử lý (khoảng 106-
108 tế bào/ml) đưa lên lưới đồng và để 1 phút để mẫu bám vào lưới vàng. Rửa nhẹ nhàng
với vài giọt nước và mẫu được làm khô qua cồn 25, 50, 75 và 100%. Chuyển qua T-
butyl. Sau đó các mẫu được làm khô bằng máy đông khô và phủ bằng vàng. Mẫu được
quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét JEOL 5410 LV.
* Hình thái tế bào của chủng Li trên kính hiển vi điện tử quét
Chủng Li có khuẩn lạc tròn, bề mặt khô, có chân ăn sâu vào thạch. Khuẩn lạc khi
trẻ có màu trắng, khi gìa chuyển màu xanh sẫm. Dưới kính hiển vi điện tử với độ phóng
đại 15000 lần chủng Li có hình que, kích thước dài từ 1,8μm đến 2,0μm, bề rộng từ
0,48μm đến 0,5 μm, xung quanh mép tế bào có màng nhày. Xác định chủng Li là vi
khuẩn.
7
Hình thái tế bào của chủng Li trên kính hiển vi điện tử độ phóng đại 15.000 lần
2. Phương pháp nuôi cấy các chủng vi sinh.
Công thức môi trường nuôi cấy
* Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: (g/l)
CMC: 10g
Pepton: 0.5g
Cao thịt: 0.2g
NaCl: 1g
Nước cất: 1lít
* Môi trường nuôi cấy nấm men: (g/l)
CMC: 10g
Glucose: 1g
Pepton: 0.5g
Cao nấm men: 0.3g
Cao malt: 0.3g
Nước cất: 1lít
* Môi trường nuôi cấy các chủng vi sinh
vật sinh cellulase được sưu tập từ phòng
thí nghiệm của trường Đại học khoa học
Tự nhiên,
CMC: 10g
Tinh bột: 1g
MgSO4: 0.2g
NaHCO3: 0.2g
K2HPO4: 5g
CaCl2: 0.2g
NaCl: 0.2g
Pepton: 2g
Nước cất: 1lít
* Môi trường nuôi cấy nấm sợi: (g/l)
CMC: 10g
Cao malt: 0.2g
Nước cất: 1lít
*Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn: (g/l)
CMC: 10g
Tinh bột: 1g
Cao nấm men: 0.2g
Nước cất: 1lít
8
* Công thức môi trường nuôi cấy tối ưu cho vi khuẩn
Môi trường Thành phần
MT1 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis VTCC-B-505: (g/l)
CMC 10g; Pepton 0.5g; Cao thịt 0.2g; NaCl 1g, Tinh bột 1g, Cao nấm men
0.2g, Nước cất 1lít
MT1’ CMC 2g; CaCl2 0,2g; NaCl 2g; Cao thịt 1g, nước cất 1lit
MT2 Môi trường nuôi cấy chủng Li (Bacillus lichenformis) được sưu tập từ
phòng thí nghiệm của trường Đại học khoa học Tự nhiên:
CMC 10g, Tinh bột 1g, MgSO4 0.2g, NaHCO3 0.2g, K2HPO4 5g, CaCl2
0.2g, NaCl 0.2g, Pepton 2g, Nước cất 1lít
MT2’ CMC 10g; MgSO4 0,2g; NaHCO3 0,2g; K2HPO4 5g; CaCl2 0,2g; NaCl
0,2g; pepton 2g; nước cất 1lit
MT3 CMC 2g; NH4NO3 1g; K2HPO4 0,5g; KH2PO4 0,5g; MgSO4 0,5g; NaCl
1g; CaCl2 0,1g FeCl3 0,02g; Cao men 0,05g, nước cất 1lit
MT4 CMC 2g; MgSO4 0,2g; NaHCO3 0,2g; K2HPO4 5g; CaCl2 0,2g; NaCl 0,2g;
nước mắm 20ml, nước cất 1lit
MT5 CMC 2g; bột đậu tương 2g, bột gạo 2g; NH4Cl 0,4g, KH2PO4 0,6g;
K2HPO4 1g; nước cất 1lit
MT6 CMC 2g; (NH4)2SO4 1,5g; KH2PO4 0,5g; K2HPO4 0,5g; MgSO4 0,4g;
NaCl 0,1g; MnSO4 0,01g; FeSO4 0,01g; Cao men 0,1g; nước cất 1lit
Cân chính xác thành phần môi trường nuôi cấy cho vào bình tam giác 1000ml chứa
sẵn khoảng 800 ml nước cất. Đun sôi nhẹ và khuấy cho CMC tan hết. Bao gói và hấp
khử trùng ở 121oC, 20 phút.
* Các bước tiến hành nuôi cấy vi sinh vật
Cho 2ml nước muối sinh lý vào ống nghiệm chứa khuẩn lạc của chủng vi sinh vật.
Dùng que cấy móc cà nhẹ lên môi trường thạch để sinh khối tế bào hòa vào dịch muối.
Chuyển dịch muối chứa sinh khối vi sinh vật vào bình môi trường đã pha ở trên. Nuôi
cấy trong điều kiện lắc 200 vòng/phút ở 280C trong 48h để thu enzym cellulase.
9
* Xác định hoạt tính sinh cellulase của vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán
trên thạch có cơ chất CMC và bột giấy
* Môi trường xác định hoạt tính
- Môi trường Cell .
Thành phần gồm có (g/l):
(NH4)2HPO4 1,5
KH2PO4 0,5
K2HPO4 0,5
MgSO4 .H2O 0,4
NaCl 0,1
MnSO40,01
FeSO4 7H2O 0,01
Bột giấy 2
Nước cất 1000ml
- Môi trường Khoáng + CMC:
Thành phần gồm có (g/l):
NH4NO3 : 1
K2HPO4 0,5
KH2PO40,5
MgSO4. 7H2O 0,5
NaCl 1
CaCl2 0,1
FeCl3 0,02
Cao men 0,05
Thạch 20
Nước cất 1000 ml ;
pH = 7,0 - 7,2
Các môi trường được khử trùng ở 121oC trong 30 phút.
- Môi trường CMC: Thành phần (g/l): CMC 2; Thạch: 20; Nước cất: 1000ml
Phương pháp đục lỗ: nhỏ 0,2ml dịch nuôi vào các giếng thạch có đường kính
10mm, giữ ở 4oC trong 2h để dịch khuếch tán đều xung quanh giếng thạch. Ủ ở 300C
trong 36 giờ, sau đó tráng dịch Lugol trên đĩa thạch và đo vòng phân hủy trong suốt
không bắt màu nhuộm xung quanh giếng thạch.
* Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy 2 chủng vi khuẩn B505 và Li đã lựa chọn
+ Lựa chọn môi trường nuôi cấy
Để có thể sản xuất enzyme ở quy mô lớn, chúng tôi tiến hành lựa chọn các nguồn
cơ chất dễ kiếm, rẻ tiền. Chúng tôi tiến hành xác định khả năng sinh trưởng và tiết
enzyme cellulase ngoại bào của 2 chủng Li và B505 trên một số loại cơ chất: bột đậu
tương, bột gạo, nước mắm, môi trường giàu chất khoáng và so sánh với môi trường quy
mô phòng thí nghiệm (môi trường MT1, MT1’, MT2, MT2’, MT3, MT4, MT5, MT6)
10
+ Thời gian nuôi cấy
Thời gian nuôi cấy cũng là một trong những nhân tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng
và khả năng sinh enzyme của các chủng vi khuẩn. Trong quá trình nuôi cấy và xác định
hoạt tính của chủng B505 và Li được theo dõi ở các mốc thời gian sau:24, 48, 68, 72,
92, 96 h.
+ Nhiệt độ
Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng và
phát triển của vi khuẩn. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng sinh trưởng và tiết
cellulase ngoại bào của 2 chủng B505 ở nhiệt độ 28, 30, 32, 37 và 45 ºC.
+ pH
pH cũng là một trong các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng
và phát triển của vi khuẩn. Vì vậy chúng tôi nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của pH ( 4-
8) đến khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chúng.
11
PHỤ LỤC 3
MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Xây dựng đường chuẩn glucose
Biểu đồ 1. Đồ thị đường chuẩn glucose
3.2. Xác định độ bền của chế phẩm enzyme cellulase từ 2 chủng B505 và Li theo
thời gian bảo quản
Các chế phẩm enzyme cellulase ngoại bào thu được từ 2 chủng B505 và Li được
bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 ºC (có bổ sung NaN3 0,02%) trong 1 ngày, 1 tuần, 2
tuần và 3 tuần. Ở cùng 1 điều kiện thủy phân, chúng tôi sử dụng phương pháp DNSA
xác định đầu đường khử để kiểm tra hoạt tính của chế phẩm enzyme theo thời gian bảo
quản. Kết quả trình bày trong hình 2 ÷ 3.
y = 3.138x - 0.223
R2 = 0.9925
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35
Nồng độ glucose (mg/ml)
A 5
30n
m
12
Biểu đồ 2. Độ bền của chế phẩm enzyme cellulase (Li ) theo thời gian bảo quản
Biểu đồ 3. Độ bền của chế phẩm enzyme cellulase (B505) theo thời gian bảo quản
Kết quả trên hình 2 và hình 3 cho thấy, sau 1 tuần bảo quản ở 4ºC, chế phẩm
cellulase của chủng B505 chỉ còn 58 % so với hoạt tính ban đầu và sau 2 tuần bảo quản
hoạt tính chỉ còn 26%. Trong khi đó cellulase của chủng Li bền hơn khi sau 2 tuần bảo
quản ở 4 ºC, hoạt tính vẫn còn 79,3 %. Chính vì vậy, chúng tôi lựa chọn cả 2 chế phẩm
cellulase từ chủng B505 và chủng Li để có thể thích ứng với từng điều kiện sản xuất và
bảo quản nguyên liệu.
0
20
40
60
80
100
1 ngày 1 tuần 2 tuần 3 tuần
Ho
ạt t
ính t
ươ
ng đ
ối
(%)
Thời gian bảo quản (ngày)
0
20
40
60
80
100
120
1 ngày 1 tuần 2 tuần 3 tuần
Ho
ạt t
ính t
ườ
ng đ
ối
(%)
Thời gian bảo quản (tuần)
13
3.3. So sánh chế phẩm enzym thô ở dạng lỏng và dạng đông khô
Để có thể bảo quản được chế phẩm enzym thô từ dạng lỏng, chúng tôi đã nghiên
cứu để sản xuất chế phẩm ở dạng đông khô.Từ 100ml dịch enzym cellulase thô của
chủng B505, thêm phụ gia, đông khô ở nhiệt độ 4°C thu được 20g chế phẩm ở dạng bột
khô. Chế phẩm enzym đông khô sau khi hòa lại để đạt cùng thể tích và nồng độ với chế
phẩm enzym ở dạng lỏng, chúng tôi đã tiến hành so sánh hoạt tính của 2 dạng chế phẩm.
Hình 1. Hoạt tính của chế phẩm enzym cellulase ở dạng lỏng và dạng khô
Hình 3.18 cho thấy chế phẩm enzym cellulase ở dạng lỏng có đường kính vòng
thủy phân 2,5 cm và chế phẩm enzym cellulase ở dạng bột khô có đường kính vòng thủy
phân là 2cm. Để sử dụng chế phẩm enzym cellulase trong thời gian dài, chúng tôi có thể
bảo quản chế phẩm ở dạng đông khô. Tuy nhiên hoạt tính của chế phẩm ở dạng bột khô
giảm hơn so với sử dụng chế phẩm ở dạng lỏng và giá thành để đông khô chế phẩm là
khá cao.Cho nên cần chọn lọc biện pháp hiệu quả, có thểtự sản xuất chế phẩm dạng lỏng
tại chỗ và sử dụng ngay cho quá trình thuỷ phân bãagar để giảm giá thành khi sấy
hoặcđông khô.
Chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu phương pháp bảo quản chế phẩm enzym cellulase
thô thu được từ chủng B505 ở dạng lỏng để giảm giá thành sản xuất và cho hiệu quả sử
dụng cao khi thủy phân bã agar làm thức ăn gia súc.
