Download - HPLC2
Erciyes Üniversitesi
HPLC High Performance
Liquid Chromatography
Erciyes Üniversitesi
HPLC 1. BölümHPLC’nin teorisi ve kullanım sahasıKullanılan modüller ve işlevleriAyırma tekniklerinin sınıflandırılması
Erciyes Üniversitesi
Kromatografi bir ayırma tekniğidir.
Diğer ayırma teknikleri: Ekstraksiyon, Filtrasyon, Destilasyon, Santrifüj etme, vb..
Kromatografide ana amaç, hedef bileşiği bulunduğu ortamdaki diğer tüm bileşiklerden ayırarak belirlemek ve miktarını ölçmektir.
KROMATOGRAFİ NEDİR?
Erciyes Üniversitesi
ChromatoChromatograph Petroleum ether
CaCOCaCO33
ChlorophyllsChlorophylls ColorColor
Rus Botanikçi M.S. Tswett. 1903
KROMATOGRAFİ NEDİR?
Erciyes Üniversitesi
KROMATOGRAFİ TÜRLERİ
Thin-Layer Chromatography (TLC)
Column Chromatography
Gas Chromatography (GC)
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Supercritical Fluid Chromatography (SFC)
Capillary Electrophoresis (CE)
Erciyes Üniversitesi
KROMATOGRAFİ NEDİR?
sabit faz
mobil faz
KROMATOGRAFİ NEDİR?
Erciyes Üniversitesi
KROMATOGRAFİ NEDİR?
Hareketli Faz (Mobile Phase)Sıvı veya Gas
Sabit Faz (Stationary Phase)solid partikül veya ince bir sıvı film ile kaplanmış solid partikül
KROMATOGRAFİ NEDİR?
Ayırma kolonda gerçekleşir.
dolgu materyali, 3-5um
kolon
Ayrılma, farklı bileşiklerin, kolon dolgu ya da kaplama materyali ile farklı etkileşiminin sonucudur.
bileşik A
bileşik B
dolgu materyali
KROMATOGRAFİ NEDİR?
karışım
KROMATOGRAFİ NEDİR?
Erciyes Üniversitesi
KROMATOGRAFİ NEDİR?
Erciyes Üniversitesi
HPLC’nin KULLANIM SAHASI
Erciyes Üniversitesi
Gıda analizleri Çevre analizleri Biokimyasal analizler İlaç formülasyonları Polimerler
Bir çözücüde çözünebilen tüm maddeler
HPLC’nin KULLANIM SAHASI
Erciyes Üniversitesi
HPLC’nin AVANTAJLARI
Eş zamanlı analiz Doğruluk Yüksek hassasiyet (ppm - ppb) Küçük enjeksiyon hacmi (1- 1000µl) Geniş uygulama sahası Zor olmayan analiz koşulları Çok iyi tekrarlanabilirlik
Erciyes Üniversitesi
HPLC Sistemi Akış Diyagramı
pompainjektör kolon
detektör
bilgi işlemci
mobil faz
Erciyes Üniversitesi
ISOCRATIC SYSTEM
LOW-PRESSURE GRADIENT SYSTEM
HIGH-PRESSURE GRADIENT SYSTEM
HPLC SİSTEM TÜRLERİ
Erciyes Üniversitesi
ISOCRATIC SYSTEM
Tek pompa, tek solvent Solvent, karışım olabilir
Akış şeması
pompainjektör kolon
detektör
bilgi işlemci
mobil faz
Erciyes Üniversitesi
yetersiz ayırımyetersiz ayırım
ODS kolon
Sistemin yetersizliğiMeOH / H2O = 6 / 4
uzun analiz süresiuzun analiz süresi
MeOH / H2O = 8 / 2
ISOCRATIC SYSTEM
