i

BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

------------

LÊ HƯƠNG THỦY

NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN BÃ RONG CÂU

(Gracilaria verrucosa) BẰNG ENZYM

CELLULASE TỪ VI KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG

TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN NUÔI CÁ RÔ

PHI ĐƠN TÍNH GIAI ĐOẠN THƯƠNG PHẨM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

KHÁNH HÒA, 2017

------------

ii

BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

------------

LÊ HƯƠNG THỦY

NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN BÃ RONG CÂU

(Gracilaria verrucosa) BẰNG ENZYM

CELLULASE TỪ VI KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG

TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN NUÔI CÁ RÔ PHI

ĐƠN TÍNH GIAI ĐOẠN THƯƠNG PHẨM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

Chuyên ngành : Công nghệ chế biến thủy sản

Mã số : 60.54.10.05

Người hướng dẫn khoa học: GS.TSKH. Nguyễn Trọng Cẩn

PGS.TS. Vũ Ngọc Bội

KHÁNH HÒA, 2017

iii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả

nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình

nào khác.

Nha Trang, Ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Lê Hương Thủy

iv

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Luận án này

Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu, Lãnh đạo Khoa Sau đại học và Ban Chủ

nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm sự kính trọng, niềm tự hào được học tập và nghiên

cứu tại Trường trong những năm qua.

Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho Thầy GS.TSKH. Nguyễn Trọng

Cẩn - nguyên Hiệu trưởng - Trường Đại học Nha Trang và PGS.TS. Vũ Ngọc Bội -

Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt

quá trình thực hiện Luận án.

Xin cám ơn Lãnh đạo Viện Nghiên cứu Hải sản và các cán bộ Phòng Nghiên cứu

Công nghệ Sau thu hoạch, Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia về Công nghệ gen

- Viện Công nghệ Sinh học, Xí nghiệp Giống thủy sản Hải Phòng, Viện Công nghệ Sinh

học và Thực phẩm - Trường Đại học Công nghiệp Tp Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ

và tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian thực hiện Luận án vừa qua.

Đặc biệt, xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ, động viên của gia đình và bạn bè

luôn luôn chia sẻ cùng tôi trong quá trình nghiên cứu.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, Ngày tháng năm 2017

Tác giả luận văn

Lê Hương Thủy

v

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................i

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................iv

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................... viii

DANH MỤC BẢNG ......................................................................................................ix

DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................xi

DANH MỤC SƠ ĐỒ ................................................................................................... xiii

DANH MỤC BIỂU ĐỒ ...............................................................................................xiv

TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN ........................................... xv

MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................................... 3

1.1. Nguyên liệu rong biển và tình hình sản xuất Agar ............................................... 3

1.1.1. Nguyên liệu rong biển ................................................................................... 3

1.1.2. Các quy trình sản xuất agar ........................................................................... 4

1.1.3. Thành phần cơ bản của bã thải agar .............................................................. 8

1.1.4. Các phương pháp xử lý bã thải agar .............................................................. 9

1.2. Tổng quan về Cellulase ..................................................................................... 11

1.3. Enzym Cellulase ................................................................................................. 13

1.3.1. Định nghĩa và phân loại ............................................................................... 13

1.3.2. Tính chất ...................................................................................................... 14

1.3.3. Cơ chế thủy phân cellulose .......................................................................... 15

1.3.4. Cơ chế tác dụng của cellulase...................................................................... 16

1.4. Vi sinh vật tổng hợp Cellulase ........................................................................... 18

1.4.1. Giới thiệu chung về các nhóm vi sinh vật tổng hợp cellulase ..................... 18

1.4.2. Một số chủng vi sinh vật được ứng dụng nhiều trong sản xuất cellulase ... 22

1.4.3. Ứng dụng của enzym cellulase vi sinh vật .................................................. 24

1.4.4. Môi trường nuôi cấy và nguồn nguyên liệu ................................................ 26

1.4. 5. Phương pháp thu nhận enzym cellulase ..................................................... 27

1.5. Sản lượng nuôi cá rô phi ..................................................................................... 30

1.6. Đặc điểm sinh học của cá rô phi ......................................................................... 32

vi

1.6.1. Phân loại ...................................................................................................... 32

1.6.2. Đặc điểm hình thái: ..................................................................................... 32

1.6.3. Đặc điểm về dinh dưỡng và sinh trưởng. .................................................... 33

1.6.4. Nhu cầu dinh dưỡng của cá rô phi ............................................................... 34

1.6.5. Nhu cầu dinh dưỡng và ảnh hưởng của thức ăn lên sinh trưởng của cá rô

phi. ......................................................................................................................... 38

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 42

2.1. Đối tượng ............................................................................................................ 42

2.1.1. Bã thải rong sau sản xuất agar ..................................................................... 42

2.1.2. Giống vi sinh vật sinh cellulase ................................................................... 42

2.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 43

2.2.1. Phương pháp phân tích ................................................................................ 43

2.2.2. Các phương pháp thu nhận và xác định hoạt tính cellulase ........................ 44

2.2.3 Phương pháp nuôi cấy và đánh giá khả năng sinh tổng hợp cellulase của vi

sinh vật ................................................................................................................... 47

2.2.4. Phương pháp xây dựng mô hinh thực nghiệm ............................................ 50

2.3. Hóa chất và thiết bị chủ yếu sử dụng trong luận án ................................................ 57

2.3.1. Hóa chất ....................................................................................................... 57

2.3.2. Thiết bị ......................................................................................................... 57

2.4. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................. 58

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..................................... 59

3.1. Khảo sát đánh giá khối lượng và thành phần hóa học cơ bản của bã thải rong câu

chỉ vàng sau sản xuất agar ......................................................................................... 59

3.2. Tuyển chọn chủng vi sinh vật và nghiên cứu một số tính chất cơ bản của các

chủng vi sinh vật tuyển chọn ..................................................................................... 61

3.2.1. Kết quả nghiên cứu tuyển chọn các chủng giống vi sinh vật ...................... 61

3.2.2. Nghiên cứu một số tính chất cơ bản của các chủng vi sinh vật tuyển chọn .... 65

3.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy 2 chủng vi khuẩn B.

Subtilis VTCC B-505 và B. Lichenformis (Li) và ứng dụng thủy phân bã rong câu

(G. Verrucosa) sau sản xuất Agar .............................................................................. 72

3.3.1. Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi sản xuất enzyme cellulase

từ 2 chủng B505 và Li ........................................................................................... 72

vii

3.3.2. Đề xuất quy trình nuôi cấy và thu nhận chế phẩm cellulase thô ................. 80

3.3.3. So sánh đánh giá hoạt tính cellulase của chủng Li và B505 với chế phẩm

cellulase từ các VSV khác ..................................................................................... 84

3.3.4. Nghiên cứu thủy phân bã thải rong sau sản xuất agar bằng enzyme cellulase

từ hai chủng vi khuẩn B 505 và Li ........................................................................ 88

3.4. Thử nghiệm sử dụng chế phẩm thủy phân bã thải rong trong thức ăn nuôi cá rô

phi .............................................................................................................................. 95

3.4.1. Xây dựng công thức thức ăn nuôi cá rô phi ................................................ 95

3.4.2. Đề xuất quy trình sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi ....................................... 97

3.4.3. Điều kiện môi trường nuôi thử nghiệm cá rô phi ...................................... 100

3.4.4. Thử nghiệm nuôi cá rô phi bằng thức ăn bổ sung chế phẩm thủy phân bã rong

............................................................................................................................. 104

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 108

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN

LUẬN ÁN ................................................................................................................... 110

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 111

viii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A530 : Đo OD ở bước sóng 530nm

B26 : Vi khuẩn Bacillus subtilis VTCC-B-26

B505 : Vi khuẩn Bacillus subtilis VTCC-B-505

CMC : Carbonyl – methyl cellulose

CMCase : Carbonyl – methyl cellulase

CPF

Thailand : Tập đoàn Nông sản Charoen Pokphand Thái Lan

ĐC : Đối chứng

DNSA : 2 –hydroxyl – 3,5 dinitrobenzoic acid

DO : Hàm lượng oxy hòa tan

DWG : Tốc độ tăng trưởng tuyệt đối

FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations (Tổ Chức

Liên Hiệp Thế Giới về Lương Thực và Nông Nghiệp)

FCR : Feed convertion ratio (Hệ số chuyển đổi thức ăn)

K-Na : TartratePotassium Sodium Tartrate Tetrahydrate

Li : Vi khuẩn Bacillus lichenformis

NT : Nghiệm Thức

Nxb : Nhà xuất bản

OD : Optical Density ( mật độ quang học)

TCA : Tricloacetic axit

TLS : Tỷ lệ sống

TM & SX : Thương mại và sản xuất

TNHH : Trách nhiệm hữu hạn

USD : Đô la Mỹ

VSV : Vi sinh vật

Wt : Khối lượng cá ứng với thời điểm t

ix

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Vi sinh vật phân hủy lignocellulose ................................................................ 19

Bảng 1.2. Các vi khuẩn có hoạt tính cellulase riêng cao nhất (µmol/phút/mg) .............. 20

Bảng 1.3. Phân biệt cá đực, cá cái .................................................................................. 32

Bảng 1.4. Giới hạn các thành phần trong thức ăn có giá thành ít nhất cho cá rô phi ở các

giai đoạn ................................................................................................................ 35

Bảng 1.5. Cung cấp bổ sung vitamin và khoáng chất trong thức ăn của cá rô phi .......... 36

Bảng 1.6. Tiêu chuẩn kỹ thuật của thức ăn nuôi cá rô phi và chế độ ăn trong nuôi lồng

và ao thâm canh .................................................................................................... 37

Bảng 1.7. Thành phần hoá học cá rô phi nuôi bằng thức ăn viên có hàm lượng protein

34,2 (%) ................................................................................................................ 40

Bảng 1.8. Nuôi cá rô phi bằng thức ăn viên có hàm lượng protein (%) khác nhau. ....... 40

Bảng 1.9: Nuôi cá rô phi với tỷ lệ thức ăn (%)/thân khác nhau ...................................... 41

Bảng 2.1. Xây dựng đường chuẩn glucose ...................................................................... 46

Bảng 3.1. Khối lượng bã thải rong sau sản xuất agar từ các vùng rong nguyên liệu khác

nhau ....................................................................................................................... 59

Bảng 3.2. Hàm lượng các chất cơ bản trong bã rong câu của một số cơ sở sản xuất Agar

............................................................................................................................... 60

Bảng 3.3. Hàm lượng kim loại nặng trong bã rong câu của một số cơ sở sản xuất Agar

............................................................................................................................... 60

Bảng 3.4. Hoạt tính cellulase ngoại bào của 17 chủng vi sinh vật nghiên cứu ............... 62

Bảng 3.5. Hoạt tính enzym cellulase của chủng Li, B505, B26 và CFd ......................... 63

Bảng 3.6. Hoạt tính cellulase ngoại bào của chủng Li, B505 trên đĩa thạch có cơ chất

bột giấy 0,2% ........................................................................................................ 69

Bảng 3.7. Khả năng thủy phân bã thải agar bằng cellulase từ 2 chủng Li và B505 ........ 70

Bảng 3.8. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng B505 nuôi trong

các môi trường khác nhau ..................................................................................... 73

Bảng 3.9. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng Li nuôi cấy ở các

môi trường khác nhau ........................................................................................... 73

Bảng 3.10. Khả năng sinh trưởng và vòng hoạt tính của chủng B505 và chủng Li tại các

nhiệt độ khác nhau ................................................................................................ 76

x

Bảng 3.11. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase của chủng B505 và chủng Li ở các pH

khác nhau .............................................................................................................. 77

Bảng 3.12. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng Li theo thời gian

nuôi cấy ................................................................................................................. 78

Bảng 3.13. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng B505 theo thời

gian nuôi cấy ......................................................................................................... 79

Bảng 3.14. So sánh hoạt tính cellulase từ 5 chủng VSV (A. niger, T. konigii, Li, B505 và

T3) trên đĩa thạch có CMC 0,2% .......................................................................... 85

Bảng 3.15. So sánh hoạt tính cellulase từ 5 chủng VSV (A. niger, T. konigii, Li, B505

và T3) trên đĩa thạch có cơ chất bột giấy 0,2% .................................................... 87

Bảng 3.16. Kết quả thí nghiệm của mô hình Box-Behnken ............................................ 89

Bảng 3.17. Kết quả xử lý số liệu trên phần mềm DX6 .................................................... 89

Bảng 3.18. Kết quả dự đoán tối ưu cho tỷ lệ Naa/Nts theo mô hình Box-Behnken .......... 91

Bảng 3.19. Kết quả kiểm chứng tối ưu theo tiên đoán và thực nghiệm .......................... 92

Bảng 3.20. Thành phần hóa học của các nguyên liệu phối trộn ...................................... 95

Bảng 3.21. Thành phần nguyên liệu của các công thức thức ăn phối trộn bã rong thủy

phân. ...................................................................................................................... 99

Bảng 3.22. Dao động các yếu tố môi trường trong quá trình thí nghiệm ..................... 101

Bảng 3.23. Ảnh hưởng của công thức thức ăn đến sinh trưởng của cá rô phi trong 80 ngày

nuôi ...................................................................................................................... 104

xi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc cellulose và mạng lưới liên kết hydrogen ...................................... 11

Hình 1.2. Sự sắp xếp các chuỗi cellulose trong thành tế bào thực vật ......................... 12

Hình 1.3. Cơ chế tác động của enzym cellulase ........................................................... 17

Hình 1.4. Cơ chế thủy phân cellulose ............................................................................ 17

Hình 1.5. Hình dạng nấm mốc A. niger ......................................................................... 23

Hình 1.6. Hình dạng nấm Trichoderma viride ............................................................. 23

Hình 2.1. Bã thải sau sản xuất agar ............................................................................... 42

Hình 2.2. Cá rô phi ........................................................................................................ 43

Hình 2.3. Bố trí các giai nuôi thử nghiệm cá rô phi ...................................................... 55

Hình 3.1. Hình ảnh về đường kính vòng thủy phân CMCcủa 4 chủng vi sinh vật lựa

chọn trên đĩa thạch chứa 1% CMC ....................................................................... 63

Hình 3.2. Điện di đồ chế phẩm cellulase thô thu nhận từ vi khuẩn B505 và Li trên gel

polyacrylamis 12,5 % theo hệ đệm Laemmi ........................................................ 68

Hình 3.3. So sánh vòng thủy phân của cellulase từ vi khuẩn Li, B505 trên đĩa thạch bổ

sung cơ chất bột giấy 0,2% ................................................................................... 69

Hình 3.4. Khả năng thủy phân bã thải agar của cellulase ngoại bào từ chủng Li và B505 ..... 71

Hình 3.5. Khả năng thủy phân bã thải agar của hỗn hợp cellulase ngoại bào từ 4 chủng

(B505, B26, Li, CFd) ............................................................................................ 71

Hình 3.6. Hình ảnh về vòng thủy phân của cellulase từ chủng B505 nuôi trong các môi

trường khác nhau .................................................................................................. 72

Hình 3.7. Hình ảnh về vòng thủy phân của cellulase từ chủng vi khuẩn Li nuôi trong

các môi trường khác nhau ..................................................................................... 74

Hình 3.8. Khả năng sinh trưởng và vòng hoạt tính của chủng B505 và chủng Li tại các

nhiệt độ khác nhau ................................................................................................ 75

Hình 3.9. Vòng hoạt tính cellulase của chủng B505 và chủng Li nuôi cấy ở các pH

khác nhau .............................................................................................................. 77

Hình 3.10. Đường kính vòng thủy phân của cellulase từ Li, B505 và T3 trên đĩa thạch

có cơ chất CMC 0,2% ........................................................................................... 84

Hình 3.11. Đường kính vòng thủy phân cellulase từ Tricoderma trên đĩa thạch có cơ

chất CMC 0,2 % .................................................................................................... 85

Hình 3.12. Hoạt tính cellulase Aspergillus trên đĩa thạch có cơ chất CMC 0,2 % ....... 85

xii

Hình 3.13. Hoạt tính cellulase của 2 chủng nấm Tricoderma và Aspergillus nuôi ở các

môi trường khác nhau trên đĩa thạch có chứa cơ chất bột giấy 0,2 %. ................. 86

Hình 3.14. Hình ảnh về đường kính vòng thủy phân cellulase từ Li, B505 và T3 trên

đĩa thạch có cơ chất bột giấy 0,2 % ...................................................................... 86

Hình 3.15. Đường đồng mức và bề mặt đáp ứng (3D) của hàm lượng đường tổng số

theo thời gian thủy phân và nồng độ enzyme ....................................................... 91

Hình 3.16. Đường đồng mức và bề mặt đáp ứng (3D) tiên đoán hàm lượng đường tổng

số theo thời gian thủy phân và nồng độ enzyme................................................... 92

xiii

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1. Quy trình công nghệ sản xuất agar theo quy mô bán cơ giới ............................ 6

Sơ đồ 1.2 Cơ chế chuyển hóa cellulose ......................................................................... 16

Sơ đồ 1.3. Thu nhận cellulase từ A. niger ..................................................................... 28

Sơ đồ 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ................................................................. 51

Sơ đồ 2.2. Sơ đồ thí nghiệm sử dụng chế phẩm bã rong thủy phân trong nuôi cá rô phi

............................................................................................................................... 53

Sơ đồ 3.3. Quy trình thủy phân bã rong bằng cellulase từ vi khuẩn ............................. 93

Sơ đồ 3.4. Quy trình sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi .................................................... 97

xiv

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 1.1. Tăng trưởng sản lượng cá rô phi, cá da trơn và cá hồi giai đoạn 1980 –

2010 ...................................................................................................................... 30

Biểu đồ 3.1. Hoạt tính enzyme cellulase của 17 chủng vi sinh vật đã thử nghiệm ....... 62

Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ enzym cellulase ngoại bào của bốn chủng

vi khuẩn Li, B26, B505, CFd ................................................................................ 65

Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ enzym cellulase ngoại bào của 4

chủng Li, B26, B505, CFd .................................................................................... 66

Biểu đồ 3.4. Hoạt tính cellulase ngoại bào của chủng Li theo thời gian nuôi cấy ........ 78

Biểu đồ 3.5. Sự thay đổi hoạt tính cellulase của chủng B505 theo thời gian nuôi cấy ......... 79

Biểu đồ 3.6. Biến động nhiệt độ nước ao thí nghiệm nuôi cá rô phi. .......................... 101

Biểu đồ 3.7. Biến động DO nước ao thí nghiệm nuôi cá rô phi .................................. 102

Biểu đồ 3.8. Biến động độ pH của nước ao thí nghiệm .............................................. 103

Biểu đồ 3.9. Tốc độ sinh trưởng (g/con) và DWG (g/ngày) của cá rô phi với thức ăn

phối trộn bã rong thủy phân khác nhau sau 80 ngày nuôi. ................................. 105

Biểu đồ 3.10. Hệ số chuyển đổi thức ăn của nuôi thử nghiệm các công thức thức ăn ..... 106

xv

TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Đề tài luận án: “Nghiên cứu thủy phân bã rong câu (Gracilaria verrucosa) bằng

enzyme cellulase từ vi khuẩn để ứng dụng trong sản xuất thức ăn

nuôi cá rô phi đơn tính giai đoạn thương phẩm”.

Ngành/Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến thủy sản

Mã số: 62540105

Nghiên cứu sinh: Lê Hương Thủy

Người hướng dẫn: 1. PGS. TSKH. Nguyễn Trọng Cẩn

2 PGS. TS. Vũ Ngọc Bội

Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang

Tóm tắt những đóng góp mới về lý luận và học thuật của luận án:

Bã thải rong từ công nghệ sản xuất agar thường giàu cellulose là hợp chất hữu

cơ rất khó bị phân hủy. Trên thế giới hiện nay, người ta đã tiến hành xử lý phế liệu rong

biển để làm thức ăn gia súc bằng một số phương pháp thủy phân trong môi trường kiềm

hoặc axit. Tuy nhiên việc phân hủy cellulose bằng phương pháp vật lý và hóa học thường

phức tạp, tốn kém và gây ô nhiễm môi trường. Trong khi đó, việc xử lý các chất thải

hữu cơ chứa cellulose bằng công nghệ vi sinh, đặc biệt sử dụng các enzyme cellulase

ngoại bào từ vi sinh vật sẽ có nhiều ưu điểm về cả mặt kỹ thuật, kinh tế và môi trường.

Thủy phân cellulose từ bã rong phế thải sẽ giúp động vật tiêu hóa và hấp thụ dễ dàng

các protein, glucide, các nguyên tố khoáng đa vi lượng có trong bã thải sau quá trình sản

xuất agar. Sự thành công của đề tài sẽ cơ sở khoa học cho việc tận dụng bã thải rong câu

trong sản xuất thức ăn nuôi động vật thủy sản.

Người hướng dẫn

(Ký và ghi rõ họ tên)

Nghiên cứu sinh

(Ký và ghi rõ họ tên)

Lê Hương Thủy

xvi

Key Findings

Thesis title: "Study on hydrolysis of seaweed wastes (Gracilaria verrucosa) by

cellulase enzyme from bacteria to apply in the production of feed for tilapia".

Mayor: Seafood processing technology

Major code: 62540105

PhD Student: Lê Hương Thủy

Supervisor:

1. Prof. PhD. Nguyen Trong Can

2 Assoc. Prof, PhD. Vu Ngoc Boi

Institution: (Nha Trang University)

Key Findings:

Seaweed waste from agar production technologies are often richly organic

cellulose that is very difficult to decompose. Todays, seaweed waste has processed to

produce animal feeds by several hydrolysis methods in alkali or acidification. However,

the processing of cellulose by physical and chemiscal methods are often complicate,

expensive and polluting the environment. while the treatment of organic waste

containing cellulose by microbial technology, especially the use of cellulase enzyme

from microbial extracellular would have advantages in technical, economic and

environmental aspects. Hydrolysis of cellulose from seaweed waste will help animals

digest and easily absorb protein, glucide, mineral elements in the waste after the

production of agar. The success of the research will be scientific basis for the utilization

of seaweed waste in feed production of aquatic animals.

Phd Student

Le Huong Thuy

1

MỞ ĐẦU

Agar là hợp chất hữu có có nguồn gốc từ rong biển và được sử dụng trong nhiều

lĩnh vực của đời sống như dùng làm môi trường nuôi cấy vi sinh, dùng trong chế biến

các sản phẩm thực phẩm,… Trên thế giới, sản lượng agar vào khoảng 7.000 - 10.000

tấn/năm [26]. Hàng năm Việt Nam sản xuất khoảng 500 tấn agar [30]. Quá trình chiết

rút agar từ rong câu thường thải ra môi trường một lượng lớn bã thải hữu cơ thải, ước

tính vào khoảng 6 - 8 tấn bã thải hữu cơ/1 tấn sản phẩm agar. Như vậy, ước tính hàng

năm lượng bã thải rong thải ra từ quá trình sản xuất agar ở nước ta vào khoảng 7.000 ÷

9.000 tấn [15]. Riêng thành phố Hải Phòng có khoảng 40 xưởng sản xuất agar từ rong

biển. Trong đó, xưởng sản xuất agar của Công ty Đồ hộp Hạ Long sản xuất 50 tấn

agar/năm và một số xưởng sản xuất agar khác tại Hải Phòng được tư nhân đầu tư sản

xuất với công suất trung bình 10 tấn/năm [30]. Trong bã thải rong có chứa protein,

carbohydrat, các khoáng chất có nguồn gốc từ biển như iod, phosphat, các nguyên tố vi

lượng cần thiết cho sự sinh trưởng phát triển của động vật nuôi. Chính vì thế, bã thải

rong nếu không được tận dụng một cách hợp lý sẽ dẫn tới lãng phí và gây ô nhiễm môi

trường nghiêm trọng. Vì vậy, việc nghiên cứu nhằm sử dụng một cách hợp lý nguồn bã

thải rong, góp phần hạn chế ô nhiễm môi trường và nâng cao giá trị cho nguồn tài nguyên

rong biển, tạo công ăn việc làm cho người dân ven biển, giúp xóa đói giảm nghèo là cần

thiết. Do vậy việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu thủy phân bã rong câu (Gracilaria

verrucosa) bằng enzyme cellulase từ vi khuẩn để ứng dụng trong sản xuất thức ăn nuôi

cá rô phi đơn tính giai đoạn thương phẩm” là hướng nghiên cứu cần thiết và có ý nghĩa

thực tiễn cao.

Mục đích của luận án

Sử dụng phế thải rong câu trong sản xuất Agar để tạo ra nguồn nguyên liệu bổ sung

vào thức ăn chăn nuôi, góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường.

Nội dung nghiên cứu của luận án

1) Đánh giá lượng bã thải rong và xác định thành phần cơ bản của bã thải rong

sau sản xuất agar.

2

2) Sàng lọc các chủng vi khuẩn sinh cellulase cao từ bộ sưu tập giống vi khuẩn

của Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội.

3) Thu nhận chế phẩm enzyme cellulase thô từ chủng vi khuẩn đã lựa chọn và ứng

dụng thủy phân bã rong câu (Gracilaria verrucosa) sau sản xuất agar.

4) Thử nghiệm sử dụng sản phẩm thủy phân bã rong bằng enzyme cellulase từ vi

khuẩn trong sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi đơn tính giai đoạn thương phẩm.

Ý nghĩa khoa học của luận án

Luận án lần đầu tiên ở Việt Nam sử dụng enzyme cellulase từ vi khuẩn trong xử

lý bã thải rong sau sản xuất agar và sử dụng dịch thủy phân bã rong làm thức ăn nuôi cá

rô phi. Luận án có ý nghĩa khoa học cao do kết quả nghiên cứu của Luận án đã khẳng

định hoàn toàn có thể ứng dụng enzyme cellulase để chuyển bã thải rong sau sản xuất

agar thành sản phẩm hữu ích dùng trong nuôi cá rô phi ở quy mô công nghiệp.

Ý nghĩa thực tiễn của luận án

Thành công của đề tài có ý nghĩa về thực tiễn cao bởi giúp giảm thiểu ô nhiễm môi

trường từ công nghệ sản xuất agar và giúp nâng cao giá trị của rau câu chỉ vàng, giảm

chi phí sản xuất trong nuôi cá rô phi và đem lại hướng mới trọng tận dụng bã thải rong

sau chế biến.

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Nguyên liệu rong biển và tình hình sản xuất Agar

1.1.1. Nguyên liệu rong biển

Rong biển là thực vật thủy sinh có đời sống gắn liền với nước. Chúng có thể là đơn

bào, đa bào sống thành quần thể. Chúng có kích thước hiển vi hoặc có khi dài hàng chục

mét. Hình dạng của chúng có thể là hình cầu, hình sợi, hình phiến lá hay hình thù rất

đặc biệt. Rong biển là loại thực vật biển quý giá được làm nguyên liệu chế biến thành

sản phẩm có giá trị trong công nghiệp, y dược và thực phẩm. Từ lâu rong biển đã được

coi là đối tượng nghiên cứu của nhiều nước trên thế giới [10], [69]. Các ngành rong biển

được chú ý và đã đưa vào sản xuất công nghiệp và đời sống gồm: ngành rong đỏ, ngành

rong nâu, rong lục. Sản lượng lớn rong nâu được dùng sản xuất acid alginic và alginat

và quan trọng hơn là ngành rong đỏ được dùng để sản xuất agar và carrageenan.

Một số loài rong đỏ có hàm lượng cao về agar, carrageenan, furcellaran. Theo tài

liệu FAO, nhóm rong cho agar thuộc ngành rong Đỏ bao gồm các loại như: Gelidium,

Gracilaria và Acanthopeltis. Rong biển phân bố ở các vùng nước mặn, nước lợ, cửa

sông, vùng triền sâu, vùng biển cạn... Ở nước ta có một số vùng chuyên canh trồng rong

câu chỉ vàng, thuộc ngành rong Đỏ, như: Phá Tam Giang (Lăng Cô - Thừa Thiên Huế);

Đầm Thị Nại (Bình Định); Đầm Ô Loan (Phú Yên) [11], [26].

Rong biển nước ta có sản lượng lớn là rong mơ Sargasum có thành phần acid

alginic với chất dinh dưỡng cao chưa được khai thác và sử dụng, rong sụn cũng đang

được trồng và chế biến thành carrageenan. Đặc biệt là rong câu Gracilaria là loài có giá

trị kinh tế cao. Theo báo cáo điều tra khảo sát của chuyên gia tư vấn thuộc chương trình

hỗ trợ phát triển nuôi trồng thuỷ sản nước lợ SUMA, sản lượng thu hoạch rong câu

gracilaria ở nước ta mỗi năm khoảng 5000 tấn khô, còn theo con số ước tính của tổ chức

FAO thì sản lượng này là khoảng 7000 tấn. Rong câu phân bố chủ yếu ở các địa phương

như Hải Phòng, Nam Hà, Thái Bình,Thanh Hoá và Thừa Thiên Huế [26], [30], [99].

Sản lượng agar trung bình hàng năm của toàn thế giới là 7.000 – 10.000 tấn/năm.

Nam Triều Tiên cung cấp nguyên liệu sản xuất agar chiếm 40% tổng sản lượng toàn thế

giới. Sản lượng agar sản xuất tại các nước như sau: châu Á: 50% (chủ yếu là Nhật Bản

4

và Hàn Quốc); châu Âu: 30% (Pháp, Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha); châu Mỹ: 15% (Mỹ,

Achentina, Brazil, Chilê); châu Phi: 5% (Marốc) [11], [99].

Công nghệ sản xuất agar ở Việt Nam bắt đầu hình thành năm 1960, nhưng lúc đó

tốc độ phát triển chậm do hạn chế bởi kiến thức, công nghệ thiết bị và thị trường. Năm

1983 dưới sự giúp đỡ của cộng hoà dân chủ Đức, một xưởng pilot agar công suất 50

tấn/năm đựợc lắp ráp tại Nhà máy cá hộp Hạ Long nhưng khi vận hành, quy trình công

nghệ gặp nhiều khó khăn và công suất chỉ đạt 20 tấn/năm. Sau này công ty đồ hộp Hạ

Long đã thay đổi quy trình sản xuất và sử dụng từng phần thiết bị để sản xuất theo hướng

thủ công đạt công suất khoảng 50 tấn/năm. Từ 1986 đến 1990, Viện Nghiên cứu Hải sản

kết hợp với Viện Nghiên cứu nghề cá và hải dương học Thái Bình Dương Liên Xô

(TINRO) tiến hành nghiên cứu kỹ thuật trồng rong câu năng suất cao và cải tiến công

nghệ sản xuất agar cùng như áp dụng phương pháp ép tách nước gel agar bằng công

nghệ ép 2 bước: ép sơ bộ bằng trọng vật và ép lần cuối bằng máy ép vít. Đây là giai đoạn

phát triển mạnh của nghề sản xuất agar ở Việt Nam do nhu cầu đầu ra của nguyên liệu

và sản phẩm đều rất lớn; vùng Viễn đông Liên Xô nhập một lượng lớn rong câu khô từ

Hải Phòng với giá 600 USD/tấn, và khoảng 100 tấn agar bột đựợc tiêu thụ tại các tỉnh

phía Nam nước ta [11], [15], [26].

Trong giai đoạn từ 1985 – 1995 nghề sản xuất agar đã có bước phát triển rất lớn.

Hải Phòng là nơi tập trung các xưởng sản xuất agar, tính chung các quy mô khác nhau

có khoảng 40 xưởng với tổng sản lượng agar ước tính sản xuất đạt 500 tấn/năm với

tổng doanh thu khoảng 70 tỷ đồng và giải quyết công ăn việc làm cho hàng nghìn lao

động. Riêng xưởng agar của Công ty Đồ hộp Hạ Long có thể sản xuất thường xuyên với

công suất 50 tấn/năm, một số xưởng sản xuất agar được tư nhân đầu tư sản xuất với

công suất trung bình 10 tấn/năm [30].

1.1.2. Các quy trình sản xuất agar

Qua khảo sát tình hình sản xuất của một số cơ sở chế biến agar nhận thấy quy mô

công nghệ sản xuất agar rất đa dạng từ quy mô thủ công hộ gia đình có công suất từ 10

– 30kg/ngày đến quy mô bán thủ công có công suất là 100 – 300 kg/ngày [26], [30],

[73].

Quy trình sản xuất agar theo quy mô hộ gia đình: đây là quy mô sản xuất nhỏ,

vốn đầu tư nhỏ, thiết bị ít, lao động thủ công, công xuất từ 10 – 30 kg/ngày, Sản phẩm

5

agar chủ yếu là dạng sợi bán cho cơ sở thu mua trong miền Nam, và bán lẻ cho các cơ

sở sản xuất bánh kẹo. Chất lượng sản phẩm không cao, giá rẻ chủ yếu là tiêu thụ nội

địa [26], [30].

Quy trình công nghệ sản xuất agar theo quy mô thủ công: quy mô sản xuất này

phổ biến ở các cơ sở ở các tỉnh miền Trung như Huế, Nha Trang. Công suất chỉ khoảng

5 – 10 kg SP/ngày. Quy mô nhỏ làm theo mùa vụ chủ yếu là bán lẻ cho các cơ sản sản

xuất mứt, bánh kẹo, đông sương ở tỉnh. [26], [30].

Quy trình công nghệ sản xuất agar theo quy mô bán cơ giới: Đây là quy mô sản

xuất bán cơ giới, đầu tư nhiều thiết bị máy móc, công xuất 100 – 250 kg SP/ngày, tập

trung ỏ Hải Phòng như Công ty cổ phần đồ hộp Hạ Long, Công ty TNHH Hải Long,

Công ty cổ phần thương mại Duy Mai, Công ty TNHH Hải Đông, Công ty TNHH

TM&SX Hoàng Yến,……Chất lượng sản phẩm agar theo quy mô sản xuất này sức đông

cao, màu sáng trắng, chất lượng ổn định tiêu thụ trong nước và xuất khẩu sang thị trường

Hàn Quốc, Italia, Trung Quốc... giá thành sản phẩm khoảng 10 -12 USD/1kg SP. Nguồn

rong câu để sản xuất agar là do các cơ sở thu mua từ các vùng ven biển Việt Nam và

rong nhập khẩu từ Trung Quốc do đó tỷ lệ phế thải bã rong phụ thuộc rất nhiều vào lọai

rong và chất lượng rong. Rong câu chỉ vàng ở vùng Đình Vũ, Cát Hải - Hải Phòng và

rong ở Phá Tam Giang, Lăng Cô - Huế thì có hàm lượng agar cao và tỷ lệ bã thải thấp

khoảng 6,75T – 7T/ 1 T sản phẩm, nhưng nhiều loại rong ở Thái Bình và Nam Định,…

thì chất lượng rong kém hàm lượng agar thấp, tỷ lệ phế thải khoảng 9 – 14 T/1 T sản

phẩm [11], [15], [26].

6

Sơ đồ 1.1. Quy trình công nghệ sản xuất agar theo quy mô bán cơ giới

Thuyết minh sơ đồ quy trình

+ Nguyên liệu: rong câu chỉ vàng Gracilaria verrucosa được thu mua ở dạng khô

ở các khu vực thuộc vùng ven biển Việt Nam.

+ Xử lý kiềm: rong câu khô được xử lý trong dung dịch NaOH, nồng độ 24 g/l

0,5 g/l. Tỷ lệ dung dịch/ rong là 20/1, nhiệt độ xử lý ở 80 – 95 oC, thời gian xử lý kể từ

khi dung dịch NaOH sôi là 50 phút. Trong quy trình xử lý cần có chế độ khuấy đảo và

lưu chuyển dịch NaOH trong nồi.

Bã

rong

Nấu chiết

Xử lý axit

Xử lý kiềm

Làm nguội cắt sợi

Ép tách nước

Sấy khô, Nghiền bột

Lọc trong có trợ lọc

Tẩy màu

Lọc trong lần 1

Bao gói Bảo quản

Nguyên liệu

7

+ Rửa trung tính: rửa sạch nước đến khi nước rửa trong và có pH = 7, sau đó để

ráo. Rửa bằng máy rửa khuấy đảo trục.

+ Tẩy màu: tẩy rong bằng dung dịch Giaven 5% tỷ lệ dung dịch/rong = 10/1

+ Xử lý axit: ngâm rong trong dung dịch axit citric có nồng độ 0,3 g/l vào khuấy

đảo đều, thời gian 15 phút. Lượng axit sử dụng phụ thuộc vào màu sắc cung như độ

cứng của cây rong. Sau khi ngâm, rửa kỹ rong đến khi nước trong.

+ Nấu chiết: đun sôi nước và thả rong câu đã xử lý ở trên vào, lượng nước dùng

được tính theo công thức [10]:

Trong đó:

N: Lượng nước nấu (lit)

A: Hàm lượng Agar trong nguyên liệu (%)

D: Sức đông của Agar (g/cm3)

R: Khối lượng rong khô cho một mẻ nấu (kg)

C: Hệ số phụ thuộc sức đông

Theo kinh nghiệm của các nhà sản xuất tỷ lệ nước cho vào nấu rong là nước/rong

sạch = 5/1.

+ Lọc trong lần 1: Lọc dịch nấu chiết bằng máy ép lọc khung bản để lọc dịch và

loại bỏ bã rong. Nhiệt độ dịch lọc khoảng 80 – 900C. Sau đó, rót dịch lọc được bơm vào

bể lọc 2

+ Lọc lần 2: Bể lọc 2 có bổ sung chất trợ lọc có tác dụng hấp thụ màu. Dịch lọc

trong được rót vào các khay tôn và để nguội tự nhiên.

+ Cắt sợi: cắt sợi thạch bằng máy cắt hoặc ống cắt thủ công theo kích thước 5x5x30

cm, sau đó cho sợi thạch vào các túi vải .

+ Ép tách nước: xếp các túi thạch dưới máy ép thủy lực, ép loại bỏ nước.

+ Sấy khô: Tấm agar sau khi loại bỏ nước có độ ẩm là khoảng 30%, tiếp tục sấy

khô đến 12 – 15%.

100.

..

C

RDAN

8

+ Nghiền bột agar: Máy nghiền có đường kính mắt lưới là 1 3 mm (tùy theo

đơn đặt hàng).

+ Đóng bao: bột agar đựng trong bao polyetylen có hai lớp với kích thước trong

của túi là 270 300 mm, khối lượng tịnh của mỗi túi là 500 15g. Sau đó, được đóng

trong bao bì carton có giấy lót chống ẩm. Trên bao bì phải có đầy đủ các thông tin như:

tên xí nghiệp sản xuất, agar, loại, ngày sản xuất, khối lượng tịnh,....

1.1.3. Thành phần cơ bản của bã thải agar

Thành phần và hàm lượng các chất trong bã thải agar phụ thuộc vào quy trình

công nghệ sản xuất agar, nhưng nhìn chung chứa 15 -20% là chất khô, độ ẩm khoảng

75- 80%. Thành phần chất khô có trong bã rong bao gồm khoảng 40-50% hợp chất hữu

cơ, chủ yếu là cellulose (xơ sợi), chất dinh dưỡng, protein 4 – 5 % và 50-60% hợp chất

vô cơ, trong đó, có khoảng 55% muối vô cơ không tan trong nước và nhiều nguyên tố

vi lượng [11].

Thành phần chính của chất thải là bã rong chứa cellulose, protein và khoáng.

Cellulose là polyme mạch thẳng của hàng ngàn cấu tử glucose đuợc nối với nhau bằng

liên kết -1,4 glucosid, tạo thành dạng sợi. Cấu trúc bậc 2,3 của cellulose rất phức tạp:

dạng lớp được gắn kết bằng các liên kết hydro, lực liên kết hydro được trùng hợp nhiều

lớn nhưng rất bền vững do đó cellulose không tan và khó phân giải. Hệ enzym phân giải

cellulose bao gồm: cellobiohydrolase có tác dụng cắt đứt liên kết hydrô làm biến dạng

cellulose tự nhiên, phân giải vùng kết tinh dạng cấu trúc vô định hình. Endoglucanase

có khả năng cắt đứt các liên kết 1-4 glucozit bên trong phân tử tạo thành những chuỗi

dài. Endoglucanase tiến hành phân giải các chuỗi dài trên thành các disacarit gọi là

cellobiose – gluconase tiến hành thuỷ phân cellobiose thành glucoza [11], [26], [99].

Theo các nhà sinh học, phần lớn lượng protein của rong tồn tại ở dạng hợp chất

với gluxit.Các phân tử glucoprotein rất bền vững dưới tác dụng phân giải của enzym

protease. Do đó để sử dụng protein của rong phục vụ mục đích sản xuất thức ăn chăn

nuôi cần phá huỷ các liên kết của các nhóm ngoại gluxit với phân tử protein trong phức

hợp glucoprotein thì enzym protease trong động vật mới có thể phân giải dễ dàng protein

trong rong biển [11].

9

Chất thải rắn sinh ra từ quá trình sản xuất Agar rất lớn, trung bình khoảng 9 ÷ 10

tấn phế thải/1TSP, thành phần chính của chất thải này là bã rong (xellulose). Nhưng do

nguồn nguyên liệu ở các vùng khác nhau, do điều kiện khí hậu ảnh hưởng đến chất lượng

rong câu chỉ vàng nên cũng ảnh hưởng đến thành phần bã rong.

Trước năm 1990 thì diện tích trồng rong câu rất lớn nhưng những năm gần đây do

tính kinh tế sản xuất trên 1 đơn vị diện tích nước nên nông dân đã chuyển hết sang nuôi

tôm cá, các đầm nuôi lớn ở Phú Yên, Bình Thuận, Bình Định,… đã chuyển sang trồng

các lọại rong kinh tế như rong sụn, rong nho, nên nguyên liệu rong câu chủ yếu là thu

gom từ môi trường tự nhiên, và một số được nông dân nuôi xen kẽ tôm cá để cải tạo

môi trường nên sản lượng không cao.