Chế phẩm enzym dạng thô
Chế phẩm enzym dạng lỏng
14
PHỤ LỤC 4
KẾT QUẢ NUÔI THỬ NGHIỆM CỦA ĐỀ TÀI
Bảng IV.1 : Thành phần hóa học của các nguyên liệu phối trộn
WUFFF DA
Cost Min. Max. Weight Dry Matter M.E. Protein E.E. C18:3 C.F
ACTIVE INGREDIENT COMPOSITION MATRIX
Bột cá lạt 58% CP 21000 1 90.7 3.22 58.43 6.17 1.89
Đậu nành rang 35000 1 90.9 3.74 39.64 15.5 9.03
Bột mì 20000 1 89 1.3 15.7 3 1.7 11
Cám gạo mịn 8% 7000 1 89.8 2.45 12.57 7.36 6.48
Bã rong khô 4000 1 88.5 2.478
Hạt bắp vàng 9 %CP 7000 1 88.8 3.31 9.42 4.15 1.95
Premix KVTM 46284 0 0 1 96 0 0 0 0 0
Vitamin ADE 342000 0 0 1 96
Binder 60000 0 0 1 95
WUFFF DA
Calcium
Total
Phos. Avail.Phos. K Cl Mn Na Zn Biotin Choline Folate
ACTIVE INGREDIENT COMPOSITION MATRIX
Bột cá lạt
58% CP 4.55 2.11 2.11 2.9
Đậu nành
rang 0.27 0.63 0.21
Bột mì 0.14 1.15 0.34 1.19 0.06 113 0.05 133 0.48 1.88 1.2
Cám gạo mịn
8% 0.17 0.91 0.3
Bã rong khô
Hạt bắp
vàng 9 %CP 0.14 0.37 0.12
15
Premix
KVTM 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Vitamin
ADE 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Binder 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
UFFF DA
ARG GLY SER
GLY
&SER HIS ILE LEU LYS MET
ACTIVE INGREDIENT COMPOSITION MATRIX
Bột cá lạt 58% CP 2.95 3.91 1.87 5.78 1.41 1.94 3.82 3.8 1.39
Đậu nành rang 2.42 1.51 0.49 2 0.85 1.45 2.66 2.17 0.54
Bột mì 0.98 0.9 0.9 1.8 0.34 0.59 0.91 0.59 0.17
Cám gạo mịn 8% 0.74 0.36 0.43 0.79 0.18 0.33 0.68 0.27 0.27
Bã rong khô 0.09 0.22 0.24 0.461 0.14 0.41 0.645 0.314 0.183
Hạt bắp vàng 9
%CP 0.44 0.35 0.45 0.8 0.31 0.32 1.15 0.24 0.24
WUFFF DA
ARG CYS TSAA PHE TYR TAAA THR TRP VAL
ACTIVE INGREDIENT COMPOSITION MATRIX
Bột cá lạt 58% CP 2.95 0.55 1.94 1.61 2.1 3.71 0.21 0.56 2.38
Đậu nành rang 2.42 0.59 1.13 1.63 1.11 2.74 1.35 0.5 1.49
Bột mì 0.98 0.25 0.42 0.49 0.4 0.89 0.42 0.3 0.73
Cám gạo mịn 8% 0.74 0.22 0.49 0.44 0.38 0.82 0.3 0.1 0.47
Bã rong khô 0.43 0.24 0.19
Hạt bắp vàng 9
%CP 0.44 0.24 0.48 0.43 0.32 0.75 0.32 0.08 0.43
16
Bảng IV.2: Tính toán công thức thức ăn bằng WUFFF DA
WUFFF DA
Feed
Cost:
$
19.157
Feed:
Cá rô phi
CT 1
Ingredient Cost Min. Amount Max. Nutrient Units Min. Amount Max.
d/kg % % %
Bot ca lat 58%
CP 21000 0,00 19,0 0,00 Dry Matter % 87,00 89,930 100
Dau nanh rang 35000 0,00 19,0 0,00
Metabolozable
Energy Kcal/g 2,60 3,028 100
Bột mì 20000 0,00 5,0 0,00 Protein % 18,50 25,206 100
Cam gao min
8% 7000 0,00 20,0 0,00 Ether Extract % 6,00 7,174 100
Bã rong khô 4000 0,00 0 0,00 Linoleic Acid % 1,00 0,085 100
Hat bap vang
9%CP 6000 0,00 34,75 0,00 Crude Fiber % 6,00 4,598 100
Premix KVTM 46284 0,00 1,0 0,00 Calcium % 3,60 1,005 100
Vitamin ADE 342000 0,00 1,0 0,00
Total
Phosphorus % 0,80 0,889 100
Binder 60000 0,00 0,25 0,00
Avail.
Phosphorus % 0,60 0,560 100
Potassium % 0,15 0,060 100
Chlorine % 0,12 0,003 100
TOTAL 100,0 Manganese mg/kg 0,00 5,650 100
Sodium % 0,15 0,003 100
Zinc mg/kg 50,00 6,650 100
Biotin mg/kg 0,00 0,024 100
Choline g/kg 0,00 0,645 100
Folate mg/kg 0,00 0,060 100
ARG % 0,90 1,370 100
GLY % 0,00 1,268 100
SER % 0,00 0,736 100
GLY&SER % 0,00 2,004 100
HIS % 0,50 0,590 100
ILE % 0,38 0,851 100
LEU % 0,76 1,812 100
LYS % 0,80 1,301 100
MET % 0,28 0,513 100
CYS % 0,36 0,357 100
TSAA % 0,64 0,869 100
PHE % 0,00 0,878 100
TYR % 0,00 0,817 100
TAAA % 0,00 1,695 100
THR % 0,68 0,489 100
TRP % 0,16 0,264 100
100
17
WUFFF DA
Feed
Cost: $ 15.115
Feed:
Cá rô phi
CT2
Ingredient Cost Min. Amount Max. Nutrient Units Min. Amount Max.
d/kg % % %
Bot ca lat
58% CP 21000 0,00 19,0 0,00 Dry Matter % 87,00 89,936 100
Dau nanh
rang 35000 0,00 20,0 0,00
Metabolozable
Energy Kcal/g 2,60 2,866 100
Bột mì 20000 0,00 5,0 0,00 Protein % 18,50 25,161 100
Cam gao min
8% 7000 0,00 20,0 0,00 Ether Extract % 6,00 7,079 100
Bã rong khô 4000 0,00 5,0 0,00 Linoleic Acid % 1,00 0,085 100
Hat bap vang
9 %CP 6000 0,00 28,75 0,00 Crude Fiber % 6,00 4,572 100
Premix
KVTM 46284 0,00 1,0 0,00 Calcium % 3,60 1,000 100
Vitamin ADE 342000 0,00 1,0 0,00
Total
Phosphorus % 0,80 0,873 100
Binder 60000 0,00 0,25 0,00
Avail.
Phosphorus % 0,60 0,554 100
Potassium % 0,15 0,060 100
Chlorine % 0,12 0,003 100
TOTAL 100,0 Manganese mg/kg 0,00 5,650 100
Sodium % 0,15 0,003 100
Zinc mg/kg 50,00 6,650 100
Biotin mg/kg 0,00 0,024 100
Choline g/kg 0,00 0,645 100
Folate mg/kg 0,00 0,060 100
ARG % 0,90 1,373 100
GLY % 0,00 1,274 100
SER % 0,00 0,726 100
GLY&SER % 0,00 1,999 100
HIS % 0,50 0,587 100
ILE % 0,38 0,867 100
LEU % 0,76 1,802 100
LYS % 0,80 1,324 100
MET % 0,28 0,513 100
CYS % 0,36 0,348 100
TSAA % 0,64 0,852 100
PHE % 0,00 0,889 100
TYR % 0,00 0,821 100
TAAA % 0,00 1,677 100
THR % 0,68 0,493 100
TRP % 0,16 0,264 100
VAL % 0,47 1,004 100
18
WUFFF
DA
Feed
Cost
:
$
17.042
Feed: Cá rô phi
CT3
Ingredient Cost Min. Amount Max
.