GRADIENT SYSTEM
Ayırma yeteneği95%
30%
MeO
H ko
nsan
trasy
onu
Zaman
Erciyes Üniversitesi
1 pompa max. 4 farklı mobil faz karışım pompadan önce
düşük basınçgradient valf
pompainjektör
kolon
M1
dedektör
bilgi işlemci
M2 M3 M4
LOW-PRESSURE GRADIENT SYSTEM Akış şeması
Erciyes Üniversitesi
2 yada 3 pompa 2 ya da 3 farklı mobil faz karışım pompadan sonra
HIGH-PRESSURE GRADIENT SYSTEM
bilgi işlemci
injektörkolon dedektör
pompa
pompa
pompa
mixerM1
M2
M3
Akış şeması
İsimlendirmenin kökeni
mixer
düşük basınç gradient ünitesi
Degasser
HIGH / LOW PRESSURE
Erciyes Üniversitesi
motor
plungerplunger seal
Check valve
pump head
10-100uL
HPLC SİSTEM MODÜLLERİ
POMPA Çalışma prensibi
Erciyes Üniversitesi
HPLC SİSTEM MODÜLLERİ Pompa Tipleri
Çift pistonlu paralel pompalar
Çift pistonlu seri pompalar
Tek pistonlu pompalar
Erciyes Üniversitesi
HPLC SİSTEM MODÜLLERİ Pompa Tipleri
Erciyes Üniversitesi
HPLC SİSTEM MODÜLLERİ Basınç dalgalanması
Erciyes Üniversitesi
kolon
LOAD INJECTpompa pompa kolon
loop
HPLC SİSTEM MODÜLLERİ Oto-Enjektör
Erciyes Üniversitesi
HPLC SİSTEM MODÜLLERİ Manual-Enjektör
Erciyes Üniversitesi
HPLC SİSTEM MODÜLLERİ Manual Enjektör
Erciyes Üniversitesi
HPLC SİSTEM MODÜLLERİ
Ön işlem yapma yeteneği
Soğutma olanağı Kendi üzerinden
kumanda edilebilme olanağı
Küçük enjeksiyon hacmi için çok iyi tekrarlanabilirlik
Düşük cross contamination
Oto-Enjektör
Erciyes Üniversitesi
HPLC SİSTEM MODÜLLERİ Kolon Fırını
Hava sirkülasyonlu Blok ısıtıcılı Düşük sıcaklık
dalgalanması Manual enjektör, mixer
ve dedektör hücresi monte etme olanağı
Sızıntı sensörü Kendi üzerinden
kumanda edilebilme olanağı
Erciyes Üniversitesi
HPLC SİSTEM MODÜLLERİ
DetektörHassasiyet
Düşük gürültü seviyesi
Detektör hücresi seçenekleri ve özellikleri
Kendi üzerinden kumanda edilebilme olanağı
Erciyes Üniversitesi
HPLC ’de AYIRMA TEKNİKLERİ
Normal Phase NPReverse Phase RPReverse Phase Ion Pairing IP Ion Exchange ICSize Exclution SEC ( GPC /
GFC ) Chiral Separation
Erciyes Üniversitesi
heksan / diklorometanheksan / diklorometan
NORMAL FAZ
İlk Geliştirilen Teknik CaCOCaCO3 / Petrol eteriPetrol eteri
Genel Tanımı:kolonkolon :: polarpolarmobil fazmobil faz : : apolarapolar
Erciyes Üniversitesi
NORMAL FAZ KOLONLARI Silica gel Cyano Amino Diol Nitro
Erciyes Üniversitesi
SilikaSi
Si-Si-CH2CH2CH2 CN-Si-CH2CH2CH2 NH2-Si-CH2CH2CH2 OCH(OH)-CH2(OH)
Kaplanmış Silika
NORMAL FAZ KOLONLARI
Erciyes ÜniversitesiSilica gel (polar)
apolar
NORMAL FAZ ETKİLEŞİMİ Hidrojen bağı (hidrofilik etkileşim)