1.1.4. Các phương pháp xử lý bã thải agar

a, Trên thế giới

Trên thế giới hiện nay người ta đã tiến hành thử nghiệm thành công nhiều phương

pháp tận dụng phế liệu rong biển theo phương pháp thuỷ phân trong môi trường bazơ

hay axit, bao gồm [11]:

- Phương pháp Bioca: ngâm bã rong trong dung dịch Ca(OH)2 0,05 N hay trong

dung dịch axit mạnh như H2SO4 1N, thì tất cả protein của rong sẽ bị thuỷ phân thành

axit amin và peptit dễ tiêu hoá. Sau đó trung hoà sản phẩm bằng axit hay kiềm thì sẽ thu

được chế phẩm có giá trị chăn nuôi cao. Ví dụ sản phẩm chăn nuôi sản xuất theo phương

pháp Iodua, trong dung dịch axit chứa 50 – 60% axit amin, trong đó có 4,7% axit amin

không thay thế (Lyzin) và các peptit dễ tiêu hoá cũng như các chất vô cơ khác kể cả Iot.

Chế phẩm này đã được thử nghiệm sinh học.Có thể thay thế 20 – 30% lượng protein

trong khẩu phần ăn. Nếu trộn vào thức ăn nuôi cá thì cá chóng lớn và tăng sức chịu đựng

của cơ thể [11], [26].

- Phương pháp Jimca: dùng để sản xuất sản phẩm chăn nuôi bằng phương pháp

thuỷ phân bã rong trong môi trường axit. Xử lý sơ bộ bã rong trong dung dịch axit HCl

1,5% trong 2 giờ, ở nhiệt độ 200C. Thuỷ phân nguyên liệu bằng dung dịch axit HCl

trong 2 giờ ở nhiệt độ 200C. Sau đó trung hoà sản phẩm bằng CaO khô đến pH = 5,5 –

5,6, lọc sản phẩm loại bỏ tạp chất rồi cô đặc chế phẩm. Chế phẩm dùng cho chăn nuôi

10

là dịch lỏng màu nâu chứa khoảng 30% chất khô, chứa 7 loại axit amin không thay thế,

chế phẩm này được dùng như chất phụ gia với cám chăn nuôi [11], [26].

Ngoài ra các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học công nghiệp Thực phẩm

Odeca cho thấy hydratcacbon của rong biển dễ dàng phân giải dưới tác dụng của axit do

đó các chế phẩm thuỷ phân tạo thành có thể sử dụng như các chất nền trong công nghiệp

sản xuất men chăn nuôi. Men chăn nuôi chứa 46% protein thô và nhiều loại enzym tiêu

hoá có giá trị chăn nuôi cao [11].

b, Trong nước

Đặc thù của công nghệ sản xuất Agar nước ta là lượng phế thải hữu cơ tương đối

cao khoảng 6 tấn phế thải/1 tấn sản phẩm. Qua các tài liệu và khảo sát hiện trạng xử lý

các chất thải tại các cơ sở sản xuất agar cho thấy, việc xử lý bã thải agar ít được quan

tâm. Đặc biệt là bã rong có chứa một lượng nước cao, chất hữu cơ dễ phân hủy, gây mùi

chua thối độc hại cho con người. Các bã thải này đa số là được xử lý bằng cách đào hố

chôn vùi hoặc ủ làm phân bón cho cây trồng gây ra mùi hôi thối, ô nhiễm môi trường

khu vực sản xuất và dân cư. Trong thực tế thường có 4 biện pháp xử lý [15], [26] sau:

+ Biện pháp chôn lấp: đây là biện pháp mang tính cổ điển, thủ công, đơn giản

nhưng đòi hỏi cần nhiều diện tích đất, tốn nhiều sức lao động, thời gian xử lý lâu, sinh

mùi hôi thối và khí độc, vì vậy, gây ô nhiễm môi trường không khí, môi trường đất và

nguồn nước ngầm.

+ Biện pháp đốt: bã rong rải ra phơi mưa nắng nhiều ngày rồi đem đốt, phương

pháp này gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng, gây hiệu ứng nhà kính và gây ra một

số căn bệnh về đường hô hấp.

+ Đổ ra sông hồ: bã rong tập trung lại vài ngày và thuê xe chở đổ đi, vì vậy, làm

tăng chi phí vận chuyển, gây ô nhiễm môi trường nếu vận chuyển không đúng cách, tăng

chi phí xử lý phế thải của thành phố.

+ Biện pháp sinh học: trộn với một số chất khác, ủ lại làm phân bón cho cây trồng.

Đây là biện pháp tối ưu nhất hiện nay, vừa tránh gây ô nhiễm môi trường vừa tận dụng

làm phân bón [13], [14].

11

1.2. Tổng quan về Cellulase

Cellulose là hợp chất hữu cơ chiếm tỷ lệ cao nhất trong tự nhiên, là thành phần cơ

bản cấu tạo nên thành tế bào thực vật. Năm 1838, Anselin Payen là người đầu tiên tìm

ra cellulose trong sợi bông (chiếm 98%), sau đó những nghiên cứu khác cũng cho thấy

cellulose có hàm lượng rất cao trong thực vật như ở sợi lanh (80%), gỗ (40-50%) và

50% còn lại là phức hợp polysaccharid [6], [12], [14], [42], [144].

Hình 1.1. Cấu trúc cellulose và mạng lưới liên kết hydrogen

Cellulose là một polymer mạch thẳng không cuộn xoắn, được tạo nên từ các đơn

vị là D-glucose thông qua liên kết β-1,4-glucosid. Mức độ polymer hóa được đánh giá

dựa vào số phân tử glucose trong chuỗi. Đối với cellulose tự nhiên, con số này khoảng

10.000-14.000 và trọng lượng phân tử của cả chuỗi là 1,5 x 106 Da, dài 5 mm [11], [69].

Các phân tử glucose trong chuỗi polymer có dạng ghế bành, phân tử này quay 180o so

với phân tử kia. Các nhóm β-OH glycoside đều nằm trên mặt phẳng ngang của các phân

tử glucose [99].

Liên kết β-1,4 glucoside giữa các phân tử đường trong chuỗi cellulose đóng một

vai trò quan trọng trong việc tạo nên những đặc tính riêng của cellulose và cả vi sợi.

Nhờ liên kết này mà chuỗi cellulose trở nên mở rộng, ít linh động hơn so với cấu trúc

amylose của tinh bột, điều này cần cho các chuỗi cellulose để chúng có thể kết hợp với

nhau và tạo thành cấu trúc dạng sợi. Mặt khác sự tương tác qua lại giữa các gốc đường

của hai chuỗi cellulose nằm cạnh nhau cho phép tạo nên liên kết hydrogen giữa các

12

chuỗi. Thực tế, các nhóm -OH ở các vị trí C2, C3, C6 và nhóm O-hemiacetal trong phân

tử glucose đều có thể tạo liên kết hydro với các gốc đường bên cạnh trong cùng chuỗi

cellulose hoặc chuỗi cellulose khác. Chính mạng lưới liên kết hydro mở rộng và liên kết

β-1,4 glucoside đã làm cho cấu trúc cellulose trở nên bền vững, chặt chẽ có thể tồn tại

trong các dung dịch kiềm và axit đậm đặc [67].

Bằng phương pháp phân tích sử dụng tia rơnghen, người ta đã tìm ra cấu trúc của

cellulose trong tế bào thực vật có dạng sợi. Đơn vị nhỏ nhất của cellulose có đường kính

vào khoảng 3 nm. Các sợi sơ cấp hợp lại thành vi sợi hay còn gọi là mixen. Mỗi vi sợi

thường có khoảng 60 phân tử cellulose, có đường kính từ 10 - 40 nm, dài 100-40.000

nm [11], [20], [74], [89], [143].

Hình 1.2. Sự sắp xếp các chuỗi cellulose trong thành tế bào thực vật

Cellulose có cấu trúc không đồng nhất gồm hai vùng:

- Vùng kết tinh có trật tự cao.

- Vùng vô định hình có cấu trúc không chặt chẽ, các mạch tập hợp với nhau nhờ

lực Van der Waals, dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài. Khi gặp nước, chúng có thể

hấp thu nước và trương phồng lên, nhờ vậy enzym cellulase rất dễ tác động. Trong khi

đó ở vùng kết tinh, các mạch cellulose liên kết với nhau theo một trật tự đều đặn nhờ

liên kết hydro nối nhóm –OH thứ nhất của mạch này với nhóm –OH ở C3 của mạch khác

nên đã ngăn cản được sự trương này. Nhờ đó mà enzym cũng như nhiều phân tử khác

khó có thể xâm nhập vào được bên trong phân tử cellulose để phân hủy [2], [32], [33].

13

Cellulose là một hợp chất có cấu trúc và các đặc tính lý hóa vô cùng phức tạp chỉ

bị phân hủy khi đun nóng với kiềm hoặc axit. Tuy nhiên nó có thể bị thủy phân dưới tác

dụng của cellulase của các vi sinh vật ở điều kiện bình thường [32].

1.3. Enzym Cellulase

1.3.1. Định nghĩa và phân loại

* Định nghĩa

Cellulase là hệ enzym xúc tác cho quá trình chuyển hóa cellulose thành sản phẩm

hòa tan. Phức hệ enzym cellulase là enzym khá phức tạp. Một mặt chúng như enzym

cảm ứng (mà ở đây cellulose lại là chất cảm ứng không chặt chẽ). Một mặt chúng lại

chịu tác động bởi cơ chế điều khiển bởi sản phẩm cuối và chịu sự kiểm soát bởi cơ chế

dị hóa [12], [28], [89].

Cellulose là một loại phân tử polyme với các tiểu phần là D – glucose. Các gốc D

– glucose được nối với nhau qua liên kết 1,4- ß-D-glycosid. Hệ thống enzym thủy phân

cellulose bao gồm ít nhất 3 enzym khác nhau: endoglucanase (1,4-ß-D-glucan-4-

glucanohydrolase, EC.3.2.1.4), exoglucanase (1,4-ß-D glucan-cellobiohydrolase,

EC.3.2.1.91) và ß-glucosidase (ß-D-glucosid glucohydrolase, EC.3.2.1.21). Các enzym

này có tính đặc hiệu khác nhau và hoạt động hỗ trợ nhau. Đầu tiên, endoglucanase phá

vỡ liên kết 1,4-ß-D-glucoside trong phân tử cellulose, sau đó exoglucanase tiếp tục thủy

phân cellulose thành các phân tử cellobiose và sau cùng ß-glucosidase phân cắt

cellobiose thành glucose [74].

* Phân loại [12], [133]

Theo phân loại của Hội sinh học phân tử và sinh hóa quốc tế IUBMB, hệ thống

thủy phân cellulose gồm có enzym: endoglucanase có ký hiệu EC 3.2.1.4, exoglucanase

ký hiệu EC 3.2.1.91 và ß-glucansidase có ký hiệu EC 3.2.1.21

Endoglucanase EC 3.2.1.4, enzym CMCase hay Cx

Tên thường gọi: cellulase

Tên hệ thống: 1,4-(1,3:1,4)-ß-D-glucan-4-glucannohydrolase

Đôi khi người ta cũng có thể gọi enzym này bằng tên khác: endo-1,4-ß-D-

glucanase; ß-1,4-glucanase; cellulase A; endoglucanase; alkali cellulase; cellulase A3;

celludetrinase…

14

Enzym này thường thủy phân các liên kết 1,4-ß-D- glycoside trong cellulose và

các ß-D-glucan của ngũ cốc.

Exoglucanase –EC 3.2.1.91,Tên thường gọi: cellulose 1,4-ß-cellobiosidase

Tên hệ thống: 1,4,ß-D-glucan cellobiohydrolase

Các tên khác: exo-cellobiohydrolase; exoglucanase; CBHI; cellulase C1; exo-ß-

1,4-glucan cellobiohydrolase…

Enzym này có tác dụng thủy phân các liên kết 1,4-ß-D-glycosid, giải phóng

cellobiose từ đầu không khử.

ß -glucosidase-EC 3.2.1.21

Tên thường gọi: ß-glucosidase

Tên hệ thống: ß-D-glucosid glucohydrolase

Các tên khác: cellobiase; ß-glucosid glucohydrolase; ß-1,6-glucosidase;

salicilinase; arbutinase…

Enzym này thủy phân các gốc ß-D-glucosid.Một số trường hợp cũng thủy phân ß-

D-galactosidase, ß-D-fucoside; ß-D-xyloside; a-L-arabinoside.

1.3.2. Tính chất

* Tính đặc hiệu

Tính đặc hiệu cùa enzym thể hiện ở chỗ mỗi enzym chỉ tác dụng lên một cơ chất

nhất định. Cellulase thủy phân các liên kết 1,4-ß-D-glucosid trong phân tử cellulose và

các ß- D- glucan của ngũ cốc còn exoglucanase tác động lên các đầu chuỗi mới tạo

thành để sản xuất chủ yếu là cellobiose, ß-glucosidase thủy phân các gốc ß-D-glucose

tạo nên phân tử D-glucose … [2], [20], [21].

* Đặc tính vật lý và hóa học

Theo nghiên cứu, hầu hết các cellulose có pH tối ưu, tính hòa tan và thành phần

acid amin giống nhau. Độ bền và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau.

- Nhiệt độ tối ưu: 40 – 50oC

- pH tối ưu: thường ở giữa 4 – 5

15

* Các chất ức chế

Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm của nó như glucose, cellobiose.Thủy ngân ức chế

cellulase hoàn toàn, trong khi các ion khác như Mn, Ag, Zn chỉ ức chế nhẹ.

1.3.3. Cơ chế thủy phân cellulose

Từ những nghiên cứu riêng rẽ từng loại enzym đến nghiên cứu tác động hiệp đồng

của cả ba loại enzym cellulase, nhiều tác giả đều đưa ra kết luận chung là các loại enzym

cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là

glucose. Tuy nhiên, hiện nay trật tự phản ứng của các enzym vẫn chưa có sự thống nhất

và có nhiều tác giả đã trình bày cơ chế tác động của cellulase theo nhiều cách khác nhau.

Có thể tóm tắt cơ chế của một số tác giả như sau [12], [20], [51], [69].

* Cơ chế của Reese (1950)

Reese là người đầu tiên đề xuất cơ chế thủy phân cellulose hòa tan bởi enzym Cx

và C1. Theo Reese thì enzym C1 là yếu tố tiền thủy phân, nó chỉ có tác dụng làm trương

nở cellulose tự nhiên tạo thành cellulose hoạt động có mạch ngắn hơn. Sau đó, enzym

Cx sẽ tiếp tục phân cắt các chuỗi này tạo thành các đường tan và cuối cùng tạo thành

glucose [12], [65].

* Cơ chế của Erickson (1979)

Erickson và các cộng tác viên đã đưa ra cơ chế tác dụng hiệp đồng của ba enzym

là exoglucanase, endoglucanase và β -glucosidase. Đầu tiên, những vùng có mức độ kết

tinh thấp trong sợi cellulose bị các endoglucanase tấn công tạo các đầu tự do. Tiếp đó

enzym exoglucanase sẽ bắt đầu phân cắt từ các đầu tự do để tạo thành các cellobiose,

cellooligosaccharide và glucose. Enzym β-glucosidase sẽ thủy phân tiếp và cuối cùng

tạo thành đường glucose [13], [33].

* Cơ chế cải tiến của Reese (1980)

Năm 1980, dựa vào quan niệm của Erickson, Reese và các cộng sự của ông đã đưa

ra cơ chế phản ứng mới cho phức hệ enzym cellulase. Đầu tiên, C1 tác dụng lên cellulose

kết tinh phá vỡ các liên kết đồng hóa trị và tạo ra cellulose biến tính hay cellulose trương

nở. Sau đó endoglucanase tác dụng lên đầu chuỗi và giải phóng các cellobiose. Tiếp đó

dưới tác dụng của ba enzym: endoglucanase, cellobiohydrolase và β-1,4-glucosidase,

cellulose sẽ bị phân giải hoàn toàn và tạo thành glucose [65], [66], [68]; [106], [107].

16

Cellulose kết tinh

Enzym cellulase C1

Endoglucanase Cx

Cellulose vô định hình Oligomer

Exoglucanase Các oligomer chuỗi ngắn

Cellobiose

β-1,4 glucosidase

Glucose

Sơ đồ 1.2 Cơ chế chuyển hóa cellulose

1.3.4. Cơ chế tác dụng của cellulase

Trong thiên nhiên, thủy phân cellulose có sự tham gia của tất cả ba loại enzym

cellulase như endoglucanase (Cx), exoglucanase (C1) và β–glucosidase. Một trong ba

loại enzym trên không thể tự thủy phân đến cùng phân tử cellulose.

Các loài vi sinh vật chỉ có khả năng sinh tổng hợp một loại enzym trong hệ enzym

cellulase. Hoạt tính enzym này thường mạnh hơn các enzym còn lại. Chính vì thế, trong

điều kiện tự nhiên, một loài vi sinh vật không thể tham gia thủy phân triệt để cellulose

được.

Từ những nghiên cứu riêng lẽ từng loại enzym đến nghiên cứu tác động tổng hợp

của cả 3 loại enzym cellulase, nhiều tác giả đều đưa ra kết luận chung là các loại enzym

cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là

glucose. Có nhiều cách trình bày khác nhau, nhưng cách trình bày cơ chế tác động của

cellulase do Erikson đưa ra được nhiều người công nhận hơn cả [33], [108].

Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiên

thường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loài phát

triển rất mạnh, có loài lại phát triển yếu. Chính vì vậy, việc phân hủy cellulose trong tự

nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm [146].

17

Hình 1.3. Cơ chế tác động của enzym cellulase

Cơ chế cắt mạch:

Hình 1.4. Cơ chế thủy phân cellulose

18

Trong điều kiện phòng thí nghiệm hay điều kiện công nghiệp, việc phân hủy

cellulose bằng enzym, ngoài các yếu tố kỹ thuật như nhiệt độ, nồng độ cơ chất, lượng

enzym…, một yếu tố quan trọng cần phải được quan tâm, đó là tính đồng bộ của hệ

enzym cellulase từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau. Quá trình thủy phân cellulase chỉ

có thể được tiến hành đến sản phẩm cuối cùng khi sử dụng đồng bộ 3 loại enzym

cellulase trong hệ enzym cellulase. Mỗi loài vi sinh vật chỉ có khả năng sinh tổng hợp

ưu việt một loại enzym. Chính vì thế ta phải khai thác enzym cellulase từ nhiều nguồn

vi sinh vật [2].

1.4. Vi sinh vật tổng hợp Cellulase

1.4.1. Giới thiệu chung về các nhóm vi sinh vật tổng hợp cellulase

Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi vi sinh vật cả trong điều kiện

hiếu khí và kị khí. Các loài vi sinh vật thay phiên nhau phân hủy cellulose đến sản phẩm

cuối cùng là glucose. Tuy nhiên, trong thiên nhiên không có một vi sinh vật nào có khả

năng cùng một lúc sinh tổng hợp tất cả các loại enzym có trong phức hệ enzym cellulase.

Các loại này có khả năng sinh tổng hợp mạnh loại enzym này, loài khác lại tổng hợp

mạnh loại enzym khác. Chính vì thế, sự phân giải cellulose trong điều kiện tự nhiên

thường rất chậm và không triệt để [25].

Số lượng các loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzym cellulase có trong điều

kiện tự nhiên rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong một số

trường hợp, các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia qúa trình phân giải

này [2], [3], [20], [23], [24], [27], [69].

Nhiều nhóm nghiên cứu khác nhau đã tiến hành tìm kiếm và phân loại các chủng

vi sinh vật tham gia trong qúa trình phân hủy sinh học cellulose. Kết qủa có rất nhiều

chủng vi sinh vật được tìm thấy, trong đó các vi sinh vật dị dưỡng là chủ yếu [24], [25],

[29], [67], [91], [122].

19

Bảng 1.1. Vi sinh vật phân hủy lignocellulose

Xạ khuẩn Nấm Vi khuẩn

ctinomyces cellulose

A. Diastaticus

A. Roseus

A.thermofucus

A.roseus

Adiasstatic

Micromonospora vulgaris

Streptomyces rectus

S. thermofuscus

S. thermonitrificans

S. thermoviolaceus

S. thermovulgaris

S. violaceus-aurriu

S. diastaticus

T. vulgaris

Thermomonospora curvata

Aspergillus niger

A. oryzae

A. terreus

A. syndovii

A. flarus

Pen. notatum

Cephalosporium

Mucor pusilus

Neurospora

Trichoderman reseii

T. viridae

T. lignorum

T. hazianum

Aabasii diomycetes

Fusarium culmorum

Chrysoporium ligaorum

Pseudomonas fluorescens

B. amylogenas

B. flavefacicus

B. megaterium

B. mensenteroides

B. ruminicola

Clotridium sp

Acetobacter xylinum

Vi khuẩn dạ cỏ

Ruminococcus albus

Ruminobacter parum

Bacteroides

Amylophillus sp

C. butyricum

C. locheheadii

Cellulosemonas

20

Bảng 1.2. Các vi khuẩn có hoạt tính cellulase riêng cao nhất (µmol/phút/mg)

Enzyme Chủng Cơ chất Hoạt

tính

Nhiệt

độ tối

ưu

(oC)

pH

tối

ưu

mannan endo-1,4-

β-mannosidase

Bacillus

subtilis

Galactoglucomannan/

glucomannans/mannans

514

50-60 5-7

cellulase Clostridium

thermocellum

Avicel/carboxymethylce

llulose/

cellulosecellopentaose/

cellotetraose/cellotriose

428 75 7

1,3-β-glucan

glucohydrolase

Streptomyces

murinus Laminarin 6,7 50 6

1,3-1,4-β-D-

glucanglucanohyd

rolase

Bacillus

macerans β-D-glucan/ lichenan 5030 60- 65 6

1,3-β-D-glucan

glucanohydrolase Bacillus sp.

3-O-β-D-Glc-D-Glc-D-

Glc-D-Glc/ laminarin 369,6 60 9

Xạ khuẩn [31], [33],

Nhiều tác giả nghiên cứu về khả năng phân giải cellulase của xạ khuẩn

Streptomyces, Actinomyces… Các tác giả cũng nhấn mạnh rằng trong cùng một loài,

hoạt tính phân giải cellulose của các chủng khác nhau thì sẽ khác nhau [32].

- Loại 1: A. coelicolor, A. sulfureus, A. aureus, A. ellulosae, A. Chromogenes, A.

verne, A. glaucus ...

- Loại 2: A. hydroscoopicus, A. griseoflavus, A. albidus, A. viridans, A. griseolus

...

- Loại 3: A. thermoficus, A. xanthosromus.

- Loại 4: A. flavochromogenes, A. bovis, Act. sampsonii.

21

Vi khuẩn

Vi khuẩn chủ yếu sinh ra endoglucanase và ß- glucisudase, gần như không tạo ra

exoglucanase.

Người ta phân tích thấy rằng có đến 15 – 20 tỷ vi khuẩn/ 1cm3 chất có trong dạ cỏ

ở động vật ăn cỏ (1960 – Gorbacheva), các loài vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose

mạnh trong dạ cỏ:

- Ruminococcus albus (Berger, 1963; Curilov, 1971).

- Ruminococcus flavefaciens

- Ruminobacter parum – Butyviribrio fibrisolvens

- Cillobacterium – cellulosove

Vi khuẩn hiếu khí: Cellulomonas persica sp. (Nov). và Cellulomonas iranensis sp.

Nov (Elberson, 2000).

Vi khuẩn kị khí: Clostridium thermcellum, Clostridium cellulovorans (Murashima,

2002), Clostridium cellulotiticus (Parsiegla, 1998).

Niêm khuẩn (Myxobacteria) gồm các giống:

- Promyxobacterium

- Cytophaga

- Sporangium

- Sporocytophaga

Nấm sợi

Nhiều loại nấm sợi có khả năng sinh ra một lượng lớn cellulase thuộc giống

Alternaria, Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Cladospochung. Một số chủng nấm

mốc đã tổng hợp cellulase có hoạt tính khá cao:

- A. flavus; A. niger; A. oryzae, …

- Chaetomium globosum; C. elatum; C. fumicolum…

- Mucor pusillus

- Penicillium notatum; Pen. variabite; P. pusillum

22

- Trichoderma koningi; Trichoderma vidide…

- Sporotrichum pruinosum.

Trong điều kiện phòng thí nghiệm hay điều kiện công nghiệp, việc phân hủy

cellulose bằng enzym, ngoài các yếu tố kỹ thuật như nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất,

lượng enzym…, một yếu tố quan trọng cần phải được quan tâm, đó là tính đồng bộ của

hệ enzym cellulase từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau. Quá trình thủy phân cellulase

chỉ có thể được tiến hành đến sản phẩm cuối cùng khi sử dụng đồng bộ các loại enzym

cellulase trong hệ enzym cellulase. Mỗi loài vi sinh vật chỉ có khả năng sinh tổng hợp

ưu việt một loại enzym. Chính vì thế ta phải khai thác enzym cellulase từ nhiều nguồn

vi sinh vật.

1.4.2. Một số chủng vi sinh vật được ứng dụng nhiều trong sản xuất cellulase

Nhiều loài nấm sợi có khả năng sinh ra một lượng lớn cellulase thuộc giống

Trichoderma, Aspergillus, Penicillium,…Trong đó Trichoderma và Aspergillus đã được

nhiều nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất cellulase (Bothast & Saha, 1997). Phần lớn

các chế phẩm cellulase thương mại được sản xuất chủ yếu từ các chủng nấm. [63].

Aspergillus niger: [12]

Giống Aspergillus là nhóm nấm sợi bao gồm các loài khác nhau. Một vài loài có

khả năng gây bệnh như A. fumigatus, A. flavus, A. pasiticus. Tuy nhiên, hầu hết các

thành viên của nhóm này có ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, đặc biệt là các loài

nấm đen A. niger, A. turbingensis, A. oryzae. Nhờ khả năng sinh ra loại enzym như

amylase, cellulase, hay protease khi nuôi cấy trên một số môi trường đặc thù. Được ứng

dụng trong sản xuất các chế phẩm sinh học xử lý nước thải.

Chủng Aspergillus đều thuộc nhóm nấm bất toàn (Deuteromycetes hay Fungi

Imperfecti). Aspegillusniger cuống đính bào tử có đầu phình ra. Nhóm nấm bất toàn là

những nấm sinh sản vô tính bằng bào tử bụi mang bởi những giá bào tử có hình dạng

khác nhau xếp thành chuổi (đính bào tử) ở đầu ngọn có cuống bào tử [53].

Nấm Aspergillus còn gọi là mốc tương. Sợi nấm có vách ngăn, cuống mang bào

tử bụi phồng lên ở ngọn. Các chuổi bào tử bụi từ đầu phồng mọc tỏa khắp mọi hướng.

Bào tử bụi có thể màu vàng (Aspergillus flavus), màu đen (Aspergillus niger).

23

Aspergillus niger tiết ra nhiều endo-β-glucanase (Cx), β-glucosidae và rất thấp exo- β-

glucanase (C1) [76], [97].

Hình 1.5. Hình dạng nấm mốc A. niger

* Nhóm Trichoderma

Nhóm Trichoderma gồm Trichoderma koningii, Trichoderma reesei,

Trichoderma viride đã được nghiên cứu và ứng dụng sản xuất cellulase. Các chủng

Trichoderma tạo ra endo-β-glucanase (Cx), exo-glucanase (C1) nhưng rất ít β-

glucosidae [40], các cellulase từ Trichoderma thường hoạt động ở vùng pH 4-8 [71],

[77], [80], [112], [120], [142].

.

Hình 1.6. Hình dạng nấm Trichoderma viride

24

* Nhóm vi khuẩn [12], [13]

Rất nhiều chủng vi sinh vật chịu nhiệt có hoạt tính cellulase được tìm thấy trong

đống ủ compost. Trong nhóm vi khuẩn, các chủng thuộc chi Baccillus luôn chiếm ưu

thế (87%). Có nhiều chủng đã được phân lập và định tên đến loài bao gồm: Bacillus

amylogenas, B. flavefacicus, B. megaterium, B. mensenteroides, B. ruminicola, B.

pumilus EB3, [46], [47], [51], [61], [72], [79], [81], [82], [83], [87], [111], [116], [118],

[119], [123], [125], [130], [132], [134], [136], [138], [141]. Ngoài ra các chi

Acinetobacter, Pseudomonas, cellulomonas và Clostridium cũng được tìm thấy trong

đống ủ [28], [41], [44], [45], [90], [126], [129], [131]. Trong xử lý rác thải, các chủng

thuộc chi Baccillus vẫn là đối tượng được quan tâm nhiều nhất vì chúng là những chủng

ưa nhiệt và sinh bào tử nên có khả năng tồn tại và sinh trưởng tốt trong các đống ủ

compost có nhiệt độ cao [23], [88], [96], [123], [125].

Hiện nay các chủng vi khuẩn được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng do vi khuẩn

có nhiều ưu việt so với các nhóm nấm vì vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng nhanh và tạo

được nhiều sinh khối hơn. Tốc độ phát triển của nấm thấp hơn do đó giá thành khi sản

xuất chế phẩm sẽ cao hơn. Cellulase do vi khuẩn sinh ra thường là những chất xúc tác

có hiệu quả cao và không bị kìm hãm bởi các chất trung gian trong quá trình thuỷ phân

(kìm hãm ngược). Quan trọng nữa là các vi khuẩn dễ được tái tổ hợp theo công nghệ

gen [12], [13], [43].

1.4.3. Ứng dụng của enzym cellulase vi sinh vật

Các chủng vi sinh vật có hoạt tính cellulase rất có ý nghĩa và có nhiều ứng dụng

rộng rãi trong thực tiễn. Ngoài ứng dụng trong công nghệ xử lý rác thải, enzym cellulase

của các chủng vi sinh vật này còn được sản xuất ở quy mô công nghiệp và được sử dụng

trong nhiều lĩnh vực khác nhau của đời sống [2], [3], [16], [17], [22], [74], [75], [91].

Hiện nay, enzym cellulase được ứng dụng rất rộng rãi trong công nghiệp dệt, công

nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm gia súc. Đặc biệt các chế phẩm cellulase thô được

ứng dụng nhiều trong xử lý ô nhiễm môi trường.

Chế phẩm enzym cellulase tinh khiết được ứng dụng trong kỹ thuật di truyền.

Trong kỹ thuật tạo tế bào trần (protoplast), người ta thường dùng chế phẩm cellulase

tinh khiết để phá vỡ thành tế bào thực vật. Ứng dụng enzym cellulase phá vỡ tế bào thực

vật không làm tổn thương các cơ quan bên trong tế bào, đảm bảo sự nguyên vẹn của các

25

nhân tố di truyền. Do đó phương pháp này đã nhanh chóng thay thế các phương pháp

cơ học và hóa học.

Theo Gascoigne (1960) và Coughlan (1979) enzym cellulase của vi sinh vật được

ứng dụng trong các lĩnh vực sau :

● Chế biến thực phẩm [58], [67],:

- Cải thiện độ tiêu hóa thức ăn.

- Chiết rút các chất gây vị, dầu, dịch ép protein từ rau qủa.

- Cải thiện độ hòa tan của các nguyên liệu trong công nghệ lên men.

- Chế biến thạch từ rau câu.

- Sản xuất thực vật đơn bào.

- Sản xuất etanol, butanol, acetone, glycerol, và một số axít hữu cơ ( axit acetic,

axit citric, axit fumaric...).

● Dược phẩm [105], [127], [140]:

- Chế các chất tự tiêu hóa .

- Loại bỏ các sợi không mong muốn.

● Thức ăn gia súc [10], [16], [17], [27], [34]:

- Cải thiện khả năng tiêu hóa cỏ, rơm làm thức ăn gia súc.

- Sản xuất thức ăn giàu protein.

● Chống ô nhiễm [92], [100], [117]:

- Làm sạch các bãi rác thải thành phố, phân hủy rác thải thành phân bón.

- Xử lý phần trong các bể thải để làm khí đốt.

● Lên men [56], [62], [64], [84], , [114], [128]; [145]:

Cung cấp cơ chất lên men cho việc tổng hợp metan, ethanol, glycerol, axit citric,

axit amin, vitamin, protein đơn bào, các chất kháng sinh và các chất có hoạt tính sinh

học khác.

Một trong những vấn đề đáng quan tâm trong việc sản xuất cellulase thương mại

là giá thành của enzyme thu được. Giá của enzyme chiếm tới 50% chi phí cho quá trình

thuỷ phân cơ chất. Theo nghiên cứu của Walker và Wilson (1991) giá của 1mg cellulose

26

được sản xuất là 55 USD, trong khi đó giá của cellulase là 2665 USD/mg. Tuy nhiên giá

của enzyme đã giảm trong 20 năm qua, nhưng còn rất cao. Do đó đã có rất nhiều nỗ lực

để giảm giá thành của enzyme, có thể tổng kết trong 3 nhóm biện pháp sau: 1. Tuyển

chọn các loài có những enzyme mới; 2. Cải thiện các loài đang được sử dụng và cộng

nghệ sản xuất enzyme; 3. Tìm các nhân tố tối ưu cho quá trình sản xuất và vận hành như

cơ chất, điều kiện nuôi cấy, sử dụng lại enzyme... [48], [55], [57], [66],[70], [88], [104],

[115], 118], [121], [124], [137]

Ngoài ra để tăng hoạt tính của enzyme, người ta đã tìm ra biện pháp tạo ra hỗn

hợp enzyme bằng cách phối hợp một số enzyme riêng biệt (hoặc phân đoạn có hoạt tính)

từ các cơ thể sinh enzyme hoặc các cơ thể tái tổ hợp với nhau. Hỗn hợp này bao gồm

các enzyme tinh khiết từ các cơ thể khác nhau, hoặc là các enzyme thô với một enzyme

tinh khiết, hoặc gồm một enzyme tinh khiết với các vùng gắn cellulose từ một cơ thể

khác, hoặc với các co-factơ khác nhau ... Thêm enzyme cellobiohydrolase 1 (C1) tinh

khiết của Trichoderma reesei vào chế phẩm cellulase thô của Thermonospa fuscađã

làm tăng hoạt tính thuỷ phân giấy lọc (C1) lên gấp 2 lần khi dùng từng enzyme riêng

biệt [71], [80], [112], [120], [142].

Việc nghiên cứu tìm ra được những nhóm vi sinh vật thích hợp cho từng loại cơ

chất để cellulase có khả năng thuỷ phân tốt là một vấn đề không đơn giản. Vì thế việc

nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có hoạt tính cellulase cao để thuỷ phân

bã thải agar cho hiệu quả cao là rất cần thiết.

1.4.4. Môi trường nuôi cấy và nguồn nguyên liệu

Để sản xuất cellulase cần có môi trường nuôi cấy thích hợp, nguồn nguyên liệu

cung cấp là bông thấm nước, giấy lọc, giấy báo, các phụ phẩm chứa cellulase trong nông

nghiệp như bột rơm rạ nghiền nhỏ, cám bã, bột ngô, bột củ cải,.. nguồn cung cấp N là

muối nitrat, muối amon, ..[98], [135].

Một số môi trường thường sử dụng như:

- Môi trường nuôi nấm Tricoderma : KH2PO4: 0,2%; (NH4)2SO4: 0,14%; URE:

0,03%; MgSO4.7H2O: 0,03%; CaCl2: 0,03%; FeSO4.7H2O: 5mg/; MnSO4.H2O: 1,56

mg/l; ZnSO4.7H2O: 1,4 mg/l; CoCl2: 2mg/l; Pepton: 0,1%

- Môi trường nuôi chủng Asp.terreus: KH2PO4:0,1%; NaNO3: 0,3%; MgSO4.H2O:

0,05%; KCl: 0,05%; FeSO4.7H2O:0,01%; Cao bắp: 0,5%; Giấy lọc: 2%

27

- Môi trường khoáng chung cho loại cellulase gồm có: NH4NO3 1 g, K2HPO4 0,5

g, KH2PO4 0,5 g, MgSO4. 7H2O 0,5 g, NaCl 1 g, CaCl2 0,1 g, FeCl3 0,02 g, cao

men 0,05 g, nước cất 1000 ml, pH = 7,0 - 7,2 .

1.4. 5. Phương pháp thu nhận enzym cellulase

Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase thuộc 3 nhóm: nấm sợi, xạ khuẩn

và vi khuẩn. Trong công nghiệp sản xuất enzyme cellulase hiện nay, người ta chủ yếu

nuôi cấy nấm sợi và xạ khuẩn, người ta thường nuôi cấy theo phương pháp bề mặt bằng

môi trường xốp (còn gọi là môi trường bán rắn). Cả xạ khuẩn và nấm sợi đều phát triển

rất tốt trong môi trường xốp có độ ẩm 60-65%, có cơ chất là cellulose [2], [12], [20].

Thành phần môi trường nuôi cấy xạ khuẩn và nấm sợi rất đa dạng, trong đó vừa phải đủ

chất dinh dưỡng, vừa phải có cơ chất là cellulose và phải có độ xốp nhất định để không

khí có thể lưu thông từ bên ngoài môi trường vào bên trong khối môi trường. Cả 2 nhóm

xạ khuẩn và nấm sợi đều là những vi sinh vật hiếu khí nên trong quá trình nuôi thường

xuyên phải được cung cấp oxi.

Điểm khác biệt lớn nhất trong khi nuôi cấy nấm sợi và xạ khuẩn là xạ khuẩn phát

triển trong môi trường kiềm và môi trường axit yếu, còn nấm sợi phát triển trong môi

trường axit. Do đó khi chế tạo môi trường cần lưu ý tạo pH môi trường ban đầu cho xạ

khuẩn từ 6,2 – 7,6; còn pH môi trường ban đầu cho nấm sợi từ 4,5 – 5,5.

Thời gian phát triển và sinh tổng hợp enzyme cellulase của xạ khuẩn và nấm sợi

cũng khác nhau. Xạ khuẩn thường có thời gian phát triển và sinh tổng hợp cellulase dài

hơn nấm sợi thông thường, nấm sợi phát triển từ 36 - 48 giờ đã cho hoạt tính enzyme

cellulase rất cao. Trong khi đó xạ khuần phải mất ít nhất 72 giờ mới tổng hợp cellulase

nhiều [13], [23].

Điểm khác cuối cùng là khả năng chịu nhiệt của 2 nhóm vi sinh vật này, các loài

xạ khuẩn thường chịu nhiệt tốt hơn các loài nấm sợi. Enzyme cellulase của xạ khuẩn

cũng hoạt động ở nhiệt độ cao hơn enzyme cellulase của nấm sợi.

Sau khi nuôi cấy trong điều kiện kỹ thuật tối ưu, người ta thu được chế phẩm

cellulase ở dạng thô. Chế phẩm này chứa nước, sinh khối vi sinh vật, thành phần môi

trường và enzyme.

Công việc tiếp theo là sử dụng những phương pháp hóa, lý tách nước, sinh khối vi

sinh vật sẽ thu được enzyme dạng bán tinh khiết. Enzyme bán tinh khiết còn chứa nước,

28

protein không hoạt động và enzyme.Bằng những phương pháp hóa, lý ta sẽ loại được

nước, protein không hoạt động khi đó ta thu được chế phẩm enzyme tinh khiết.

Các loại nấm sợi như Aspergilus và Trichoderma thường được dùng làm đối tượng

để sản xuất cellulase ứng dụng nhiều trong thực tiễn. [53], [76], [97],[112], [120], [142].

Để sản xuất ra sản phẩm theo công nghệ ứng dụng vi sinh cần có những điều kiện

sau: Giống vi sinh, môi trường nuôi cấy, nguồn nguyên liệu (cơ chất) và quá trình lên

men (cấy giống, lên men và thu nhận sản phẩm).

Sau khi chuẩn bị môi trường nuôi cấy là quá trình lên men vi sinh. Đây là quá

trình sinh học diễn ra liên tục, bắt đầu từ khâu tạo giống, nhân giống sinh khối, lên men

và thu nhận sản phẩm cuối cùng. Các giai đoạn này có liên quan mật thiết và ảnh hưởng

qua lại với nhau. Để tạo được sản phẩm, quá trình lên men theo 3 giai đoạn: [2]; [12];

[54], [59], [63], [67], [74], [86]; [93], [110], [113], [133].

* Giai đoạn giữ giống gốc, nhân giống sinh khối và nhân giống sản xuất:

-Giống gốc được mua từ các Trung tâm thực nghiệm, trường Đại học, Viện nghiên

cứu…rồi nhân giống sinh khối theo môi trường thích hợp và nhân giống sản xuất đại trà.

Giống nấm mốc Aspergilus niger

- Quan sát đại thể

- Quan sát vi thể Hoạt hóa

Thử hoạt tính cellulase

Nuôi cấy trên môi trường cám gạo Nuôi cấy trên BC

Chế phẩm enzyme cellulase thô

Tinh chế enzyme cellulase

Thử hoạt tính phân giải cellulose của chế phẩm

Sơ đồ 1.3. Thu nhận cellulase từ A. niger

29

-Nếu không có giống gốc thì phải phân lập giống từ tự nhiên hoặc từ các cơ sở sản

xuất.

* Giai đoạn lên men:

Giai đoạn này có 2 quá trình lên men cơ bản là quá trình lên men hiếu khí và quá

trình lên men yếm khí (kỵ khí).