Nutrient Units Min. Amoun
t
Max.
d/kg % % %
Bot ca lat
58% CP 21000
0,00 20,0 0,00 Dry Matter % 87,0
0 89,940
100
Dau nanh
rang 35000
0,00 20,0 0,00 Metabolozabl
e Energy
Kcal/
g
2,60 2,700
100
Bột mì
20000
0,00 5,0 0,00 Protein % 18,5
0 25,304
100
Cam gao
min 8% 7000
0,00 20,0 0,00 Ether Extract % 6,00 6,892
100
Bã rong khô 4000 0,00 10,0 0,00 Linoleic Acid % 1,00 0,085 100
Hat bap
vang 9
%CP 6000
0,00 22,75 0,00 Crude Fiber % 6,00 4,474
100
Premix
KVTM 46284
0,00 1,0 0,00 Calcium % 3,60 1,037
100
Vitamin
ADE 342000
0,00 1,0 0,00 Total
Phosphorus
% 0,80 0,872
100
Binder
60000
0,00 0,25 0,00 Avail.
Phosphorus
% 0,60 0,568
100
Potassium % 0,15 0,060 100
TOTAL 100,0 Chlorine % 0,12 0,003 100
Manganese mg/kg 0,00 5,650 100
Sodium % 0,15 0,003 100
Zinc mg/kg 50,0
0 6,650
100
Biotin mg/kg 0,00 0,024 100
Choline g/kg 0,00 0,674 100
Folate mg/kg 0,00 0,060 100
ARG % 0,90 1,380 100
GLY % 0,00 1,303 100
SER % 0,00 0,729 100
GLY&SER % 0,00 2,032 100
HIS % 0,50 0,589 100
ILE % 0,38 0,887 100
LEU % 0,76 1,804 100
LYS % 0,80 1,364 100
MET % 0,28 0,521 100
CYS % 0,36 0,339 100
TSAA % 0,64 0,842 100
PHE % 0,00 0,901 100
TYR % 0,00 0,835 100
TAAA % 0,00 1,669 100
THR % 0,68 0,485 100
TRP % 0,16 0,265 100
VAL % 0,47 1,002 100
19
WUFFF
DA
Feed
Cost
:
$
17.382
Feed: Cá rô phi
CT4
Ingredient Cost Min. Amount
Max
. Nutrient Units Min.
Amoun
t Max.
d/kg % % %
Bot ca lat
58% CP 21000 0,00 20,0 0,00 Dry Matter %
87,0
0 89,946 100
Dau nanh
rang 35000 0,00 21,0 0,00
Metabolozabl
e Energy
Kcal/
g 2,60 2,539 100
Bột mì 20000 0,00 5,0 0,00 Protein %
18,5
0 25,259 100
Cam gao
min 8% 7000 0,00 20,0 0,00 Ether Extract % 6,00 6,798 100
Bã rong khô 4000 0,00 15,0 0,00 Linoleic Acid % 1,00 0,085 100
Hat bap
vang 9
%CP 6000 0,00 16,75 0,00 Crude Fiber % 6,00 4,447 100
Premix
KVTM 46284 0,00 1,0 0,00 Calcium % 3,60 1,031 100
Vitamin
ADE 342000 0,00 1,0 0,00
Total
Phosphorus % 0,80 0,856 100
Binder 60000 0,00 0,25 0,00
Avail.
Phosphorus % 0,60 0,563 100
Potassium % 0,15 0,060 100
Chlorine % 0,12 0,003 100
TOTAL 100 Manganese mg/kg 0,00 5,650 100
Sodium % 0,15 0,003 100
Zinc mg/kg
50,0
0 6,650 100
Biotin mg/kg 0,00 0,024 100
Choline g/kg 0,00 0,674 100
Folate mg/kg 0,00 0,060 100
ARG % 0,90 1,383 100
GLY % 0,00 1,308 100
SER % 0,00 0,719 100
GLY&SER % 0,00 2,027 100
HIS % 0,50 0,586 100
ILE % 0,38 0,903 100
LEU % 0,76 1,793 100
LYS % 0,80 1,387 100
MET % 0,28 0,522 100
CYS % 0,36 0,331 100
TSAA % 0,64 0,825 100
PHE % 0,00 0,913 100
TYR % 0,00 0,839 100
TAAA % 0,00 1,652 100
THR % 0,68 0,489 100
TRP % 0,16 0,265 100
VAL % 0,47 0,991 100
20
WUFFF DA Feed
Cost: 14660
Feed: Cá rô
phi CT5
Ingredient Cost Min. Amount Max. Nutrient Units Min. Amount Max.
d/kg % % %
Bot ca lat
58% CP 21000 0,00 21,0 0,00 Dry Matter % 87,00 89,939 100
Dau nanh
rang 35000 0,00 20,5 0,00
Metabolozable
Energy Kcal/g 2,60 2,370 100
Bột mì 20000 0,00 5,0 0,00 Protein % 18,50 25,251 100
Cam gao min
8% 7000 0,00 20,0 0,00 Ether Extract % 6,00 6,554 100
Bã rong khô 4000 0,00 20,0 0,00 Linoleic Acid % 1,00 0,085 100
Hat bap vang
9 %CP 6000 0,00 11,3 0,00 Crude Fiber % 6,00 4,313 100
Premix
KVTM 46284 0,00 1,0 0,00 Calcium % 3,60 1,068 100
Vitamin
ADE 342000 0,00 1,0 0,00
Total
Phosphorus % 0,80 0,853 100
Binder 60000 0,00 0,3 0,00
Avail.
Phosphorus % 0,60 0,577 100
Potassium % 0,15 0,060 100
Chlorine % 0,12 0,003 100
TOTAL 100,0 Manganese mg/kg 0,00 5,650 100
Sodium % 0,15 0,003 100
Zinc mg/kg 50,00 6,650 100
Biotin mg/kg 0,00 0,024 100
Choline g/kg 0,00 0,703 100
Folate mg/kg 0,00 0,060 100
ARG % 0,90 1,381 100
GLY % 0,00 1,331 100
SER % 0,00 0,723 100
GLY&SER % 0,00 2,054 100
HIS % 0,50 0,586 100
ILE % 0,38 0,918 100
LEU % 0,76 1,787 100
LYS % 0,80 1,416 100
MET % 0,28 0,529 100
CYS % 0,36 0,320 100
TSAA % 0,64 0,812 100
PHE % 0,00 0,919 100
TYR % 0,00 0,849 100
TAAA % 0,00 1,634 100
THR % 0,68 0,476 100
TRP % 0,16 0,264 100
VAL % 0,47 0,984 100
21
WUFFF DA Feed
Cost:
$ 14.685
Feed: Cá rô phi
CT6
Ingredient Cost Min. Amount Max. Nutrient Units Min. Amount Max.
d/kg % % %
Bot ca lat
58% CP 21000
0,00 21,5 0,00 Dry Matter % 87,00 89,915
100
Dau nanh
rang 35000
0,00 21,5 0,00 Metabolozable
Energy
Kcal/g 2,60 2,243
100
Bột mì 20000 0,00 5,0 0,00 Protein % 18,50 25,325 100
Cam gao min
8% 7000
0,00 16,0 0,00 Ether Extract % 6,00 6,341
100
Bã rong khô 4000 0,00 25,0 0,00 Linoleic Acid % 1,00 0,085 100
Hat bap vang
9 %CP 6000
0,00 8,75 0,00 Crude Fiber % 6,00 4,105
100
Premix
KVTM 46284
0,00 1,0 0,00 Calcium % 3,60 1,083
100
Vitamin ADE
342000
0,00 1,0 0,00 Total
Phosphorus
% 0,80 0,825
100
Binder
60000
0,00 0,25 0,00 Avail.
Phosphorus
% 0,60 0,574
100
Potassium % 0,15 0,060 100
Chlorine % 0,12 0,003 100
TOTAL 100,0 Manganese mg/kg 0,00 5,650 100
Sodium % 0,15 0,003 100
Zinc mg/kg 50,00 6,650 100
Biotin mg/kg 0,00 0,024 100
Choline g/kg 0,00 0,718 100
Folate mg/kg 0,00 0,060 100
ARG % 0,90 1,383 100
GLY % 0,00 1,354 100
SER % 0,00 0,721 100
GLY&SER % 0,00 2,074 100
HIS % 0,50 0,594 100
ILE % 0,38 0,942 100
LEU % 0,76 1,809 100
LYS % 0,80 1,456 100
MET % 0,28 0,533 100
CYS % 0,36 0,314 100
TSAA % 0,64 0,801 100
PHE % 0,00 0,936 100
TYR % 0,00 0,859 100
TAAA % 0,00 1,628 100
THR % 0,68 0,480 100
TRP % 0,16 0,266 100
VAL % 0,47 0,981 100
22
Bảng IV.3 : Bảng số liệu các chỉ tiêu môi trường
Ngày Nhiệt độ
sáng (0C)
Nhiệt độ
chiều (0C) pH sáng
pH
chiều
DO sáng
(mg/l)
DO chiều
(mg/l)
1 28,5 29,5 6,9 7,4 5,5 6
2 28,5 29 6,9 7,4 5 5,5
3 28,5 29 6,9 7,4 5 5
4 28,5 28,5 6,8 7,3 5,5 5
5 28 29 6,8 7,3 5 5
6 28 29 6,9 7,4 5,5 5,5
7 28 28,5 6,9 7,2 5,5 5,5
8 28 29 6,8 7,4 6 6
9 28 29 6,6 7,4 5,5 5,5
10 28 29 6,6 7,4 5 5,5
11 28 29,5 6,7 7,4 5 5
12 28 29,5 6,6 7,5 5,5 5
13 28,5 29 6,7 7,2 5 5
14 28,5 29,5 6,8 7,3 5,5 5,5
15 28,5 29 6,8 7,4 5 5
16 28,5 29 6,8 7,3 5,5 6
17 28 29 6,9 7,4 4,5 5
18 28 29 7 7,5 5 6
19 28 29 6,8 7,3 5 5,5
20 28 28,5 6,9 7,3 5 5,5
21 28 29 6,8 7,4 5 5
22 28 29 6,8 7,3 5,5 5
23 28 28,5 6,8 7,4 5 5,5
24 28 29 6,9 7,5 5 5
25 28,5 29 6,8 7,3 5,5 5,5
26 28,5 28,5 6,8 7,3 5 5
27 28 28,5 6,9 7,3 5 5,5
28 28 29 6,9 7,3 5,5 5,5
29 28 28,5 6,9 7,4 6 6
30 28 28,5 7 7,4 5,5 5,5
31 28 28,5 7,1 7,3 6 5,5
32 28 28 7,1 7,4 5 5
33 28,5 28,5 7,2 7,5 5,5 5
34 28,5 29 7 7,5 5 5
35 28,5 28,5 7 7,6 5,5 5,5
23
36 28 28,5 7 7,5 5 5
37 28 28,5 7 7,4 5,5 5,5
38 28 29 7,1 7,5 5,5 5,5
39 28,5 29 7,2 7,6 5 6
40 28,5 29,5 7,2 7,6 5 5,5
41 29 29,5 7,2 7,7 5 5,5
42 29 29,5 6,8 7,4 5 5
43 29 29 7,1 7,5 5,5 5,5
44 28,5 29 7,1 7,5 5 6
45 28,5 28,5 7,2 7,6 5 5,5
46 28 28,5 7,1 7,5 6 6
47 28 28,5 7,1 7,5 5 5
48 28 28 7,2 7,6 5,5 5
49 27,5 28 7,1 7,5 5 5
50 27,5 28 7,2 7,6 5,5 5,5
51 27,5 27,5 7,2 7,5 6 6
52 27 27,5 7,1 7,6 5,5 5,5
53 27 27,5 7,2 7,5 5,5 5,5
54 27 27,5 7,2 7,5 5 5
55 27 28 7 7,4 5 5,5
56 27 28 7 7,5 5,5 5,5
57 27,5 28,5 7,2 7,6 5,5 5
58 28 28,5 7,1 7,6 5 5
59 28 29 7,2 7,7 4,5 5
60 28 29 7,3 7,6 5 5
61 28 29,5 7,3 7,8 5 5
62 28,5 29 7,4 7,6 5 5,5
63 28 28,5 7,4 7,8 5,5 5,5
64 27,5 28 7,3 7,8 5,5 5,5
65 27 27,5 7,4 7,8 5 6
66 26,5 27 7,4 7,8 5 5,5
67 26,5 27 7,3 7,6 5 6
68 26,5 27,5 7,3 7,7 5,5 5,5
69 27 27,5 7,4 7,8 5,5 6
70 27 28 7,2 7,6 5 6
71 27,5 28 7,2 7,7 5,5 5,5
72 27,5 28 7,3 7,5 5 5,5
73 27,5 28,5 7,1 7,5 5 5,5
24
74 28 28,5 7,2 7,6 5 5
75 28 28,5 7,2 7,6 5,5 6
76 28 29 7,1 7,5 5 5
77 28,5 29 7,1 7,6 5,5 5,5
78 28,5 29,5 7,2 7,7 5 5
79 28,5 29 7,2 7,5 5,5 5,5
80 28,5 29 7,2 7,3 5,5 5,5