* Giai đoạn thu nhận sản phẩm lên men:

Tùy theo mục đích thu nhận sản phẩm mà có các phương pháp thu nhận sản phẩm

khác nhau. Dưới đây là một số phương pháp chủ yếu:

- Thu nhận chế phẩm enzyme vi sinh vật thô từ phương pháp nuôi cấy chìm:

phương pháp lắng tủa, lọc, ly tâm…

- Thu nhận chế phẩm enzyme vi sinh vật thô từ phương pháp nuôi cấy bề mặt

- Thu nhận chế phẩm enzyme bán tinh khiết

Trong nhiều trường hợp ứng dụng, người ta dùng chế phẩm enzyme thô và trong

nhiều trường hợp người ta dùng chế phẩm enzyme bán tinh khiết và chế phẩm enzyme

tinh khiết. Để thu nhận được chế phẩm enzyme bán tinh khiết, người ta dùng các tác

nhân gây tủa protein như: cồn, acetone, muối trung tính…, sau đó ly tâm thu chế phẩm

enzyme, theo phương pháp thu chế phẩm enzym bán tinh khiết giá thành của enzym sẽ

cao, khi ứng dụng đại trà sẽ có nhiều hạn chế.

Hiện nay, enzym cellulase được ứng dụng rất rộng rãi trong công nghiệp dệt, công

nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm gia súc.Đặc biệt các chế phẩm cellulase thô được

ứng dụng nhiều trong xử lý ô nhiễm môi trường.

Chế phẩm enzym cellulase tinh khiết được ứng dụng trong kỹ thuật di truyền.

Trong kỹ thuật tạo tế bào trần (protoplast), người ta thường dùng chế phẩm cellulase

tinh khiết để phá vỡ thành tế bào thực vật. Ứng dụng enzym cellulase phá vỡ tế bào thực

vật không làm tổn thương các cơ quan bên trong tế bào, đảm bảo sự nguyên vẹn của các

nhân tố di truyền. Do đó phương pháp này đã nhanh chóng thay thế các phương pháp

cơ học và hóa học.

Những ứng dụng của cellulase trong công nghiệp thực phẩm đã có kết quả rất tốt.

Tuy nhiên hạn chế lớn nhất là rất khó thu được chế phẩm có cellulase hoạt độ cao.

30

Hiện tại thị trường Việt Nam mới chỉ có rất ít các chế phẩm chứa các chủng nấm

có hoạt tính cellulase như: sản phẩm sinh học Trichoderma cho cây trồng của Tieu

Phong, chế phẩm BIMA của TT CNSH TP Hồ Chí Minh chứa các chủng Trichoderma

phối trộn với một số enzym để chống bệnh cho cây trồng và xử lý ô nhiễm môi

trường...Các chế phẩm cellulase ngoại có giá rất cao cho nên hiện chưa được lưu thông

trên thị trường.

1.5. Sản lượng nuôi cá rô phi

Cá rô phi hiện đang được nuôi rộng rãi trên thế giới. Ngoài mục đích cải thiện dinh

dưỡng cho người dân nghèo, nuôi cá rô phi còn tạo ra sản phẩm hàng hóa ngày càng có

sức cạnh tranh cao trên thị trường thế giới. Thị trường cá rô phi trên thế giới tăng nhanh

trong 2 thập kỉ qua, đặc biệt ở thị trường Mỹ. Thị trường nhập khẩu cá rô phi trên thế

giới năm 1992 mới đạt 2.500 tấn, đến năm 1999 đã là 100.000 tấn. Trong vòng 5 năm

qua, nhu cầu nhập khẩu cá rô phi tăng 38%/năm. Ðứng đầu các nước nhập khẩu cá rô

phi là Mỹ, tiếp sau là Nhật, một số nước châu Âu.Năm 1992, Mỹ nhập 3.400 tấn, năm

2000 nhập 40.000 tấn.Năm 2001, ước tính nhập 70.000 - 75.000 tấn, trị giá 106 - 108

triệu USD.

Cá rô phi là loài được nuôi phổ biến và có sản lượng lớn nhất trên thế giới,

cao hơn sản lượng cá da trơn và cá hồi.

Biểu đồ 1.1. Tăng trưởng sản lượng cá rô phi, cá da trơn và cá hồi giai đoạn 1980

– 2010

(Nguồn Fitzsimmons - Global Outlook for Aquaculture Leadership, Kualalumpur 2010)

31

Trong những năm gần đây sản lượng cá rô phi tăng nhanh chóng, năm 2000 đạt

1,3 triệu tấn (FAO Fishtat, 2002), trong đó Trung Quốc chiếm 50% sản lượng. Nghiên

cứu từ CPF Thái Lan đã cho thấy thức ăn viên chứa 20% protein thô có thể tiết kiệm chi

phí trong nuôi cá rô phi ao và lồng [52].

Có thể nuôi cá rô phi bằng nhiều phương pháp khác nhau, như nuôi ao bán thâm

canh có bón phân và cung cấp thức ăn, nuôi thâm canh trong bể, nuôi thâm canh lồng

và nuôi khép kín (nuôi tuần hoàn).Tuy nhiên, hiện nay có xu hướng đẩy mạnh nuôi cá

rô phi chất lượng cao thoả mãn nhu cầu tiêu dùng nội địa và xuất khẩu. Ðối tượng cá rô

phi đỏ được nuôi nhiều ở Ðông Nam Á vì chúng có giá tương đối thấp và thịt ngon nên

đã trở thành loài có tính cạnh tranh và là sản phẩm thay thế các loài cá có vây khác như

cá vược [18], [29], [49], [139].

Nuôi cá rô phi ở Việt Nam được bắt đầu từ những năm 1950 sau khi cá rô phi

đen (O.mossambicus) được nhập vào nước ta. Vào thời kỳ đó cá rô phi chủ yếu được

nuôi theo hình thức quảng canh nên năng suất thấp. Mặt khác do đặc điểm của cá rô phi

đen là chậm lớn, đẻ dày, kích thước nhỏ nên dẫn đến việc cá rô phi trong một thời gian

dài không được người nuôi chú ý. Năm 1973 cá rô phi vằn (O.niloticus) đã được nhập

vào miền Nam nước ta từ Đài Loan, cá trở thành đối tượng nuôi triển vọng, song do

công tác lưu giữ giống thuần không tốt, hiện tượng lai tạp giữa cá rô phi đen và rô phi

vằn Đài Loan là phổ biến, làm suy giảm chất lượng cá rô phi giống. Trong những năm

1990 thông qua các đề tài nghiên cứu khoa học, và các chương trình hợp tác quốc tế,

Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1 đã nhập một số giống cá rô phi có chất lượng

như: Cá rô phi vằn dòng Thái Lan, dòng Egypt – Swansea, cá rô phi dòng GIFT chọn

giống thế hệ thứ năm của ICLARM. Cá rô phi vằn dòng GIFT nhập nội đã được sử

dụng làm vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống cá rô phi tiến hành tại Viện

nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1, sau các thế hệ chọn giống theo phương pháp gia đình,

cá rô phi chọn giống có tốc độ tăng trưởng tăng thêm 29,1%.

Tổng cục thống kê năm (2005) diện tích nuôi cá rô phi của cả nước là

22.340 ha chiếm 3% tổng diện tích nuôi trồng thủy sản, trong đó nuôi nước lợ, mặn là

2.068 ha và nuôi nước ngọt là 20.272 ha. Tổng sản lượng cá rô phi ước tính đạt 54.486,8

tấn, chiếm 9,08% tổng sản lượng cá nuôi. Phần lớn diện tích nuôi tập trung ở đồng bằng

sông Cửu Long (10.129 ha chiếm 45,3%), kế đến là vùng đồng bằng sông Hồng và vùng

Đông Bắc Bộ [50], [60].

32

1.6. Đặc điểm sinh học của cá rô phi

1.6.1. Phân loại

Dựa vào đặc điểm sinh sản, người ta chia cá rô phi thành 3 giống [8], [9], [102]:

- Tilapia (cá đẻ cần giá thể)

- Sarotherodon (Cá bố hay cá mẹ ấp trứng trong miệng)

- Cá rô và Oreochromis (Cá mẹ ấp trứng trong miệng)

Cá rô phi hiện đang nuôi phổ biến ở Việt Nam thuộc :

Bộ cá vược - PerciForms

Họ - Cichlidae

Giống - Oreochromis

Loài - Cá rô phi vằn O.niloticus.

Hiện nay có 3 loài chính được phổ biến tại Việt Nam là :

- Cá rô phi cỏ Oreochromis Mossambicus, được nhập vào Việt Nam năm 1953 qua

ngã Thái Lan.

- Cá rô phi vằn ( Rô phi Đài Loan O.niloticus ) được nhập vào Việt Nam năm

1974 từ Đài Loan.

- Cá rô phi đỏ ( red Tilapia ), có màu hồng được nhập vào Việt Nam năm 1985 từ

Maliaxia.

1.6.2. Đặc điểm hình thái:

Cá rô có thân hình màu hơi tím, vảy sáng bóng, có 9-12 sọc đậm song song nhau

từ lưng xuống bụng. Vi đuôi có màu sọc đen sậm song song từ phía trên xuống phía

dưới và phân bổ khắp vi đuôi. Vi lưng có những sóc trắng chạy song song trên nền xám

đen. Viền vi lưng và vi đuôi có màu hồng nhạt [39]; [85].

Bảng 1.3. Phân biệt cá đực, cá cái

ĐẶC ĐIỂM PHÂN BIỆT CÁ ĐỰC CÁ CÁI

Đầu To và nhô cao Nhỏ, hàm dưới trề do

ngậm trứng và con

Màu sắc Vi lưng và vi đuôi sặc sỡ Màu nhạt hơn

Lỗ niệu sinh dục 2 lỗ : lỗ niệu sinh dục và

lỗ hậu môn

3 lỗ : lỗ niệu. lỗ sinh dục

và lỗ hậu môn.

33

Môi trường sống: Các loài cá rô phi hiện đang nuôi có đặc điểm sinh thái gần giống

nhau.

Nhiệt độ: Nhiệt độ cần thiết cho sự phát triển của cá rô phi từ 20-320C, thích hợp

nhất là 25-320C. khả năng chịu đựng với biến đổi nhiệt độ cũng rất cao từ 8-420C, cá

chết rét ở 5,50C và bắt đầu chết nóng ở 420C. Nhiệt độ càng thấp thì cá càng giảm ăn,

ức chế sự tăng trưởng và tăng rủi ro nhiễm bệnh.

Độ mặn: Cá rô phi là loài rộng muối, có khả năng sống được trong môi trường nước

sông, suối, đập tràn, hồ ao nước ngọt, nước lợ và nước mặn có độ muối từ 0-40%. Trong

môi trường nước lợ (độ mặn 10-25‰) cá tăng trưởng nhanh, mình dày, thịt thơm ngon.

pH: Môi trường có độ pH từ 6,5-8,5 thích hợp cho cá rô phi, nhưng cá có thể chịu

đựng trong môi trường nước có độ PH thấp bằng 4.

Oxy hoà tan: Cá rô phi có thể sống được trong ao, đìa có màu nước đậm, mật độ

tảo dày, có hàm lượng chất hữu cơ cao, thiếu Oxy. Yêu cầu hàm lượng oxy hoà tan trong

nước của cá rô phi ở mức thấp hơn 5-10 lần so với tôm sú [94], [95].

1.6.3. Đặc điểm về dinh dưỡng và sinh trưởng.

Đặc điểm dinh dưỡng: Bộ máy tiêu hoá của cá rô phi thích nghi với việc ăn tạp.

Miệng chúng khá rộng hướng lên trên, có thể ăn được những mồi lớn. Răng hàm

ngắn và nhiều xếp lộn xộn giúp cá bắt và giữ mồi tốt, lược mang ngắn và khá dày giúp

cá lọc tảo dễ dàng. Ruột cá rô phi dài và xếp thành nhiều vòng, đó là đặc điểm của loài

cá ăn thực vật [38]; [78].

Cá rô phi là loài cá ăn tạp nghiêng về thực vật, thức ăn chủ yếu là tảo và một phần

thực vật bậc cao và mùn bã hữu cơ. Ở giai đoạn cá con từ cá bột lên cá hương, thức ăn

chủ yếu là động vật phù du (ÐVPD) và một ít thực vật phù du (TVPD). Từ giai đoạn cá

hương đến cá trưởng thành thức ăn chủ yếu là mùn bã hữu cơ và TVPD. Cá rô phi có khả

năng tiêu hóa các loài tảo xanh, tảo lục mà một số loài cá khác không có khả năng tiêu hoá.

Ngoài ra cá rô phi còn ăn được thức ăn bổ sung như cám gạo, bột ngô, các loại phụ phẩm

nông nghiệp khác. Ðặc biệt cá rô phi có thể sử dụng rất có hiệu quả thức ăn tinh như: cám

gạo, bột ngô, khô dầu lạc, đỗ tương, bột cá... và các phụ phẩm nông nghiệp khác.

Nhu cầu dinh dưỡng của cá rô phi thay đổi theo từng giai đoạn phát triển. Trong các

yếu tố dinh dưỡng thì protein đóng vai trò quan trọng nhất cả về số lượng và chất lượng.

34

Các loài cá khác nhau có nhu cầu protein khác nhau. Ngay trong cùng một loài nhu cầu

protein cũng khác nhau giữa các độ tuổi và điều kiện môi trường nuôi khác nhau. Đối với

cá nhỏ nhu cầu protein trong khẩu phần thức ăn nhiều hơn cá lớn, cá nuôi trong hệ thống

nghèo thức ăn tự nhiên, đòi hỏi mức độ protein trong khẩu phần ăn cao hơn so với cá nuôi

trong môi trường giàu thức ăn tự nhiên hay trong ao bón phân [19], [36].

Tập tính ăn: Khi còn nhỏ, cá rô phi ăn sinh vật phù du ( tảo và động vật nhỏ) là

chủ yếu (cá 20 ngày tuổi , kích thước khoảng 18mm). Khi cá trưởng thành ăn mùn bả

hữu cơ lẫn các tảo lắng ở đáy ao, ăn ấu trùng, côn trùng, thực vật thuỷ sinh. Tuy nhiên

trong nuôi công nghiệp cá cũng ăn các loại thức ăn chế biến từ cá tạp, cua, ghẹ, ốc, bột

cá khô, bột bắp, bột khoai mì, khoai lang, bột lúa, cám mịn, bã đậu nành, bã đậu

phộng.Trong thiên nhiên cá thường ăn từ tầng đáy có mức sâu từ 1-2m [40].

Sinh trưởng: Khi nuôi trong ao, cá sử dụng thức ăn tự nhiên sẵn có kết hợp với

thức ăn chế biến, cá rô phi vằn đơn tính lớn nhanh từ tháng đầu đến tháng thứ 5-6.

Nuôi cá rô phi lồng: Nuôi lồng có vốn đầu tư và chi phí hoạt động thấp hơn nhiều

so với nuôi ao và nuôi bể. Cụ thể là cá được nuôi với mật độ cao và được cho ăn toàn

bộ. Mật độ nuôi phải tuỳ theo lượng ôxy có trong nước nuôi. ở Ðông Nam á, khi nuôi

thâm canh cá rô phi những người nuôi sử dụng thức ăn chứa 20 - 32% protein.

Kết hợp nuôi ao và nuôi lồng: việc kết hợp này cho phép quản lý số lượng cá thả

và thu hoạch cá. Cho cá ăn các thức ăn chế biến sẵn chứa 20 - 32% protein thô. Các cuộc

thử nghiệm nhằm xác định hiệu suất nuôi cá rô phi lồng (100m3/lồng) trong điều kiện

độ mặn 15 - 20ppt và nhiệt độ 28 - 320C, với năng suất 20,4; 20,9 và 21,2 tấn/ha/vụ

tương ứng với thời gian nuôi là 143; 154 và 167 ngày. Mật độ thả 16300; 16500 và

15300 tương ứng với trọng lượng cá là 127g; 149g và 145g. Các ao nuôi được lắp đặt

các guồng quạt nước [40].

1.6.4. Nhu cầu dinh dưỡng của cá rô phi

Giống như các loại cá khác, cá rô phi cũng cần 10 loại axít amin thiết yếu. Chúng

tiêu hoá cácbon hyđrat tốt hơn cá chép và cá trê phi. Việc cung cấp nhiều loại cácbon

hyđrat và lipit có tác dụng tăng hiệu quả của protein trong chế độ ăn, với mức protein

chiếm 18 - 22%. Rất khó xác định những vitamin và khoáng chất thích hợp trong chế

độ dinh dưỡng của cá rô phi. Ðể giải quyết vấn đề này, một số nghiên cứu đã được tiến

hành. Do cá rô phi có thói quen ăn uống đa dạng nên yêu cầu về chế độ ăn của chúng

35

cũng rất linh hoạt. Bột cá vẫn là nguồn protein động vật chủ yếu trong thức ăn của cá rô

phi, ngoài ra có thể lựa chọn các loại khác như thịt gia cầm, cá ủ xilô, bột tôm, nhuyễn

thể... Những protein thực vật được sử dụng nhiều nhất trong thức ăn cá rô phi là đỗ

tương, lạc, hạt bông, hạt hướng dương, hạt cải dầu và lá leucaena sp. Tuy nhiên, những

protein động vật và thực vật trên chỉ có thể thay thế một phần bột cá trong thức ăn của

cá rô phi. Ðiều này có thể do sự thiếu cân bằng của các chất dinh dưỡng thiết yếu như

các axit amin và các khoáng chất, do sự hiện diện của các nhân tố phi dinh dưỡng làm

giảm tính hấp dẫn của thức ăn, giảm tính ổn định của thức ăn trong nước và độ tiêu hoá

thức ăn kém. Ðối với chế độ ăn không có bột cá, để đạt được mức tăng trưởng so với

chế độ ăn tiêu chuẩn, phải bổ sung thêm 3% đicanxi phosphat và 2% lipit. [7], [8], [9],

[101], [103], [109].

Ðể đảm bảo đủ lượng thức ăn, có thể cho cá rô phi chưa trưởng thành (vài tuần

tuổi) ăn với tỷ lệ cao bằng 3 - 4% trọng lượng cơ thể trong một ngày. Cá có trọng lượng

250-400g thì lượng thức ăn hàng ngày tốt nhất là bằng 1,5% trọng lượng cơ thể. Ðối với

những loài nuôi trong nước biển thì hằng ngày nên cho ăn lượng thức ăn ít hơn 2% trọng

lượng cơ thể.

Bảng 1.4. Giới hạn các thành phần trong thức ăn có giá thành ít nhất cho cá rô

phi ở các giai đoạn

Thành phần % giới hạn Khởi điểm Bắt đầu Tăng

trưởng

Kết

thúc

Protein thô Tối thiểu (Min) 40 30 25 20

Chất béo thô Tối thiểu 4 4 4 4

Sợi thô Tối đa (Max) 4 4 4 8

Lysin Tối thiểu 2,04 1,53 1,28 1,02

Metionin + xystin Tối thiểu 1,28 0,96 0,8 0,64

Threonin Tối thiểu 1,44 1,08 0,9 0,72

Axít béo Tối thiểu 0,5 0,5 0,5 0,5

Axít béo Tối thiểu 0,5 0,5 0,5 0,5

Canxi Tối đa 2,5 2,5 2,5 2,5

Photphorơ (toàn bộ) Tối đa 1,5 1,5 1,5 1,5

36

Photphorơ (có sẵn) Tối thiểu 0,6 0,6 0,6 0,6

Tinh bột Tối thiểu 25 25 25 25

Năng lượng tiêu hoá

(Kcal/kg) Tối thiểu 2800 2800 2800 2800

Vitamin và khoáng chất Cố định 2 2 2 2

Bột cá (tối thiểu 60%

protein) Tối thiểu 15 12 10 8

Cám gạo Không hạn chế

Cám lúa mỳ Không hạn chế

Hạt cải dầu/hạt bông Tối đa - 10 12 20

Ngô/bột sắn/bột lúa

miến Tối thiểu 10 10 10 10

(Nguồn Asia Aquaculture Magarize)

Ðặc điểm kỹ thuật trong thức ăn của cá rô phi phụ thuộc vào nhu cầu dinh dưỡng

trong từng điều kiện nuôi. Ðặc điểm này phụ thuộc vào loại hình nuôi, loại thức ăn chế

biến, giá trị sản phẩm và nguồn thức ăn có nhiều ở các quốc gia Trong thành phần thức

ăn chế biến sẵn cho cá rô phi ở Thái Lan, Inđônêxia, Malaixia, Trung Quốc, những

nguyên liệu thô có sẵn ở địa phương thường chiếm tỷ lệ lớn, đặc biệt là nguồn cácbon

hyđrat ví dụ như cám gạo, cám lúa mỳ, ngô, bột sắn. Những nguyên liệu thô này có tính

mùa vụ nhưng thực tế đã chứng minh là chúng có chất lượng cao và mang lại hiệu quả

lớn.

Bảng 1.5. Cung cấp bổ sung vitamin và khoáng chất trong thức ăn của cá rô phi

Vitamin mg/kg Khoáng chất g/kg

Thiamin 20 Canxi 3

Piryđoxin 10 Photpho 7

Riboflavin 20 Magiê 0,4

B12 1 Sắt 0,03

Axít folic 5 Kẽm 0,2

Cholin 500 Ðồng 0,003

37

Pantothenic 50 Mangan 0,013

Niaxin 100 Iốt 0,0025

Axit ascorbic 375

Biotin 1

Inositol 100

K 10

A 5500IU/kg

D3 2000

Alpha-tocopherol 50

(Nguồn Asia Aquaculture Magarize)

Tỷ lệ cho ăn và tần suất cho ăn ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của cá và tỷ lệ trao

đổi thức ăn. Tỷ lệ cho ăn cao có thể làm cho cá tăng trưởng tốt nhưng không xác định

được độ chuyển hoá thức ăn. Bảng 5 chỉ ra loại thức ăn và chế độ cho ăn nên được sử

dụng rộng rãi trong nuôi thâm canh cá rô phi ao và lồng ở Ðông Nam Á. Bảng chế độ

ăn này có thể áp dụng với điều kiện nuôi có nhiệt độ nước 28 - 320C. ở điều kiện nhiệt

độ cao hơn hay thấp hơn thì cần điều chỉnh tỷ lệ và tần suất cho ăn hợp lý.

Bảng 1.6. Tiêu chuẩn kỹ thuật của thức ăn nuôi cá rô phi và chế độ ăn trong nuôi

lồng và ao thâm canh

Loại thức

ăn

Kích

thước

(mm)

Cỡ cá

(g)

Protein

(% tối

thiểu)

Chất

béo

(% tối

đa)

Chất

xơ

Tỷ lệ cho

ăn (% cân

nặng/ngày)

Số lần

cho

ăn/ngày

Vụn <0,6 <0,5 40 4 4 20 6

Vụn 0,6-1,0 0,5 40 4 4 15 6

Vụn 0,6-1,0 1 40 4 4 11 6

Vụn 0,6-1,0 1 40 4 4 9 5

Ép đùn, nổi 1,4-2,4 2 40 4 6 6,5 5

Ép đùn, nổi 2,4 10 30 4 6 6,5 5

38

Ép đùn, nổi 2,4 15 30 4 6 4,6 5

Ép đùn, nổi 2,4 15 30 4 6 4,6 5

Ép đùn, nổi 3,2 30 30 4 6 3,6 4

Ép đùn, nổi 3,2 60 30 4 6 3 4

Ép đùn, nổi 4,8 100 25 4 6 2,6 4

Ép đùn, nổi 4,8-6 175 25 4 6 2,2 3

Ép đùn, nổi 6,0-8,0 300 20 4 8 1,8 3

Ép đùn, nổi 8,0-10 400 20 4 8 1,5 3

(Nguồn Asia Aquaculture Magarize)

1.6.5. Nhu cầu dinh dưỡng và ảnh hưởng của thức ăn lên sinh trưởng của cá rô phi.

Cá rô phi là loài ăn tạp [7], [38]. Trong điều kiện tự nhiên cá rô phi ăn được các

loại thức ăn như phiêu sinh vật, sinh vật đáy, động vật không xương sống, mùn bã hữu

cơ, các loại thực vật thủy sinh có thân mềm [39]. Trong ao nuôi, cá cũng ăn thức ăn

nhân tạo, phân hữu cơ…[7]. Cá trưởng thành ăn mùn bã hữu cơ lẫn các tảo lắng ở đáy,

ấu trùng côn trùng và một phần thực vật thượng thẳng loại mềm, sinh vật phù du, có khi

ăn cả các sinh vật bơi lội. Thức ăn của cá rô phi trưởng thành trong môi trường sống tự

nhiên là thực vật nổi [8]. Trong thành phần thức ăn tự nhiên thì tảo có vai trò quan trọng

vì lược mang của cá rô phi có thể lọc tảo để làm thức ăn, nhưng khả năng lọc phiêu sinh

của lược mang cá rô phi không tốt như cá Mè trắng hoặc cá Mè hoa [39]. Cá rô phi có

ruột dài gấp 6 lần chiều dài thân. Cá có chiều dài ruột dài hơn cơ thể (chiều dài thân) thì

ăn thực vật [7]. Ở cá rô phi có thể tiêu hóa 30-60% đạm có chứa trong tảo [39]. Qua đó

ta thấy trong điều kiện tự nhiên cá rô phi ăn phiêu sinh vật, mùn bã hữu cơ, một phần

thực vật thượng đẳng loại mềm.

Các công trình nghiên cứu về dinh dưỡng của cá rô phi tập trung chủ yếu ở nhu

cầu protein, axit amin không thay thế, axit béo, vitamin và khoáng chất. Rất khó xác

định những vitamin và khoáng chất thích hợp trong chế độ dinh dưỡng của cá rô phi.Vài

cuộc thử nghiệm ở Trung tâm nghiên cứu động vật dưới nước Charoen Pokphand (Thái

Lan) đã được tiến hành để xác định loại thức ăn và tần suất cho ăn thích hợp cho sự tăng

trưởng của cá rô phi [5].

39

Chất đạm là yếu tố dinh dưỡng quan trọng cho sinh trưởng của cá rô phi. Tuy

nhiên, nhu cầu chất đạm của cá rô phi rất khác nhau trong loài và theo kích cỡ cá. Nhu

cầu đạm của rô phi vằn (Oreochromis niloticus) dao động trong khoảng 36 – 40% (Lê

Thị Quỳnh Ba, 1997), 30% (De Silva 1983). Để cá sinh trưởng tối đa thì khẩu phần ăn

của cá cần có hàm lượng đạm 45% và mức năng lượng 400kcal/100g, mức đạm kinh tế

trong khẩu phần thức ăn của cá rô phi là 25 – 35% với tỉ lệ cho ăn từ 4 – 6% trọng lượng

thân/ngày, thức ăn của cá rô phi biến thiên từ 1 – 50% đạm. Giá trị thông thường nhất

là dưới 15% đạm [37].

Yêu cầu đạm của cá rô phi có trọng lượng từ 1 – 5g là 30 – 40%, cá 5 – 25g là 20

– 30% và nặng hơn 25g yêu cầu 20 – 25% đạm. Điều này chứng tỏ cá càng lớn thì nhu

cầu về đạm trong thức ăn của cá càng giảm. Theo Winfree và Stickney (1981) cá có

trọng lượng 2,5 gam tốt nhất thì cần 36% đạm. Kubark (1980) cho biết cá rô phi tăng

trưởng từ 3 – 30 gam tốt nhất thì cần 36% đạm. Một số nghiên cứu cho biết cá rô phi

nuôi bán thâm canh thì thức ăn cần 28% đạm, nuôi thâm canh cần 30 – 36% đạm.

Mức đạm kinh tế trong khẩu phần thức ăn của cá rô phi là 25 – 35%, ở nhiệt độ

27 – 290c thì cho cá có trọng lượng từ 5 – 20g, với mức ăn là 4 – 6% trọng lượng

thân/ngày. Khi nuôi cá rô phi ở các ao, hồ gần trại chăn nuôi hoặc ven đô thị có nguồn

nước thải sinh hoạt, cá rất mau lớn và cho năng suất 6 tấn/ha vì trong phân heo, gà bài

tiết còn chứa một số cabohydrate, đạm mà heo gà không tiêu hóa hết hoặc các loại vi

sinh vật và dịch nhờn của ống tiêu hóa tiết ra, cá rô phi có thể dùng làm thức ăn.

Nguyên liệu dùng thức ăn cho cá có thể rất khác nhau như các loài thực vật thủy

sinh có thân mềm như rau muống, bèo. Bèo hoa Dâu Azolla đã được sử dụng trong khẩu

phần thức ăn của cá rô phi và đã nhận thấy sự sinh trưởng tốt của cá. Các loại thức ăn

như bột gạo, bột mì, bột bắp, bánh đầu và khoai lang, bã đậu, bã rượu, khô dầu, cám đều

có thể dùng để chế biến thức ăn cho cá rô phi [34].

Qua đó cho ta thấy nhu cầu về đạm cho cá rô phi biến động trong khoảng từ 15

– 50% tuy nhiên tập trung nhất ở mức 25 – 35% và sử dụng được các loại thức ăn ở

dạng chế phẩm trong sản xuất, chế biến nông nghiệp, chất thải sinh hoạt, chăn nuôi và

các loại thức ăn nhân tạo. Sự tăng trưởng của cá rô phi phụ thuộc vào các yéu tố như ưu

thế của di truyền, chất lượng và số lượng thức ăn được cung cấp, một số điều kiện sinh

thái của môi trường nuôi, giới tính và mật độ nuôi. Như cá rô phi đực có trọng lượng

40

ban đầu 20 – 30 gram nếu điều kiện nuôi tốt có thể đạt trọng lượng 450 – 500 gram, cá

có thể tăng trọng 4 – 5g/ngày và nếu điều kiện nuôi lí tưởng thì từ cá bột có trọng lượng

1 gram, sau 1 năm nuôi có thể đạt 800 gram.

Theo Micha (1988), cá rô phi có trọng lượng ban đầu là 5,1g sau 10 tuần nuôi cá

đạt 25g, với thức ăn viên có 34,3% đạm, FCR: 1,2 và FER: 2,4 và có thành phần hoá

học cơ thể ( % trọng lượng thô ) trước và sau thí nghiệm như sau

Bảng 1.7. Thành phần hoá học cá rô phi nuôi bằng thức ăn viên có hàm lượng

protein 34,2 (%)

Cá Độ ẩm

(%) Lipit (%) Protein (%) Tro (%)

Trước thí nghiệm (5.1g) 74.4 20.7 60.6 17.9

Sau thí nghiêm (25g) 75.0 23.6 59.7 14.9

Theo Chiayvareesajja. S và ctv (1988) cá rô phi nuôi trong lồng với 12 công thức

thức ăn có mức đạm từ 17,3 – 38,0%, sau 5 tháng nuôi, FCR của 12 công thức khác biệt

không có ý nghĩa về mặt thống kê (P<5%), sự khác biệt WG không tìm thấy qui luật nào.

Theo kết quả nghiên cứu cá rô phi của Li Zihongjie (1991) ở Trung Quốc:

Bảng 1.8. Nuôi cá rô phi bằng thức ăn viên có hàm lượng protein (%) khác nhau.

Thức ăn (% đạm) WG(%) FCR FER

32,2 85,6 1,71 1,79

27,2 97,0 1,58 2,34

25,7 84,3 1,65 2,35

- Thức ăn cho cá rô phi có FCR thường nhỏ hơn 2 [36]

- Cá rô phi có trọng lượng ban đầu 10.0 – 10.6g cho ăn thức ăn chiếm 3 – 5% trọng

lượng cá/ngày, với thức ăn là 100% cám gạo, có SGR = 0,69 và FCR = 4,7[19]. Cá có

trọng lượng ban đầu 10.0 – 10.6g cho ăn 55 trọng lượng cá, thức ăn là 50% bột cá +

50% cám gạo, có SGR = 2,03 [35].

Maerk (1975) đã phát triển đặc tính cho ăn của cá rô phi ở Israel, trọng lượng cá

(gram) thì lượng thức ăn chiếm % trọng lượng thân/ngày như sau:

41

Bảng 1.9: Nuôi cá rô phi với tỷ lệ thức ăn (%)/thân khác nhau

Trọng lượng cá (g) 5 – 10 10 - 20 20 – 50 50 - 70 70 – 100

Thức ăn 6,7 5,3 4,6 3,3 2,8

Qua các nghiên cứu trên ta thấy với lượng thức ăn khác nhau, đạm khác nhau, có

ảnh hưởng đến hệ số tiêu thốn thức ăn và sinh trưởng của cá rô phi, các kết quả trên có

SGR từ 0,69 – 2,03%/ngày và FCR từ 1,2 – 4,7

Chế độ cho ăn: Đảm bảo đủ lượng thức ăn, có thể cho cá rô phi chưa trưởng thành

(vài tuần tuổi) ăn với tỷ lệ cao bằng 3 – 4% trọng lượng cơ thể trong 1 ngày. Cá có trọng

lượng 250 – 400g thì thức ăn hàng ngày tốt nhất là bằng 15% trọng lượng cơ thể. Đối

với những loài nuôi trong nước biển thì hàng ngày nên cho ăn lượng thức ăn ít hơn 2%

trọng lượng cơ thể.

Hiện nay, tổng năng lực chế biến thức ăn thủy sản của Việt Nam ước tính

250.000 tấn/năm thức ăn nuôi tôm và 100.000 tấn/năm thức ăn nuôi cá. Điều này cho

thấy rằng năng lực chế biến hiện nay không đủ đáp ứng nhu cầu trong tương lai ước

tính cần khoảng 300.000 tấn thức ăn nuôi tôm và 200.000 tấn thức ăn nuôi cá, chủ

yếu cho cá rô phi và cá tra, basa.

Việt Nam đã có sự tăng trưởng đáng kể trong hoạt động nuôi trồng thủy sản,

đặc biệt là nuôi tôm biển. Chỉ trong thời gian ngắn, Việt Nam đã thu hút được nhiều

công ty đa quốc gia đầu tư vào các nhà máy chế biến thức ăn chăn nuôi. Cho đến

cuối năm 2003, đã có 15 công ty chế biến thức ăn lớn và 20 – 30 công ty vừa và nhỏ

đang hoạt động trong thị trường thức ăn thủy sản ở Việt Nam. Chính phủ đã chỉ đạo

chương trình mở rộng thêm các vùng nuôi tôm biển, nuôi cá nước ngọt và nuôi biển

mới. Do vậy, nhu cầu thức ăn nuôi thủy sản trở thành một vấn đề cấp bách [18].

42

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng

2.1.1. Bã thải rong sau sản xuất agar

Bã thải rong sau sản xuất agar được thu nhận từ cơ sở sản xuất agar của Công ty

TNHH SX & TM Hoàng Yến phường Lãm Hà, Quận Kiến An, thành phố Hải Phòng.

Sau quá trình nấu chiết thu agar, bã agar được loại thải qua giai đoạn lọc khung bản.

Mẫu được lấy ngẫu nhiên giữa các lần nấu chiết sau đó ép để giảm bớt hàm lượng nước

và bảo quản ở nhiệt độ lạnh. Bã rong sau khi thu mua về bảo quản có màu trắng nâu, sợi

rong mềm, có mùi tanh tự nhiên của rong biển.

Hình 2.1. Bã thải sau sản xuất agar

2.1.2. Giống vi sinh vật sinh cellulase

Các chủng vi sinh vật sinh cellulase sử dụng trong qúa trình nghiên cứu được lấy

từ bộ sưu tập giống vi sinh vật sinh cellulase của Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và bộ sưu tập giống vi sinh vật của Trường Đại

học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội. Bao gồm các chủng sau: Bacillus

subtilis VTCC-B-26; Bacillus subtilis VTCC-B-505; Bacillus Lichenformis- Li; CFd;

43

CFh; MSM 04; MSM 11; Streptomyces sp VTCC-A-62; Sarcharomyces fibulgera

VTCC-Y-519; Sarcharomyces fibulgera VTCC-Y-529; Sarcharomyces capsularis

VTCC-Y-32; Aspergillus niger VTCC-F273; Tricoderma konigii VTCC-708; 1’; V2;

V3; V4.

2.1.3. Cá rô phi giống

Cá rô phi

Hình 2.2. Cá rô phi

Bộ cá vược Perciformes

Họ Cichlidei

Giống Oreochromis

Loài O. niloticus (Linnaeus, 1757)

Tên địa phương cá Rô phi vằn dòng Gift

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp phân tích

+ Xác định hàm lượng protein theo TCVN 4328-1:2007 (ISO 5983-1:2005).

+ Xác định hàm lượng nước theo TCVN 4326:2001 (ISO 6596:1999).

+ Xác định hàm lượng tro theo TCVN 4327:2007 (ISO 5984:2002).

+ Xác định hàm lượng cellulose AOAC No 973.09.1997/TCVN 4329:2007 (ISO

6865:2000).

+ Xác định hàm lượng lipit TCVN 4331:2001.

+ Xác định nấm mốc độc theo HPLC 3.19-05-2/CL1/ST.

44

+ Xác định NaCl theo TCVN 4330:1986.

+ Xác định Canxi theo TCVN 1526: 2007.

+ Xác định Phospho theo TCVN 1525 - 2001.

+ Phân tích các nguyên tố kim loại trên máy quang phổ hấp phụ nguyên tử

2.2.2. Các phương pháp thu nhận và xác định hoạt tính cellulase

2.2.2.1. Phương pháp thu nhận enzym cellulase thô

* Nguyên tắc [2], [6]

Phương pháp nuôi cấy chìm là phương pháp vi sinh vật phát triển, sinh sản và trao

đổi chất trong lòng môi trường. Môi trường dùng trong nuôi cấy chìm thường là môi

trường lỏng. Trong quá trình phát triển, sinh sản và trao đổi chất trong môi trường lỏng,

vi sinh vật sẽ tổng hợp ra các enzym thủy phân. Các enzym thủy phân là các enzym hòa

tan trong nước. Do đó việc thu nhận enzym trong trường hợp này là thu nhận dịch nuôi

cấy (sau khi đã tách sinh khối và những thành phần không hòa tan của môi trường).

Chế phẩm enzym vi sinh vật thô trong nuôi cấy chìm ở đây bao gồm enzym đã hòa

tan trong nước, nước và các sản phẩm trao đổi chất hòa tan khác.

* Thiết bị: Cân phân tích chính xác 0,0001g, miếng ami-ăng, bếp điện, nồi thanh

trùng, bình tam giác 250ml , bình tam giác , tủ cấy, máy lắc, đũa khuấy.

* Cách pha: Cho 800 ml nước cất vào bình tam giác, cân các hóa chất đúng theo

khối lượng cho vào bình. Lắc cho các chất tan hết rồi thêm nước cất cho đủ 1000ml.

Đun dung dịch trên bếp có lót miếng ami-ăng. Đun môi trường đến 90 oC thì cho CMC

vào. Dùng đũa khuấy khuấy đều để CMC tan hoàn toàn. Dùng ống đong để lấy 200 ml

dung dịch đã pha và cho vào bình tam giác 250ml. Làm nút bông và bao gói, hấp khử

trùng ở 121oC trong 20 phút.

* Lên men các chủng vi sinh vật sinh enzym cellulase

Thực hiện trong tủ cấy vô trùng bằng tia cực tím. Cho 2ml nước muối sinh lý vào

ống giống chứa khuẩn lạc của mỗi chủng. Dùng que cấy vòng cà nhẹ trên bề mặt thạch

để thu toàn bộ sinh khối tế bào. Thu dịch chuyển qua bình tam giác chứa môi trường

riêng của mỗi chủng.Đậy nút bông và nuôi cấy lắc 200 vòng/phút ở 28oC trong 48 giờ.

45

Kết thúc lên men, dịch nuôi cấy được ly tâm 12000 vòng/phút ở nhiệt độ 4oC trong

10 phút. Bỏ tủa, thu dịch nổi chính là enzym thô được bảo quản ở 4oC cho các thí nghiệm

tiếp theo.

2.2.2.2. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme cellulase bằng phương pháp xác

định đường khử

* Nguyên tắc: hoạt tính cellulase của dịch nuôi vi sinh vật được xác định theo

phương pháp xác định hàm lượng đường khử. Enzym celluase thủy phân cơ chất CMC

tạo thành sản phẩm là các đường có chứa gốc khử. Hàm lượng đường khử tạo thành

được xác định bằng cách cho phản ứng với dung dịch DNSA. Màu sinh ra sau phản ứng

được xác định bằng phương pháp so màu trên máy quang phổ ở bước sóng 530nm.

Một đơn vị hoạt độ enzym CMCase là lượng enzym phân giải cơ chất tạo thành

1mg glucose sau 1h tác dụng ở 400C, pH 5.0 [6], [12]

* Hóa chất và thiết bị: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: Glucose;

đệm acetate 0.5M, pH 5.0; DNSA, K-Na tartrate dung dịch CMC (1g/ 60ml), Folin,

TCA, casein .

Pha dung dịch cơ chất: Cân chính xác 1g CMC, hòa tan trong 80ml dung dịch đệm

acetate 0.5M, pH 5.0. Chuyển vào bình định mức, thêm dung dịch đến vạch và lắc đều.

Pha dung dịch DNSA: Cho từ từ 100g K-Na tartrate vào dung dịch NaOH 1% đang

được đun cách thủy nhẹ, nhiệt độ khoảng 50oC, khuấy đều bằng máy khuấy từ. Chờ cho K-

Na tartrate tan hết tiếp tục cho từ từ 5g DNSA vào và khuấy cho tan hoàn toàn. Làm lạnh

dung dịch DNSA đến nhiệt độ phòng. Bảo quản trong chai màu nâu có nắp ở 4oC.

Thiết bị bao gồm: tủ ấm 40 0C, Máy khuấy từ, Máy quang phổ.

* Phản ứng enzym

Mẫu thí nghiệm: cho 0.5ml dịch nuôi vi sinh vật và 0.5ml đệm acetate pH 5.0 vào

ống nghiệm, giữ 10 – 15 phút ở 400C. Thêm 1.5ml dung dịch CMC (đạt 400C), lắc đều

giữ ở 400C trong 1h. Sau đó, 0.5ml dịch sau phản ứng được lấy ra để tiến hành xác định

hàm lượng đường khử tạo thành.