81 28 28,5 7,2 7,3 5 6
82 28 29 7,1 7,2 5,5 5,5
83 28 29 7,1 7,2 5 5,5
84 28 28,5 7,2 7,3 5 5
85 28 29 7,2 7,6 5,5 5,5
86 28 29 7,3 7,7 5 5
87 28 29 7,3 7,7 5,5 5
88 28 29,5 7,1 7,5 5,5 5
89 28,5 29,5 7,1 7,5 5 5
90 28,5 29 7,2 7,5 5,5 5,5
91 28,5 29,5 7,3 7,5 5,5 5,5
92 28,5 29 7,2 7,6 5 6
93 28 29 7,2 7,6 5 5,5
94 28 29 6,8 7,2 5 6
95 28 29 6,9 7,4 5 5,5
96 28 29 6,9 7,5 5,5 6
97 28 28,5 6,6 7,4 5 6
98 28 29 6,7 7,4 5,5 5,5
99 28 29 6,6 7,4 5,5 5,5
100 28 28,5 6,8 7,4 5 6
101 28,5 29 6,8 7,5 5 5,5
102 28,5 29 6,7 7,2 5 5,5
103 28 28,5 6,8 7,3 5 5
104 28 28,5 6,8 7,4 5,5 5
105 28 29 6,8 7,3 5 5
106 27,5 28,5 6,9 7,4 5 5
107 27,5 28,5 6,7 7,7 5,5 5
108 28 28,5 7,1 7,6 5 5
109 28 28 7,1 7,6 5,5 5,5
110 28 28,5 7,2 7,7 5,5 5,5
111 28 28,5 7,2 7,6 5 6
25
112 28 28 7,3 7,7 5,5 5,5
113 27,5 28 7,4 7,7 5 6
114 27,5 28 7,1 7,6 5 5,5
115 27,5 27,5 7,1 7,6 5,5 6
116 27,5 28 7,2 7,6 5 6
117 27,5 28 7,3 7,6 5,5 5,5
118 27,5 28 7,2 7,7 5 5,5
119 28 28,5 7,2 7,7 5 5,5
120 28 28,5 6,8 7,3 5 5
121 28 28 6,9 7,3 5,5 5
122 28 28,8 6,9 7,3 5 5
123 28 28,5 6,8 7,3 5,5 5,5
124 28 29 6,8 7,3 5 5
125 28 29 6,7 7,2 5,5 5,5
126 28,5 29 6,8 7,3 5,5 5,5
127 28,5 29 6,8 7,3 5 6
128 28,5 28,5 6,7 7,3 5 5,5
129 28 28,5 6,8 7,3 5 5,5
130 28 28,5 6,8 7,8 5 5
131 28 29 6,8 7,7 5,5 5
132 28,5 29 6,9 7,4 5 5
133 28,5 29,5 7,2 7,7 5 5
134 29 29,5 7,1 7,6 5,5 5
135 29 29,5 7,1 7,6 5 5
136 29 29 7,2 7,7 5,5 5,5
137 28,5 29 7,2 7,6 5,5 5,5
138 28,5 28,5 7,3 7,7 5 6
139 28 28,5 7,4 7,7 5 5,5
140 28 28,5 7,1 7,6 5,5 5,5
141 28 28 7,1 7,6 5 6
142 27,5 28 7,2 7,6 5 5,5
143 27,5 28 7,3 7,6 5 5,5
144 27,5 27,5 7,2 7,7 5 5
145 27 27,5 7,2 7,7 5,5 5
146 27 27,5 6,8 7,3 5 5
147 27 27,5 6,9 7,3 5 5
148 27 28 6,9 7,5 5,5 5
149 27 28 6,7 7,4 5 5
26
150 27,5 28,5 6,8 7,4 5,5 5,5
151 28 29 7 7,2 5 5
152 28 29 7 7,2 5,5 5,5
153 28 28,5 6,9 7,2 5 5
154 28,5 29 6,9 7,2 5,5 5,5
155 28,5 29 7 7,4 5 6
156 28,5 29 6,7 7,2 5 5,5
157 28 28,5 6,8 7,3 5 5
158 28 28,5 6,8 7,4 5,5 5
159 28 29 6,8 7,3 5 5
160 27,5 28,5 6,9 7,4 5 5
161 27,5 28,5 6,7 7,7 5,5 5
162 28 28,5 7,1 7,6 5 5
163 28 28 7,1 7,6 5,5 5,5
164 28 28,5 7,2 7,7 5,5 5,5
165 28 28,5 7,2 7,6 5 6
166 28 28 7,3 7,7 5,5 5,5
167 27,5 28 7,4 7,7 5 6
168 27,5 28 7,1 7,6 5 5,5
169 27,5 27,5 7,1 7,6 5,5 6
170 27,5 28 7,2 7,6 5 6
171 28,5 29 7,1 7,6 5,5 5,5
172 28,5 29,5 7,2 7,7 5 5
173 28,5 29 7,2 7,5 5,5 5,5
174 28,5 29 7,2 7,3 5,5 5,5
175 28 28,5 7,2 7,3 5 6
176 28 29 7,1 7,2 5,5 5,5
177 28 29 7,1 7,2 5 5,5
178 28 28,5 7,2 7,3 5 5
179 28 29 7,2 7,6 5,5 5,5
180 28 29 7,3 7,7 5 5
181 28,5 28,5 7,2 7,5 5,5 5
182 28,5 29 7 7,5 5 5
183 28,5 28,5 7 7,6 5,5 5,5
184 28 28,5 7 7,5 5 5
27
Bảng IV.4: Bảng mô tả thống kê các số liệu môi trường nước ao nuôi
Descriptive Statistics
Minimum Maximum Mean
Std.