Mẫu kiểm tra: sau khi trộn lẫn enzym với cơ chất, lấy ngay ra 0.5ml dịch để xác

định đường khử. Mỗi phản ứng đều đều lấy một mẫu kiểm tra riêng.

Mẫu đối chứng: thay 0.5ml dịch nuôi vi sinh vật bằng 0.5ml nước cất. Các bước

tiếp theo thực hiện như mẫu thí nghiệm.

46

* Xác định hàm lượng đường khử

Cho 0.5ml dịch sau phản ứng và 0.5ml dung dịch DNSA vào eppendof 1.5ml. Đun

sôi 5 phút, làm lạnh và ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút. Thu dịch trong và đo độ

hấp phụ tại bước sóng 530nm.

* Xây dựng đường chuẩn glucose

Chuẩn bị 20ml dung dịch glucose 1mg/ml rồi pha loãng dung dịch này với độ pha

loãng khác nhau từ 0.1 – 0.3 mg/ml. Thực hiện các thí nghiệm theo bảng sau:

Bảng 2.1. Xây dựng đường chuẩn glucose

Ống số 0 1 2 3 4 5

Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3

Dung dịch glucose (ml) 0 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3

Nước cất (ml) 1 0,9 0,85 0,8 0,75 0,7

Lấy 0.5ml từ mỗi dịch pha loãng glucose ở trên và làm phản ứng xác định hàm

lượng đường khử như phương pháp đã được mô tả ở trên.

* Công thức tính hoạt độ cellulase

Tính hiệu số giá trị mật độ quang học của mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm tra, dựa

vào đồ thị chuẩn tính lượng mg glucose tương ứng. Tính hoạt độ cellulase trong 1ml

dịch nuôi vi sinh vật theo công thức sau:

X= a.k.2,5 (mg)

Trong đó:

X: Số đơn vị hoạt độ trong 1ml dịch enzym

2,5: Thể tích của hỗn hợp phản ứng giữa enzym và cơ chất

a: Số mg glucose tương ứng với hiệu số giá trị mật độ quang học của ống thí

nghiệm và ống kiểm tra

k: Độ pha loãng dung dịch enzym.

47

2.2.3.3. Phương pháp xác định độ bền của chế phẩm enzym cellulase theo thời

gian bảo quản

Các chế phẩm enzym được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 0 ºC (có bổ sung

NaN3 0,02%) trong 1 ngày, 1 tuần, 2 tuần và 3 tuần. Ở cùng 1 điều kiện thủy phân, bằng

phương pháp DNSA xác định đầu đường khử để kiểm tra hoạt tính của chế phẩm enzym.

2.2.2.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính cellulase bằng phương pháp điện di

Xác định cellulase bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamis 12,5 % theo

Laemmi [5]

20ml dịch nuôi được tủa cồn 80% lạnh ly tâm thu tủa hòa trong 200mcl nước chạy

điện di trên gel polyacrylamis 12,5 % theo Laemmi. Sau khi điện di gel được rửa bằng

nước cất và ngâm ủ trong CMC 1% trong 2h ở 37 ºC nhuộm bằng thuốc nhuộm lugo.

Vị trí nào trên gel có cellulase sẽ cho vạch trắng ( không bắt màu với lugo).

2.2.2.6. Phương pháp xác định hoạt tính tương đối thủy phân bã agar

Sử dụng phương pháp DNSA (mục 2.2.3) để đo hoạt tính thủy phân bã agar của

các enzym cellulase. Mẫu enzym nào có so đo cao nhất được đánh giá là 100% hoạt tính

tương đối, các mẫu enzym khác có hoạt tính thấp hơn sẽ được so sánh với mẫu cao nhất

tính theo %.

2.2.3 Phương pháp nuôi cấy và đánh giá khả năng sinh tổng hợp cellulase của vi

sinh vật

2.2.3.1. Các phương pháp nuôi vi sinh vật

Cân chính xác thành phần môi trường nuôi cấy cho vào bình tam giác 1000ml chứa

sẵn khoảng 800 ml nước cất. Đun sôi nhẹ và khuấy cho CMC tan hết. Bao gói và hấp

khử trùng ở 121oC, 20 phút. (thành phần môi trường nuôi cấy ở Phụ lục II)

* Các bước tiến hành nuôi cấy vi sinh vật

Cho 2ml nước muối sinh lý vào ống nghiệm chứa khuẩn lạc của chủng vi sinh vật.

Dùng que cấy móc cà nhẹ lên môi trường thạch để sinh khối tế bào hòa vào dịch muối.

Chuyển dịch muối chứa sinh khối vi sinh vật vào bình môi trường đã pha ở trên. Nuôi

cấy trong điều kiện lắc 200 vòng/phút ở 280C trong 48h để thu enzym cellulase.

48

2.2.3.2. Đánh giá sinh trưởng của vi khuẩn

Sinh trưởng của vi khuẩn được xác định bằng cách đo mật độ quang học (OD) của

dịch nuôi cấy trên may so màu quang phổ ở bước sóng 620nm.

2.2.3.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh cellulase của vi sinh vật

Đánh giá hoạt tính sinh cellulase của vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán trên

thạch có cơ chất CMC và bột giấy.

Nguyên tắc của phương pháp là nuôi vi sinh trên môi đặc hiệu có bổ sung cơ chất

CMC như sau:

* Môi trường xác định hoạt tính

- Môi trường Cell .

Thành phần gồm có (g/l):

(NH4)2HPO4 1,5

KH2PO4 0,5

K2HPO4 0,5

MgSO4 .H2O 0,4

NaCl 0,1

MnSO40,01

FeSO4 7H2O 0,01

Bột giấy 2

Nước cất 1000ml

- Môi trường Khoáng + CMC:

Thành phần gồm có (g/l):

NH4NO3 : 1

K2HPO4 0,5

KH2PO40,5

MgSO4. 7H2O 0,5

NaCl 1

CaCl2 0,1

FeCl3 0,02

Cao men 0,05

Thạch 20

Nước cất 1000 ml ;

pH = 7,0 - 7,2

Các môi trường được khử trùng ở 121oC trong 30 phút.

Phương pháp đục lỗ: nhỏ 0,2ml dịch nuôi vào các giếng thạch có đường kính

10mm, giữ ở 4oC trong 2h để dịch khuếch tán đều xung quanh giếng thạch. Ủ ở 300C

trong 36 giờ, sau đó tráng dịch Lugol trên đĩa thạch và đo vòng phân hủy trong suốt

không bắt màu nhuộm xung quanh giếng thạch.

49

2.2.3.4. Phương pháp xác định pH tối ưu của enzym cellulase

* Hóa chất và thiết bị

Đệm acetat 0,1 M pha ở các pH 4,5 và 5,5;

Đệm phosphate 0,1 M pha ở các pH 6,5 – 9,5

Máy đo pH Corning 215 (Anh), cân điện tử Shimazu (Nhật Bản), cân kỹ thuật

CALTEX (Tây Đức), máy ly tâm eppendorf (Đức), máy so màu UV-1650PC, máy so

màu UV-1650v.v.

* Tiến hành phản ứng: Thực hiện phản ứng như mô tả ở mục 2.2.3.3 nhưng pha

cơ chất CMC và đệm phản ứng bằng các dung dịch đệm Na-acetat pH: 4,5; 5,5 và đệm

phosphate pH: 6,5; 7,5; 8,5; 9,5. Nhiệt độ phản ứng giữ nguyên ở 400C.

2.2.3.5. Phương pháp xác định nhiệt độ tối ưu của enzym cellulase

* Tiến hành phản ứng

Thực hiện phản ứng như mô tả ở mục 2.2.3.3 cơ chất CMC được pha vào đệm ở

pH tối thích. Tiến hành phản ứng enzym ở các nhiệt độ khác nhau từ: 300C – 800C.

2.2.3.6. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy 2 chủng vi khuẩn B505 và Li đã lựa chọn

+ Lựa chọn môi trường nuôi cấy

Để có thể sản xuất enzyme ở quy mô lớn, chúng tôi tiến hành lựa chọn các nguồn

cơ chất dễ kiếm, rẻ tiền. Chúng tôi tiến hành xác định khả năng sinh trưởng và tiết

enzyme cellulase ngoại bào của 2 chủng Li và B505 trên một số loại cơ chất: bột đậu

tương, bột gạo, nước mắm, môi trường giàu chất khoáng và so sánh với môi trường quy

mô phòng thí nghiệm (môi trường MT1, MT1’, MT2, MT2’, MT3, MT4, MT5, MT6)

(Môi trường nuôi cấy ở Phụ lục II)

+ Thời gian nuôi cấy

Thời gian nuôi cấy cũng là một trong những nhân tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng

và khả năng sinh enzyme của các chủng vi khuẩn. Trong quá trình nuôi cấy và xác định

hoạt tính của chủng B505 và Li được theo dõi ở các mốc thời gian sau:24, 48, 68, 72,

92, 96 h.

+ Nhiệt độ

Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng và

phát triển của vi khuẩn. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng sinh trưởng và tiết

cellulase ngoại bào của 2 chủng B505 ở nhiệt độ 28, 30, 32, 37 và 45 ºC.

50

+ pH

pH cũng là một trong các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng

và phát triển của vi khuẩn. Vì vậy chúng tôi nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của pH (4-

8) đến khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chúng.

2.2.4. Phương pháp xây dựng mô hinh thực nghiệm

2.2.4.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm tổng quát

Bã thải rong sau sản xuất agar được thu nhận từ cơ sở sản xuất agar của Công

ty TNHH SX & TM Hoàng Yến phường Lãm Hà, Quận Kiến An, thành phố Hải Phòng.

Sau quá trình nấu chiết thu agar, bã agar được loại thải qua giai đoạn lọc khung bản, tiến

hành phân tích đánh giá thành phần cơ bản của bã rong.

Tiến hành đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase ngoại bào của 17 chủng vi

sinh vật trong bộ sưu tập giống vi khuẩn của Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học

Quốc gia Hà Nội. Sau khi lên men, dịch lên men được ly tâm để loại tế bào và sử dụng

dịch lên men để đánh giá khả năng thủy phân cơ chất CMC để tuyển chọn chủng vi sinh

vật sinh cellulase cao. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát như sau:

51

Sơ đồ 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Tiến hành thí nghiệm tuyển chon chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme

cellulose mạnh, nghiên cứu xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi sản xuất

enzyme cellulase từ chủng vi sinh vật đã tuyển chọn. Sau khi lựa chọn điều kiện tối thích

Nhân giống

cấp 1

Chọn loại VSV thích

hợp

Nhân giống cấp

1

Giống vi sinh

vật

Thu nhận dịch cellulase ngoại bào

Lên men

Chế phẩm

cellulase ngoại

bào thô

Nhân giống

cấp 2

Cá rô phi

Xây dựng công thức

phối chế thức ăn

nuôi cá

Đánh giá hiệu quả nuôi cá

Xác định công thức phối chế

thức ăn phù hợp

Chế phẩm bã

rong thủy

phân

Thủy phân

Bã thải

Agar

Tối ưu hóa quá

trình thủy phân

Nghiên cứu chế

độ thủy phân

Khảo sát

thành phần bã

rong

52

để sản xuất chế phẩm enzyme cellulase ứng dụng để thủy phân bã thải agar để ứng dụng

phối trộn trong thức ăn nuôi cá rô phi.

2.2.4.2. Bố trí thí nghiêm tối ưu hóa quá trình thủy phân bã thải rong bằng enzym

cellulase

Sơ đồ bố trí thí nghiệm theo quy hoạch thực nghiệm để xác định các thông số cho

quá trình thủy phân bã rong:

Tiến hành quy hoạch thực nghiệm xác định ba thông số: Thời gian, nhiệt độ và

nồng độ enzyme.

Trong đó: U1: Thời gian (h)

U2: Tỷ lệ enzyme/cơ chất (ml/g)

U3: Nhiệt độ (0C)

Y: Hàm lượng đường tổng số (g)

Sau khi tiến hành thực nghiệm tối ưu xác định được thời gian, nhiệt độ và nồng độ

enzyme tối ưu cho quá trình thủy phân bã thải Agar.

2.4.4.3. Bố trí thí nghiệm thử nghiệm sử dụng chế phẩm thủy phân bã thải rong

trong thức ăn nuôi cá rô phi

Từ chế phẩm bã rong thủy phân tiến hành phối chế công thức thức ăn nuôi cá rô

phi với hàm lượng Protein là 25% với các tỷ lệ phối trộn chế phẩm bã thải thủy phân.

THỦY PHÂN

U1

U3

Y U2

53

Sơ đồ 2.2. Sơ đồ thí nghiệm sử dụng chế phẩm bã rong thủy phân trong nuôi

cá rô phi

Ký hiệu các công thức thức ăn thí nghiệm như sau:

CT1: Bổ sung bã rong thủy phân với tỷ lệ 5%

CT2: Bổ sung bã rong thủy phân với tỷ lệ 10%

CT3: Bổ sung bã rong thủy phân với tỷ lệ 15%

CT4: Bổ sung bã rong thủy phân với tỷ lệ 20%

CT5: Bổ sung bã rong thủy phân với tỷ lệ 25%

Cá rô phi được nuôi trong 18 giai có kích thước (3m x 2m x 1 m) bằng 5 loại thức

ăn thí nghiệm có bổ sung bã agar thủy phân với tỷ lệ phối trộn lần lượt là 5%, 10%,

15%, 20%, 25% có có hàm lượng protein 25 %. Khối lượng trung bình cá khi bắt đầu

thí nghiệm là 205,9 ± 4,34 g/con. Trong thời gian thí nghiệm, hàng ngày cho cá ăn 2 lần

5% 20% 15% 10% 25%

Nguyên liệu phối trộn thức ăn

Công thức thức ăn có phối trộn bã rong thủy phân

Thức ăn nuôi cá

Nuôi thử nghiệm

Đánh giá tốc độ sinh trưởng, tỷ lệ sống, hệ số thức

ăn, lựa chọn công thức thức ăn phù hợp

54

vào 8h sáng và 16h. Khẩu phần ăn hàng ngày giai đoạn cá từ 40 – 100g/con là 5% khối

lượng thân, 100 – 150g/con là 4% khối lượng thân giai đoạn từ 150 – 200g/con là 3%

khối lượng thân. Khẩu phần ăn được điều chỉnh theo tăng trưởng của cá. Cứ 20 ngày

dùng vợt bắt 10 cá thể, cân rồi tính trọng lượng trung bình, làm cơ sở để ước tính lượng

cá trong ao. Dựa vào các chỉ tiêu sinh trưởng và tỷ lệ sống mà xác định được công thức

thức ăn tốt nhất.

2.2.4.3. Phương pháp xây dựng khẩu phần công thức thức ăn

Bước 1: Xác định nhu cầu dinh dưỡng, tiêu chuẩn cho gia súc, gia cầm. Nhu cầu

dinh dưỡng theo tiêu chuẩn Việt nam (TCVN) hoặc tham khảo tiêu chuẩn NRC (Mỹ),

ARC(Anh), tiêu chuẩn của Nhật Bản, Hà Lan, Ân Độ.. phù hợp với các giống gia súc

gia cầm và từng giai đoạn sinh trưởng phát triển của con vật.

Bước 2: Chọn lựa các nguyên liệu thức ăn để lập khẩu phần ăn. Phải biết giá trị dinh

dưỡng và giá thành các nguyên liệu thức ăn đó. Nguyên liệu thức ăn phải bảo đảm chất

lượng tốt và phải phù hợp với từng loại gia súc, đảm bảo tính ngon miệng của con vật.

Bước 3: Tiến hành lập khẩu phần. Phương pháp này thường theo các bước chính

sau đây:

- Xác định khối lượng các loại thức ăn bổ sung như khoáng vi lượng, premix vitamin...

Các loại thức ăn này thường chiếm tỷ lệ thấp trong khẩu phần.

- Ấn định khối lượng một số loại thức ăn giàu protein hoặc thức ăn giàu năng lượng

- Trên cơ sở thức ăn đã ấn định tính toán khối lượng các loại thức ăn còn lại. Ta có

thể xác định khối lượng của từng loại thức ăn này bằng 2 phương pháp: phương pháp

đường chéo Pearson hoặc phương pháp dùng phương trình đại số.

- Để phối trộn công thức thức ăn, sử dụng nguyên tắc đường chéo

- Để phối trộn công thức thức ăn, sử dụng nguyên tắc chéo

Protein trong nguyên liệu “A” Tỷ lệ nguyên liệu “A” cần

Mức protein mong muốn

Protein trong nguyên liêu “B” Tỷ lệ nguyên liệu “B” cần

- Dùng WUFFF DA để tính toán giá trị dinh dưỡng của khẩu phần dự kiến

55

- Điều chỉnh và bổ sung: dựa vào tiêu chuẩn ăn để điều chỉnh và bổ sung các chất dinh

dưỡng cho phù hợp với nhu cầu con vật.

2.2.4.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm thử nghiệm thức ăn bổ sung bã rong thủy

phân trong nuôi cá rô phi.

Địa điểm: Xí nghiệp Giống thủy sản

Địa chỉ; Cầu Nguyệt, Kiến An, Hải Phòng.

Hình 2.3. Bố trí các giai nuôi thử nghiệm cá rô phi

* Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của các công thức thức ăn lên sinh trưởng cá

rô phi giai đoạn nuôi thương phẩm: Cá rô phi được nuôi trong 18 giai có kích thước

(3m x 2m x 1 m) bằng 6 loại thức ăn thí nghiệm có bổ sung bã agar thủy phân với tỷ lệ

phối trộn lần lượt là 0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25% có có hàm lượng protein 25 %. Mỗi

nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Mật độ nuôi là 4 con/m3. Khối lượng trung bình cá khi

bắt đầu thí nghiệm là 205,9 ± 4,34 g/con. Trong thời gian thí nghiệm, hàng ngày cho cá

ăn 2 lần vào 8h sáng và 16h. Khẩu phần ăn hàng ngày giai đoạn cá từ 40 – 100g/con là

5% khối lượng thân, 100 – 150g/con là 4% khối lượng thân giai đoạn từ 150 – 200g/con

là 3% khối lượng thân. Khẩu phần ăn được điều chỉnh theo tăng trưởng của cá. Cứ 20

ngày dùng vợt bắt 10 cá thể, cân rồi tính trọng lượng trung bình, làm cơ sở để ước tính

lượng cá trong ao.

56

- Khẩu phần ăn hàng ngày giai đoạn cá từ 80 – 100g/con là 5% khối lượng thân,

giai đoạn từ 200 – 300g/con là 3% khối lượng thân, giai đoạn 300-400 g/con cho ăn 2%

khối lượng thân , và > 400g/con cho ăn 1% khối lượng thân.

Khẩu phần ăn được tính theo công thức:

X = A x D x S x 95% x F (Kg)

trong đó: A : khối lượng trung bình của cá (kg/con)

D: mật độ cá thả (con/m2)

X: khẩu phần thức ăn

S: tỷ lệ sống tại thời điểm kiểm tra

F: tỷ lệ cho ăn (%)

Khẩu phần ăn được điều chỉnh theo tăng trưởng của cá 20 ngày 1 lần. Cách làm

cụ thể như sau: Cứ 20 ngày dùng vợt bắt 10 cá thể, cân rồi tính trọng lượng trung bình,

làm cơ sở để ước tính lượng cá trong ao.

2.2.4.5. Phương pháp xác định các thông số nuôi cá rô phi

Phương pháp tiếp cận và thu thập số liệu nuôi thử nghiệm

Phương pháp thứ cấp: Thông qua tài liệu tham khảo, các báo cáo khoa học, tài

liệu có liên quan.

Phương pháp sơ cấp: Thông qua việc trực tiếp bố trí thí nghiệm.

Phương pháp trực tiếp: các thông số môi trường sử dụng các thiết bị đo trực tiếp.

Thu thập số liệu định kỳ 20 ngày/lần bằng cách cân đo cá rô phi, xác định tốc độ

sinh trưởng về chiều dài và trọng lượng [7], [8].

*Tỷ lệ sống: TLS (%)

TLS =

Tổng số cá kết thúc thí nghiệm

× 100% Tổng số cá ban đầu thí nghiệm

57

* Tốc độ sinh trưởng

Thí nghiệm tiến hành 80 ngày, tốc độ sinh trưởng của cá rô phi được tính theo

tốc độ tăng trưởng về kích thước và chiều dài.

*Tốc độ sinh trưởng phần trăm theo khối lượng:

WW(%) = Wtb2 – Wtb1

× 100% Wtb1

. * Tốc độ sinh trưởng đặc trưng trên ngày về khối lượng (SGR %/ ngày)(Specific

Growth Rate)

* Tốc độ sinh trưởng tuyệt đối trung bình ngày về khối lượng (DWG)(Daily

Weight Growth)

Wtb1, Wtb2: Khối lượng trung bình tại thời điểm T1 và T2.

Hệ số thức ăn (FCR)

Khối lượng thức ăn đã sử dụng

FCR =

Tổng khối lượng cá tăng trọng

2.3. Hóa chất và thiết bị chủ yếu sử dụng trong luận án

2.3.1. Hóa chất

Carboxymethyl cellulose (CMC), Glucose, Pepton, cao thịt, tinh bột, cao nấm men,

cao malt, MgSO4, CaCl2, K2HPO4, NaHCO3, NaCl,….. các hóa chất nhập ngoại của các

hãng có uy tín trên thế giới như Sigma, Merk, Bio-Canada,…

2.3.2. Thiết bị

Các thiết bị chủ yếu bao gồm: Tủ ủ, Tủ sấy, Thiết bị thủy phân có khuấy đảo dung

tích 30 lít, Máy ly tâm, Cân, Máy đo pH, Máy quang phổ UV vis, máy xay, máy nghiền,

máy ép viên thức ăn, ....

SGRW =

LnWtb2 – LnWtb1

× 100% T2 – T1

DWG =

Wtb2 – Wtb1

(g/ngày) T2 – T1

58

Các thí nghiệm nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Phòng Nghiên

cứu công nghệ Sau thu hoạch - Viện Nghiên cứu Hải sản và Phòng Thí nghiệm Trọng

điểm Quốc gia về Công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ Sinh học, đã có sẵn các thiết

bị, máy móc hiện đại, có độ chính xác cao của đảm bảo cho việc thực hiện đề tài.

2.4. Phương pháp xử lý số liệu

Phân tích thống kê số liệu sẽ sử dụng tiêu chuẩn t-test, xử lý số liệu tối ưu bằng

phần mềm Design Expert version 6.0 (DX6), các phần mềm Excell và K-graph sẽ được

sử dụng để phân tích và vẽ đồ thị. [1], [4].

59

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát đánh giá khối lượng và thành phần hóa học cơ bản của bã thải rong

câu chỉ vàng sau sản xuất agar

Trước tiên đề tài tiến hành khảo sát và đánh giá lượng phế thải rong sau sản xuất

agar từ các vùng nguyên liệu rong câu chỉ vàng hiện đang có các cơ sở sản xuất agar ở

Việt Nam. Sau khi khảo sát lấy mẫu đánh giá thành phần hóa học cơ bản của bã thải

rong. Kết quả trình bày ở bảng 3.1 ÷3.3.

Bảng 3.1. Khối lượng bã thải rong sau sản xuất agar từ các vùng rong nguyên liệu

khác nhau

STT Vùng nguyên liệu Khối lượng bã thải

(tấn bã thải/1 tấn sản phẩm

agar)

1 Cát Hải - Hải Phòng 8,2

2 Đồ Sơn - Hải Phòng 7,5

3 Đình Vũ - Hải Phòng 7,4

4 Điêm Điềm – Thái Bình 14,3

5 Tiền Hải – Thái Bình 12,6

6 Nam Định 13,75

7 Thanh Hóa 12,8

8 Huế 6,75

9 Bình Định 8,8

10 Phú Yên 8,6

60

* Về khối lượng bã thải:

Từ số liệu ở bảng 3.1 khảo sát đánh giá lượng phế thải rong sau sản xuất agar ở

một số cơ sở sản xuất agar tại Hải Phòng, Nam Định,… cho thấy lượng phế thải rong

thải ra trong quá trình sản xuất agar khá lớn từ 6,75 tấn ÷ 14,3 tấn (tính trên 1 tấn sản

phẩm agar). Lượng phế thải bã rong phụ thuộc rất nhiều vào vùng thu mua rong để sản

xuất agar làm cho tỷ lệ bã thải/sản phẩm có sự biến động và lượng bã phát sinh rất chênh

lệch nhau. Cụ thể, rong câu chỉ vàng ở vùng Bạch Long Vĩ, Cát Hải - Hải Phòng và

vùng Phá Tam Giang, Lăng Cô - Huế thì hàm lượng agar thu được cao tức lượng bã

thải rong thu được thấp vào khoảng 6,75 tấn ÷ 7 tấn/tấn sản phẩm. Trong khi đó, rong

câu chỉ vàng nuôi trồng ở Thái Bình và Nam Định,… thì chất lượng rong kém nên hàm

lượng agar thu được thấp và lượng phế thải cao, nằm trong khoảng 9 tấn ÷ 14 tấn/tấn

agar.

Kết quả điều tra cũng cho thấy chỉ tính riêng tại Hải Phòng đã có một số Công ty

sản xuất agar lớn như Công ty Cổ phần Đồ hộp Hạ Long, Công ty TNHH Hải Long,

Công ty Cổ phần Thương mại Duy Mai, Công ty TNHH Hải Đông, Công ty TNHH

TM&SX Hoàng Yến,… mỗi công ty trung bình sản xuất từ 100 ÷ 200 kg agar/1ngày.

Như vậy hàng năm các công ty này sản xuất khoảng 350 tấn agar và lượng bã thải rong

sau sản xuất agar của các công ty này vào khoảng 3.500 tấn/năm. Như vậy bã thải rong

từ quá trình sản xuất agar khá lớn nên việc nghiên cứu xử lý nhằm tận dụng lượng bã

thải này trong chăn nuôi và hạn chế ô nhiễm môi trường là cần thiết.

Bảng 3.2. Hàm lượng các chất cơ bản trong bã rong câu của một số cơ sở

sản xuất Agar

Chỉ tiêu Protein (%) Tro (%) Cellulose (%) Cát sạn (%)

Bã rong câu 3,26 ± 0,11 12,28 ± 3,77 74,26 ± 4,68 10,2 ± 2,19

Bảng 3.3. Hàm lượng kim loại nặng trong bã rong câu của một số cơ sở sản xuất

Agar

Chỉ

tiêu

Cu

(mg/kg)

Pb

(mg/kg)

Zn

(mg/kg)

Cd

(mg/kg)

Hg

(mg/kg)

As

(mg/kg)

Fe

(mg/kg)

Mn

(mg/kg)

Bã

rong

câu

0,31 ±

0,09

0,29 ±

0,08

0,85 ±

0,16

0,06 ±

0,01

0,03 ±

0,01

0,07 ±

0,02

0,84 ±

0,27

0,48 ±

0,16

61

Từ các kết quả phân tích ở các bảng 3.2 ÷ 3.3 cho thấy:

* Về thành phần hóa học cơ bản của bã thải rong sau sản xuất agar:

Kết quả phân tích ở bảng 3.2 cho thấy bã thải rong sau sản xuất agar có hàm lượng

protein vào khoảng 3,26 ± 0,11%; hàm lượng cellulose vào khoảng 74,26 ± 4,68 %; hàm

lượng tro khá cao 12,28 ± 3,77 %.

Kết quả phân tích trên cũng cho thấy trong bã rong có hàm lượng các nguyên tố

khoáng vi lượng rất đầy đủ và hàm lượng các nguyên tố kim loại nặng (As, Pb, Cd,

Hg,…) đều dưới mức cho phép dùng trong thực phẩm theo tiêu chuẩn của EU do vậy

bã rong từ sản xuất agar hoàn toàn có thể tái sử dụng mà không sợ ảnh hưởng đến vật

nuôi cây trồng. Ngoài các loại thức ăn truyền thống, thì vai trò của các protein, các

vitamin, axit amin và chất khoáng sẽ có ý nghĩa rất lớn đến sự tăng trưởng nhất là yêu

cầu chất lượng thương phẩm đang là vấn đề được đặt lên hàng đầu hiện nay. Việc bổ

sung từng chất khoáng riêng lẻ gặp rất nhiều khó khăn, phức tạp, những chất khoáng,

nhất là khoáng vi lượng chỉ cần một số lượng rất nhỏ nên rất khó định lượng và không

chính xác. Nếu thiếu khoáng chất và vitamin bổ sung vào khẩu phần thức ăn, sẽ giảm

sức đề kháng đồng thời nẩy sinh nhiều dịch bệnh. Việc tận dụng bã rong từ sản xuất

Agar bổ sung vào thức ăn chăn nuôi vừa đảm bảo chất lượng dinh dưỡng vừa mở ra một

hướng mới trong tìm nguyên liệu đối với các nhà máy chế biến thức ăn.

Từ các phân tích ở trên cho thấy bã thải rong từ quá trình sản xuất agar có số

lượng lớn và cũng có một số thành phần dinh dương như protein, khoáng chất và có

hàm lượng kim loại nặng đạt tiêu chuẩn dùng trong thực phẩm và chăn nuôi. Do vậy

việc nghiên cứu xử lý bã thải rong dùng trong chăn nuôi là cần thiết.

3.2. Tuyển chọn chủng vi sinh vật và nghiên cứu một số tính chất cơ bản của các

chủng vi sinh vật tuyển chọn

3.2.1. Kết quả nghiên cứu tuyển chọn các chủng giống vi sinh vật

Tiến hành đánh giá khả năng sinh enzyme cellulase ngoại bào của 17 chủng vi

sinh vật (6 chủng vi khuẩn, 1 chủng xạ khuẩn, 3 chủng nấm men và 2 chủng nấm sợi và

5 chủng VSV chưa được định tên) trong bộ sưu tập giống vi khuẩn của Viện Công nghệ

Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Trường Đại học Khoa

học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội. Sau khi lên men, dịch lên men được ly tâm để

loại tế bào và sử dụng dịch lên men để đánh giá khả năng thủy phân cơ chất CMC. Kết

quả đánh giá hoạt độ cellulase của 17 chủng vi sinh vật và đánh giá đường kính vòng

62

thủy phân CMC của các chủng có hoạt tinh sinh cellulase cao bằng phương pháp khuếch

tán trên đĩa thạch có cơ chất CMC 1% được trình bày ở hình 3.1, 3.2 và bảng 3.4, 3.5.

Biểu đồ 3.1. Hoạt tính enzyme cellulase của 17 chủng vi sinh vật đã thử nghiệm

Bảng 3.4. Hoạt tính cellulase ngoại bào của 17 chủng vi sinh vật nghiên cứu

STT

Tên chủng

Hoạt tính

(unit/ml) Phân loại

sơ bộ

1 Bacillus subtilis VTCC-B-26 5,20

Vi khuẩn

2 Bacillus subtilis VTCC-B-505 9,95

3 Bacillus lichenformis- Li 9,76

4 CFd 7,71

5 CFh 1,45

6 MSM 04 0,90

7 MSM 11 0,92

8 Streptomyces sp VTCC-A-62 0,90

9 Saccharomyces fibulgera VTCC-Y-519 1,35 Nấm men

10 Sarcharomyces fibulgera VTCC-Y-529 2,67

0

2

4

6

8

10

12H

oạt

tín

h c

ellu

lase

(unit

/mt)

Chủng VSV

63

11 Sarcharomyces capsularis VTCC-Y-32 1,81

12 Aspergillus niger VTCC-F273 1,08 Nấm sợi

13 Tricoderma konigii VTCC-708 0,89

14 1’ 1,32

Chưa phân

loại

15 V2 0,93

16 V3 1,10

17 V4 1,07

Hình 3.1. Hình ảnh về đường kính vòng thủy phân CMCcủa 4 chủng vi

sinh vật lựa chọn trên đĩa thạch chứa 1% CMC

Số 1 và 4: Đối chứng dương: enzyme cellulase 1mg/ml; Số 2: B505; Số3: Li; Số

5: B26 và số 6: CFd

Bảng 3.5. Hoạt tính enzym cellulase của chủng Li, B505, B26 và CFd

STT Tên vi sinh vật Đường kính vòng thủy phân (mm)

1 B505 34,0

2 Li 29,5

3 B26 26,0

4 CFd 27,5

Từ các phân tích ở hình 3.1, 3.2 và các bảng 3.4, 3.5 cho thấy:

5

4

6

1

2 3

64

* Về hoạt tính sinh cellulase

Các vi sinh vật được nuôi trong các môi trường đặc trưng có bổ sung CMC làm

cơ chất cảm ứng cho việc sinh enzym cellulase và CMC là cơ chất đặc hiệu cho cellulose

[2], [28], [32], [33], [66]. Kết quả thí nghiệm ở hình 3.1 cho thấy 4 chủng Li, B26, B505

và CFd có hoạt tính enzyme cellulase mạnh hơn các chủng khác đã thử nghiệm. Chủng

Li và chủng B505 là hai chủng có khả năng tiết cellulase mạnh nhất với hoạt tính lên

đến gần 10 unit/ml, cao gấp 6-7 lần so với các chủng khác. Bốn chủng B26, B505, Li và

CFd sinh cellulase mạnh thuộc nhóm vi khuẩn, trong đó các chủng B26, B505 và Li

thuộc chi Baccillus (bảng 3.5). Kết quả nghiên cứu của đề tài phù hợp với các nghiên

cứu của một số tác giả nước ngoài. Chẳng hạn, Peter đã nghiên cứu và cho rằng trong số

các loại vi khuẩn thủy phân cellulose, 87% là các vi khuẩn thuộc chi Baccillus [100];

Nghiên cứu của Mawadza C, Hatti-Kaul R. (2000) và Seung Hwan Park, Ha Keun Kim

(1991) cho thấy B. subtilis có khả năng sản xuất enzym cellulase mạnh [91], [100], [123];

Howard và cộng sự, Singh C.P. và cộng sự cũng chỉ ra rằng có nhiều chủng khuẩn thuộc

chi Bacillus như: B. subtilis, B. macerans, B. sp, B. lichenformis, B. sphaericus có khả

năng sinh enzyme cellulase cao [75], [118], [119].

* Về đánh giá đường kính vòng thủy phân cellulase

Kết quả kiểm tra đường kính vòng thủy phân cellulase của 4 chủng vi sinh vật (Li,

B505, B26 và CFd) bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch với cơ chất CMC 1%

cho thấy B505 và Li là hai chủng có khả năng tiết cellulase mạnh nhất có đường kính

vòng thủy phân là 34 mm và 29,5 mm, cao hơn đường kính vòng thủy phân của B26 và

CFd kết quả tương tự với phương pháp đánh giá hoạt tính cellulase. Kết quả ở hình 3.2

và bảng 3.5 cho thấy chủng vi khuẩn B505 có hoạt tính cellulase cao nhất, cao gấp 1,15

÷ 1,3 lần so với đường kính vòng thủy phân CMC của các chủng Li, B26 và CFd.

Từ kết quả đánh giá hoạt độ của enzyme cellulase và phương pháp đánh giá đường

kính vòng thủy phân bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch có cơ chất CMC 1%

đã cho thấy 4 chủng sinh cellulase ngoại bài cao là:Bacillus lichenformis (Li), Bacillus

subtilis VTCC-B-505, Bacillus subtilis VTCC-B-26 và CFd. Vì thế 4 chủng này được

lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu ở các phần sau.

65

3.2.2. Nghiên cứu một số tính chất cơ bản của các chủng vi sinh vật tuyển chọn

3.2.2.1. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của các

chủng vi khuẩn đã lựa chọn

Tiến hành 4 lô thí nghiệm, mỗi lô 24 thí nghiệm nghiên cứu đánh giá khả năng

sinh cellulase của 4 chủng đã lựa chọn có hoạt tính sinh cellulase cao ở các pH khác

nhau từ 4,5 ÷9,5. Lô thí nghiệm 1: nghiên cứu khả năng sinh cellulase của chủng vi

khuẩn Li; Lô thí nghiệm 2: nghiên cứu khả năng sinh cellulase của chủng vi khuẩn B505;

Lô thí nghiệm 3: nghiên cứu khả năng sinh cellulase của chủng vi khuẩn B26 và Lô thí

nghiệm 4: nghiên cứu khả năng sinh cellulase của chủng vi khuẩn CFd. Các thí nghiệm

đều tiến hành ở môi trường nuôi cấy vi khuẩn (CMC:10g; Pepton:0.5g; Cao thịt:0.2g;

NaCl:1g; Nước cất:1lít) có cơ chất CMC và đệm phản ứng bằng các dung dịch đệm Na-

acetat pH: 4,5; 5,5 và đệm phosphate pH: 6,5; 7,5; 8,5; 9,5, ở cùng điều kiện nhiệt độ ở

400C và thời gian 48 h. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh cellulase

được trình bày ở hình 3.3.

Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ enzym cellulase ngoại bào của bốn

chủng vi khuẩn Li, B26, B505, CFd

Từ các kết quả phân tích ở các hình 3.3 cho thấy ảnh hưởng của pH lên hoạt độ

enzym cellulase của bốn chủng Li, B505, B 26, CFd cho thấy enzyme cellulase ngoai

0

2

4

6

8

10

12

4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5

Ho

ạt đ

ộ (

unit

/ml.

h )

pH

Li B 505 B 26 CFd

66

bào của chủng Li, B505 và CFd có hoạt tính cao nhất tại pH 5,5; riêng enzyme cellulase

ngoai bào của chủng B26 có hoạt tính cao nhất tại pH 6,5. Như vậy enzyme cellulase

ngoại bào của 4 chủng trên hoạt động mạnh trong vùng pH trung tính (pH = 5,5÷ 6,5).

3.2.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh tổng hợp khả năng sinh tổng

hợp enzyme cellulase của các chủng vi khuẩn đã lựa chọn

Tiến hành 4 lô thí nghiệm, mỗi lô 24 thí nghiệm nghiên cứu đánh giá khả năng

sinh cellulase của 4 chủng vi khuẩn đã lựa chọn có hoạt sinh cellulase cao ở nhiệt độ

khác nhau từ 300C ÷800C. Lô thí nghiệm 1: nghiên cứu khả năng sinh cellulase của

chủng vi khuẩn Li; Lô thí nghiệm 2: nghiên cứu khả năng sinh cellulase của chủng vi

khuẩn B505; Lô thí nghiệm 3: nghiên cứu khả năng sinh cellulase của chủng vi khuẩn

B26 và Lô thí nghiệm 4: nghiên cứu khả năng sinh cellulase của chủng vi khuẩn CFd.

Các thí nghiệm đều tiến hành ở môi trường nuôi cấy vi khuẩn (CMC:10g; Pepton:0.5g;

Cao thịt:0.2g; NaCl:1g; Nước cất:1lít) có cơ chất CMC và đệm phản ứng bằng cùng

nồng độ dung dịch đệm Na-acetat pH: 5,5, thời gian 48 h, thay đổi nhiệt độ của phản

ứng enzym từ 30-80C. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh

cellulase được trình bày ở hình 3.4.

Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ enzym cellulase ngoại bào của 4

chủng Li, B26, B505, CFd

0

5

10

15

20

25

30

35

30 40 50 60 70 80

Ho

ạt đ

ộ (

unit

/ml.

h)

Nhiệt độ

Li

B 505

B 26

CFd

67

Từ các kết quả phân tích ở hình 3.4 cho thấy mỗi enzyme có hoạt đông tối ưu ở

một nhiệt độ thích hợp. Hoạt tính enzyme sẽ mạnh nhất khi hoạt động tại vùng nhiệt độ

tối thích và giảm dần khi quá ngưỡng nhiệt độ này. Trên hình 3.4 cho thấy enzyme

cellulase ngoại bào của chủng Li có hoạt tính cao nhất tại nhiệt độ 50C, enzyme

cellulase ngoai bào của chủng B505, B26 và CFd có hoạt tính cao nhất tại nhiệt độ 60C.

Rất nhiều loại enzyme cellulase của vi sinh vật đã được nghiên cứu, phần lớn các enzyme

của các vi sinh vật được sử dụng trong xử lý rác thải có vùng nhiệt độ hoạt động tối

thích khá cao khoảng từ 50-70C [3]. Các enzyme cellulase ngoại bào của 4 chủng vi

sinh vật mà chúng tôi sàng lọc được hoạt động mạnh trong vùng nhiệt độ từ 50-60C,

đây là vùng nhiệt độ rất thích hợp cho quá trinh xử lý bã agar vì nhiệt độ này không làm

mất hoạt tính các khoáng vi lượng, protein va acid amin có trong thành phần bã rong để

sử dụng làm thức ăn gia súc.

Qua kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ enzym cellulase ngoại

bào của 4 chủng: Bacillus lichenformis (Li), Bacillus subtilis VTCC-B-505, Bacillus

subtilis VTCC-B-26 và CFd). Với các điều kiện pH (5,5) và nhiệt độ (50-60oC) tối ưu

cho thấy 2 enzym cellulase ngoại bào của chủng Li và B505 có hoạt tính Cx mạnh nhất.

3.2.2.3. Sơ bộ đánh giá trọng lượng phân tử của cellulase của 2 chủng Li và B505

bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamis

Để sơ bộ đánh giá trọng lượng phân tử của enzyme cellulase ngoại bào thu được

từ 2 chủng Li và B505 bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamis12,5% theo

Laemmi. Kết quả điện di được trình bày trong hình 3.5.

68

Hình 3.2. Điện di đồ chế phẩm cellulase thô thu nhận từ vi khuẩn B505 và Li trên

gel polyacrylamis 12,5 % theo hệ đệm Laemmi

Kết quả điện di trên gel polyacrylamis chế phẩm cellulase thu nhận từ môi trường

nuôi cấy 2 chủng vi khuẩn Li và B505 trình bày ở hình 3.5 cho thấy 2 chế phẩm enzyme

ngoại bào thu được từ chủng Li và B505 đều cho một băng hoạt tính protein có hoạt tính

cellulase. Kết quả trên điện di cũng cho thấy enzyme cellulase từ 2 chủng Li và B505

trên có trọng lượng phân tử tương đương với nhau. So sánh băng điện di chế phẩm

enzyme thu nhận từ 2 chủng vi khuẩn Li và B505 với trọng lượng phân tử của protein

chuẩn thì 2 enzyme cellulase này có trọng lượng phân tử nằm trong khoảng 115 Kda.

Từ các phân tích ở trên cho thấy enzyme cellulase từ hai chủng vi khuẩn Li và B505

có trọng lượng phân tử nằm trong khoảng 115 Kda, kết quả này phù hợp với một số kết

quả nghiên cứu của Begunin (1990); Gilkes và cộng sự (1991)cho rằng trọng lượng phân

tử của enzyme cellulase nằm trong khoảng 30-110 Kdal.

3.2.2.4. So sách hoạt tính cellulase của 2 chủng Li và B505 với hoạt tính cellulase

của Tricoderma konigii

Tiến hành đánh giá khả năng thủy phân cellulose bột giấy của cellulase từ hai

A B

14,4

KDa

20,1

30

45

66

96

120 KDa

~ 115 kda A. Phổ điện di cellulase

của chế phẩm enzym

ngoại bào từ chủng Li và

B505

B. Phổ điện di protein

của chế phẩm enzym

ngoại bào từ chủng Li và

B505

Li B505 Li B505

69

chủng B505 và Liso sánh khả năng thủy phân bột giấy của cellulase ngoại bào được tiết ra

từ chủng nấm Trichoderma konigii, là chủng nấm thường được dùng để sản xuất cellulase

ứng dụng nhiều trong thực tiễn. Kết quả được trình bày trong hình 3.6 và bảng 3.6.

Hình 3.3. So sánh vòng thủy phân của cellulase từ vi khuẩn Li, B505 trên đĩa

thạch bổ sung cơ chất bột giấy 0,2%

1. Cellulase của chủng Tricoderma konigii nuôi trên môi trường cell

2. Cellulase của chủng Bacillus lichenformis (Li)

3. Cellulase của chủng Bacillus subtilis VTCC-B-505

Bảng 3.6. Hoạt tính cellulase ngoại bào của chủng Li, B505 trên đĩa thạch có cơ

chất bột giấy 0,2%

STT Nguồn cellulase

Đường kính vòng

thủy phân bột giấy

(cm)

1 Cellulase từ T. konigii nuôi trên môi trường Cell 1,4

2 Cellulase từ B. lichenformis (Li) 1,3

3 Cellulase từ B. subtilis VTCC-B-505 1,2

Từ các kết quả phân tích ở các hình 3.6 và bảng 3.6 cho thấy:

1

2

3

70

Kết quả từ hình 3.6 và bảng 3.6 cho thấy 2 chủng vi khuẩn B505 và Li cũng sinh

cellulase ngoại bào thủy phân bột giấy mạnh (1,2-1,3 cm) gần bằng chủng nấm

Tricoderma konigii (1,4 cm).

Các kết quả khảo sát hoạt tính cellulase và sàng lọc các chủng cho thấy 2 chủng

vi khuẩn B. subtilis VTCC-B-505 và B. lichenformis (Li) có cả hai hoạt tính thuỷ phân

CMC (Cx) và bột giấy cao, rất thích hợp cho việc thuỷ phân cellulose.

3.2.2.4. Thử nghiệm khả năng thủy phân bã agar bằng enzyme cellulase từ chủng

Li và B505.

Tiến hành 3 mẫu thí nghiệm thử nghiệm khả năng thủy phân bã thải agar, mỗi mẫu

cho 5 gram bả thải agar và 5 ml chế phẩm enzyme thu nhận được từ Li, B505, và hỗn

hợp chế phẩm enzym của 4 chủng vi sinh vật B505, B26, Li, CFd. Kết quả nghiên cứu

thử nghiệm khả năng thủy phân bã thải agar và qui trình thu nhận chế phẩm sinh học từ

2 chủng Li và B505 từ các chế phẩm enzyme cellulase ngoại bào của 2 chủng Li và

B505 được trình bày ở bảng 3.7 và các hình 3.7 ÷3.8.

Bảng 3.7. Khả năng thủy phân bã thải agar bằng cellulase từ 2 chủng Li và B505

STT Chế phẩm cellulase ngoại bào Đối

chứng

Độ mủn

của mẫu

Hoạt tính

tương đối

(%)

1

5ml enzym của B505 + 5gr bã thải agar +

15ml đệm acetate 0.01M, pH 5.5 (lắc

200v/p, 500C, 60giờ)

- xxxxx 100,0

2

5ml enzym của Li + 5gr bã thải agar + 15ml

đệm acetate 0.01M, pH 5.5 (lắc 200v/p,

500C, 60giờ)

- xxxxx 96,0

3

5 ml enzym của 4 chủng vsv (B505, B26, Li,

CFd) + 5 gr bã thải agar + 15 ml đệm acetate

0.01M, pH 5.5 ( lắc 200v/p, 500C, 60giờ)

- xxxx 83,0

Đối chứng: Mỗi mẫu có một mẫu đối chứng. Mẫu đối chứng chỉ bao gồm bả thải agar và đệm

hoặc nước, lắc trong cùng điều kiện nhiệt độ và thời gian như mẫu xử lý.

71

Hình 3.4. Khả năng thủy phân bã thải agar của cellulase ngoại bào từ chủng Li và B505

Hình 3.5. Khả năng thủy phân bã thải agar của hỗn hợp cellulase ngoại bào

từ 4 chủng (B505, B26, Li, CFd)

Từ các kết quả phân tích ở trên bảng 3.7, hình 3.7, hình 3.8cho thấy enzyme

cellulase ngoại bào của 2 chủng Li và B505 có khả năng thủy phân bã agar rất tốt và

hiệu quả hơn khi sử dụng hỗn hợp của 4 enzym ngoại bào mạnh nhất đã sàng lọc

được.Hiệu quả thủy phân bã gar của hai chủng Li và B505 cũng dễ dàng nhận ra bằng

cảm quan. Các mẫu bã agar bị loãng ra khi bổ sung enzym cellulase của chủng Li và

B505 so với mẫu đối chứng.

Điều này cho thấy khả năng ứng dụng của hai chủng vi khuẩn B. subtilis VTCC-

B-505 và B. lichenformis (Li) này để xử lý bã agar trong công nghiệp là rất khả thi.

72

3.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy 2 chủng vi khuẩn B.

Subtilis VTCC B-505 và B. Lichenformis (Li) và ứng dụng thủy phân bã rong câu

(G. Verrucosa) sau sản xuất Agar

3.3.1. Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi sản xuất enzyme cellulase

từ 2 chủng B505 và Li

3.3.1.1. Lựa chọn môi trường nuôi cấy

Tiến hành 2 lô thí nghiệm mỗi lô 6 thí nghiệm nuôi cấy vi khuẩn sinh cellulase

trên các môi trường nuôi cấy khác nhau: bột đậu tương, bột gạo, nước mắm, môi trường

giàu chất khoáng và so sánh với môi trường quy mô phòng thí nghiệm (môi trường MT1,

MT1’, MT2, MT2’, MT3, MT4, MT5, MT6). Lô 1 nuôi cấy chủngvi khuẩn B. subtilis

VTCC-B-505 và Lô 2 nuôi cấy chủng B. lichenformis (Li). Sau khi nuôi cấy đánh giá

khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulose bằng phương pháp đo mật độ quang

học (OD) của dịch nuôi cấy trên máy so màu quang phổ ở bước sóng 620nm. Và xác

định hoạt tính cellulase bằng phương pháp khuếch tán trên thạch có cơ chất CMC. 0,2ml

dịch enzyme thô nhỏ vào các giếng thạch có đường kính 10mm, ủ ở 300C, sau 24 giờ

tráng lên đĩa dịch lugol, đo vòng phân hủy trong suốt không bắt màu thuốc nhuộm xung

quanh giếng thạch. Kết quả trình bày trong bảng 3.8÷ 3.9, và hình 3.9 ÷ 3.10.

Hình 3.6. Hình ảnh về vòng thủy phân của cellulase từ chủng B505 nuôi trong các

môi trường khác nhau

MT1

MT1, MT 3

MT4 MT5

MT 6

73

Bảng 3.8. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng B505 nuôi

trong các môi trường khác nhau

STT Môi trường OD (620 nm) Đường kính vòng thủy phân

CMC (cm)

1 MT1 1,62 0,88

2 MT1’ 2,38 0,9

3 MT3 1,49 0,8

4 MT4 0,98 0,67

5 MT5 1,38 0,9

6 MT6 0,82 0,78

Bảng 3.9. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng Li nuôi cấy

ở các môi trường khác nhau

STT Môi trường OD (nm) Đường kính vòng thủy phân

CMC (cm)

1 MT2 2,56 0,9

2 MT2’ 1,13 0,88

3 MT3 1,11 0,78

4 MT4 0,7 0,88

5 MT5 0,94 1,12

6 MT6 0,36 0,78

74

Hình 3.7. Hình ảnh về vòng thủy phân của cellulase từ chủng vi khuẩn Li nuôi

trong các môi trường khác nhau

Từ các kết quả phân tích ở trên bảng 3.8÷ 3.9 và các hình 3.9 ÷ 3.10 cho thấy:

+ Về hoạt tính cellulase của chủng B. subtilis VTCC-B-505: Kết quả bảng 3.8,

hình 3.9 cho thấy ở điều kiện dinh dưỡng trong môi trường MT1’ và MT5 chủng B505

có khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase cao nhất có đường kính vòng thủy

phân là 0,9 cm cao gấp 1,02 lần so với MT1; cao gấp 1,125 lần so với MT3; 1,37 lần so

với MT4 và cao gấp 1,153 lần so với MT6. Môi trường nuôi cấy nuôi cấy vi khuẩn hỗn

hợp của nhiều thành phần có thể đáp ứng yêu cầu về dưỡng chất như nguồn C, nguồn

N, vitamin, khoáng. Môi trường MT1’ (CMC 2g; CaCl2 0,2g; NaCl 2g; Cao thịt 1g,

nước cất 1lit) có nguồn C và nguồn N từ môi trường tổng hợp nên giá thành cao. Còn

môi trường nuôi cấy MT5: (CMC 2g; bột đậu tương 2g, bột gạo 2g; NH4Cl 0,4g,

KH2PO4 0,6g; K2HPO4 1g; nước cất 1lit) có nguồn C và nguồn N từ môi trường tự nhiên

là bột đậu tương, bột gao và có giá thành rẻ hơn. Do đó để sản xuất quy mô lớn, môi

trường nuôi cấy MT5: (CMC 2g; bột đậu tương 2g, bột gạo 2g; NH4Cl 0,4g, KH2PO4

0,6g; K2HPO4 1g; nước cất 1lit) là môi trường kinh tế hơn môi trường MT1’.

+ Về hoạt tính cellulase của chủng B. lichenformis (Li): Kết quả nghiên cứu

trình bày ở bảng 3.9 và hình 3.10 cho thấy ở điều kiện dinh dưỡng trong môi trường

MT5 (CMC 2g; bột đậu tương 2g, bột gạo 2g; NH4Cl 0,4g, KH2PO4 0,6g; K2HPO4 1g;

nước cất 1lit) chủng Li có khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase cao nhất có

MT2

MT2’

MT3

MT4

MT5 MT6

75

đường kính vòng thủy phân là 1,12 cm cao gấp 1,24 lần so với MT2; cao gấp 1, 27 lần

so với MT2’ và MT4; và cao gấp 1,33 lần so với MT3 và MT6.

Như vậy môi trường MT5 là môi trường thích hợp cho cả hai chủng Li và B505,

trên cơ sở đó đề tài đã tiến hành xác định các điều kiện nuôi cấy tối ưu của 2 chủng vi

khuẩn Bacillus subtilis VTCC-B-505 và Bacillus lichenformis (Li).

3.3.1.2.Xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu

Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát

triển của vi khuẩn. Vì vậy thí nghiệm tiến hành khảo sát khả năng sinh trưởng và tiết

cellulase ngoại bào của 2 chủng B505 và Li ở nhiệt độ 25, 30, 35, 40, 45 và 50ºC. Kết

quả trình bày trong bảng 3.10 và hình 3.11.

250C

300C

35oC

40ºC

45ºC

Hình 3.8. Khả năng sinh trưởng và vòng hoạt tính của chủng B505 và chủng Li

tại các nhiệt độ khác nhau

B505 Li Li B505

Li B505 B505 Li Li B505

76

Bảng 3.10. Khả năng sinh trưởng và vòng hoạt tính của chủng B505 và chủng Li

tại các nhiệt độ khác nhau

STT

Nhiệt độ

(0C)

Chủng B505 Chủng Li

OD (nm) Vòng hoạt tính (cm) OD(nm) Vòng hoạt tính (cm)

1 25 2,206 0,68 0,969 0,65

2 30 2,321 0,85 1,125 0,9

3 35 2,38 0,75 0,905 0,75

4 40 2,2 0,78 1,027 0,8

5 45 2,12 0,80 1,14 1,1

6 50 2,1 0,75 1,1 1,0

Nhiệt độ của môi trường cũng có ảnh hưởng rất lớn đối với sự sinh trưởng của vi

sinh vật. Trên thực tế, do vi sinh vật thường là các sinh vật đơn bào cho nên chúng rất

mẫn cảm với sự biến hóa của nhiệt độ, và thường bị biến hóa cùng với sự biến hóa về

nhiệt độ của môi trường. Trong phạm vi nhiệt độ thấp, khi nhiệt độ tăng lên sẽ làm tăng

tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật, vì các phản ứng trong tế bào đều tăng cho nên toàn

bộ hoạt động trao đổi chất sẽ tăng lên khi nhiệt độ cao hơn, và vi sinh vật sẽ sinh trưởng

nhanh hơn. Lúc nhiệt độ tăng lên đến một mức độ nhất định thì nhiệt độ càng tăng tốc

độ sinh trưởng càng giảm. Khi nhiệt độ tăng quá cao vi sinh vật sẽ chết. Khi nhiệt độ

quá cao sẽ gây ra sự biến tính của enzym, của các thể vận chuyển (transport carriers) và

các protein khác. Màng sinh chất sẽ bị tổn thương vì hai lớp lipid sẽ bị hòa tan, tế bào

bị tổn thương đến mức khó hồi phục và dẫn đến việc ức chế sinh trưởng. Qua kết quả

trên cho thấy các chủng vi khuẩn sẽ sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở trong khoảng

nhiệt độ thích hợp.

Từ các phân tích ở trên cho thấy, nhiệt độ thích hợp cho chủng B505 sinh trưởng

và tiết cellulase là 300C và nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn Li sinh trưởng phát triển,

sinh cellulase 450C.

3.3.1.3. Xác định pH nuôi cấy tối ưu

pH cũng là một trong các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng

và phát triển của vi khuẩn. Vì vậy chúng tôi nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của pH đến

77

khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào. Kết quả trình bày trong bảng 3.11 và

hình 3.12.

Bảng 3.11. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase của chủng B505 và chủng Li ở

các pH khác nhau

STT

pH Chủng B505 Chủng Li

OD (nm) Vòng hoạt tính (cm) OD (nm) Vòng hoạt tính (cm)

1 4 0,97 0,2 1,87 0,25

2 5 1,05 0,3 2,26 0,5

3 6 1,37 0,4 2,11 0,4

4 7 1,63 0,47 1,97 0,37

5 8 1,13 0,3 1,87 0,48

B505

Li

Hình 3.9. Vòng hoạt tính cellulase của chủng B505 và chủng Li nuôi cấy ở các pH

khác nhau

pH có ảnh hưởng rõ rệt đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật. Mỗi vi sinh vật

đều có một phạm vi pH sinh trưởng nhất định và pH sinh trưởng tốt nhất. Phần lớn vi

khuẩn và động vật nguyên sinh là ưa trung tính là pH 5,5-8,0.

Kết quả ở bảng 3.11 và hình 3.9 cho thấy khả năng tiết cellulase ngoại bào của

chủng B505 và chủng Li cũng chịu ảnh hưởng của các nồng độ pH khác nhau một cách

rõ rệt. Chủng B505 nuôi ở môi trường pH 7 tiết cellulase mạnh nhất trong khi đó chủng

7

4

5 8

6

5

6

8

7

4

78

Li tiết cellulase mạnh nhất khi nuôi trong môi trường có pH 5

3.3.1.4. Thời gian nuôi cấy tối ưu

Thời gian nuôi cấy cũng là một trong những nhân tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng

và khả năng sinh enzyme của các chủng vi khuẩn. Trong quá trình nuôi cấy và xác định

hoạt tính của B. subtilis VTCC-B-505 và B. lichenformis (Li) được theo dõi ở các mốc

thời gian được trình bày ở bảng 3.12 ÷ 3.13 và hình 3.13 ÷3.14.

Bảng 3.12. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng Li theo

thời gian nuôi cấy

STT Thời gian (giờ) Li

OD (620 nm) Hoạt tính cellulase tương đối (%)

1 24 0,502 88,9

2 48 0,797 97,8

3 60 0,828 100

4 72 0,769 97,8

5 96 0,804 97,8

Biểu đồ 3.4. Hoạt tính cellulase ngoại bào của chủng Li theo thời gian nuôi cấy

60

70

80

90

100

24 48 60 72 96

Họ

a tí

nh t

ươ

ng đ

ối

(%)

Thời gian nuôi cấy (h)

79

Bảng 3.13. Khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chủng B505 theo

thời gian nuôi cấy

STT Thời gian (giờ) B505

OD (620 nm) Hoạt tính cellulase tương đối (%)

1 8 0,3412 62,1

2 24 0,4215 73,4

3 48 0,5287 93,6

4 60 0,5594 99

5 72 0,5721 100

6 96 0,5854 99,6

Biểu đồ 3.5. Sự thay đổi hoạt tính cellulase của chủng B505 theo thời gian nuôi cấy

Từ các kết quả phân tích ở các bảng 3.12 ÷ 3.13 và hình 3.13 ÷3.14 cho thấy chủng

Li sau 60 giờ nuôi cấy tiết cellulase ngoại bào mạnh nhất và sau 60 giờ nuôi cấy chủng

B505, enzyme CMCase ngoại bào thô thu được có hoạt tính đạt 99 % so với hoạt tính

enzyme CMCase ngoại bào thu được tại 72 giờ nuôi cấy. Như vậy 60 giờ nuôi cấy chủng

B505 thu dịch enzyme cho hiệu quả kinh tế cao nhất, tiết kiệm được giá thành sản xuất.

60

70

80

90

100

24 48 60 72 96

Ho

ạt t

ính t

ươ

ng đ

ối

của

cell

ula

se

(% s

o v

ới

cực

đại

)

Thời gian nuôi cấy (giờ)

80

Các kết quả nghiên cứu ghi nhận được như sau: các điều kiện tối ưu cho sinh

trưởng và sinh cellulase có hoạt tính của 2 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis VTCC-B-

505 và Bacillus lichenformis (Li), môi trường MT5; pH 5-7; nhiệt độ 30 – 450C, thời

gian 60 phút.

3.3.2. Đề xuất quy trình nuôi cấy và thu nhận chế phẩm cellulase thô

Từ những kết quả nghiên cứu ở trên, đề tài đưa ra quy trình nuôi cấy và thu nhận

sinh khối enzym thô từ chủng B. substilis VTCC-B-505 hoặc chủng Bacillus

licheniformis Li.

A. Quy trình nuôi cấy và thu nhận sinh khối enzym thô từ chủng B. substilis VTCC-

B-505

Sơ đồ 3.1. Quy trình thu nhận chế phẩm cellulase thô từ chủng B. substilis VTCC-

B-505

Nhân giống cấp 1

(pH=5; T=12-14h; to=28oC)

Nhân giống cấp 2

(pH= 5; T=12-14h; to = 28oC)

Thu nhận dịch cellulase ngoại bào

(Ly tâm 12000 v/ph; T= 10 ph; to = 4oC)

Chế phẩm cellulase ngoại bào thô

(B505 hoạt độ 72 UI/ml;

Giống vi sinh vật

VTCC-B-505 và Li

Lên men

(B505: T= 60h, to = 30oC, 200v/ph;

81

* Thuyết minh quy trình:

+ Giống vi sinh vật

Chủng giống B. substilis VTCC-B-505 là chủng vi khuẩn Việt Nam được phân

lập từ đất và được lưu giữa tại Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật - Viện Vi sinh vật và

Công nghệ Sinh học.

Chủng giống vi sinh vật được bảo quản trong ống thạch nghiêng giữ ở nhiệt độ 40C.

+ Nhân giống

- Nhân giống cấp 1

Giống được cấy từ ống thạch nghiêng vào 5ml môi trường lỏng trong ống nghiệm.

+ Môi trường nhân giống chủngBacillus subtilis VTCC-B-505:

CMC 10g; Pepton 0.5g; Cao thịt 0.2g; NaCl 1g, Tinh bột 1g, Cao nấm men 0.2g,

Nước cất 1lít.

Môi trường nuôi cấy được thanh trùng ở 121ºC thời gian 20 phút.

Điều kiện nuôi cấy: lắc 200 vòng/phút ở 28ºC thời gian 12-14 giờ.

- Nhân giống cấp 2

Cấy chuyển 1% từ dịch nuôi cấy giống cấp 1 sang môi trường nhân giống cấp 2. Môi

trường và điều kiện nuôi cấy như môi trường và điều kiện nuôi cấy nhân giống cấp 1.

+ Lên men

- Môi trường lên men:

- Môi trường lên men chủng Bacillus substilis VTCC-B-505 (môi trường M1):

Thành phần môi trường M1: CMC 2g; bột đậu tương 2g, bột gạo 2g; NH4Cl 0,4g,

KH2PO4 0,6g; K2HPO4 1g; nước cất 1lít; pH 7,0. Môi trường nuôi được thanh trùng ở

121ºC trong 20 phút.

- Qui mô lên men: quy mô phòng thí nghiệm. 1 lit môi trường lên men trong bình

tam giác thể tích 5 lít.

- Tỉ lệ cấy giống:1% giống cấp 2 cấy chuyển vào môi trường lên men

Điều kiện lên men:

- Chủng vi khuẩn B505 lên men ở điều kiện nhiệt độ 30ºC, thời gian 60giờ; tốc độ

lắc 200v/phút.

82

+ Thu nhận dịch cellulase ngoại bào

Sau khi kết thúc lên men, dịch lên men được ly tâm để loại tế bào vi khuẩn và thu

dịch cellulase ngoại bào.

Điều kiện ly tâm: 12.000 vòng/phút, thời gian 10 phút, nhiệt độ 4ºC.

+ Chế phẩm cellulase ngoại bào thô B. substilis VTCC-B-505

Các chế phẩm cellulase ngoại bào thu được từ chủng B505 được bảo quản trong

tủ lạnh ở điều kiện nhiệt độ 4ºC (có bổ sung NaNO3 0,02% để diệt vi khuẩn). Chế phẩm

cellulase ngoại bào thô dùng để thủy phân bã thải từ sản xuất agar.Hoạt tính của chế

phẩm cellulase ngoại bào của chủng Bacillus substilis VTCCB-505: 72UI/ml.

B. Quy trình nuôi cấy và thu nhận sinh khối enzym thô từ chủng Bacillus

licheniformis Li.

Sơ đồ 3.2. Quy trình thu nhận chế phẩm cellulase thô từ chủng Bacillus

licheniformis Li.

Nhân giống cấp 1

(pH=5; T=12-14h; to=28oC)

Nhân giống cấp 2

(pH= 5; T=12-14h; to = 28oC)

Thu nhận dịch cellulase ngoại bào

(Ly tâm 12000 v/ph; T= 10 ph; to = 4oC)

Chế phẩm cellulase ngoại bào thô

Li hoạt độ 54 UI/ml

Giống vi sinh vật Li

Lên men

(Li: T= 72h, to = 45oC, 200v/ph)

83

* Thuyết minh quy trình:

+ Giống vi sinh vật

Chủng giống B. lichenformis Li được phân lập từ ruột tằm do Trung tâm Biolap

phân lập và cung cấp.

Chủng giống vi sinh vật được bảo quản trong ống thạch nghiêng giữ ở nhiệt độ 40C.

+ Nhân giống

- Nhân giống cấp 1

Giống được cấy từ ống thạch nghiêng vào 5ml môi trường lỏng trong ống nghiệm.

+ Môi trường nhân giống chủng Bacillus licheniformis Li:

CMC 10g, Tinh bột 1g, MgSO4 0.2g, NaHCO3 0.2g, K2HPO4 5g, CaCl2 0.2g, NaCl

0.2g, Pepton 2g, Nước cất 1lít.

Môi trường nuôi cấy được thanh trùng ở 121ºC thời gian 20 phút.

Điều kiện nuôi cấy: lắc 200 vòng/phút ở 28ºC thời gian 12-14 giờ.

- Nhân giống cấp 2

Cấy chuyển 1% từ dịch nuôi cấy giống cấp 1 sang môi trường nhân giống cấp 2. Môi

trường và điều kiện nuôi cấy như môi trường và điều kiện nuôi cấy nhân giống cấp 1.

+ Lên men

- Môi trường lên men:

- Môi trường lên men chủng Bacillus licheniformis Li (môi trường M2): Thành

phần môi trường M2: CMC 2g; bột đậu tương 2g, bột gạo 2g; NH4Cl 0,4g, KH2PO4

0,6g; K2HPO4 1g; nước cất 1lit; pH 5,0. Môi trường lên men được thanh trùng ở 121ºC

trong 20 phút.

- Qui mô lên men: quy mô phòng thí nghiệm. 1 lit môi trường lên men trong bình

tam giác thể tích 5 lít.

- Tỉ lệ cấy giống: 1% giống cấp 2 cấy chuyển vào môi trường lên men

Điều kiện lên men:

- Chủng vi khuẩn Li lên men ở điều kiện nhiệt độ 45ºC, thời gian 60 giờ,

84

+ Thu nhận dịch cellulase ngoại bào

Sau khi kết thúc lên men, dịch lên men được ly tâm để loại tế bào vi khuẩn và thu

dịch cellulase ngoại bào.

Điều kiện ly tâm: 12.000 vòng/phút, thời gian 10 phút, nhiệt độ 4ºC.

+ Chế phẩm cellulase ngoại bào thô

Các chế phẩm cellulase ngoại bào thu được từ chủng Li được bảo quản trong tủ

lạnh ở điều kiện nhiệt độ 4ºC (có bổ sung NaNO3 0,02% để diệt vi khuẩn). Chế phẩm

cellulase ngoại bào thô dùng để thủy phân bã thải từ sản xuất agar. Hoạt tính của chế

phẩm cellulase ngoại bào của chủng Bacillus lichenformis Li: 54 UI/ml.

3.3.3. So sánh đánh giá hoạt tính cellulase của chủng Li và B505 với chế phẩm

cellulase từ các VSV khác

So sánh hoạt tính cellulase ngoại bào của 2 chủng Li và B505 với enzym ngoại bào

của 2 chủng nấm Tricoderma và Aspergillus và enzym cellulase của chủng Bacillus T3

do Viện Công nghệ Sinh học cung cấp bằng phương pháp xác định hoạt tính cellulase

trên môi trường chứa cơ chất CMC (môi trường tối ưu để phát hiện enzym Cx) và môi

trường cell có bổ sung bột giấy (môi trường tốt cho enzym C1 hoạt động). Kết quả được

trình bày ở bảng 3.14 ÷ 3.15 và hình 3.16 ÷ 3.20.

Hình 3.10. Đường kính vòng thủy phân của cellulase từ Li, B505 và T3 trên đĩa

thạch có cơ chất CMC 0,2%

85

Hình 3.11. Đường kính vòng thủy phân

cellulase từ Tricoderma trên đĩa thạch có

cơ chất CMC 0,2 %

Hình 3.12. Hoạt tính cellulase Aspergillus

trên đĩa thạch có cơ chất CMC 0,2 %

Ghi chú: Mẫu 1: Cellulase từ A. niger nuôi trên môi trường Cell; Mẫu 2: Cellulase

từ T. konigii nuôi trên môi trường Cell; Mẫu 3: Cellulase từ A. niger nuôi trên môi trường

Zapek; Mẫu 4: Cellulase từ T. konigii nuôi trên môi trường Zapek; Mẫu 5: Cellulase từ

T. konigii nuôi trên môi trường riêng cho chủng; Mẫu 6: Cellulase từ A. niger nuôi trên

môi trường riêng cho chủng.

Bảng 3.14. So sánh hoạt tính cellulase từ 5 chủng VSV (A. niger, T. konigii, Li,

B505 và T3) trên đĩa thạch có CMC 0,2%

STT Nguồn cellulase Đường kính vòng

thủy phân CMC(cm)

1 Cellulase từ A. niger nuôi trên môi trường Cell 0,1

2 Cellulase từ T. konigii nuôi trên môi trường Cell 0,2

3 Cellulase từ A. niger nuôi trên môi trường Zapek 0,1

4 Chủng T. konigii nuôi trên môi trường Zapek 0,2

5 Cellulase từ T. konigii nuôi trên môi trường riêng cho chủng 0,1

6 Cellulase từ A. niger nuôi trên môi trường riêng cho chủng 0,2

7 Cellulase từ B. substilis VTCC-B-505 0,65

8 Cellulase từ B. lichenformis Li 0,6

9 Cellulase từ Bacillus T3 0,7

86

Ghi chú: Mẫu 1: Cellulase từ A. niger nuôi trên môi trường Cell; Mẫu 2: Cellulase từ T.

konigii nuôi trên môi trường Cell;

Mẫu 3: Cellulase từ A. niger nuôi trên môi trường Zapek; Mẫu 4: Cellulase từ T.

konigii nuôi trên môi trường Zapek;

Mẫu 5: Cellulase từ T. konigii nuôi trên môi trường riêng cho chủng; Mẫu 6:

Cellulase từ A. niger nuôi trên môi trường riêng cho chủng.

Hình 3.14. Hình ảnh về đường kính vòng thủy phân cellulase từ Li, B505 và T3

trên đĩa thạch có cơ chất bột giấy 0,2 %

Hình 3.13. Hoạt tính cellulase của 2 chủng nấm Tricoderma và Aspergillus nuôi ở

các môi trường khác nhau trên đĩa thạch có chứa cơ chất bột giấy 0,2 %.

87

Bảng 3.15. So sánh hoạt tính cellulase từ 5 chủng VSV (A. niger, T. konigii, Li,

B505 và T3) trên đĩa thạch có cơ chất bột giấy 0,2%

STT Nguồn cellulase

Đường kính vòng thủy

phân bột giấy (cm)

1 Cellulase từ A. niger nuôi trên môi trường Cell 0,2

2 Cellulase từ T. konigii nuôi trên môi trường Cell 1,4

3 Cellulase từ A. niger nuôi trên môi trường Zapek 0,8

4 Chủng T. konigii nuôi trên môi trường Zapek 1,6

5 Cellulase từ T. konigii nuôi trên môi trường riêng cho

chủng 1,5

6 Cellulase từ A. niger nuôi trên môi trường riêng cho

chủng

0,6

7 Cellulase từ B. substilis VTCC-B-505 1,2

8 Cellulase từ B. lichenformis Li 1,3

9 Cellulase từ Bacillus T3 1,3

Từ các phân tích ở 3.14 ÷ 3.15 và hình 3.19 ÷ 3.22 cho thấy:

Về hoạt tính cellulase của 5 chủng VSV trên đĩa thạch có cơ chất CMC 0,2%

Kết quả phân tích ở hình 3.19, 3.20 và bảng 3.14 cho thấy 2 chủng nấm Aspergillus

niger, Tricoderma konigii mặc dù được nuôi cấy ở các điều kiện môi trường tối ưu cho

nấm nhưng hoạt tính cellulase (Cx) thủy phân cơ chất CMC vẫn yếu hơn 3 chủng vi

khuẩn B505, Li và T3. Enzym Cx của chủng B505 có hoạt tính gần tương đương với

hoạt tính Cx của chủng T3 (một chủng Bacillus sinh cellulase đã được sử dụng trong

chế phẩm của Viện Công nghệ Sinh học). Như vậy chủng B505 và chủng Li tiết ra 2

enzym cellulase Cx ngoại bào mạnh hơn rất nhiều so với cellulase ngoại bào của 2 chủng

nấm Tricoderma và Aspergillus.

Về hoạt tính cellulase của 5 chủng VSV trên đĩa thạch có cơ chất bột giấy

0,2%

Kết quả hình 3.20; 3.21 và bảng 3.15 cho thấy chủng nấm Tricoderma konigii nuôi

trên môi trường Zapek cho hoạt tính cellulase ngoại bào thủy phân bột giấy mạnh nhất.

88

Tuy nhiên 2 chủng vi khuẩn B505, Li cũng sinh cellulase ngoại bào thủy phân bột giấy

mạnh gần bằng chủng nấm Tricoderma konigii. Các số liệu thu được cũng phù hợp với

các kết quả của các tác giả khác, cellulase của các chủng nấm thường có hoạt tính C1

cao hơn, trong khi đó hoạt tính Cx thấp hơn cellulase của các chủng vi khuẩn [24], [63].

Như vậy 3 chủng vi khuẩn T3, B505 và Li là có khả năng thủy phân cơ chất CMC

và bột giấy có hiệu quả cao. Việc nuôi cấy vi khuẩn thu chế phẩm enzym thường đơn

giản và rẻ tiền hơn so với nuôi cấy các chủng nấm. Trong nhóm vi khuẩn, các chủng

thuộc chi Baccillus luôn chiếm ưu thế (87%) khi ứng dụng vào xử lý phế thải , bởi các

chủng này là những vi khuẩn ưa nhiệt và sinh bào tử nên có khả năng tồn tại và sinh

trưởng tốt trong các đống ủ phế thải có nhiệt độ cao [56].

Giá thành để sản xuất 1lit chế phẩm enzym thô ở dạng lỏng mà đề tài nghiên cứu

cần 40.000 ÷45.000 đồng. Trong khi đó chế phẩm cellulase thô do Công ty Phát triển

Sinh học 186 Ngô Gia Tự, Hà Nội sản xuất giá 250.000 đồng/1 lit chế phẩm. Các chế

phẩm cellulase nhập ngoại thì giá thành rất cao, không thể sử dụng để thuỷ phân bã thải

agar đại trà. Việc nghiên cứu thu nhận enzym cellulase từ vi sinh vật giúp đề tài có thể

chủ động trong khâu thu nhận enzym, giá thành sản xuất lại rẻ hơn so với enzym thương

mại được sản xuất trong nước.

Từ kết quả phân tích ở trên cho thấy cellulase từ hai chủng B505 và Li có hoạt

tính Cx và C1 cao so với cellulase từ các chủng nấm Aspergillus niger, Tricoderma

konigii, không kém chủng T3 trong chế phẩm của Viện Công nghệ sinh học. Như vậy có

thể sử dụng từng chủng B505 hoặc Li riêng biệt, hay đồng thời cả hai chủng để thu nhận

cellulase làm chế phẩm sinh học để thuỷ phân bã thải agar cho hiệu quả cao. Việc

nghiên cứu thu nhận các enzym cellulase có khả năng thủy phân bã agar từ 2 chủng

B505 và Li giúp chủ động trong khâu thu nhận enzym, giá thành sản xuất rẻ hơn nhiều

so với enzym thương mại được sản xuất trong nước.

3.3.4. Nghiên cứu thủy phân bã thải rong sau sản xuất agar bằng enzyme cellulase

từ hai chủng vi khuẩn B 505 và Li

3.3.4.1. Tối ưu hóa quá trình thủy phân bã rong bằng cellulase vi khuẩn

Trên cơ sở thí nghiệm thăm dò để chọn vùng ảnh hưởng của các yếu tố (nồng độ

enzyme so với cơ chất, thời gian thuỷ phân, pH, nhiệt độ) đến quá trình thủy phân, tiến

89

hành tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng, sử dụng mô hình thiết kế Box-

Behnken quá trình thủy phân bã thải agar với các thông số biên như sau: nồng độ enzyme

với cơ chất (1% - 3%), thời gian thủy phân (24 ÷ 48 giờ), nhiệt độ 40 ÷ 600C. Cố định

các yếu tố: pH 5,5. Kết quả tối ưu hóa được thể hiện trong bảng 3.16 ÷ 3.19 và hình 3.23

÷ 3.24.

Bảng 3.16. Kết quả thí nghiệm của mô hình Box-Behnken

STT

Thời gian

(giờ) Tỷ lệ E/S (%)

Nhiệt độ

(0C)

Hàm lượng đường

tổng số (mg/g)

1 24 1 50 2,05

2 48 1 50 2,64

3 24 3 50 2,61

4 48 3 50 2,76

5 24 2 40 2,61

6 48 2 40 2,69

7 24 2 60 2,59

8 48 2 60 2,98

9 36 1 40 2,34

10 36 3 40 2,98

11 36 1 60 2,57

12 36 3 60 2,94

13 36 2 50 2,92

14 36 2 50 2,91

15 36 2 50 2,78

16 36 2 50 2,56

17 36 2 50 2,67

Bảng 3.17. Kết quả xử lý số liệu trên phần mềm DX6

90

Source Sum of

Squares df

Mean

Square F Value

p-value

Prob > F

Model 0.81 9.00 0.09 5.28 0.0196 significant

A - Thời gian 0.18 1.00 0.18 10.69 0.0137

B - Nồng độ E 0.36 1.00 0.36 20.86 0.0026

C - Nhiệt độ 0.03 1.00 0.03 1.55 0.2538

AB 0.05 1.00 0.05 2.83 0.1365

AC 0.02 1.00 0.02 1.40 0.2748

BC 0.02 1.00 0.02 1.06 0.3364

A2 0.06 1.00 0.06 3.63 0.0984

B2 0.07 1.00 0.07 4.25 0.0781

C2 0.02 1.00 0.02 1.24 0.3022

Residual 0.12 7.00 0.02

Lack of Fit 0.02 3.00 0.01 0.33 0.8081

not

significant

Pure Error 0.10 4.00 0.02

Cor Total 0.93 16.00

Kết quả thí nghiệm cho thấy có mối liên hệ hàm bậc 2 giữa hàm lượng đường tổng

số (mg/kg) với thời gian thủy phân (giờ), nồng độ Enzyme so với cơ chất (%) và nhiệt

độ thủy phân (0C) (P F lack of fit = 0,8081).

Y= 2,77 + 0,15 X1 + 0,21X2 + 0,058X3 - 1,12X12 - 0,13X2

2 + 0,071 X32 – 0,11X1X2

+ 0,078 X1X3 – 0,068 X2X3

Trong đó: Y: hàm lượng đường tổng số (mg/g)

X1: Thời gian thủy phân (giờ)

X2: Tỷ lệ hỗn hợp enzyme so với cơ chất (%)

X3: Nhiệt độ (0C).

91

Kết quả xử lý thống kê cho thấy trong khoảng nghiên cứu hai yếu tố ảnh hưởng

đến hàm lượng đường tổng số (mg/g) là thời gian thủy phân (p=0.0137) và nồng độ

enzyme so với cơ chất (p= 0,0026). Thời gian thủy phân và nồng độ enzyme càng tăng

thì hàm lượng đường tổng số (mg/g) càng tăng. Kết quả xử lý thống kê cũng cho thấy

nhiệt độ thủy phân ảnh hưởng không đáng kể đến quá trình thủy phân (p=0,2538), hay

nói cách khác trong khoảng nhiệt độ nghiên cứu từ 40 – 60 0C việc nhiệt độ thủy

phânkhông làm tăng hàm lượng đường tổng số (mg/g).

Hình 3.15. Đường đồng mức và bề mặt đáp ứng (3D) của hàm lượng đường tổng

số theo thời gian thủy phân và nồng độ enzyme

Kết quả dự đoán vùng tối ưu cho hàm lượng đường tổng số (mg/kg) được thể hiện

trên bảng 3.17 và hình 3.21. Kết quả chỉ ra một vùng tối ưu và hàm lượng đường tổng

số (mg/kg) là 2,98 (mg/kg).

Bảng 3.18. Kết quả dự đoán tối ưu cho tỷ lệ Naa/Nts theo mô hình Box-Behnken

Điểm

tiên

đoán

Thời gian

thủy phân

(giờ)

Nồng độ Enzyme so

với cơ chất (%)

Nhiệt độ

(0C)

Hàm lượng

đường tổng số

(mg/g)

1 41,57 2,40 59,48 2,98184

2 42,90 2,60 59,89 2,9869

3 45,53 2,33 59,07 2,98437

4 46,14 2,28 59,01 2,98327

5 34,19 3,00 40,00 2,93145

92

Hình 3.16. Đường đồng mức và bề mặt đáp ứng (3D) tiên đoán hàm lượng đường

tổng số theo thời gian thủy phân và nồng độ enzyme

Từ bảng 3 chọn được thí nghiệm tối ưu cho quá trình thủy phân là mẫu 7 tương

ứng với chế độ thủy phân là: thời gian thủy phân 42 giờ, nồng độ enzyme so với cơ chất

2,6% và nhiệt độ là 60 0C. Trên cơ sở các điểm tiên đoán từ mô hình, tiến hành thí

nghiệm để kiểm chứng. Kết quả thí nghiệm kiểm chứng được trong bảng 3.19.