Deviation
Nhiệt độ sáng (oC) 26,5 29 27,99 0,51
Nhiệt độ chiều (oC) 27 29,5 28,61 0,57
DO sáng (mg/l) 4,5 6 5,23 0,29
DO chiều (mg/l) 5 6 5,40 0,36
pH sáng 6,6 7,4 7,04 0,21
pH chiều 7,2 7,8 7,49 0,16
Bảng IV.5: Bảng số liệu đo tăng trọng cá thí nghiệm sau 80 ngày nuôi
Nghiệm
thức
Mẫu
Trọng
lượng cá
ban đầu
(g/con)
Trọng
lượng cá
cuối (g)
20 ngày
(g/con)
40 ngày
(g/con)
60 ngày
(g/con)
80 ngày
(g/con)
CT1
0%
1 212 310 430 540 630
1 208 315 420 535 640
1 204 300 430 538 635
1 208 305 435 545 625
1 208 308 430 545 628
1 204 310 427 535 625
1 206 312 435 525 628
1 205 315 420 545 632
1 205 305 430 535 630
1 200 300 425 540 628
CT 2
5%
1 205 270 390 520 656
1 208 278 402 518 650
1 204 272 405 510 648
1 212 273 395 505 645
1 208 276 390 510 658
1 204 274 398 518 650
1 206 278 400 520 652
1 205 272 397 515 655
1 205 275 395 512 657
1 210 274 398 515 652
CT3
10%
1 208 285 414 546 685
1 210 298 420 540 670
28
1 212 292 410 550 679
1 208 298 407 556 678
1 205 292 420 542 665
1 204 297 418 548 679
1 206 302 416 538 672
1 205 296 418 542 677
1 208 295 416 548 665
1 210 297 412 543 680
CT4
15%
1 210 340 470 610 765
1 208 335 475 595 765
1 204 332 473 605 768
1 208 336 480 605 760
1 208 338 478 600 772
1 204 330 475 605 770
1 190 335 470 608 765
1 205 330 480 602 760
1 205 340 476 610 765
1 205 337 477 607 760
CT 5
20%
1 212 340 468 600 740
1 208 338 475 605 738
1 190 335 458 595 735
1 208 330 465 603 730
1 208 328 468 598 738
1 204 345 460 592 735
1 206 335 462 597 730
1 205 330 460 605 738
1 205 335 465 600 737
1 212 335 468 603 730
CT6
25%
1 190 355 455 585 680
1 208 350 445 590 685
1 204 345 440 595 678
1 208 347 455 578 680
1 210 342 450 595 682
1 204 340 448 582 685
1 206 335 452 590 690
1 210 348 455 585 695
1 205 350 455 587 685
1 205 340 445 595 690
29
Bảng IV.6. Kết quả nuôi thử nghiệm
Mẫu thí
nghiệm
Nghiệm
thức
Mẫu Trọng lượng
cá ban đầu (g)
Trọng lượng
cá cuối (g)
DWG
(g/ngày)
1 CT 1 (0%) 1 212 630 5,23
2 1 208 640 5,40
3 1 204 635 5,39
4 1 208 625 5,21
5 1 208 628 5,25
6 1 204 625 5,26
7 1 206 628 5,28
8 1 205 632 5,34
9 1 205 630 5,31
10 1 200 628 5,35
GTTB 206 630,1 5,30
Std 3,23 4,61 0,07
1 CT 2 (5%) 1 205 656 5,64
2 1 208 650 5,53
3 1 204 648 5,55
4 1 212 645 5,41
5 1 208 658 5,63
6 1 204 650 5,58
7 1 206 652 5,58
8 1 205 655 5,63
9 1 205 657 5,65
10 1 210 652 5,53
GTTB 206,7 652,3 5,57
Std 2,71 4,19 0,07
1 CT 3 (10%) 1 208 685 5,96
2 1 210 670 5,75
3 1 212 679 5,84
4 1 208 678 5,88
5 1 205 665 5,75
6 1 204 679 5,94
7 1 206 672 5,83
8 1 205 677 5,90
9 1 208 665 5,71
10 1 210 680 5,88
GTTB 207,6 675 5,84
Std 2,59 6,7 0,08
1 CT 4 (15%) 1 210 765 6,94
30
2 1 208 765 6,96
3 1 204 768 7,05
4 1 208 760 6,90
5 1 208 772 7,05
6 1 204 770 7,08
7 1 190 765 7,19
8 1 205 760 6,94
9 1 205 765 7,00
10 1 205 760 6,94
GTTB 204,7 765 7,00
Std 5,56 4,19 0,09
1 CT 5 (20%) 1 212 740 6,60
2 1 208 738 6,63
3 1 190 735 6,81
4 1 208 730 6,53
5 1 208 738 6,63
6 1 204 735 6,64
7 1 206 730 6,55
8 1 205 738 6,66
9 1 205 737 6,65
10 1 212 730 6,48
GTTB 205,8 735,1 6,62
Std 6,2 3,81 0,09
1 CT 6 (25%) 1 190 680 6,13
2 1 208 685 5,96
3 1 204 678 5,93
4 1 208 680 5,90
5 1 210 682 5,90
6 1 204 685 6,01
7 1 206 690 6,05
8 1 210 695 6,06
9 1 205 685 6,00
10 1 205 690 6,06
GTTB 205 685 6,00
Std 5,73 5,35 0,08
31
Bảng IV.7: Tỷ lệ sống của cá rô phi nuôi thử nghiệm bằng các loại
thức ăn khác nhau
Mẫu thí
nghiệm
Nghiệm
thức
Số lượng cá
ban đầu (con)
số lượng cá cuối
cùng (con)
Tỷ lệ sống
(%)
1 CT 1 (0%) 24 18 75
2 24 17 70,83
3 24 20 83,33
GTTB 24 76,39
Std 6,36
1 CT 2 (5%) 24 19 79,17
2 24 20 83,33
3 24 19 79,17
GTTB 24 80,56
Std 2,41
1 CT 3 (10%) 24 20 83,33
2 24 19 79,17
3 24 20 83,33
GTTB 24 81,94
Std 2,41
1 CT 4 (15%) 24 20 83,33
2 24 21 87,5
3 24 22 91,67
GTTB 24 87,5
Std 4,17
1 CT 5 (20%) 24 22 91,67
2 24 22 91,67
3 24 20 83,33
GTTB 24 21,33 88,89
Std 4,81
1 CT 6 (25%) 24 22 91,67
2 24 21 87,5
3 24 19 79,17
GTTB 24 86,11
Std 6,37
Bảng IV.8 : Hệ số thức ăn nuôi thử nghiệm
32
Nghiệm thức Hệ số thức ăn Năng xuất thu
hoạch (g)
Khối lượng
ban đầu (g)
Khối lượng
tăng trọng
(g)
CT1 (0%) 2,67 11341,8 4800 6541,8
Ct 2 (5%) 2,38 12393,7 5040 7353,7
CT 3(10%) 1,92 14175 5040 9135
CT 4 (15%) 1,57 16065 4920 11145
CT 5 (20%) 1,69 15437,1 5088 10349,1
CT 6 (25%) 1,84 14385 4920 9465
Bảng IV.9: Bảng mô tả thống kê so sánh DWG và khối lượng của cá sau 140 ngày
nuôi
Descriptives
N Mean Std. Deviation Std. Error
95% Confidence Interval for Mean
Minimum Maximum
Lower Bound
Upper Bound
W 80 CT 1 (0%) 10 630.10 4.606 1.456 626.81 633.39 625 640
CT2 (5%) 10 652.30 4.191 1.325 649.30 655.30 645 658
CT3 (10%) 10 675.00 6.700 2.119 670.21 679.79 665 685
CT4 (15%) 10 765.00 4.190 1.325 762.00 768.00 760 772
CT5 (20%) 10 735.10 3.814 1.206 732.37 737.83 730 740
CT6 (25%) 10 685.00 5.354 1.693 681.17 688.83 678 695
Total 60 690.42 47.026 6.071 678.27 702.56 625 772
DWG CT 1 (0%) 10 5.3020 .06647 .02102 5.2545 5.3495 5.21 5.40
CT2 (5%) 10 5.5730 .07288 .02305 5.5209 5.6251 5.41 5.65
CT3 (10%) 10 5.8440 .08449 .02672 5.7836 5.9044 5.71 5.96
CT4 (15%) 10 7.0050 .08797 .02782 6.9421 7.0679 6.90 7.19
CT5 (20%) 10 6.6180 .08954 .02832 6.5539 6.6821 6.48 6.81
CT6 (25%) 10 6.0000 .07688 .02431 5.9450 6.0550 5.90 6.13
Total 60 6.0570 .59674 .07704 5.9028 6.2112 5.21 7.19
33
ANOVA
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
KHOILUONGCC Between Groups 129172.683 5 25834.537 1.073E3 .000
Within Groups 1299.900 54 24.072
Total 130472.583 59
DWG Between Groups 20.663 5 4.133 643.455 .000
Within Groups .347 54 .006
Total 21.010 59
34
Multiple Comparisons
Dependent Variable
(I) CONGTHUC
(J) CONGTHUC
Mean Difference
(I-J) Std. Error Sig.