Bảng 3.19. Kết quả kiểm chứng tối ưu theo tiên đoán và thực nghiệm

Điểm tiên

đoán

Thời gian

thủy phân

(giờ)

Tỷ lệ enzyme (%) Nhiệt độ

(0C)

Hàm lượng

đường tổng số

(mg/g)

Điểm tiên

đoán 42,90 2,60 59,89 2,9869

Thực

nghiệm 42,90 2,60 59,89 2,68 ± 0,09

Kết quả kiểm chứng thực nghiệm cho thấy có sự tương thích giữa lý thuyết và thực

nghiệm. Hàm lượng đường tổng số 2,68 ± 0,09 (%) khi thủy phân bã thải agar bằng chế

phẩm enzyme thô ở nhiệt độ 600C, pH = 5,5 thời gian thủy phân 42 giờ, tỷ lệ hỗn hợp

enzyme so với cơ chất 2,6 %. Kết quả đánh giá cảm quan cho thấy bã rong mềm, bóp

93

nhẹ thì bã rong nát, màu nâu sáng, mùi tanh của rong. Sản phẩm thủy phân protein thu

được từ bã thải agar có thể được sử dụng để phối trộn sản xuất thức ăn chăn nuôi.

Từ các phân tích ở trên cho phép chọn các thông số tối ưu cho hoạt động thủy

phân bã rong sau sản xuất agar: nhiệt độ thích hợp 600C, pH tối thích 5,5, thời gian

thủy phân thích hợp 42 giờ, tỷ lệ enzyme là 2,6 %.

3.3.4.2. Đề xuất quy trình thủy phân bã rong bằng cellulase từ vi khuẩn

Từ các kết quả nghiên cứu trên đề tài rút ra quy trình sản xuất chế phẩm thủy phân

bã rong dạng bột như sau:

Sơ đồ 3.3. Quy trình thủy phân bã rong bằng cellulase từ vi khuẩn

Thủy phân (pH=5,5; E/S= 2,6 %, to

= 60oC)

Phối trộn

Làm khô

Xay nghiền

Chế phẩm thủy phân bã rong dạng bột

Cám gạo (10%)

Enzym cellulase

Bã thải Agar

94

* Thuyết minh quy trình

+ Bã thải agar

Bã thải agar là bã thải của các cơ sở sản xuất agar (bả thải được lấy sau quá trình

xử lý và nấu chiết thu agar, bã thải agar được lọc bằng máy ép khung bản). Thành phần

bã thải agar là hàm lượng protein 3,26 ± 0,11%; hàm lượng cellulose 74,26 ± 4,68%;

hàm lương tro 12,28 ± 3,77 %

+ Thủy phân

Tiến hành thủy phân bã thải agar với độ pH thích hợp là 5,5, là nhiệt độ 600C, thời

gian thủy phân 42 giờ, tỷ lệ hỗn hợp enzyme so với cơ chất 2,6 %, bổ sung dung dịch

đệm acetat pH 5,5 (dd đệm/bã thải agar) 10%, thủy phân trong bình thủy phân dung tích

30 lít có khuấy đảo. Enzym cellulase sử dụng là chế phẩm cellulase ngoại bào thô thu

được từ 2 chủng Bacillus substilis B505 và Bacillus lichenformis Li được bảo quản trong

tủ lạnh ở nhiệt độ 4ºC.

+ Phối trộn

Bã thải agar sau khi thủy phân đem phối trộn với cám gạo theo tỷ lệ 10%/ bã thải

agar thủy phân. Cám gạo có màu trắng ngà, dạng bột. Thành phần của cám gạo protein

10- 13,3%, hàm lượng xơ thô 7,7-9,4%, lipit 12 - 15%. Phối trộn hỗn hợp trong máy

quấy đảo thời gian 2 –3 phút.

+ Làm khô

Sau khi phối trộn bã rong thủy phân làm khô trong tủ sấy đối lưu ở chế độ thời

gian 4 giờ, nhiệt độ sấy 70oC, độ dày 5 cm.

+ Xay nghiền

Sau khi sấy khô thì tiến hành xay nghiền bằng máy xay nghiền tạo sản phẩm dạng

bột. Độ mịn của sản phẩm là 1,0 – 1,5 mm.

+ Chế phẩm thủy phân dạng bột

Sản phẩm bã rong thủy phân dạng bột có màu vàng sáng, chế phẩm thủy phân dạng

bột có độ mịn và tơi, mùi đặc trưng của rong biển khô có hàm lượng protein 4,55 %, xơ

95

thô 23,12%, độ ẩm 12,97 %. Đóng gói sản phẩm trong túi ni lông, bảo quản ở nhiệt độ

phòng, nơi khô ráo, thoáng mát.

3.4. Thử nghiệm sử dụng chế phẩm thủy phân bã thải rong trong thức ăn nuôi cá

rô phi

3.4.1. Xây dựng công thức thức ăn nuôi cá rô phi

Công thức thức ăn nuôi cá rô phi được xây dựng dựa vào đặc điểm sinh học và nhu

cầu dinh dưỡng theo từng giai đoạn phát triển, nhu cầu protein và lipit của cá rô phi làm

chuẩn để thay đổi công thức thích hợp. Bên cạnh đó, việc tính toán các tỷ lệ cho phù

hợp để đáp ứng nhu cầu năng lượng và protein cho thức ăn nuôi cá rô phi cũng được

quan tâm.

Nguyên liệu thức ăn đưa vào phối trộn cũng được lựa chọn nguyên liệu từ các căn

cứ trên. Thêm vào đó, các nguyên liệu phối trộn đầu vào được tiến hành xác định thành

phần hóa học . Mặc khác, thành phần dinh dưỡng của công thức thức ăn phối trộn thức

ăn cho cá rô phi được tính toán dựa vào phần mềm WUFFF DA.

Bảng 3.20. Thành phần hóa học của các nguyên liệu phối trộn

WUFFF DA

Cost Min. Max. Weight Dry Matter M.E. Protein E.E. C18:3 C.F

ACTIVE INGREDIENT COMPOSITION MATRIX

Bột cá lạt 58% CP 21000 1 90.7 3.22 58.43 6.17 1.89

Đậu nành rang 35000 1 90.9 3.74 39.64 15.5 9.03

Bột mì 20000 1 89 1.3 15.7 3 1.7 11

Cám gạo mịn 8% 7000 1 89.8 2.45 12.57 7.36 6.48

Bã rong khô 4000 1 88.5 2.478

Hạt bắp vàng 9 %CP 7000 1 88.8 3.31 9.42 4.15 1.95

Premix KVTM 46284 0 0 1 96 0 0 0 0 0

Vitamin ADE 342000 0 0 1 96

Binder 60000 0 0 1 95

96

WUFFF DA

Calcium Total

Phos. Avail.Phos. K Cl Mn Na Zn Biotin Choline Folate

ACTIVE INGREDIENT COMPOSITION MATRIX

Bột cá lạt 58% CP 4.55 2.11 2.11 2.9

Đậu nành rang 0.27 0.63 0.21

Bột mì 0.14 1.15 0.34 1.19 0.06 113 0.05 133 0.48 1.88 1.2

Cám gạo mịn 8% 0.17 0.91 0.3

Bã rong khô

Hạt bắp vàng 9

%CP 0.14 0.37 0.12

Premix KVTM 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Vitamin ADE 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Binder 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

WUFFF DA

ARG GLY SER

GLY

&SER HIS ILE LEU LYS MET

ACTIVE INGREDIENT COMPOSITION MATRIX

Bột cá lạt 58% CP 2.95 3.91 1.87 5.78 1.41 1.94 3.82 3.8 1.39

Đậu nành rang 2.42 1.51 0.49 2 0.85 1.45 2.66 2.17 0.54

Bột mì 0.98 0.9 0.9 1.8 0.34 0.59 0.91 0.59 0.17

Cám gạo mịn 8% 0.74 0.36 0.43 0.79 0.18 0.33 0.68 0.27 0.27

Bã rong khô 0.09 0.22 0.24 0.461 0.14 0.41 0.645 0.314 0.183

Hạt bắp vàng 9 %CP 0.44 0.35 0.45 0.8 0.31 0.32 1.15 0.24 0.24

WUFFF DA

ARG CYS TSAA PHE TYR TAAA THR TRP VAL

ACTIVE INGREDIENT COMPOSITION MATRIX

Bột cá lạt 58% CP 2.95 0.55 1.94 1.61 2.1 3.71 0.21 0.56 2.38

Đậu nành rang 2.42 0.59 1.13 1.63 1.11 2.74 1.35 0.5 1.49

Bột mì 0.98 0.25 0.42 0.49 0.4 0.89 0.42 0.3 0.73

Cám gạo mịn 8% 0.74 0.22 0.49 0.44 0.38 0.82 0.3 0.1 0.47

Bã rong khô 0.43 0.24 0.19

Hạt bắp vàng 9 %CP 0.44 0.24 0.48 0.43 0.32 0.75 0.32 0.08 0.43

97

Từ kết quả phân tích thành phần của các nguyên liệu lựa chọn để phối trộn trong

các công thức thức ăn nuôi cá rô phi thì thây thành phần của của các nguyên liệu phối

trộn trong thức ăn nuôi có đầy đủ thành phần dinh dưỡng: protein, lipit, xơ, vitamin và

khoáng chất ,… Các nguồn nguyên liệu này rất nhiều, dễ kiếm, …., giá thành rẻ, ..,

không bị biến đổi chất lượng trong quá trình sản xuất thức ăn chăn nuôi.

3.4.2. Đề xuất quy trình sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi

Từ các kết quả nghiên cứu lựa chọn nguyên liệu phối trộn thức ăn, thử nghiệm phối

trộn theo các tỷ lệ tính toán của các công thức thức ăn có phối trộn tỷ lệ bã thải agar với tỷ

lệ khác nhau (Phụ lục IV), ép viên, sấy khô, phân tích thành phần dinh dưỡng của các công

thức phối chế, …, đề xuất quy trình sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi như sau:

Sơ đồ quy trình:

Sơ đồ 3.4. Quy trình sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi

Xử lý

Bã thải AgarNguyên liệu

Phối trộn

Ép viên

Sấy khô

Thức ăn nuôi cá

Enzym cellulase

Thủy phân

Chế phẩm bã thải agar thủy phân

98

Thuyết minh quy trình

1. Nguyên liệu

- Bột cá : bột cá loại I có hàm lượng Protein 55-60%, hàm lượng lipit : 4,92 -7,89%,

hàm lượng xơ thô 2,4 – 3,5% . Màu xám đen, mùi thơm nhẹ, vị hơi mặn, trạng thái mịn,

xốp. Nguyên liệu bột cá mua của Công ty TNHH chế biến Thủy sản – xuất nhập khẩu

Việt Trường.

- Bột đậu tương: hạt đậu tương được sấy chín ở 1300C trong 20-30 phút, rồi nghiền

mịn, có màu vàng nhạt, mùi thơm đặc trưng. Thành phần của đậu tương protein 38,4 -

42%, hàm lượng xơ thô 5,9-7,5%, lipit 16,3 -18,4%.

- Bột cám gạo :màu trắng ngà, dạng bột, mùi thơm. Thành phần của cám gạo

protein10- 13,3%, hàm lượng xơ thô 7,7-9,4%, lipit 12 - 15%.

- Bột ngô có màu vàng, dạng bột mịn, mùi thơm đặc trưng. Thành phần của cám

ngô protein 8- 9,8%, hàm lượng xơ thô 2,2-3%, lipit 4,0 – 5,1%.

- Rỉ mật: có màu nâu, trạng thái dịch keo sánh và có mùi thơm đặc trưng. Thành

phần của rỉ mật protein 11%, tro 7,5%.

- Ngoài ra còn có Premix khoáng, Vitamin tổng hợp (gồm Vitamin A, D3 E , K3

Vitamin B1, Vitamin B2 B6, B12, Vitamin C, axit Nicotinic, Calcium D- Pantothenate,

axit Folic , Cholin Chloride, Biotin, Fe, Cu, Co, Mg, Zn, Mn, I, Se,

Inositol, Methionin, lysin, sulfathiazole)

2. Bã thải agar

Bã thải agar là bã thải của công ty sản xuất agar (bả thải được lấy sau quá trình xử

lý và nấu chiết thu agar, bã agar được loại thải qua giai đoạn lọc bằng máy ép khung

bản). Thành phần bã thải agar có hàm lượng protein 3,26 ± 0,11%; hàm lượng cellulose

74,26 ± 4,68%; hàm lương tro 12,28 ± 3,77 %.

Thủy phân bã thải agar

Bã thải agar được tiến hành thủy phân với độ pH thích hợp là 5,5, nhiệt độ 48-50

ºC, thời gian 42 h, tỷ lệ enzyme celulase thô (E/S) 2,6 %, bổ sung dung dịch đệm acetat

pH 5,5 (dd đệm/S) 10%, thủy phân trong bình thủy phân có khuấy đảo. Enzym cellulase

99

sử dụng là chế phẩm cellulase ngoại bào thô thu được từ 2 chủng Bacillus substilis B505

và Bacillus lichenformis Li được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4ºC.

3. Xử lý nguyên liệu

Nguyên liệu sản xuất thức ăn nuôi cá rô phi phải được nghiền mịn: qua mắt sàng

có đường kính 1-1,5mm, độ mịn của nguyên liệu ảnh hưởng rất nhiều đến kết cấu, độ

tan của viên thức ăn, đặc biệt là khả năng tiêu hóa của thức ăn. Bột cá phải có độ đạm

đạt 53 – 57%, không có mùi ôi khét, mùi tanh tự nhiên của cá, không hôi thối. Cám ngô,

đậu tương, cám gạo phải được xử lý nhiệt để tạo tăng khả năng tiêu hóa của thức ăn và

tăng độ dẫn dụ mồi của thức ăn nuôi cá rô phi.

4. Phối trộn

Việc phối trộn các nguyên liệu bằng cách quấy đảo đều hỗn hợp bằng máy đảo

trộn. Bã thải agar sau khi thủy phân được phối trộn với rỉ mật, cám ngô, cám gạo, đậu

tương,....theo tỷ lệ công thức phối trộn 6 công thức thức ăn như sau:

Bảng 3.21. Thành phần nguyên liệu của các công thức thức ăn phối trộn bã rong

thủy phân.

STT Nguyên liệu CT 1 CT2 CT 3 CT 4 CT 5 CT6

1 Bột cá (%) 19,0 19,0 20,0 20,0 21,0 21,5

2 Bột đậu tương (%) 19,0 20,0 20,0 21,0 20,5 21,5

3 Bột mì (%) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

4 Bột cám gạo (%) 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0 16,0

5 Bột cám ngô (%) 34,75 28,75 22,75 16,75 11,25 8,75

6 Bã rong thủy phân

khô (%) 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0

7 Premix (%) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

8 Vitamin (%) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

9 Chất kết dính (%) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

100

5. Ép viên

Hỗn hợp sau khi đảo trộn đều đưa vào máy ép viên, tùy theo kích cỡ của cá mà

chọn mắt sàng cho phù hợp, cá cỡ 200 – 500g/con thì viên thức ăn có đường kính không

quá 4 mm. Trong quy mô sản xuất phòng thí nghiệm có thể sử dụng máy ép đùn trục vít

với mắt sàng từ 4 – 6 mm. Trong sản xuất công nghiệp sử dụng máy ép đùn với áp lực

cao để tạo viên thức ăn nổi với chế độ ép 150 ºC, áp suất 121,0 bar, tốc độ trục vít 250

rpm, tốc độ cắt 1000 vòng/phút, tốc độ nạp liệu 25 kg/h, hàm lượng nước 47%.

6. Sấy khô

Thức ăn được sấy khô ở nhiệt độ 70 – 80ºC, độ dày thức ăn 3 cm, đến khi độ ẩm

viên thức ăn vào khoảng 10 – 12%. Thiết bị sấy khô thức ăn là tủ sấy không khí đối lưu.

Thức ăn sau khi sấy khô được làm nguội và bao gói trong túi ni lông, bảo quản ở nơi

khô ráo, thoáng mát.

3.4.3. Điều kiện môi trường nuôi thử nghiệm cá rô phi

3.4.3.1. Điều kiện môi trường nước

Cá rô phi đơn tính có nhiều ưu điểm hơn so với cá rô phi thường, như lớn nhanh,

ăn tạp nên dễ nuôi. Khi nuôi loại cá này người nuôi có thể quyết định được cỡ cá thương

phẩm, kiểm soát được mật độ thả… Cá rô phi chịu ảnh hưởng rất lớn của các yếu tố môi

trường sống. Các yếu tố môi trường sống có tác động đến tốc độ sinh trưởng và phát

triển của cá thông qua những ảnh hưởng tới khả năng bắt mồi, khả năng tiêu thụ thức

ăn, khả năng đề kháng và miễn dịch với bệnh. Do đó quản lý môi trường nuôi tốt, thích

hợp và ổn định là rất cần thiết đặc biệt là trong các thí nghiệm. Dưới đây là các yếu tố

thủy lý, thủy hóa chủ yếu được theo dõi và quản lý trong suốt quá trình thí nghiệm.

101

Bảng 3.22. Dao động các yếu tố môi trường trong quá trình thí nghiệm

Descriptive Statistics

Minimum Maximum Mean Std. Deviation

Nhiệt độ sáng (oC) 26,5 29 27,99 0,51

Nhiệt độ chiều (oC) 27 29,5 28,61 0,57

DO sáng (mg/l) 4,5 6 5,23 0,29

DO chiều (mg/l) 5 6 5,40 0,36

pH sáng 6,6 7,4 7,04 0,21

pH chiều 7,2 7,8 7,49 0,16

3.4.3.2. Nhiệt độ nước

Nhiệt độ nước ao thí nghiệm được đo 2 lần trong ngày vào lúc 8 giờ và 14 giờ

bằng nhiệt kế thủy ngân. Kết quả được trình bày ở Hình 3.25.

Biểu đồ 3.6. Biến động nhiệt độ nước ao thí nghiệm nuôi cá rô phi.

Qua kết quả Hình 3.25 cho thấy nhiệt độ nước ao nuôi trong suốt quá trình thí

nghiệm có sự biến động nhẹ, dao động quanh mức 28 ± 0,5oC vào buổi sáng và 28,5 ±

0,6oC vào buổi chiều, sự biến thiên nhiệt độ trong quá trình thí nghiệm dao động từ 25,5

25,0

25,5

26,0

26,5

27,0

27,5

28,0

28,5

29,0

29,5

30,0

1 7

13

19

25

31

37

43

49

55

61

67

73

79

85

91

97

103

109

115

121

127

133

139

145

151

157

163

169

175

181

Nhiệ

t độ (

0C

)

Ngày

Nhiệt độ sáng (0C) Nhiệt độ chiều (0C)

102

– 29,5oC nằm trong ngưỡng nhiệt độ thích hợp cho cá rô phi. Do đó, nhiệt độ không ảnh

hưởng xấu đến hoạt động sống và bắt mồi của cá rô phi. Nhiệt độ nước được xem là một

trong những yếu tố ảnh hưởng lớn đến các loài thủy sản. Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp

đến hoạt động sinh lý của cá hoặc gián tiếp thông qua các yếu tố môi trường khác. Nhiệt

độ nước không những ảnh hưởng đến diễn biến các quá trình sinh thái thủy vực

(Kinniburgh, 1998), tác động đến chất lượng nước (Kennish, 1992) mà còn chi phối sức

khỏe của động vật thủy sản (Valiela, 1991; Swann, 1997). Vì vậy việc theo dõi biến

động nhiệt độ nước ao thí nghiệm là cần thiết để đánh giá ảnh hưởng của nó đến kết quả

thí nghiệm. Kock và Kramer (1994) cho rằng mỗi loài có một khoảng nhiệt độ tối ưu

riêng cho sự sống của chúng. Vì thế, nếu nhiệt độ vượt khỏi khoảng tối ưu này sẽ gây

bất lợi cho sinh trưởng và sinh lý của chúng.

3.4.3.3. Hàm lượng oxy hòa tan (DO)

Trong quá trình sống cá cần một lượng oxy nhất định để sống, để cung cấp cho

hoạt động trao đổi chất. Hàm lượng oxy là yếu tố quyết định đến hoạt động sống và sự

sinh trưởng của cá. Do đó hàm lượng oxy được kiểm tra hàng ngày trong quá trình thí

nghiệm đo bằng bộ test kit của Thái Lan . Kết quả được trình bày trong hình 3.26.

Biểu đồ 3.7. Biến động DO nước ao thí nghiệm nuôi cá rô phi

0

1

2

3

4

5

6

7

1 7

13

19

25

31

37

43

49

55

61

67

73

79

85

91

97

103

109

115

121

127

133

139

145

151

157

163

169

175

181

DO

(m

g/l

)

Ngày

DO sáng ( mg/l) DO chiều ( mg/l)

103

Kết quả phân tích ở hình 3.26 cho thấy oxy hòa tan trong nước ao chênh lệch

tương đối lớn giữa thời điểm 8 giờ và 14 giờ, DO vào buổi sáng dao động quanh mức

5,23 ± 0,29 mg/L và vào buổi chiều là 5,4 ± 0,36 mg/L. Sự biến đổi hàm lượng oxy nằm

trong ngưỡng thích hợp cho sự sinh trưởng của cá rô phi, dao động trong khoảng 4,5 –

6,0 (mg/l).

3.4.3.4. Độ pH

Độ pH cũng là một trong những yếu tố tác động mạnh đến đời sống của cá. Độ pH

quá cao hay quá thấp đều ảnh hưởng tới đời sống của cá và có thể gây chết cá. Độ pH

được đo bằng Test kit do Thái Lan sản xuất với độ chính xác là 0,3. Kết quả thí nghiệm

được trình bày ở Hình 3.27.

Biểu đồ 3.8. Biến động độ pH của nước ao thí nghiệm

Theo kết quả ở Hình 3.27 cho thấy, pH của nước ao cũng biến động trong khoảng

thuận lợi cho sự phát triển của cá, với dao động ngày đêm không quá lớn, cụ thể là quanh

mức 7,0 ± 0,2 vào buổi sáng và 7,5 ± 0,2 vào buổi chiều. Khoảng biến động của pH như

vậy đều nằm trong khoảng thích hợp (6,6 đến 7,8) cho hầu hết các loài cá nuôi sinh

trưởng (Mason, 2001).

06

06

06

07

07

07

07

07

08

08

08

1 7

13

19

25

31

37

43

49

55

61

67

73

79

85

91

97

103

109

115

121

127

133

139

145

151

157

163

169

175

181

Độ p

H

Ngày

pH sáng pH chiều

104

3.4.4. Thử nghiệm nuôi cá rô phi bằng thức ăn bổ sung chế phẩm thủy phân bã rong

3.4.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của công thức thức ăn đến sinh trưởng của cá rô phi

Nghiên cứu ảnh hưởng của protein đến sự sinh trưởng của cá rô phi được tiến hành

thử nghiệm. Cá rô phi được nuôi trong 18 giai có kích thước (3m x 2m x 1 m) bằng 6

loại thức ăn thí nghiệm có bổ sung bã agar thủy phân với tỷ lệ phối trộn lần lượt là 0%,

5%, 10%, 15%, 20%, 25% có hàm lượng protein 25% tương ứng với 6 nghiệm. Mỗi

nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Số đơn vị thí nghiệm tương ứng là 18 đơn vị thí nghiệm

(18 giai nuôi). Mật độ nuôi là 4 con/m2. Khối lượng trung bình cá khi bắt đầu thí nghiệm

là 205,9 ± 4,3 g/con. Cá được cho ăn hàng ngày 2 lần vào 8h sáng và 16h và được cho

ăn trong suốt thời gian thí nghiệm. Khẩu phần cho ăn hàng ngày tùy thuộc vào giai đoạn

cá: từ 40 – 100g/con là 5% khối lượng thân, 100 – 150g/con là 4% khối lượng thân giai

đoạn từ 150 – 200g/con là 3% khối lượng thân. Khẩu phần cho ăn được điều chỉnh theo

tăng trưởng của cá bằng cách bắt ngẫu nhiên 10 cá thể cá đem cân sau 20 ngày nuôi để

có khối lượng trung bình làm cơ sở ước tính lượng cá trong các nghiệm thức thí nghiệm

Tốc độ sinh trưởng khối lượng của cá thí nghiệm sau 80 ngày nuôi được trình bày

trong Hình 3.28 và Bảng 3.23.

Bảng 3.23. Ảnh hưởng của công thức thức ăn đến sinh trưởng của cá rô phi trong 80

ngày nuôi

Chỉ tiêu Nghiệm thức

CT 1 CT 2 CT 3 CT 4 CT 5 CT 6

Khối lượng

đầu (g) 206,0± 3,2 206,7 ± 2,71 207,6 ± 2,59 204,7 ± 5,58 205,8 ± 6,2 205,0 ± 5,73

Khối lượng

cuối (g) 630,1 ± 4,6a 652,3 ± 4,1b 675,0 ± 6,9 c 765 ±4,2d 735,1±3,8e 685±5,3f

Tỉ lệ sống (%) 76,4± 6,3 80,6 ± 2,4 81,9 ± 2,4 87,5 ± 4,2 88,5±4,8 86,11±6,3

DWG (g/ngày) 5,3 ± 0,06a 5,7 ± 0,07b 5,8 ± 0,08c 7,0±0,08d 6,81±0,09e 6,0±0,08f

Hệ số thức ăn 2,67 2,38 1,92 1,57 1,69 1,84

Ghi chú: Số liệu được trình bày dưới dạng GTTB±độ lệch chuẩn. Các ký tự chữ trên

cùng hàng giống nhau biểu thị sự khác nhau của các giá trị trung bình không có ý nghĩa

thống kê (P>0,05) và ngược lại.

105

Biểu đồ 3.9. Tốc độ sinh trưởng (g/con) và DWG (g/ngày) của cá rô phi với thức

ăn phối trộn bã rong thủy phân khác nhau sau 80 ngày nuôi.

Qua kết quả hình 3.26 cho thấy khối lượng cá ở cả sáu công thức đều có sự tăng lên về

khối lượng. Khối lượng trung bình ở các giai nuôi thử nghiệm từ 652 đến 765 g. Công

thức thức ăn có hàm lượng protein là 25% với tỷ lệ phối trộn bã rong thủy phân là 15%/

khối lượng có sự tăng trọng tốt nhất với trọng lượng cao nhất là 765 ±4,2 (g và tốc độ

tăng trưởng cao nhất là 4,65±0,03 (g/ngày). Thức ăn có hàm lượng protein là 25%

(Pr25) với công thức đối chứng không phối trộn bã rong thủy phân có tốc độ tăng trưởng

thấp hơn trong suốt quá trình nuôi thí nghiệm, trung bình tăng trưởng là 3,52 ± 0,04

(g/ngày). Theo Jauncey và Ross; Santiago và Laron khẩu phần thích hợp cho cá rô phi

cỡ 200 gam đến cỡ thương phẩm cần khẩu phần protein thích hợp khoảng 20-25%. Các

nghiên cứu cũng đều chỉ ra số lần cho cá rô phi ăn giảm đi khi cá lớn, cá rô phi giống

nên ăn nhiều lần/ngày hơn cá trưởng thành [40], [50], [52],[68], [73], . Các số liệu thực

tế trong nuôi ở Thái Lan cho thấy, nuôi cá rô phi có trọng lượng ban đầu 58 - 89g, nuôi

với mật độ khác nhau và cho ăn thức ăn công nghiệp chứa 20 - 32% protein thô. Sau

120 ngày cá đạt cân nặng 650 - 700g với năng suất thu hoạch 50kg/m. Các số

liệu tương tự cũng thu được từ nuôi cá rô phi ở Malayxia và Inđônêxia. [94],

[95], [139].

Kết quả cho thấy mức tăng trưởng trung bình của cá nuôi ở công thức CT4 (15%)

và CT5 (20%) lại vượt trội hơn so với công thức khác là do trong quá trình thủy phân

bã thải rong bằng enzyme cellulase, các polyme như cellulose, hemicellulose, ... sẽ bị

thủy phân thành các đơn phân như đường glucose, các loại đường đơn thường dễ được

106

hấp thu qua thành ruột. Bên cạnh đó trong bã rong còn chứa hàm lượng chất xơ rất cao.

Chất xơ kích thích nhu động co bóp của ống tiêu hoá làm cho thức ăn di chuyển dễ dàng

để tống cặn bã, độc hại ra ngoài. Chất xơ có tác dụng làm gia tăng tốc độ thức ăn đi qua

đường tiêu hóa nên nó tác dụng làm tăng lượng thức ăn động vật thủy sản ăn vào. Tuy

nhiên sự gia tăng chất xơ đến một mức sẽ làm giảm khả năng tiêu hóa thức ăn do chất

xơ giảm tỉ lệ tiêu hoá thức ăn bằng cách ngăn giữ dưỡng chất bên trong các tế bào, thay

vì chúng phải được tiếp xúc trực tiếp với các men tiêu hoá của đường ruột. Chính vì vậy

cho thấy có tỷ lệ phối trộn bã thải rong câu thích hợp trong thức ăn nuôi cá là 15% đến

20% , do đó công thức thức ăn CT4 (15%) và CT5 (20%) có mức tăng trưởng trung bình

của cá nuôi vượt trội hơn các công thức khác.

Biểu đồ 3.10. Hệ số chuyển đổi thức ăn của nuôi thử nghiệm các công thức thức ăn

Tỷ lệ sống và hệ số thức ăn của cá sau thời gian nuôi thử nghiệm ở nghiệm thức

đối chứng (CT1) không có phối trộn bã rong thủy phân lần lượt là 76,4 % và 2,67. Trong

khi đó các nghiệm thức bằng thức ăn có phối trộn thêm bã rong thủy phân thì có hệ số

thức ăn từ 1,57 đến 2,4 và tỷ lệ sống từ 80,6% - 88,5%. Nếu so sánh với một số kết quả

nuôi của các tác giả đã công bố thì tỷ lệ sống này cao hơn nhiều. Theo kết quả nghiên

cứu của Viện Nuôi trồng Thủy sản I, nghiên cứu của Phạm Anh Tuấn, với chu kỳ nuôi

277 ngày tỷ lệ sống đạt 64,7 – 65,7 %, Nguyễn Văn Tiến với chu kỳ nuôi 190 ngày tỷ

lệ sống cá là 74,7 – 88,6 % [18] . Kết quả nuôi cá rô phi của Vũ Văn Tân bằng thức ăn

công nghiệp có khối lượng trung bình là 535 g/con và tỷ lệ sống trung bình là 81,3%

[19], [40].

2,67

2,38

1,92

1,571,69

1,84

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

CT1 Ct 2 CT 3 CT 4 CT 5 CT 6

Hệ

số

th

ức

ăn

Công thức thức ăn đã thử nghiệm

107

Kết quả thử nghiệm nuôi cá rô phi bằng công thức thức ăn CT4 và CT5 cho thấy

công thức thức ăn CT4 và CT5 cho kết quả nuôi tốt hơn các công thức khác là do: trong

quá trình thủy phân bã thải rong bằng enzyme cellulase, các polyme như cellulose,

hemicellulose,.. sẽ bị thủy phân thành các đơn phân như đường glucose, các loại đường

đơn thường dễ được hấp thu qua thành ruột. Mặt khác, trong chế phẩm thủy phân từ bã

thải rong còn chứa các khoáng chất, nguyên tố vi lượng và các chất khác từ bã thải rong.

Do vậy, thức ăn nuôi cá rô phi có bổ sung chế phẩm thủy phân từ bã thải rong, sẽ cung

cấp đủ khoáng chất, các nguyên tố vi lượng có nguồn gốc từ biển hơn các thức ăn bình

thường. Mặt khác loại thức nuôi cá rô phi có bổ sung chế phẩm thủy phân từ bã thải

rong lại chứa các chất thủy phân dạng đơn phân (ví dụ glucose) nên dễ hấp thụ. Do vậy,

khi nuôi cá rô phi bằng thức ăn có bổ sung chế phẩm thủy phân từ bã thải rong, cá lớn

nhanh hơn, hệ số thức ăn sẽ thấp hơn.

108

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. KẾT LUẬN

Từ các kết quả nghiên cứu ở trên cho phép rút ra một số kết luận sau:

1) Kết quả khảo sát đánh giá về bã thải rong sau sản xuất agar của một số doanh

nghiệm sản xuất agar từ rong câu tại Hải phòng và một số địa phương khác cho thấy

hàng năm các doanh nghiệp sản xuất agar tại Hải Phòng thải ra trên 3.500 tấn bã thải

rong có thành phần như sau: hàm lượng protein 3,26 ± 0,11%; hàm lượng cellulose

74,26 ± 4,68%; hàm lương tro 12,28 ± 3,77 % và có hàm lượng kim loại nặng dưới mức

cho phép của Bộ Y tế.

2) Đã tiến hành nghiên cứu, sàng lọc khả năng sinh enzyme cellulase của 17 chủng

vi sinh vật trong sưu tập giống vi sinh vật của Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học

Quốc gia Hà Nội và lựa chọn được 2 chủng: B. subtilis VTCC-B-505 (B505) và B.

lichenformis (Li) có hoạt tính sinh cellulase cao.

3) Khi nuôi cấy ở các điều kiện tối ưu để 2 chủng vi khuẩn B. subtilis VTCC-B-

505 và B. lichenformis (Li) sinh enzyme cellulase với hoạt tính cao: môi trường MT5

(CMC 2g; bột đậu tương 2g, bột gạo 2g; NH4Cl 0,4g, KH2PO4 0,6g; K2HPO4 1g; nước

cất 1lit); pH 5-7; nhiệt độ 30 – 450C, thời gian 60 phút, hai chủng vi khuẩn B. substilis

VTCC-B-505 và B. lichenformis Li có khả năng sinh cellulase với nồng độ rất cao,

tương ứng là 72UI/ml và 54 UI/ml.

4) Xác định được một số điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân bã rong câu

sau sản xuất agar bằng chế phẩm cellulase từ 2 chủng vi khuẩn (B. substilis VTCC

B505 và B. lichenformis Li): nhiệt độ thích hợp 600C, pH thích hợp 5,5, thời gian thủy

phân tối ưu 42 giờ, tỷ lệ hỗn hợp enzyme so với cơ chất 2,6 %. Sản phẩm thủy phân bã

thải agar dạng bột có độ mịn và tơi, mùi đặc trưng của rong biển khô có hàm lượng

protein 4,55 %, xơ thô 23,12%, độ ẩm 12,97 %.

5) Bước đầu có thể khẳng định rằng bả thải rong câu được xử lý thích hợp bằng chế

phẩm enzyme cellulase từ vi khuẩn có thể sử dụng để bổ sung (khoảng 15%) vào thành

phần thức ăn nuôi cá rô phi đơn tính, mang lại hiệu quả về kinh tế cao (tỷ lệ cá sống

109

cao trên 80 %, hệ số thức ăn thấp 1,57 - 1,94), đồng thời góp phần xử lý chất thải làm

sạch môi trường.

2. KIẾN NGHỊ

Từ những nghiên cứu ở trên cho phép đề xuất kiến nghị:

1) Tiến hành sản xuất cellulase từ 2 chủng B. subtilis VTCC-B-505 (B505) và B.

lichenformis (Li) ở qui mô lớn để thu chế phẩm enzym cellulase dùng trong công nghiệp

thủy phân bã rau câu sau sản xuất agar.

2) Thử nghiệm sản xuất thức ăn bổ sung chế phẩm bã thải agar thủy phân theo

công thức của Luận án đã đề xuất để triển khai nuôi cá rô phi và một số loài cá nước

ngọt ở quy mô công nghiệp.

110

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN

LUẬN ÁN

1. Lê Hương Thủy (2009), “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học tận dụng

bã thải từ sản xuất agar phục vụ sản xuất thức ăn chăn nuôi”,Hội thảo Khoa học Đánh

giá kết quả thực hiện đề tài, dự án Công nghệ Sinh học Nông nghiệp -Thủy sản giai

đoạn 2007 - 2008,Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, Tr. 193-195.

2. Võ Hoài Bắc, Lê Hương Thủy, Lê Thị Lan Oanh (2010), “Sàng lọc chủng vi

sinh vật sinh cellulase sử dụng trong thủy phân bã thải agar”, Bản tin Viện Nghiên cứu

Hải sản, Số 15, tr 20 – 24.

3. Lê Hương Thủy, Võ Hoài Bắc, Lê Thị Lan Oanh (2011), “Tối ưu hóa các điều

kiện sinh cellulase ngoại bào từ 2 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis B-505 và Bacillus

lichenformis Li trên môi trường lên men công nghiệp”, Bản tin Viện Nghiên cứu Hải

sản, Số 19, tr. 20 - 25.

4. Lê Hương Thủy (2011), “Nghiên cứu ứng dụng bã rong thủy phân trong sản

xuất thức ăn nuôi cá rô phi”, Bản tin Viện Nghiên cứu Hải sản,Số 22, tr. 19 -26.

5. Lê Hương Thủy, Võ Hoài Bắc (2011), “Nghiên cứu sàng lọc và tối ưu hóa điều

kiện nuôi cấy các chủng vi sinh vật sinh cellulase sử dụng trong thủy phân bã thải agar”,

Tạp chí KHCN Nông nghiệp và phát triển nông thôn, Tr. 140 – 148.

6. Lê Hương Thủy (2013), Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học tận dụng bã

thải sản xuất agar phục vụ sản xuất thức ăn chăn nuôi. Tạp chí KHCN Nông nghiệp và

phát triển nông thôn. Tr 275 - 284.

111

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Nguyễn Cảnh, Nguyễn Đình Soa (1994), Tối ưu hoá thực nghiệm trong hoá học

và kỹ thuật hoá học, Trường Đại học Kỹ thuật TP. HCM.

2. Nguyễn Trọng Cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1997),

Công nghệ enzyme, Nxb. Nông nghiệp, Hà Nội.

3. Nguyễn Lân Dũng (1987), Men và thức ăn gia súc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà

Nội.

4. Đặng văn Giáp (1997), Phân tích dữ liệu khoa học bằng chương trình M-S Excel,

Nxb. Giáo dục, Hà Nội.

5. Đoàn Giang (2003), «Công thức mới trong thức ăn của cá rô phi», Thông tin Khoa

học và kinh tế Thủy sản, Nông nghiệp Việt Nam.

6. Phạm Thị Ánh Hồng (2003), Kỹ thuật sinh hóa, Nxb. Đại học quốc gia TP. HCM.

7. Lại Văn Hùng (2004), Dinh dưỡng và thức ăn nuôi trồng thuỷ sản, Nxb Nông

nghiệp, Tp HCM.

8. Khoa thuỷ sản Trường đại học cần thơ (1994), Kỹ thuật nuôi thuỷ sản nước lợ ,

Nxb Nông nghiệp, Hà Nội .

9. Khoa Thuỷ Sản , Đại học cần Thơ (1994), Kỹ thuật nuôi cá nước ngọt, Nxb Nông

nghiệp, Hà Nội.

10. Lê Văn Liễn, Nguyễn Hữu Tào (2004), Kỹ thuật chế biến phụ phẩm nông nghiệp

làm thức ăn cho gia súc, Viện Chăn nuôi Quốc gia, Nxb Lao Động – Xã hội, Hà Nội.

11. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa (2004),

Chế biến rong biển, Nxb Nông Nghiệp, Tp. HCM.

12. Nguyễn Đức Lượng (2001), Công nghệ sinh học, Nxb Đại học Quốc gia, Tp

HCM.

13. Nguyễn Đức Lượng (1996), Nghiên cứu tính chất của một số vi sinh vật có khả

năng tổng hợp cellulase cao và ứng dụng trong công nghệ xử lý chất thải hữu cơ, Luận văn

tiến sĩ khoa học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Hà Nội.

112

14. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2003), Thí Nghiệm

Công nghệ Sinh học, Nxb Đại học Quốc gia, Tp HCM.

15. Đỗ Văn Nam (2004), Nghiên cứu, đánh giá hiện trạng môi trường các cơ sở chế

biến Agar – Agar, đề xuất các biện pháp quản lý , Báo cáo khoa học, Viện nghiên cứu Hải

sản, Hải Phòng.

16. Nguyễn Thị Minh Nguyệt (2009), Nghiên cứu chế biến bã cơm dừa làm nguyên

liệu để sản xuất thức ăn cho gia súc, Báo cáo khoa học, Viện Nghiên cứu Dầu và Cây có

dầu.

17. Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Phan Văn Sỹ (2008), Nghiên cứu hiệu quả sử dụng

chế phẩm bã cơm dừa lên men trong chăn nuôi, Báo cáo khoa học, Viện Nghiên cứu Dầu

và Cây có dầu.

18. Nguyễn Hữu Ninh (2003), Tình hình nuôi cá rô phi trên thế giới, Báo cáo Trung

tâm Quốc gia giống thuỷ sản nước ngọt miền Bắc, Hải Dương.

19. Nguyễn Thị Diệu Phương, Phạm Anh Tuấn, (2005), Ảnh hưởng của hàm lượng

protein trong thức ăn và số lần cho ăn đến sinh trưởng, môi trường nuôi cá rô phi, Báo cáo

khoa học, Viện Nuôi trồng Thủy sản 1, Bắc Ninh.

20. Lương Đức Phẩm (2004), Công nghệ vi sinh vật, Nxb. Khoa học và Kỹ thuật, Hà

Nội.

21. Lương Đức Phẩm, Hồ Sưởng (1978), Vi sinh tổng hợp, Nxb Khoa học và Kỹ

Thuật, Hà Nội.

22. Lê Thị Bích Phượng (2002), Nghiên cứu sử dụng bã khoai mì làm thức ăn cho

chăn nuôi, Báo cáo khoa học Viện Sinh học Nhiệt đới, Tp. HCM.

23. Lê Hồng Phú (2003), Nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme pectinase và cellulase từ

Aspergillus niger và ứng dụng để xử lý vỏ cà phê để sản xuất trong phân bón, Luận văn

thạc sỹ, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp. HCM.

24. Lê Hồng Phú (2012), Nghiên cứu thu nhận chế phẩm vi sinh vật enzyme pectinase

và cellulase và ứng dụng trong sản xuất cà phê nhân theo phương pháp lên men, Luận án

Tiến sĩ, Trường Đại học khoa học tự nhiên, Đại học quốc gia Tp HCM .

25. Võ Vân Phước Quế, Cao Ngọc Diệp (2011), «Phân lập và nhận diện vi khuẩn

113

phân giải Cellulose», Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ, Trang 177 - 184.

26. Đỗ Văn Khương, (1995), Final workshop of the regional study on the taxonomy,

Ecology and processing of commercially important seaweeds. Country status report of Việt

Nam.

27. Hoàng Văn Tiến (1970), Cơ sở sinh hoá trong việc sản xuất và sử dụng nấm men

cho gia súc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà nội.

28. Nguyễn Tiến Thắng, Ngô Kế Sương, Trần Hạnh Phúc, Võ Hồng Nhân, (1994),

Công nghệ sinh học và một số ứng dụng tại Việt Nam, Tập 1, Nxb Nông nghiệp.

29. Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Như Trí, Phạm Minh Anh (2012), «Đánh giá ảnh

hưởng của nấm men (Kluyveromyces marxianus) đến tốc độ tăng trưởng, tỷ lệ sống, hiệu

quả sử dụng thức ăn và khả năng miễn dịch của cá rô phi vằn (Oreochromis niloticus)

giống», Tạp chí Khoa học kỹ thuật Nông Lâm nghiệp, Đại học Nông Lâm Tp HCM

30. Nguyễn Văn Thục (2003), Nghiên cứu công nghệ sản xuất agar chất lượng cao,

Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học cấp Nhà nước, Viện nghiên cứu Hải sản, Hải

Phòng.

31. Lê Thị Tú (2003), Nghiên cứu xử lý toàn diện phế liệu dừa nhà máy chế biến đồ

hộp bằng công nghệ vi sinh. Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, Trường Đại học Khoa học

tự nhiên, Tp HCM

32. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng (1982). Enzyme

vi sinh vật, Tập 2, Nxb. Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.

33. Lê Ngọc Tú và các tác giả (1997), Hoá sinh học công nghiệp, Nxb. Khoa học và

Kỹ thuật, Hà Nội .

34. Trần Lê Cẩm Tú, Nguyễn Hữu Bon, Trần Thị Thanh Hiền (2008), “Đánh giá khả

năng sử dụng khoai ngọt (Dioscorea alata) làm thức ăn cho cá rô phi (Oreochromis

niloticus)”, Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, Trang 141 – 146.

35. Phạm Anh Tuấn, (2003), «Công nghệ phục vụ nuôi cá rô phi xuất khẩu- Thuận

lợi và khó khăn», Tạp chí Khoa học công nghệ thủy sản, Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy

sản I, Bắc Ninh

36. Nguyễn Như Trí, Nguyễn Hồng Lây (2012), «Đánh giá hiệu quả kinh tế việc sử

114

dụng thức ăn với hàm lượng Protein khác nhau trên cá rô phi đỏ (Oreochromis spp)»,

Trường Đại học Nông Lâm, Tp HCM. Trang 90 – 95.

37. Tuyển tập Tiêu chuẩn Quốc gia về thức ăn chăn nuôi (2007).

38. Mai Đình Yên (1983), Cá kinh tế nước ngọt ở miền nam, Nxb Khoa học và kỹ

thuật , Hà Nội.

39. Mai Đình Yên, Vũ Trung Tạng , Bùi Lai , Trần Mai Thiên (1979), Ngư loại học,

Nxb Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội .

40. «Các nghiên cứu mới trong việc cho cá rô phi ăn» (2003), Asian Aquaculture

Magazine 1,2/2003).

TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI

41. Aboul Enein, A. Abou Elalla, F. Serour, E. Hussien T, (2010), “Purification

and characterization of a novel thermoactive cellulase from Thermophilic actinomycetes

isolated from soil sample of Egypt”, Int. J. Acad. Res. 2, pp 81–86.

42. Adegunloye D. V., Adetuyi F. C., Akinyosoye F. A., Doyeni M. O., (2007),

“Microbial analysis of compost using cowdung as booster”, Pak. J. Nut. 6, pp 506 – 510.

43. Annamalai N., Rajeswari M. V., Balasubramanian T. (2014), Enzymatic

saccharification of pretreated rice straw by cellulase produced from Bacillus

carboniphilus CAS 3 utilizing lignocellulosic wastes through statistical optimization,

Biomass Bioen. 68, pp 151–160.

44. Annamalai N, Rajeswari M.V, Elayaraja S, Balasubramanian T, (2013),

Thermostable, haloalkaline cellulase from Bacillus halodurans CAS 1 by conversion of

lignocellulosic wastes, Carbohy. Polym. 94, pp 409–415.

45. Assareh R, Zahiri H.S, Noghabi K.A, Aminzadeh S, Khaniki G.B, (2012),

Characterization of the newly isolated Geobacillus sp. T1, the efficient cellulase-

producer on untreated barley and wheat straws, Biores. Technol. 120, pp 99–105.

46. Ancharida Akaracharanya, Thanawan Taprig, Jaruwan Sitdhipol and Somboon

Tanasupawat (2014), «Characterization of cellulase producing Bacillus and Paenibacillus

strains from Thai soils», JAPS. 40502

47. Ariffim H, Abdulah N, Umi K.M.S, Shirai Y and Hassam MA, (2006),

115

«Production and characterisation of cellulase by Bacillus pulmilus EB3”, International

Journal of Engineering and Technology. Vol. 3, No 1, pp 47-53.

48. Akasaka H, T Izawa, K. Ueki and A. Ueki. (2002), Phylogeny of numerically

abundant culturable anaerobic bacteria associated with degradation of rice plant residue

in Japanese paddy feld soil. Faculty of Agriculture, Yamagata University, Tsuruoka, pp

997-8555.

49. Arbor Acres (1995), Management manual and broiler feeding, Arbor Acres farm

inc, pp.20.

50. Arkom Choomthi (1997), Polyculture of Nile Tilapia (Orechromis niloticus),

Asian Institute of Technology, pp 8-11.

51. Alef K., Nannipieri P. (1995), “Enzymee activities”, Methods in Applied

Soil Microbiology and Biochemistry, pp.311-373.

52. Balarin J.D and Haler, R.D (1982), «Imn Recent Aquaculture» (J.F Muir and

R.J.Robert,eds), Croom Helem, London, pp 265-356.

53. Bansal N., Tewari R., Soni R., Soni S.K., (2012), “Production of cellulases

from Aspergillus niger NS-2 in solid state fermentation on agricultural and kitchen

waste residues”, Waste Manage, 32, pp 1341–1346.

54. E.A. Bayer, H. Chanzy, R. Lamed, Y. Shoham (1998), “Cellulose, cellulases and

cellulosomes», Curr. Opin. Struct. Biol. 8 , pp 548–557.

55. Binod P., Palkhiwala P., Gaikaiwari R., Nampoothiri K.M., Duggal A., Dey

K., Pandey A., (2013), “Industrial enzymes – present status and future perspectives for

India”, J. Sci. Ind. Res. 72, pp 271–286.

56. Cen P.L., Xia L.M., (1999), “Production of cellulase by solid-state

fermentation”, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 65, pp 68–92.

57. Cherry J.R., Fidantsef A.L., (2003), “Directed evolution of industrial enzymes:

an update”, Curr. Opin. Biotechnol. 14, pp 438–443.

58. Coughlan M.P., Folan M.A (1979), “Cellulose and cellulase: food for throught,

food for future”, InT.J.Biochem, (10), pp 103-168.

59. Coughlan M.P., (1988), “Methods In Enzymology (Wood Ed.) ”, Vol. 160 ,

116

Academic Press, New York, pp. 135- 144

60. Copland J.W. and Alders R.G. (2005), “The Australian poultry development

programme in Asia and Africa”, World Poultry Science Journal 61, pp 31-37.

61. Das, A., Bhattacharya, S., Murali, L., (2010), “Production of cellulase from

Thermophilic bacillussp isolated from cow dung”, Am. Eurasian J. Agric. Environ. Sci.

8, pp 685–691.

62. Dhillon, G.S., Oberoi, H.S., Kaur, S., Bansal, S., Brar, S.K., (2011). “Value-

addition of agricultural wastes for augmented cellulase and xylanase production through

solid state tray fermentation employing mixed-culture of fungi” Ind. Crops Prod. 34, pp

1160–1167.

63. Dhillon, G.S., Brar, S.K., Kaur, S., Sabrine, M., M’hamdi, N., (2012a).

“Lactoserum as a moistening medium and crude inducer for fungal cellulases and

hemicellulose induction through solid-state fermentation of apple pomace”, Biomass

Bioen. 41, pp 165–174.

64. Dhillon, G.S., Brar, S.K., Kaur, S., Brar, S.K., Verma, M., (2012b). “Potential

of apple pomace as a solid substrate for fungal cellulase and hemicellulose

bioproduction through solid-state fermentation”, Ind. Crops Prod. 38, pp 6–13.

65. Fan L.T and Lee L.H (1983), “Kinetic studies of enzymatic hydrolysis of

insoluble cellulose, a mechannistic kinetic model Biotech”, Bioeng (15), pp 2707-2733.

66. Fields, M. W., J. B. Russell and D. B. Wilson. (1998). “The role of ruminal

carboxymethylcellulases in the degradation of β-glucans from cereal grain”, FEMS

Microbiol. Ecol. 27:261–268.

67. Gascoigne J. and Gascoigne M.M (1960), “Biological degradation of cellulose”,

Butterwozch and Co.Limited, London, pp 17-21.

68. Guerrero. R.D (1980), “Studies on the feeding of Tilapia nilotica in floating

cages”, Aquaculture 20, pp 169-175.

69. Gupta, V.K., M.P.S. Bakshi, and P.N. Langar (1987), “Microbiological Changes

During Natural Fermentation of Urea-wheat Straw”, Biological Wastes 21.

70. El-Bakry, M., Abraham, J., Cerda, A., Barrena, R., Ponsá, S., Gea, T.,

117

Sánchez, T., (2015), “From wastes to high value added products: novel aspects of SSF

in the production of enzymes”. Crit. Review. Environ. Sci. Technol. 45 (18), pp 1999–

2042.

71. Hao, X.C., Yu, X.B., Yan, Z.L., (2006), “Optimization of the medium for the

production of cellulase by the mutant Trichoderma reesei WX-112 using response

surface methodology”, Food Technol. Biotechnol. 44, pp 89–94.

72. Hakamada. Y, K. Endo, S. Takizawa, T. Kobayashi, T. Shirai, T. Yamane, S. Ito

(2002), “Enzymatic properties, crystallization, and deduced amino acid sequence of an

alkaline endoglucanase from Bacillus circulans”, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)

Gen. Subj. 1570 (2002) 174–180.

73. Hayer J.F. and Mc Carthy J.C (1970), “The effect of selection at different ages

for high and low weigh are the pattern of deposition in mice”, Gienet. Res.

74. Helmul Uhlig (1998), Ph. D. Industrial enzym and theor applications. John Wiley

and Sons, inc. New York.

75. Howard R.L., Abotsi E., Jansen van Rensburg and Howard S (2003),

“Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production”, African

Journal of Biotechnology Vol. 2 (12), pp. 602-619, December 2003.

76. Hurst. PL, Nielsen J, Sullivan PA and Shepherd MG, (1977), “Purification and

Properties of a Cellulase from Aspergillus niger”. Biochem. J. 165, pp 33-41

77. Hart, T.D., Leij, D.F., Kinsey, G., Kelley, J., Lynch, J.M., (2002), “Strategies

for the isolation of cellulolytic fungi for composting of wheat straw”, World J.

Microbiol. Biotechnol. 18, pp 471–480.

78. John E. Halver, (1989), “Fish nutrition”, Academic press. Inc,588, pp 117.

79. Jorgensen, H., Olsson, L., (2006), “Production of cellulases by Penicillium

brasilianum IBT 20888—effect of substrate on hydrolytic performance”, Enzyme

Microb. Technol. 38, pp 381–390.

80. Kansoh, A., Essam, S.A., Zeinat, A.N., (1999), “Biodegradation and

utilization of bagasse with Trichoderma reesei”, Polym. Degrad. Stab. 63, pp 273–278.

81. Karim, A., Nawaz, M.A., Aman, A., Ul Qader, S.A., (2015), “Hyper

118

production of cellulose degrading endo (1,4) b-d-glucanase from Bacillus licheniformis

KIBGE-IB2”, J. Radiation Res. Appl. Sci. 8, pp 160–165.

82. Kim, H., Pack, M.Y., (1988), “Endo-b-1,4-glucanase encoded by Bacillus

subtilisgene cloned in Bacillus megaterium”, Enzyme Microb. Technol. 10, pp 347–

351.

83. Kim, B.-K., Lee, B.-H., Lee, Y.-J., Jin, I.-H., Chung, C.-H., Lee, J.-W., (2009),

“Purification and characterization of carboxymethylcellulase isolated from a marine

bacterium,Bacillus subtilissubsp. subtilis A-53”, Enzyme Microb. Technol. 44 (6–7), pp

411–416.

84. Kurup, R.S.C., Snishamol, C., Prabhu, G.N., (2005), “Cellulase production by

native bacteria using water hyacinth as substrate under solid state fermentation”,

Malaysian J. Microbiol. 1 (2), pp 25–29.

85. Kubaryk.J.M (1980), “Effect of diet, feeding schedule, ser on food consumption

, growth and retention of protein and energy by tilapia”, Ph.D. Dissertation , Auburn,

Alabama. pp 51.

86. Lee, R. L., P. J. Weimer, W. H. Zyl and I. S. Pretorius. (2002), “Microbial

Cellulose Utilization: Fundamentals and Biotechnology”, Microbiology and Molecular

biology reviews. pp 506–577.

87. Lee, Y.-J., Kim, B.-K., Lee, B.-H., et al., (2008), “Purification and

characterization of cellulase produced by Bacillus amyoliquefaciens DL-3 utilizing rice

hull ”, Biores. Technol. 99 (2), pp 378–386.

88. Leticia, M., S. Herrera, A. Ramos and M. Salgado (2007), “Differential

expression of cellulases and xylanases by Cellulomonas flavigena grown on different

carbon sources”, Applied Microbiology and Biotechnology. 77, pp 0175-7598.

89. L. M. Robson and G. H. Chambliss, J. Bacteriol, 165, 612 (1986); Biol. Chem.

90. Lucas, R., Robles, A., Garcia, M.T., Alvarez De Cienfuegos, G., Galvez, A.,

(2001), “Production, purification, and properties of an endoglucanase produced by the

hyphomycete Chalara (syn.Thielaviopsis) paradoxa CH32”, J. Agric. Food Chem. 49,

pp 79–85.

119

91. Mawadza, C., Hatti-Kaul, R., Zvauya, R., Mattiasson, B., (2000), “Purification

and characterization of cellulases produced by two Bacillusstrains”, J. Biotechnol. 83,

pp 177–187.

92. Muthuvelayudham R., Viruthagiri T, (2010), “Application of central

composite design based response surface methodology in parameter optimization and

on cellulase production using agricultural waste”, Int. J. Chem. Biol. Eng. 3, pp 97–104.

93. Maxwell G.S, Cole A.L, Tong C.C. (1988), “Methods In Enzymology”,

(Wood Ed.), Vol. 160 Academic Press, New York, pp 300-307.

94. Micha. J.C, T . Antoine , p . Wery and Van Hove (1988), “Growth. ingestion

capacity, comparative appetency and biochemical compossition of Oreochromis niloticus

and Tilapia rendalli fed with Azolla”, pp. 347-355.

95. Michael B.New (1987), “Feed and feeding of fish and shrimp”, Food and

agriculture organnization of the united nation, pp 109.

96. Muhammad Irfan, Asma Safdar, Quratulain Syed, Muhammad Nadeem

(2012), “Isolation and screening of cellulolytic bacteria from soil and optimization of

cellulase production and activity”, Turkish Journal of Biochemistry–Turk J Biochem;

37 (3) ; pp 287–293 .

97. Narra, M., Dixit, G., Divecha, J., Madamwar, D., Shah, A.R., (2012),

“Production of cellulases by solid state fermentation with Aspergillus terreusand

enzymatic hydrolysis of mild alkali-treated rice straw”, Biores. Technol. 121, pp 355–

361.

98. Nelson, N. (1944), “A photometric adaption of the Somogyi method for the

determination of glucose”, J. Bio. Chem. 153: pp 375-380.

99. Ole Rasmussen, Olave Jansen, Đỗ Văn Khương, Nguyễn Văn Thục (2001).

Seaweed processing and market for Viet Nam, Report for SUMA programe.

100. Peter f. Strom (1985), “Identification of Thermophilic Bacteria in Solid-Waste

Composting”, Applied and environmental microbiology, pp 906-913.

101. Popma, T.J and Lovshin, LL (1996), “Worldwide prospects for commercial

production of Tilapia”, Research and development Series No.41 International center for

120

aquaculture and aquatic environment, pp. 4-14.

102. Pullin R.S.V and R.H.Lowe. Mc Cornell (1982), “The biology and culture of

Tilapias”, International center for ling aquatic resources management.

103. Pullin R.S.V, T.Bhukaswan, K. Tonguthai, J.L. Macllean (1998), “The second

international symposium on Tilapia in aquaculture”, Deparment of fisheries Bangkok,

Thailan, pp 388-395.

104. Rajoka, M.I., Malik, K.A., (1997), “Cellulase production by Cellulomonas

biazotea cultured in media containing different cellulosic substrates”, Biores. Technol.

59, pp 21–27.

105. Rashid, S.S., Alam, M.Z., Karim, M.I.A., Salleh, M.H., (2009),

“Optimization of the nutrient supplements for cellulase production with the basal

medium palm oil mill effluent”, World Acad. Sci. Eng. Technol. 3, pp 12–24.

106. Reese E.T., and Siu R.G.H (1950), “Giological degration of solube cellulose

derities”, Biotech. J., (59), pp 485.

107. Reese E.T (1963), “Advances in enzymatic hydrolysis of cellulose and related

material”, Perganom press, London, pp 394-420.

108. R. M. Mackay, A. Lo, G. Willick, M. Zuker, S. Baird, M. Dove, F. Moranelli

and V. Seligy, (1986), Nucleic Acids Res., 14, 9159.

109. Saha, S., R. Roy, S. Sen and A. Ray. (2006), “Characterization of cellulase-

producing bacteria from the digestive tract of tilapia”, Oreochromis mossambica (Peters)

and grass carp, Ctenopharyngodon idella (Valenciennes), Aquaculture Research. 37: pp

380-388.

110. Sasidharan Sreedevi, Sreedharan Sajith, Sailas Benjamin (2013), “Cellulase

Producing Bacteria from the Wood-Yards on Kallai River Bank”, Advances in

Microbiology, 3, pp 326-332.

111. Sadhu, S., Ghosh, P.K., Aditya, G., Maiti, T.K., (2014), “Optimization and

strain improvement by mutation for enhanced cellulase production by Bacillussp.

(MTCC10046) isolated from cow dung”, J. King. Soud. Univ.-Sci. 26, pp 323–332.

112. Salwee Yasmin, R. L. Mattoo and F. A. Nehvi (2013), “Isolation,

121

Characterization and Molecular weight determination of Cellulase from Trichoderma

viride”, Academic Journals Vol. 12(28), pp. 4512-4518.

113. Schwarz, W.H. (2001), “The cellulosome and cellulose degradation by

anaerobic bacteria”, Appl. Microbiol. Biotechnol. 56, pp 634-649

114. Shafique, S., Asghier, M., Sheikh, M.A., Asad, M.J., (2004), “Solid state

fermentation of banana stalk for exoglucanase production”, Int. J. Agri. Biol. 6, pp 488–

491.

115. Shanmughapriya, S., Kiran, G.S., Selvin, J., Thomas, T.A., Rani, C., (2010),

“Optimization, purification, and characterization of extracellular mesophilic alkaline

cellulose from sponge-associated Marinobactersp. MSI032”, Appl. Biochem.

Biotechnol. 162, pp 625–640.

116. Shu-bin, L., Ren-Cha, Z., Xia, L., Chu-Yi, C., Ai-lin, Y., (2012), “Solid-state

fermentation with Okara for production of cellobiase-rich cellulases preparation by a

selected Bacillus subtilis Pa5”, Afr. J. Microbiol. 11 (11), pp 2720–2730.

117. Singh C.P (1987), “Preparation of High grade Compost by an enviroment on

organic matter decomposition”, Biol. Agric. Hort., (5), pp 41-49.

118. Singh, J., Batra, N. and Sobti, R.C. (2004), “Purification and characterisation of

alkaline cellulase produced by a novel isolate, Bacillus sphaericus JS1”, Journal of

Industrial Microbiology and Biotechnology, 31: pp 51-56.

119. Singh, K., Richa, K., Bose, H., Karthik, L., Kumar, G., Rao, K.V.B., (2014),

“Statistical media optimization and cellulase production from marine Bacillus

VITRKHB”, Biotech 4, pp 591–598.

120. Singhania, R.R., Sukumaran, R.K., Pandey, A., (2007), “Improved cellulase

production by Trichoderma reesei RUT C30 under SSF through process optimization”,

Appl. Biochem. Biotechnol. 142, pp 60–70.

121. Singhania, R.R., Saini, R., Adsul, M., Saini, J.K., Mathur, A., Tuli, D.,

(2015), “An integrative process for bio-ethanol production employing SSF produced

cellulase without extraction”, Biochem. Eng. J. 102, pp 45.

122. Song, J.-M., Wei, D.-Z., (2010), “Production and characterization of

122

cellulases and xylanases of Cellulosimicrobium cellulans grown in pretreated and

extracted bagasse and minimal nutrient medium M9”, Biomass Bioen. 34, pp 1930–

1934.

123. Seung Hwan Park, Ha Keun Kim and Moo Young Pack, (1991),

“Characterization and Structure of the Cellulase Gene of Bacillus subtilis BSE616”, Agric.

Biol. Chem., 55 (2), pp 441-448,

124. S. Landaud, P. Piquerel and J. Pourquie’ ( 1995), “Screening for bacilli

producing cellulolytic enzyme active in the neutral pH range”, Letters in Applied

Microbiology, 21, pp 319-321.

125. P. Sas Pereira, M. Costa-Ferreira, M.R. Aires-Barros (2002), “Enzymatic

properties of a neutral endo-1,3(4)-[beta]-xylanase Xyl II from Bacillus subtilis”, J.

Biotechnol. 94, pp 265–275.

126. Pratima Gupta, Kalpana Samant, and Avinash Sahu (2012), “Isolation of

Cellulose-Degrading Bacteria and Determination of Their Cellulolytic Potential”,

International Journal of Microbiology, Article ID 578925,.

127. Teather, R.M., Wood, P.J., (1982), “Use of Congo red-polysaccharide

interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine

rumen”, Appl. Environ. Microbiol. 43, pp 777–780.

128. Thomas, L., Larroche, C., Pandey, A., (2013), “Current developments in

solid-state fermentation”, Biochem. Eng. J. 81, pp 146–161.

129. Trivedi, N., Gupta, V., Reddy, C.R., Jah, B., (2013), “Detection of ionic

liquid stable cellulase produced by the marine bacterium Pseudoal teromonassp isolated

from brown alga Sargassum polycystum C”, Agardh. Biores. Technol. 132, pp 313–319.

130. Trivedi, N., Gupta, V., Kumar, M., Kumari, P., Reddy, C.R.K., Jha, B.,

(2011), “Solvent tolerant marine bacterium Bacillus aquimaris secreting organic solvent

stable alkaline cellulase”, Chemosphere 83, pp 706–712.

131. Ulrich A., G. Klimke, S. Wirth. (2008), “Diversity and Activity of Cellulose-

Decomposing Bacteria, Isolated from a Sandy and a Loamy Soil after Long-Term Manure

Application”, Microb Ecol. 55, pp 512–522.

123

132. Deliang Yang, Haibo Weng, Minge Wang, Weihua Xu, Yaozhao Li, Huiling

Yang (2010), “Cloning and expression of a novel thermostable cellulose from newly

isolated Bacillus subtilis strain I15”, Mol Biol Rep, (2010)37:pp 1923-1929

133. Y. Koide, A. Nakamura, T. Uozumi and T. Beppu (1986), Agric. Biol. Chem.,

50, pp 233 .

134. Vinay K. Singh and Anil Kumar (1998), “Production and purification of an

extracellular cellulase from Bacillus brevis VS-1”, Biochemistry and Molecular biology

International, Vol. 45, No. 3, pp 443-452.

135. Verma, V., Verma, A., Kushwaha, A., (2012), “Isolation and production of

cellulose enzyme from bacteria isolated from agricultural fields in district Hardoi”,

Uttar Pradesh, India. Adv. Appl. Sci. Res. 3, pp 171–174.

136. Vijayaraghavan, P., Vincent, S.G.P., (2012), “Purification and

characterization of carboxymethyl cellulase from a Bacillussp. isolated from a paddy

field”, Polish J. Microbiol. 61 (1), pp 51–55.

137. Wang, G., Zhang, X., Wang, L., Wang, K., Peng, F., Wang, L., (2012), “The

activity and kinetic properties of cellulases in substrates containing metal ions and acid

radicals”, Adv. Biol. Chem. 2, pp 390–395.

138. Wang Li, Wei-Wei Zhang, Ming-Ming Zang, Yu-Lin Chen (2008),

“Cloning of Thermostable Cellulase Gene from newly isolated Bacillus subtilis and its

expression in Escherichia coli”, Mol Biotechnol, 40: pp 195-201.

139. Walter J . Rainboth (1996), “Fish of the Cambodian Mekong”, Agriculture

organization . pp 6.

140. L. Westers, H. Westers, W.J. Quax (2004), “Bacillus subtilis as cell factory for

pharmaceutical proteins: a biotechnological approach to optimize the host organism”,

Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Mol. Cell Res. 1694, pp 299 – 310.

141. W. Li, W.-W. Zhang, M.-M. Yang, Y.-L. Chen (2008), “Cloning of the

thermostable cellulase gene from newly isolated Bacillus subtilis and its expression in

Escherichia coli”, Mol. Biotechnol. 40, pp 195–201.

142. Wood. TM and Mccrae. SI, (1972), “The Purification and Properties of the C1

Component of Trichoderma koningii Cellulase”, Biochem. J. 128, pp 1183-1192).

124

MỘT SỐ TRANG WEB ĐÃ TRA CỨU

143. http://www.chem. qmul.ac.uk/iubmb/enzym/EC 3/2/1/4.html.

144. http://www.doitpoms.ac.uk/tlplib/wood/figures/cellulose.png

145. http://botit.botany.wisc.edu/toms_fungi/thanks.html

146. http://www.fao.org/docrep/w7241e/w7241e08.htm#3.2.1%20cellulase)

1

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1:HÌNH ẢNH MỘT SỐ HOẠT ĐỘNG CỦA ĐỀ TÀI ....................... 2

PHỤ LỤC 2: LÝ LỊCH CÁC CHỦNG VI SINH VẬT ......................................... 5

PHỤ LỤC 3 : MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................... 11

PHỤ LỤC 4: KẾT QUẢ NUÔI THỬ NGHIỆM CỦA ĐỀ TÀI.......................... 14

2

PHỤ LỤC 1

HÌNH ẢNH MỘT SỐ HOẠT ĐỘNG CỦA ĐỀ TÀI

Máy thủy lực ép tách nước Thiết bị thủy phân có khuấy đảo

Nuôi cấy chủng VSV Ly tâm thu dịch cellulase ngoại bào

3

Nuôi thử nghiệm cá rô phi

Khảo sát vùng nguyên liệu sản xuất agar ở cơ sở sản xuất agar

Bã thải agar và chế phẩm bã thải agar dạng bột

4

Máy ly tâm Máy lắc nuôi vi sinh vật

Cân phân tích Máy quang phổ UV – Vis

Thiết bị ổn nhiệt Memmert Buồng cấy vi sinh

5

PHỤ LỤC 2

1. LÝ LỊCH CÁC CHỦNG VI SINH VẬT

* Chủng vi khuẩn Bacillus substilis VTCC-B-505 do Viện Vi sinh vật và Công

nghệ Sinh học, Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật cung cấp. (Địa chỉ: 144 Xuân Thủy,

Cầu Giấy, Hà nội). Đây là chủng vi khuẩn Việt Nam được phân lập từ đất.

Chủng vi khuẩn này là những vi khuẩn hình que, Gram dương. Các điều kiện

sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào tối ưu đã được Viện Công nghệ Sinh học nghiên

cứu là: (60h, 30ºC, pH 7, 200v/phút).

Trình tự gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn này đã được giải trình tự và phân

tích

(http://biotechvnu.edu.vn/vtcc/index.php?page=shop.product_details&flypage=flypage

.tpl&product_id=1949&category_id=6&option=com_virtuemart&Itemid=47)

VTCC No. VTCC-B-505

Scientific Name of this Strain Bacillus subtilis

Product etc. 16S rDNA

>VTCC-B-505

GAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGA

TGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACT

GGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAG

GTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACC

AAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGAC

TCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGA

GTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGT

ACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTG

GCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCC

CCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCC

ACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTA

ACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAA

CGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCC

TGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATG

TGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAG

GACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGG

GTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGA

6

CTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTA

CACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCT

GTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCA

GCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACA

CCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGT

CGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTT

* Chủng Li. là chủng vi khuẩn Bacillus lichenformis được phân lập từ ruột tằm .

do Trung tâm Biolap phân lập và cung cấp.

Phương pháp xác định hình thái khuẩn lạc trên kính hiển vi điện tử quét JEOL

5410 LV

Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng có chứa nguồn

cơ chất thích hợp. Hình thái tế bào được quan sát sau hai ngày. Sinh khối được lấy từ

đĩa thạch tách khuẩn lạc, lọc qua giấy lọc rồi đem ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút,

rửa tách lấy tế bào. Tế bào được hòa tan trong glutaraldehyt 2,5% trong đệm

photphatnatri 100mM (pH 7,2) trong 30 phút. Lấy một giọt tế bào đã xử lý (khoảng 106-

108 tế bào/ml) đưa lên lưới đồng và để 1 phút để mẫu bám vào lưới vàng. Rửa nhẹ nhàng

với vài giọt nước và mẫu được làm khô qua cồn 25, 50, 75 và 100%. Chuyển qua T-

butyl. Sau đó các mẫu được làm khô bằng máy đông khô và phủ bằng vàng. Mẫu được

quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét JEOL 5410 LV.

* Hình thái tế bào của chủng Li trên kính hiển vi điện tử quét

Chủng Li có khuẩn lạc tròn, bề mặt khô, có chân ăn sâu vào thạch. Khuẩn lạc khi

trẻ có màu trắng, khi gìa chuyển màu xanh sẫm. Dưới kính hiển vi điện tử với độ phóng

đại 15000 lần chủng Li có hình que, kích thước dài từ 1,8μm đến 2,0μm, bề rộng từ

0,48μm đến 0,5 μm, xung quanh mép tế bào có màng nhày. Xác định chủng Li là vi

khuẩn.

7

Hình thái tế bào của chủng Li trên kính hiển vi điện tử độ phóng đại 15.000 lần

2. Phương pháp nuôi cấy các chủng vi sinh.

Công thức môi trường nuôi cấy

* Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: (g/l)

CMC: 10g

Pepton: 0.5g

Cao thịt: 0.2g

NaCl: 1g

Nước cất: 1lít

* Môi trường nuôi cấy nấm men: (g/l)

CMC: 10g

Glucose: 1g

Pepton: 0.5g

Cao nấm men: 0.3g

Cao malt: 0.3g

Nước cất: 1lít

* Môi trường nuôi cấy các chủng vi sinh

vật sinh cellulase được sưu tập từ phòng

thí nghiệm của trường Đại học khoa học

Tự nhiên,

CMC: 10g

Tinh bột: 1g

MgSO4: 0.2g

NaHCO3: 0.2g

K2HPO4: 5g

CaCl2: 0.2g

NaCl: 0.2g

Pepton: 2g

Nước cất: 1lít

* Môi trường nuôi cấy nấm sợi: (g/l)

CMC: 10g

Cao malt: 0.2g

Nước cất: 1lít

*Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn: (g/l)

CMC: 10g

Tinh bột: 1g

Cao nấm men: 0.2g

Nước cất: 1lít

8

* Công thức môi trường nuôi cấy tối ưu cho vi khuẩn

Môi trường Thành phần

MT1 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis VTCC-B-505: (g/l)

CMC 10g; Pepton 0.5g; Cao thịt 0.2g; NaCl 1g, Tinh bột 1g, Cao nấm men

0.2g, Nước cất 1lít

MT1’ CMC 2g; CaCl2 0,2g; NaCl 2g; Cao thịt 1g, nước cất 1lit

MT2 Môi trường nuôi cấy chủng Li (Bacillus lichenformis) được sưu tập từ

phòng thí nghiệm của trường Đại học khoa học Tự nhiên:

CMC 10g, Tinh bột 1g, MgSO4 0.2g, NaHCO3 0.2g, K2HPO4 5g, CaCl2

0.2g, NaCl 0.2g, Pepton 2g, Nước cất 1lít

MT2’ CMC 10g; MgSO4 0,2g; NaHCO3 0,2g; K2HPO4 5g; CaCl2 0,2g; NaCl

0,2g; pepton 2g; nước cất 1lit

MT3 CMC 2g; NH4NO3 1g; K2HPO4 0,5g; KH2PO4 0,5g; MgSO4 0,5g; NaCl

1g; CaCl2 0,1g FeCl3 0,02g; Cao men 0,05g, nước cất 1lit

MT4 CMC 2g; MgSO4 0,2g; NaHCO3 0,2g; K2HPO4 5g; CaCl2 0,2g; NaCl 0,2g;

nước mắm 20ml, nước cất 1lit

MT5 CMC 2g; bột đậu tương 2g, bột gạo 2g; NH4Cl 0,4g, KH2PO4 0,6g;

K2HPO4 1g; nước cất 1lit

MT6 CMC 2g; (NH4)2SO4 1,5g; KH2PO4 0,5g; K2HPO4 0,5g; MgSO4 0,4g;

NaCl 0,1g; MnSO4 0,01g; FeSO4 0,01g; Cao men 0,1g; nước cất 1lit

Cân chính xác thành phần môi trường nuôi cấy cho vào bình tam giác 1000ml chứa

sẵn khoảng 800 ml nước cất. Đun sôi nhẹ và khuấy cho CMC tan hết. Bao gói và hấp

khử trùng ở 121oC, 20 phút.

* Các bước tiến hành nuôi cấy vi sinh vật

Cho 2ml nước muối sinh lý vào ống nghiệm chứa khuẩn lạc của chủng vi sinh vật.

Dùng que cấy móc cà nhẹ lên môi trường thạch để sinh khối tế bào hòa vào dịch muối.

Chuyển dịch muối chứa sinh khối vi sinh vật vào bình môi trường đã pha ở trên. Nuôi

cấy trong điều kiện lắc 200 vòng/phút ở 280C trong 48h để thu enzym cellulase.

9

* Xác định hoạt tính sinh cellulase của vi sinh vật bằng phương pháp khuếch tán

trên thạch có cơ chất CMC và bột giấy

* Môi trường xác định hoạt tính

- Môi trường Cell .

Thành phần gồm có (g/l):

(NH4)2HPO4 1,5

KH2PO4 0,5

K2HPO4 0,5

MgSO4 .H2O 0,4

NaCl 0,1

MnSO40,01

FeSO4 7H2O 0,01

Bột giấy 2

Nước cất 1000ml

- Môi trường Khoáng + CMC:

Thành phần gồm có (g/l):

NH4NO3 : 1

K2HPO4 0,5

KH2PO40,5

MgSO4. 7H2O 0,5

NaCl 1

CaCl2 0,1

FeCl3 0,02

Cao men 0,05

Thạch 20

Nước cất 1000 ml ;

pH = 7,0 - 7,2

Các môi trường được khử trùng ở 121oC trong 30 phút.

- Môi trường CMC: Thành phần (g/l): CMC 2; Thạch: 20; Nước cất: 1000ml

Phương pháp đục lỗ: nhỏ 0,2ml dịch nuôi vào các giếng thạch có đường kính

10mm, giữ ở 4oC trong 2h để dịch khuếch tán đều xung quanh giếng thạch. Ủ ở 300C

trong 36 giờ, sau đó tráng dịch Lugol trên đĩa thạch và đo vòng phân hủy trong suốt

không bắt màu nhuộm xung quanh giếng thạch.

* Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy 2 chủng vi khuẩn B505 và Li đã lựa chọn

+ Lựa chọn môi trường nuôi cấy

Để có thể sản xuất enzyme ở quy mô lớn, chúng tôi tiến hành lựa chọn các nguồn

cơ chất dễ kiếm, rẻ tiền. Chúng tôi tiến hành xác định khả năng sinh trưởng và tiết

enzyme cellulase ngoại bào của 2 chủng Li và B505 trên một số loại cơ chất: bột đậu

tương, bột gạo, nước mắm, môi trường giàu chất khoáng và so sánh với môi trường quy

mô phòng thí nghiệm (môi trường MT1, MT1’, MT2, MT2’, MT3, MT4, MT5, MT6)

10

+ Thời gian nuôi cấy

Thời gian nuôi cấy cũng là một trong những nhân tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng

và khả năng sinh enzyme của các chủng vi khuẩn. Trong quá trình nuôi cấy và xác định

hoạt tính của chủng B505 và Li được theo dõi ở các mốc thời gian sau:24, 48, 68, 72,

92, 96 h.

+ Nhiệt độ

Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng và

phát triển của vi khuẩn. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng sinh trưởng và tiết

cellulase ngoại bào của 2 chủng B505 ở nhiệt độ 28, 30, 32, 37 và 45 ºC.

+ pH

pH cũng là một trong các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng

và phát triển của vi khuẩn. Vì vậy chúng tôi nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của pH ( 4-

8) đến khả năng sinh trưởng và tiết cellulase ngoại bào của chúng.

11

PHỤ LỤC 3

MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Xây dựng đường chuẩn glucose

Biểu đồ 1. Đồ thị đường chuẩn glucose

3.2. Xác định độ bền của chế phẩm enzyme cellulase từ 2 chủng B505 và Li theo

thời gian bảo quản

Các chế phẩm enzyme cellulase ngoại bào thu được từ 2 chủng B505 và Li được

bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 ºC (có bổ sung NaN3 0,02%) trong 1 ngày, 1 tuần, 2

tuần và 3 tuần. Ở cùng 1 điều kiện thủy phân, chúng tôi sử dụng phương pháp DNSA

xác định đầu đường khử để kiểm tra hoạt tính của chế phẩm enzyme theo thời gian bảo

quản. Kết quả trình bày trong hình 2 ÷ 3.

y = 3.138x - 0.223

R2 = 0.9925

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35

Nồng độ glucose (mg/ml)

A 5

30n

m

12

Biểu đồ 2. Độ bền của chế phẩm enzyme cellulase (Li ) theo thời gian bảo quản

Biểu đồ 3. Độ bền của chế phẩm enzyme cellulase (B505) theo thời gian bảo quản

Kết quả trên hình 2 và hình 3 cho thấy, sau 1 tuần bảo quản ở 4ºC, chế phẩm

cellulase của chủng B505 chỉ còn 58 % so với hoạt tính ban đầu và sau 2 tuần bảo quản

hoạt tính chỉ còn 26%. Trong khi đó cellulase của chủng Li bền hơn khi sau 2 tuần bảo

quản ở 4 ºC, hoạt tính vẫn còn 79,3 %. Chính vì vậy, chúng tôi lựa chọn cả 2 chế phẩm

cellulase từ chủng B505 và chủng Li để có thể thích ứng với từng điều kiện sản xuất và

bảo quản nguyên liệu.

0

20

40

60

80

100

1 ngày 1 tuần 2 tuần 3 tuần

Ho

ạt t

ính t

ươ

ng đ

ối

(%)

Thời gian bảo quản (ngày)

0

20

40

60

80

100

120

1 ngày 1 tuần 2 tuần 3 tuần

Ho

ạt t

ính t

ườ

ng đ

ối

(%)

Thời gian bảo quản (tuần)

13

3.3. So sánh chế phẩm enzym thô ở dạng lỏng và dạng đông khô

Để có thể bảo quản được chế phẩm enzym thô từ dạng lỏng, chúng tôi đã nghiên

cứu để sản xuất chế phẩm ở dạng đông khô.Từ 100ml dịch enzym cellulase thô của

chủng B505, thêm phụ gia, đông khô ở nhiệt độ 4°C thu được 20g chế phẩm ở dạng bột

khô. Chế phẩm enzym đông khô sau khi hòa lại để đạt cùng thể tích và nồng độ với chế

phẩm enzym ở dạng lỏng, chúng tôi đã tiến hành so sánh hoạt tính của 2 dạng chế phẩm.

Hình 1. Hoạt tính của chế phẩm enzym cellulase ở dạng lỏng và dạng khô

Hình 3.18 cho thấy chế phẩm enzym cellulase ở dạng lỏng có đường kính vòng

thủy phân 2,5 cm và chế phẩm enzym cellulase ở dạng bột khô có đường kính vòng thủy

phân là 2cm. Để sử dụng chế phẩm enzym cellulase trong thời gian dài, chúng tôi có thể

bảo quản chế phẩm ở dạng đông khô. Tuy nhiên hoạt tính của chế phẩm ở dạng bột khô

giảm hơn so với sử dụng chế phẩm ở dạng lỏng và giá thành để đông khô chế phẩm là

khá cao.Cho nên cần chọn lọc biện pháp hiệu quả, có thểtự sản xuất chế phẩm dạng lỏng

tại chỗ và sử dụng ngay cho quá trình thuỷ phân bãagar để giảm giá thành khi sấy

hoặcđông khô.