95% Confidence Interval
Lower Bound
Upper Bound
W80
Tukey HSD CT 1 (0%) CT2 (5%) -22.200* 2.194 .000 -28.68 -15.72
CT3 (10%) -44.900* 2.194 .000 -51.38 -38.42
CT4 (15%) -134.900* 2.194 .000 -141.38 -128.42
CT5 (20%) -105.000* 2.194 .000 -111.48 -98.52
CT6 (25%) -54.900* 2.194 .000 -61.38 -48.42
CT2 (5%) CT 1 (0%) 22.200* 2.194 .000 15.72 28.68
CT3 (10%) -22.700* 2.194 .000 -29.18 -16.22
CT4 (15%) -112.700* 2.194 .000 -119.18 -106.22
CT5 (20%) -82.800* 2.194 .000 -89.28 -76.32
CT6 (25%) -32.700* 2.194 .000 -39.18 -26.22
CT3 (10%) CT 1 (0%) 44.900* 2.194 .000 38.42 51.38
CT2 (5%) 22.700* 2.194 .000 16.22 29.18
CT4 (15%) -90.000* 2.194 .000 -96.48 -83.52
CT5 (20%) -60.100* 2.194 .000 -66.58 -53.62
CT6 (25%) -10.000* 2.194 .000 -16.48 -3.52
CT4 (15%) CT 1 (0%) 134.900* 2.194 .000 128.42 141.38
CT2 (5%) 112.700* 2.194 .000 106.22 119.18
CT3 (10%) 90.000* 2.194 .000 83.52 96.48
CT5 (20%) 29.900* 2.194 .000 23.42 36.38
CT6 (25%) 80.000* 2.194 .000 73.52 86.48
CT5 (20%) CT 1 (0%) 105.000* 2.194 .000 98.52 111.48
CT2 (5%) 82.800* 2.194 .000 76.32 89.28
35
CT3 (10%) 60.100* 2.194 .000 53.62 66.58
CT4 (15%) -29.900* 2.194 .000 -36.38 -23.42
CT6 (25%) 50.100* 2.194 .000 43.62 56.58
CT6 (25%) CT 1 (0%) 54.900* 2.194 .000 48.42 61.38
CT2 (5%) 32.700* 2.194 .000 26.22 39.18
CT3 (10%) 10.000* 2.194 .000 3.52 16.48
CT4 (15%) -80.000* 2.194 .000 -86.48 -73.52
CT5 (20%) -50.100* 2.194 .000 -56.58 -43.62
DWG Tukey HSD CT 1 (0%) CT2 (5%) -.27100* .03584 .000 -.3769 -.1651
CT3 (10%) -.54200* .03584 .000 -.6479 -.4361
CT4 (15%) -1.70300* .03584 .000 -1.8089 -1.5971
CT5 (20%) -1.31600* .03584 .000 -1.4219 -1.2101
CT6 (25%) -.69800* .03584 .000 -.8039 -.5921
CT2 (5%) CT 1 (0%) .27100* .03584 .000 .1651 .3769
CT3 (10%) -.27100* .03584 .000 -.3769 -.1651
CT4 (15%) -1.43200* .03584 .000 -1.5379 -1.3261
CT5 (20%) -1.04500* .03584 .000 -1.1509 -.9391
CT6 (25%) -.42700* .03584 .000 -.5329 -.3211
CT3 (10%) CT 1 (0%) .54200* .03584 .000 .4361 .6479
CT2 (5%) .27100* .03584 .000 .1651 .3769
CT4 (15%) -1.16100* .03584 .000 -1.2669 -1.0551
CT5 (20%) -.77400* .03584 .000 -.8799 -.6681
CT6 (25%) -.15600* .03584 .001 -.2619 -.0501
CT4 (15%) CT 1 (0%) 1.70300* .03584 .000 1.5971 1.8089
CT2 (5%) 1.43200* .03584 .000 1.3261 1.5379
CT3 (10%) 1.16100* .03584 .000 1.0551 1.2669
CT5 (20%) .38700* .03584 .000 .2811 .4929
CT6 (25%) 1.00500* .03584 .000 .8991 1.1109
CT5 (20%) CT 1 (0%) 1.31600* .03584 .000 1.2101 1.4219
36
CT2 (5%) 1.04500* .03584 .000 .9391 1.1509
CT3 (10%) .77400* .03584 .000 .6681 .8799
CT4 (15%) -.38700* .03584 .000 -.4929 -.2811
CT6 (25%) .61800* .03584 .000 .5121 .7239
CT6 (25%) CT 1 (0%) .69800* .03584 .000 .5921 .8039
CT2 (5%) .42700* .03584 .000 .3211 .5329
CT3 (10%) .15600* .03584 .001 .0501 .2619
CT4 (15%) -1.00500* .03584 .000 -1.1109 -.8991
CT5 (20%) -.61800* .03584 .000 -.7239 -.5121
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
37
W 80
CONGTHUC N
Subset for alpha = 0.05
1 2 3 4 5 6
Tukey HSDa CT 1 (0%) 10 630.10
CT2 (5%) 10 652.30
CT3 (10%) 10 675.00
CT6 (25%) 10 685.00
CT5 (20%) 10 735.10
CT4 (15%) 10 765.00
Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
Duncana CT 1 (0%) 10 630.10
CT2 (5%) 10 652.30
CT3 (10%) 10 675.00
CT6 (25%) 10 685.00
CT5 (20%) 10 735.10
CT4 (15%) 10 765.00
Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 10.000.
38
DWG
CONGTHUC N
Subset for alpha = 0.05
1 2 3 4 5 6
Tukey HSDa CT 1 (0%) 10 5.3020
CT2 (5%) 10 5.5730
CT3 (10%) 10 5.8440
CT6 (25%) 10 6.0000
CT5 (20%) 10 6.6180
CT4 (15%) 10 7.0050
Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
Duncana CT 1 (0%) 10 5.3020
CT2 (5%) 10 5.5730
CT3 (10%) 10 5.8440
CT6 (25%) 10 6.0000
CT5 (20%) 10 6.6180
CT4 (15%) 10 7.0050
Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 10.000.