Chúng tôi sẽ tiếp tục nghiên cứu phương pháp bảo quản chế phẩm enzym cellulase

thô thu được từ chủng B505 ở dạng lỏng để giảm giá thành sản xuất và cho hiệu quả sử

dụng cao khi thủy phân bã agar làm thức ăn gia súc.

Chế phẩm enzym dạng thô

Chế phẩm enzym dạng lỏng

14

PHỤ LỤC 4

KẾT QUẢ NUÔI THỬ NGHIỆM CỦA ĐỀ TÀI

Bảng IV.1 : Thành phần hóa học của các nguyên liệu phối trộn

WUFFF DA

Cost Min. Max. Weight Dry Matter M.E. Protein E.E. C18:3 C.F

ACTIVE INGREDIENT COMPOSITION MATRIX

Bột cá lạt 58% CP 21000 1 90.7 3.22 58.43 6.17 1.89

Đậu nành rang 35000 1 90.9 3.74 39.64 15.5 9.03

Bột mì 20000 1 89 1.3 15.7 3 1.7 11

Cám gạo mịn 8% 7000 1 89.8 2.45 12.57 7.36 6.48

Bã rong khô 4000 1 88.5 2.478

Hạt bắp vàng 9 %CP 7000 1 88.8 3.31 9.42 4.15 1.95

Premix KVTM 46284 0 0 1 96 0 0 0 0 0

Vitamin ADE 342000 0 0 1 96

Binder 60000 0 0 1 95

WUFFF DA

Calcium

Total

Phos. Avail.Phos. K Cl Mn Na Zn Biotin Choline Folate

ACTIVE INGREDIENT COMPOSITION MATRIX

Bột cá lạt

58% CP 4.55 2.11 2.11 2.9

Đậu nành

rang 0.27 0.63 0.21

Bột mì 0.14 1.15 0.34 1.19 0.06 113 0.05 133 0.48 1.88 1.2

Cám gạo mịn

8% 0.17 0.91 0.3

Bã rong khô

Hạt bắp

vàng 9 %CP 0.14 0.37 0.12

15

Premix

KVTM 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Vitamin

ADE 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Binder 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

UFFF DA

ARG GLY SER

GLY

&SER HIS ILE LEU LYS MET

ACTIVE INGREDIENT COMPOSITION MATRIX

Bột cá lạt 58% CP 2.95 3.91 1.87 5.78 1.41 1.94 3.82 3.8 1.39

Đậu nành rang 2.42 1.51 0.49 2 0.85 1.45 2.66 2.17 0.54

Bột mì 0.98 0.9 0.9 1.8 0.34 0.59 0.91 0.59 0.17

Cám gạo mịn 8% 0.74 0.36 0.43 0.79 0.18 0.33 0.68 0.27 0.27

Bã rong khô 0.09 0.22 0.24 0.461 0.14 0.41 0.645 0.314 0.183

Hạt bắp vàng 9

%CP 0.44 0.35 0.45 0.8 0.31 0.32 1.15 0.24 0.24

WUFFF DA

ARG CYS TSAA PHE TYR TAAA THR TRP VAL

ACTIVE INGREDIENT COMPOSITION MATRIX

Bột cá lạt 58% CP 2.95 0.55 1.94 1.61 2.1 3.71 0.21 0.56 2.38

Đậu nành rang 2.42 0.59 1.13 1.63 1.11 2.74 1.35 0.5 1.49

Bột mì 0.98 0.25 0.42 0.49 0.4 0.89 0.42 0.3 0.73

Cám gạo mịn 8% 0.74 0.22 0.49 0.44 0.38 0.82 0.3 0.1 0.47

Bã rong khô 0.43 0.24 0.19

Hạt bắp vàng 9

%CP 0.44 0.24 0.48 0.43 0.32 0.75 0.32 0.08 0.43

16

Bảng IV.2: Tính toán công thức thức ăn bằng WUFFF DA

WUFFF DA

Feed

Cost:

$

19.157

Feed:

Cá rô phi

CT 1

Ingredient Cost Min. Amount Max. Nutrient Units Min. Amount Max.

d/kg % % %

Bot ca lat 58%

CP 21000 0,00 19,0 0,00 Dry Matter % 87,00 89,930 100

Dau nanh rang 35000 0,00 19,0 0,00

Metabolozable

Energy Kcal/g 2,60 3,028 100

Bột mì 20000 0,00 5,0 0,00 Protein % 18,50 25,206 100

Cam gao min

8% 7000 0,00 20,0 0,00 Ether Extract % 6,00 7,174 100

Bã rong khô 4000 0,00 0 0,00 Linoleic Acid % 1,00 0,085 100

Hat bap vang

9%CP 6000 0,00 34,75 0,00 Crude Fiber % 6,00 4,598 100

Premix KVTM 46284 0,00 1,0 0,00 Calcium % 3,60 1,005 100

Vitamin ADE 342000 0,00 1,0 0,00

Total

Phosphorus % 0,80 0,889 100

Binder 60000 0,00 0,25 0,00

Avail.

Phosphorus % 0,60 0,560 100

Potassium % 0,15 0,060 100

Chlorine % 0,12 0,003 100

TOTAL 100,0 Manganese mg/kg 0,00 5,650 100

Sodium % 0,15 0,003 100

Zinc mg/kg 50,00 6,650 100

Biotin mg/kg 0,00 0,024 100

Choline g/kg 0,00 0,645 100

Folate mg/kg 0,00 0,060 100

ARG % 0,90 1,370 100

GLY % 0,00 1,268 100

SER % 0,00 0,736 100

GLY&SER % 0,00 2,004 100

HIS % 0,50 0,590 100

ILE % 0,38 0,851 100

LEU % 0,76 1,812 100

LYS % 0,80 1,301 100

MET % 0,28 0,513 100

CYS % 0,36 0,357 100

TSAA % 0,64 0,869 100

PHE % 0,00 0,878 100

TYR % 0,00 0,817 100

TAAA % 0,00 1,695 100

THR % 0,68 0,489 100

TRP % 0,16 0,264 100

100

17

WUFFF DA

Feed

Cost: $ 15.115

Feed:

Cá rô phi

CT2

Ingredient Cost Min. Amount Max. Nutrient Units Min. Amount Max.

d/kg % % %

Bot ca lat

58% CP 21000 0,00 19,0 0,00 Dry Matter % 87,00 89,936 100

Dau nanh

rang 35000 0,00 20,0 0,00

Metabolozable

Energy Kcal/g 2,60 2,866 100

Bột mì 20000 0,00 5,0 0,00 Protein % 18,50 25,161 100

Cam gao min

8% 7000 0,00 20,0 0,00 Ether Extract % 6,00 7,079 100

Bã rong khô 4000 0,00 5,0 0,00 Linoleic Acid % 1,00 0,085 100

Hat bap vang

9 %CP 6000 0,00 28,75 0,00 Crude Fiber % 6,00 4,572 100

Premix

KVTM 46284 0,00 1,0 0,00 Calcium % 3,60 1,000 100

Vitamin ADE 342000 0,00 1,0 0,00

Total

Phosphorus % 0,80 0,873 100

Binder 60000 0,00 0,25 0,00

Avail.

Phosphorus % 0,60 0,554 100

Potassium % 0,15 0,060 100

Chlorine % 0,12 0,003 100

TOTAL 100,0 Manganese mg/kg 0,00 5,650 100

Sodium % 0,15 0,003 100

Zinc mg/kg 50,00 6,650 100

Biotin mg/kg 0,00 0,024 100

Choline g/kg 0,00 0,645 100

Folate mg/kg 0,00 0,060 100

ARG % 0,90 1,373 100

GLY % 0,00 1,274 100

SER % 0,00 0,726 100

GLY&SER % 0,00 1,999 100

HIS % 0,50 0,587 100

ILE % 0,38 0,867 100

LEU % 0,76 1,802 100

LYS % 0,80 1,324 100

MET % 0,28 0,513 100

CYS % 0,36 0,348 100

TSAA % 0,64 0,852 100

PHE % 0,00 0,889 100

TYR % 0,00 0,821 100

TAAA % 0,00 1,677 100

THR % 0,68 0,493 100

TRP % 0,16 0,264 100

VAL % 0,47 1,004 100

18

WUFFF

DA

Feed

Cost

:

$

17.042

Feed: Cá rô phi

CT3

Ingredient Cost Min. Amount Max

.

Nutrient Units Min. Amoun

t

Max.

d/kg % % %

Bot ca lat

58% CP 21000

0,00 20,0 0,00 Dry Matter % 87,0

0 89,940

100

Dau nanh

rang 35000

0,00 20,0 0,00 Metabolozabl

e Energy

Kcal/

g

2,60 2,700

100

Bột mì

20000

0,00 5,0 0,00 Protein % 18,5

0 25,304

100

Cam gao

min 8% 7000

0,00 20,0 0,00 Ether Extract % 6,00 6,892

100

Bã rong khô 4000 0,00 10,0 0,00 Linoleic Acid % 1,00 0,085 100

Hat bap

vang 9

%CP 6000

0,00 22,75 0,00 Crude Fiber % 6,00 4,474

100

Premix

KVTM 46284

0,00 1,0 0,00 Calcium % 3,60 1,037

100

Vitamin

ADE 342000

0,00 1,0 0,00 Total

Phosphorus

% 0,80 0,872

100

Binder

60000

0,00 0,25 0,00 Avail.

Phosphorus

% 0,60 0,568

100

Potassium % 0,15 0,060 100

TOTAL 100,0 Chlorine % 0,12 0,003 100

Manganese mg/kg 0,00 5,650 100

Sodium % 0,15 0,003 100

Zinc mg/kg 50,0

0 6,650

100

Biotin mg/kg 0,00 0,024 100

Choline g/kg 0,00 0,674 100

Folate mg/kg 0,00 0,060 100

ARG % 0,90 1,380 100

GLY % 0,00 1,303 100

SER % 0,00 0,729 100

GLY&SER % 0,00 2,032 100

HIS % 0,50 0,589 100

ILE % 0,38 0,887 100

LEU % 0,76 1,804 100

LYS % 0,80 1,364 100

MET % 0,28 0,521 100

CYS % 0,36 0,339 100

TSAA % 0,64 0,842 100

PHE % 0,00 0,901 100

TYR % 0,00 0,835 100

TAAA % 0,00 1,669 100

THR % 0,68 0,485 100

TRP % 0,16 0,265 100

VAL % 0,47 1,002 100

19

WUFFF

DA

Feed

Cost

:

$

17.382

Feed: Cá rô phi

CT4

Ingredient Cost Min. Amount

Max

. Nutrient Units Min.

Amoun

t Max.

d/kg % % %

Bot ca lat

58% CP 21000 0,00 20,0 0,00 Dry Matter %

87,0

0 89,946 100

Dau nanh

rang 35000 0,00 21,0 0,00

Metabolozabl

e Energy

Kcal/

g 2,60 2,539 100

Bột mì 20000 0,00 5,0 0,00 Protein %

18,5

0 25,259 100

Cam gao

min 8% 7000 0,00 20,0 0,00 Ether Extract % 6,00 6,798 100

Bã rong khô 4000 0,00 15,0 0,00 Linoleic Acid % 1,00 0,085 100

Hat bap

vang 9

%CP 6000 0,00 16,75 0,00 Crude Fiber % 6,00 4,447 100

Premix

KVTM 46284 0,00 1,0 0,00 Calcium % 3,60 1,031 100

Vitamin

ADE 342000 0,00 1,0 0,00

Total

Phosphorus % 0,80 0,856 100

Binder 60000 0,00 0,25 0,00

Avail.

Phosphorus % 0,60 0,563 100

Potassium % 0,15 0,060 100

Chlorine % 0,12 0,003 100

TOTAL 100 Manganese mg/kg 0,00 5,650 100

Sodium % 0,15 0,003 100

Zinc mg/kg

50,0

0 6,650 100

Biotin mg/kg 0,00 0,024 100

Choline g/kg 0,00 0,674 100

Folate mg/kg 0,00 0,060 100

ARG % 0,90 1,383 100

GLY % 0,00 1,308 100

SER % 0,00 0,719 100

GLY&SER % 0,00 2,027 100

HIS % 0,50 0,586 100

ILE % 0,38 0,903 100

LEU % 0,76 1,793 100

LYS % 0,80 1,387 100

MET % 0,28 0,522 100

CYS % 0,36 0,331 100

TSAA % 0,64 0,825 100

PHE % 0,00 0,913 100

TYR % 0,00 0,839 100

TAAA % 0,00 1,652 100

THR % 0,68 0,489 100

TRP % 0,16 0,265 100

VAL % 0,47 0,991 100

20

WUFFF DA Feed

Cost: 14660

Feed: Cá rô

phi CT5

Ingredient Cost Min. Amount Max. Nutrient Units Min. Amount Max.

d/kg % % %

Bot ca lat

58% CP 21000 0,00 21,0 0,00 Dry Matter % 87,00 89,939 100

Dau nanh

rang 35000 0,00 20,5 0,00

Metabolozable

Energy Kcal/g 2,60 2,370 100

Bột mì 20000 0,00 5,0 0,00 Protein % 18,50 25,251 100

Cam gao min

8% 7000 0,00 20,0 0,00 Ether Extract % 6,00 6,554 100

Bã rong khô 4000 0,00 20,0 0,00 Linoleic Acid % 1,00 0,085 100

Hat bap vang

9 %CP 6000 0,00 11,3 0,00 Crude Fiber % 6,00 4,313 100

Premix

KVTM 46284 0,00 1,0 0,00 Calcium % 3,60 1,068 100

Vitamin

ADE 342000 0,00 1,0 0,00

Total

Phosphorus % 0,80 0,853 100

Binder 60000 0,00 0,3 0,00

Avail.

Phosphorus % 0,60 0,577 100

Potassium % 0,15 0,060 100

Chlorine % 0,12 0,003 100

TOTAL 100,0 Manganese mg/kg 0,00 5,650 100

Sodium % 0,15 0,003 100

Zinc mg/kg 50,00 6,650 100

Biotin mg/kg 0,00 0,024 100

Choline g/kg 0,00 0,703 100

Folate mg/kg 0,00 0,060 100

ARG % 0,90 1,381 100

GLY % 0,00 1,331 100

SER % 0,00 0,723 100

GLY&SER % 0,00 2,054 100

HIS % 0,50 0,586 100

ILE % 0,38 0,918 100

LEU % 0,76 1,787 100

LYS % 0,80 1,416 100

MET % 0,28 0,529 100

CYS % 0,36 0,320 100

TSAA % 0,64 0,812 100

PHE % 0,00 0,919 100

TYR % 0,00 0,849 100

TAAA % 0,00 1,634 100

THR % 0,68 0,476 100

TRP % 0,16 0,264 100

VAL % 0,47 0,984 100

21

WUFFF DA Feed

Cost:

$ 14.685

Feed: Cá rô phi

CT6

Ingredient Cost Min. Amount Max. Nutrient Units Min. Amount Max.

d/kg % % %

Bot ca lat

58% CP 21000

0,00 21,5 0,00 Dry Matter % 87,00 89,915

100

Dau nanh

rang 35000

0,00 21,5 0,00 Metabolozable

Energy

Kcal/g 2,60 2,243

100

Bột mì 20000 0,00 5,0 0,00 Protein % 18,50 25,325 100

Cam gao min

8% 7000

0,00 16,0 0,00 Ether Extract % 6,00 6,341

100

Bã rong khô 4000 0,00 25,0 0,00 Linoleic Acid % 1,00 0,085 100

Hat bap vang

9 %CP 6000

0,00 8,75 0,00 Crude Fiber % 6,00 4,105

100

Premix

KVTM 46284

0,00 1,0 0,00 Calcium % 3,60 1,083

100

Vitamin ADE

342000

0,00 1,0 0,00 Total

Phosphorus

% 0,80 0,825

100

Binder

60000

0,00 0,25 0,00 Avail.

Phosphorus

% 0,60 0,574

100

Potassium % 0,15 0,060 100

Chlorine % 0,12 0,003 100

TOTAL 100,0 Manganese mg/kg 0,00 5,650 100

Sodium % 0,15 0,003 100

Zinc mg/kg 50,00 6,650 100

Biotin mg/kg 0,00 0,024 100

Choline g/kg 0,00 0,718 100

Folate mg/kg 0,00 0,060 100

ARG % 0,90 1,383 100

GLY % 0,00 1,354 100

SER % 0,00 0,721 100

GLY&SER % 0,00 2,074 100

HIS % 0,50 0,594 100

ILE % 0,38 0,942 100

LEU % 0,76 1,809 100

LYS % 0,80 1,456 100

MET % 0,28 0,533 100

CYS % 0,36 0,314 100

TSAA % 0,64 0,801 100

PHE % 0,00 0,936 100

TYR % 0,00 0,859 100

TAAA % 0,00 1,628 100

THR % 0,68 0,480 100

TRP % 0,16 0,266 100

VAL % 0,47 0,981 100

22

Bảng IV.3 : Bảng số liệu các chỉ tiêu môi trường

Ngày Nhiệt độ

sáng (0C)

Nhiệt độ

chiều (0C) pH sáng

pH

chiều

DO sáng

(mg/l)

DO chiều

(mg/l)

1 28,5 29,5 6,9 7,4 5,5 6

2 28,5 29 6,9 7,4 5 5,5

3 28,5 29 6,9 7,4 5 5

4 28,5 28,5 6,8 7,3 5,5 5

5 28 29 6,8 7,3 5 5

6 28 29 6,9 7,4 5,5 5,5

7 28 28,5 6,9 7,2 5,5 5,5

8 28 29 6,8 7,4 6 6

9 28 29 6,6 7,4 5,5 5,5

10 28 29 6,6 7,4 5 5,5

11 28 29,5 6,7 7,4 5 5

12 28 29,5 6,6 7,5 5,5 5

13 28,5 29 6,7 7,2 5 5

14 28,5 29,5 6,8 7,3 5,5 5,5

15 28,5 29 6,8 7,4 5 5

16 28,5 29 6,8 7,3 5,5 6

17 28 29 6,9 7,4 4,5 5

18 28 29 7 7,5 5 6

19 28 29 6,8 7,3 5 5,5

20 28 28,5 6,9 7,3 5 5,5

21 28 29 6,8 7,4 5 5

22 28 29 6,8 7,3 5,5 5

23 28 28,5 6,8 7,4 5 5,5

24 28 29 6,9 7,5 5 5

25 28,5 29 6,8 7,3 5,5 5,5

26 28,5 28,5 6,8 7,3 5 5

27 28 28,5 6,9 7,3 5 5,5

28 28 29 6,9 7,3 5,5 5,5

29 28 28,5 6,9 7,4 6 6

30 28 28,5 7 7,4 5,5 5,5

31 28 28,5 7,1 7,3 6 5,5

32 28 28 7,1 7,4 5 5

33 28,5 28,5 7,2 7,5 5,5 5

34 28,5 29 7 7,5 5 5

35 28,5 28,5 7 7,6 5,5 5,5

23

36 28 28,5 7 7,5 5 5

37 28 28,5 7 7,4 5,5 5,5

38 28 29 7,1 7,5 5,5 5,5

39 28,5 29 7,2 7,6 5 6

40 28,5 29,5 7,2 7,6 5 5,5

41 29 29,5 7,2 7,7 5 5,5

42 29 29,5 6,8 7,4 5 5

43 29 29 7,1 7,5 5,5 5,5

44 28,5 29 7,1 7,5 5 6

45 28,5 28,5 7,2 7,6 5 5,5

46 28 28,5 7,1 7,5 6 6

47 28 28,5 7,1 7,5 5 5

48 28 28 7,2 7,6 5,5 5

49 27,5 28 7,1 7,5 5 5

50 27,5 28 7,2 7,6 5,5 5,5

51 27,5 27,5 7,2 7,5 6 6

52 27 27,5 7,1 7,6 5,5 5,5

53 27 27,5 7,2 7,5 5,5 5,5

54 27 27,5 7,2 7,5 5 5

55 27 28 7 7,4 5 5,5

56 27 28 7 7,5 5,5 5,5

57 27,5 28,5 7,2 7,6 5,5 5

58 28 28,5 7,1 7,6 5 5

59 28 29 7,2 7,7 4,5 5

60 28 29 7,3 7,6 5 5

61 28 29,5 7,3 7,8 5 5

62 28,5 29 7,4 7,6 5 5,5

63 28 28,5 7,4 7,8 5,5 5,5

64 27,5 28 7,3 7,8 5,5 5,5

65 27 27,5 7,4 7,8 5 6

66 26,5 27 7,4 7,8 5 5,5

67 26,5 27 7,3 7,6 5 6

68 26,5 27,5 7,3 7,7 5,5 5,5

69 27 27,5 7,4 7,8 5,5 6

70 27 28 7,2 7,6 5 6

71 27,5 28 7,2 7,7 5,5 5,5

72 27,5 28 7,3 7,5 5 5,5

73 27,5 28,5 7,1 7,5 5 5,5

24

74 28 28,5 7,2 7,6 5 5

75 28 28,5 7,2 7,6 5,5 6

76 28 29 7,1 7,5 5 5

77 28,5 29 7,1 7,6 5,5 5,5

78 28,5 29,5 7,2 7,7 5 5

79 28,5 29 7,2 7,5 5,5 5,5

80 28,5 29 7,2 7,3 5,5 5,5

81 28 28,5 7,2 7,3 5 6

82 28 29 7,1 7,2 5,5 5,5

83 28 29 7,1 7,2 5 5,5

84 28 28,5 7,2 7,3 5 5

85 28 29 7,2 7,6 5,5 5,5

86 28 29 7,3 7,7 5 5

87 28 29 7,3 7,7 5,5 5

88 28 29,5 7,1 7,5 5,5 5

89 28,5 29,5 7,1 7,5 5 5

90 28,5 29 7,2 7,5 5,5 5,5

91 28,5 29,5 7,3 7,5 5,5 5,5

92 28,5 29 7,2 7,6 5 6

93 28 29 7,2 7,6 5 5,5

94 28 29 6,8 7,2 5 6

95 28 29 6,9 7,4 5 5,5

96 28 29 6,9 7,5 5,5 6

97 28 28,5 6,6 7,4 5 6

98 28 29 6,7 7,4 5,5 5,5

99 28 29 6,6 7,4 5,5 5,5

100 28 28,5 6,8 7,4 5 6

101 28,5 29 6,8 7,5 5 5,5

102 28,5 29 6,7 7,2 5 5,5

103 28 28,5 6,8 7,3 5 5

104 28 28,5 6,8 7,4 5,5 5

105 28 29 6,8 7,3 5 5

106 27,5 28,5 6,9 7,4 5 5

107 27,5 28,5 6,7 7,7 5,5 5

108 28 28,5 7,1 7,6 5 5

109 28 28 7,1 7,6 5,5 5,5

110 28 28,5 7,2 7,7 5,5 5,5

111 28 28,5 7,2 7,6 5 6

25

112 28 28 7,3 7,7 5,5 5,5

113 27,5 28 7,4 7,7 5 6

114 27,5 28 7,1 7,6 5 5,5

115 27,5 27,5 7,1 7,6 5,5 6

116 27,5 28 7,2 7,6 5 6

117 27,5 28 7,3 7,6 5,5 5,5

118 27,5 28 7,2 7,7 5 5,5

119 28 28,5 7,2 7,7 5 5,5

120 28 28,5 6,8 7,3 5 5

121 28 28 6,9 7,3 5,5 5

122 28 28,8 6,9 7,3 5 5

123 28 28,5 6,8 7,3 5,5 5,5

124 28 29 6,8 7,3 5 5

125 28 29 6,7 7,2 5,5 5,5

126 28,5 29 6,8 7,3 5,5 5,5

127 28,5 29 6,8 7,3 5 6

128 28,5 28,5 6,7 7,3 5 5,5

129 28 28,5 6,8 7,3 5 5,5

130 28 28,5 6,8 7,8 5 5

131 28 29 6,8 7,7 5,5 5

132 28,5 29 6,9 7,4 5 5

133 28,5 29,5 7,2 7,7 5 5

134 29 29,5 7,1 7,6 5,5 5

135 29 29,5 7,1 7,6 5 5

136 29 29 7,2 7,7 5,5 5,5

137 28,5 29 7,2 7,6 5,5 5,5

138 28,5 28,5 7,3 7,7 5 6

139 28 28,5 7,4 7,7 5 5,5

140 28 28,5 7,1 7,6 5,5 5,5

141 28 28 7,1 7,6 5 6

142 27,5 28 7,2 7,6 5 5,5

143 27,5 28 7,3 7,6 5 5,5

144 27,5 27,5 7,2 7,7 5 5

145 27 27,5 7,2 7,7 5,5 5

146 27 27,5 6,8 7,3 5 5

147 27 27,5 6,9 7,3 5 5

148 27 28 6,9 7,5 5,5 5

149 27 28 6,7 7,4 5 5

26

150 27,5 28,5 6,8 7,4 5,5 5,5

151 28 29 7 7,2 5 5

152 28 29 7 7,2 5,5 5,5

153 28 28,5 6,9 7,2 5 5

154 28,5 29 6,9 7,2 5,5 5,5

155 28,5 29 7 7,4 5 6

156 28,5 29 6,7 7,2 5 5,5

157 28 28,5 6,8 7,3 5 5

158 28 28,5 6,8 7,4 5,5 5

159 28 29 6,8 7,3 5 5

160 27,5 28,5 6,9 7,4 5 5

161 27,5 28,5 6,7 7,7 5,5 5

162 28 28,5 7,1 7,6 5 5

163 28 28 7,1 7,6 5,5 5,5

164 28 28,5 7,2 7,7 5,5 5,5

165 28 28,5 7,2 7,6 5 6

166 28 28 7,3 7,7 5,5 5,5

167 27,5 28 7,4 7,7 5 6

168 27,5 28 7,1 7,6 5 5,5

169 27,5 27,5 7,1 7,6 5,5 6

170 27,5 28 7,2 7,6 5 6

171 28,5 29 7,1 7,6 5,5 5,5

172 28,5 29,5 7,2 7,7 5 5

173 28,5 29 7,2 7,5 5,5 5,5

174 28,5 29 7,2 7,3 5,5 5,5

175 28 28,5 7,2 7,3 5 6

176 28 29 7,1 7,2 5,5 5,5

177 28 29 7,1 7,2 5 5,5

178 28 28,5 7,2 7,3 5 5

179 28 29 7,2 7,6 5,5 5,5

180 28 29 7,3 7,7 5 5

181 28,5 28,5 7,2 7,5 5,5 5

182 28,5 29 7 7,5 5 5

183 28,5 28,5 7 7,6 5,5 5,5

184 28 28,5 7 7,5 5 5

27

Bảng IV.4: Bảng mô tả thống kê các số liệu môi trường nước ao nuôi

Descriptive Statistics

Minimum Maximum Mean

Std.

Deviation

Nhiệt độ sáng (oC) 26,5 29 27,99 0,51

Nhiệt độ chiều (oC) 27 29,5 28,61 0,57

DO sáng (mg/l) 4,5 6 5,23 0,29

DO chiều (mg/l) 5 6 5,40 0,36

pH sáng 6,6 7,4 7,04 0,21

pH chiều 7,2 7,8 7,49 0,16

Bảng IV.5: Bảng số liệu đo tăng trọng cá thí nghiệm sau 80 ngày nuôi

Nghiệm

thức

Mẫu

Trọng

lượng cá

ban đầu

(g/con)

Trọng

lượng cá

cuối (g)

20 ngày

(g/con)

40 ngày

(g/con)

60 ngày

(g/con)

80 ngày

(g/con)

CT1

0%

1 212 310 430 540 630

1 208 315 420 535 640

1 204 300 430 538 635

1 208 305 435 545 625

1 208 308 430 545 628

1 204 310 427 535 625

1 206 312 435 525 628

1 205 315 420 545 632

1 205 305 430 535 630

1 200 300 425 540 628

CT 2

5%

1 205 270 390 520 656

1 208 278 402 518 650

1 204 272 405 510 648

1 212 273 395 505 645

1 208 276 390 510 658

1 204 274 398 518 650

1 206 278 400 520 652

1 205 272 397 515 655

1 205 275 395 512 657

1 210 274 398 515 652

CT3

10%

1 208 285 414 546 685

1 210 298 420 540 670

28

1 212 292 410 550 679

1 208 298 407 556 678

1 205 292 420 542 665

1 204 297 418 548 679

1 206 302 416 538 672

1 205 296 418 542 677

1 208 295 416 548 665

1 210 297 412 543 680

CT4

15%

1 210 340 470 610 765

1 208 335 475 595 765

1 204 332 473 605 768

1 208 336 480 605 760

1 208 338 478 600 772

1 204 330 475 605 770

1 190 335 470 608 765

1 205 330 480 602 760

1 205 340 476 610 765

1 205 337 477 607 760

CT 5

20%

1 212 340 468 600 740

1 208 338 475 605 738

1 190 335 458 595 735

1 208 330 465 603 730

1 208 328 468 598 738

1 204 345 460 592 735

1 206 335 462 597 730

1 205 330 460 605 738

1 205 335 465 600 737

1 212 335 468 603 730

CT6

25%

1 190 355 455 585 680

1 208 350 445 590 685

1 204 345 440 595 678

1 208 347 455 578 680

1 210 342 450 595 682

1 204 340 448 582 685

1 206 335 452 590 690

1 210 348 455 585 695

1 205 350 455 587 685

1 205 340 445 595 690

29

Bảng IV.6. Kết quả nuôi thử nghiệm

Mẫu thí

nghiệm

Nghiệm

thức

Mẫu Trọng lượng

cá ban đầu (g)

Trọng lượng

cá cuối (g)

DWG

(g/ngày)

1 CT 1 (0%) 1 212 630 5,23

2 1 208 640 5,40

3 1 204 635 5,39

4 1 208 625 5,21

5 1 208 628 5,25

6 1 204 625 5,26

7 1 206 628 5,28

8 1 205 632 5,34

9 1 205 630 5,31

10 1 200 628 5,35

GTTB 206 630,1 5,30

Std 3,23 4,61 0,07

1 CT 2 (5%) 1 205 656 5,64

2 1 208 650 5,53

3 1 204 648 5,55

4 1 212 645 5,41

5 1 208 658 5,63

6 1 204 650 5,58

7 1 206 652 5,58

8 1 205 655 5,63

9 1 205 657 5,65

10 1 210 652 5,53

GTTB 206,7 652,3 5,57

Std 2,71 4,19 0,07

1 CT 3 (10%) 1 208 685 5,96

2 1 210 670 5,75

3 1 212 679 5,84

4 1 208 678 5,88

5 1 205 665 5,75

6 1 204 679 5,94

7 1 206 672 5,83

8 1 205 677 5,90

9 1 208 665 5,71

10 1 210 680 5,88

GTTB 207,6 675 5,84

Std 2,59 6,7 0,08

1 CT 4 (15%) 1 210 765 6,94

30

2 1 208 765 6,96

3 1 204 768 7,05

4 1 208 760 6,90

5 1 208 772 7,05

6 1 204 770 7,08

7 1 190 765 7,19

8 1 205 760 6,94

9 1 205 765 7,00

10 1 205 760 6,94

GTTB 204,7 765 7,00

Std 5,56 4,19 0,09

1 CT 5 (20%) 1 212 740 6,60

2 1 208 738 6,63

3 1 190 735 6,81

4 1 208 730 6,53

5 1 208 738 6,63

6 1 204 735 6,64

7 1 206 730 6,55

8 1 205 738 6,66

9 1 205 737 6,65

10 1 212 730 6,48

GTTB 205,8 735,1 6,62

Std 6,2 3,81 0,09

1 CT 6 (25%) 1 190 680 6,13

2 1 208 685 5,96

3 1 204 678 5,93

4 1 208 680 5,90

5 1 210 682 5,90

6 1 204 685 6,01

7 1 206 690 6,05

8 1 210 695 6,06

9 1 205 685 6,00

10 1 205 690 6,06

GTTB 205 685 6,00

Std 5,73 5,35 0,08

31

Bảng IV.7: Tỷ lệ sống của cá rô phi nuôi thử nghiệm bằng các loại

thức ăn khác nhau

Mẫu thí

nghiệm

Nghiệm

thức

Số lượng cá

ban đầu (con)

số lượng cá cuối

cùng (con)

Tỷ lệ sống

(%)

1 CT 1 (0%) 24 18 75

2 24 17 70,83

3 24 20 83,33

GTTB 24 76,39

Std 6,36

1 CT 2 (5%) 24 19 79,17

2 24 20 83,33

3 24 19 79,17

GTTB 24 80,56

Std 2,41

1 CT 3 (10%) 24 20 83,33

2 24 19 79,17

3 24 20 83,33

GTTB 24 81,94

Std 2,41

1 CT 4 (15%) 24 20 83,33

2 24 21 87,5

3 24 22 91,67

GTTB 24 87,5

Std 4,17

1 CT 5 (20%) 24 22 91,67

2 24 22 91,67

3 24 20 83,33

GTTB 24 21,33 88,89

Std 4,81

1 CT 6 (25%) 24 22 91,67

2 24 21 87,5

3 24 19 79,17

GTTB 24 86,11

Std 6,37

Bảng IV.8 : Hệ số thức ăn nuôi thử nghiệm

32

Nghiệm thức Hệ số thức ăn Năng xuất thu

hoạch (g)

Khối lượng

ban đầu (g)

Khối lượng

tăng trọng

(g)

CT1 (0%) 2,67 11341,8 4800 6541,8

Ct 2 (5%) 2,38 12393,7 5040 7353,7

CT 3(10%) 1,92 14175 5040 9135

CT 4 (15%) 1,57 16065 4920 11145

CT 5 (20%) 1,69 15437,1 5088 10349,1

CT 6 (25%) 1,84 14385 4920 9465

Bảng IV.9: Bảng mô tả thống kê so sánh DWG và khối lượng của cá sau 140 ngày

nuôi

Descriptives

N Mean Std. Deviation Std. Error

95% Confidence Interval for Mean

Minimum Maximum

Lower Bound

Upper Bound

W 80 CT 1 (0%) 10 630.10 4.606 1.456 626.81 633.39 625 640

CT2 (5%) 10 652.30 4.191 1.325 649.30 655.30 645 658

CT3 (10%) 10 675.00 6.700 2.119 670.21 679.79 665 685

CT4 (15%) 10 765.00 4.190 1.325 762.00 768.00 760 772

CT5 (20%) 10 735.10 3.814 1.206 732.37 737.83 730 740

CT6 (25%) 10 685.00 5.354 1.693 681.17 688.83 678 695

Total 60 690.42 47.026 6.071 678.27 702.56 625 772

DWG CT 1 (0%) 10 5.3020 .06647 .02102 5.2545 5.3495 5.21 5.40

CT2 (5%) 10 5.5730 .07288 .02305 5.5209 5.6251 5.41 5.65

CT3 (10%) 10 5.8440 .08449 .02672 5.7836 5.9044 5.71 5.96

CT4 (15%) 10 7.0050 .08797 .02782 6.9421 7.0679 6.90 7.19

CT5 (20%) 10 6.6180 .08954 .02832 6.5539 6.6821 6.48 6.81

CT6 (25%) 10 6.0000 .07688 .02431 5.9450 6.0550 5.90 6.13

Total 60 6.0570 .59674 .07704 5.9028 6.2112 5.21 7.19

33

ANOVA

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

KHOILUONGCC Between Groups 129172.683 5 25834.537 1.073E3 .000

Within Groups 1299.900 54 24.072

Total 130472.583 59

DWG Between Groups 20.663 5 4.133 643.455 .000

Within Groups .347 54 .006

Total 21.010 59

34

Multiple Comparisons

Dependent Variable

(I) CONGTHUC

(J) CONGTHUC

Mean Difference

(I-J) Std. Error Sig.

95% Confidence Interval

Lower Bound

Upper Bound

W80

Tukey HSD CT 1 (0%) CT2 (5%) -22.200* 2.194 .000 -28.68 -15.72

CT3 (10%) -44.900* 2.194 .000 -51.38 -38.42

CT4 (15%) -134.900* 2.194 .000 -141.38 -128.42

CT5 (20%) -105.000* 2.194 .000 -111.48 -98.52

CT6 (25%) -54.900* 2.194 .000 -61.38 -48.42

CT2 (5%) CT 1 (0%) 22.200* 2.194 .000 15.72 28.68

CT3 (10%) -22.700* 2.194 .000 -29.18 -16.22

CT4 (15%) -112.700* 2.194 .000 -119.18 -106.22

CT5 (20%) -82.800* 2.194 .000 -89.28 -76.32

CT6 (25%) -32.700* 2.194 .000 -39.18 -26.22

CT3 (10%) CT 1 (0%) 44.900* 2.194 .000 38.42 51.38

CT2 (5%) 22.700* 2.194 .000 16.22 29.18

CT4 (15%) -90.000* 2.194 .000 -96.48 -83.52

CT5 (20%) -60.100* 2.194 .000 -66.58 -53.62

CT6 (25%) -10.000* 2.194 .000 -16.48 -3.52

CT4 (15%) CT 1 (0%) 134.900* 2.194 .000 128.42 141.38

CT2 (5%) 112.700* 2.194 .000 106.22 119.18

CT3 (10%) 90.000* 2.194 .000 83.52 96.48

CT5 (20%) 29.900* 2.194 .000 23.42 36.38

CT6 (25%) 80.000* 2.194 .000 73.52 86.48

CT5 (20%) CT 1 (0%) 105.000* 2.194 .000 98.52 111.48

CT2 (5%) 82.800* 2.194 .000 76.32 89.28

35

CT3 (10%) 60.100* 2.194 .000 53.62 66.58

CT4 (15%) -29.900* 2.194 .000 -36.38 -23.42

CT6 (25%) 50.100* 2.194 .000 43.62 56.58

CT6 (25%) CT 1 (0%) 54.900* 2.194 .000 48.42 61.38

CT2 (5%) 32.700* 2.194 .000 26.22 39.18

CT3 (10%) 10.000* 2.194 .000 3.52 16.48

CT4 (15%) -80.000* 2.194 .000 -86.48 -73.52

CT5 (20%) -50.100* 2.194 .000 -56.58 -43.62

DWG Tukey HSD CT 1 (0%) CT2 (5%) -.27100* .03584 .000 -.3769 -.1651

CT3 (10%) -.54200* .03584 .000 -.6479 -.4361

CT4 (15%) -1.70300* .03584 .000 -1.8089 -1.5971

CT5 (20%) -1.31600* .03584 .000 -1.4219 -1.2101

CT6 (25%) -.69800* .03584 .000 -.8039 -.5921

CT2 (5%) CT 1 (0%) .27100* .03584 .000 .1651 .3769

CT3 (10%) -.27100* .03584 .000 -.3769 -.1651

CT4 (15%) -1.43200* .03584 .000 -1.5379 -1.3261

CT5 (20%) -1.04500* .03584 .000 -1.1509 -.9391

CT6 (25%) -.42700* .03584 .000 -.5329 -.3211

CT3 (10%) CT 1 (0%) .54200* .03584 .000 .4361 .6479

CT2 (5%) .27100* .03584 .000 .1651 .3769

CT4 (15%) -1.16100* .03584 .000 -1.2669 -1.0551

CT5 (20%) -.77400* .03584 .000 -.8799 -.6681

CT6 (25%) -.15600* .03584 .001 -.2619 -.0501

CT4 (15%) CT 1 (0%) 1.70300* .03584 .000 1.5971 1.8089

CT2 (5%) 1.43200* .03584 .000 1.3261 1.5379

CT3 (10%) 1.16100* .03584 .000 1.0551 1.2669

CT5 (20%) .38700* .03584 .000 .2811 .4929

CT6 (25%) 1.00500* .03584 .000 .8991 1.1109

CT5 (20%) CT 1 (0%) 1.31600* .03584 .000 1.2101 1.4219

36

CT2 (5%) 1.04500* .03584 .000 .9391 1.1509

CT3 (10%) .77400* .03584 .000 .6681 .8799

CT4 (15%) -.38700* .03584 .000 -.4929 -.2811

CT6 (25%) .61800* .03584 .000 .5121 .7239

CT6 (25%) CT 1 (0%) .69800* .03584 .000 .5921 .8039

CT2 (5%) .42700* .03584 .000 .3211 .5329

CT3 (10%) .15600* .03584 .001 .0501 .2619

CT4 (15%) -1.00500* .03584 .000 -1.1109 -.8991

CT5 (20%) -.61800* .03584 .000 -.7239 -.5121

*. The mean difference is significant at the 0.05 level.

37

W 80

CONGTHUC N

Subset for alpha = 0.05

1 2 3 4 5 6

Tukey HSDa CT 1 (0%) 10 630.10

CT2 (5%) 10 652.30

CT3 (10%) 10 675.00

CT6 (25%) 10 685.00

CT5 (20%) 10 735.10

CT4 (15%) 10 765.00

Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000

Duncana CT 1 (0%) 10 630.10

CT2 (5%) 10 652.30

CT3 (10%) 10 675.00

CT6 (25%) 10 685.00

CT5 (20%) 10 735.10

CT4 (15%) 10 765.00

Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 10.000.

38

DWG

CONGTHUC N

Subset for alpha = 0.05

1 2 3 4 5 6

Tukey HSDa CT 1 (0%) 10 5.3020

CT2 (5%) 10 5.5730

CT3 (10%) 10 5.8440

CT6 (25%) 10 6.0000

CT5 (20%) 10 6.6180

CT4 (15%) 10 7.0050

Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000

Duncana CT 1 (0%) 10 5.3020

CT2 (5%) 10 5.5730

CT3 (10%) 10 5.8440

CT6 (25%) 10 6.0000

CT5 (20%) 10 6.6180

CT4 (15%) 10 7.0050

Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 10.000.