Erciyes Üniversitesi
HİDROJEN BAĞI Bileşiğin yapısında bulunan
COOH, -NH2, -OH, -CN vb. polar guruplar
Hidrojen bağının kuvvetini artırır
CH, -CH2 guruplarının sayısı ve dallanma
Hidrojen bağının kuvvetini azaltır
Erciyes Üniversitesi
OH
HO
SiOH
SiOH
kuvvetli
zayıf
HİDROJEN BAĞI
Erciyes Üniversitesi
NORMAL FAZDA ALIKONMA Solvent : Hexane
1 : Dioctyl phthalate
2 : Dibutyl phthalate
3 : Diethyl phthalate
4 : Dimethyl phthalate
Erciyes Üniversitesi
su / metanol / asetonitrilsu / metanol / asetonitril
TERS FAZ (REVERS PHASE) En çok kullanılan teknik Genel Tanımı:
kolonkolon :: apolarapolarmobil fazmobil faz : : polarpolar
Erciyes Üniversitesi
TERS FAZ KOLONLARI C18 (ODS) C8 (octyl) C4 (butyl) Phenyl TMS Cyano
Erciyes Üniversitesi
Si• apolar özellik
TERS FAZ KOLONLARI
Erciyes Üniversitesi
apolarapolar
polarpolar Hidrofobik etkileşimHidrofobik etkileşimTERS FAZ ETKİLEŞİMİ
Erciyes Üniversitesi
HİDROFOBİK ETKİLEŞİM
Bileşiğin yapında bulunan
Karbon zincirinin uzunluğu ve aromatik guruplar Hidrofobik etki kuvvetini artırırHidrofobik etki kuvvetini artırır
COOH, -NH2, -OH, vb. polar guruplar Hidrofobik etki kuvvetini azaltırHidrofobik etki kuvvetini azaltır
Erciyes Üniversitesi
OH
OH
C18 (ODS)
kuvvetli
zayıf
TERS FAZDA ALIKONMA
Erciyes Üniversitesi
TERS FAZDA ALIKONMA Solvent : MeOH+Su
1 : p-Hydoxymethylbenzoate
2 : p-Hydoxyethylbenzoate
3 : p-Hydoxypropylbenzoate
4 : p-Hydoxybutylbenzoate
Erciyes Üniversitesi
C18 (ODS)
kuvvetli
C8
Bileşik
Bileşik
Bileşik
C4
orta
zayıf
SABİT FAZIN ETKİSİ
Erciyes Üniversitesi
ODS C8 TMSODS C8 TMS
SABİT FAZIN ETKİSİ
1. Methyl benzoate
2. Ethyl benzoate3. n-Propyl
benzoate4. n- Butyl
benzoate
Erciyes Üniversitesi
TERS FAZ-İYON ÇİFTİ
Erciyes Üniversitesi
İYON ÇİFTİ REAKTİFLERİ
Anyonik bileşiklerTetra-n-butilamonumhidroksid (TBA)
Katyonik BileşiklerBütan (C4) - Dekan (C10)sülfonik asit sodyum tuzu
Erciyes Üniversitesi
İYON DEĞİŞTİRİCİ KOLONLARKatyon değiştirici kolonlar
–Kuvvetli katyon değiştirici (SCX)
–Zayıf katyon değiştirici (WCX)
Anyon değiştirici kalonlar
-Kuvvetli anyon değiştirici (SAX) -Zayıf anyon değiştirici (WAX)
Erciyes Üniversitesi
N+
RR
RAnyon
SO3- Katyon
+
++++
++
+
++++
+
İYON KROMATOGRAFİDE ETKİLEŞİM İyonların çekim kuvveti
Erciyes Üniversitesi
Size Exclusion Chromatography – SEC-Size Exclusion Chromatography – SEC-
Gel Permeation Chromatography (GPC) Polimerlerin analizi, molekül ağırlığı ölçümü
Gel Filtration Chromatography (GFC) Proteinlerin ayrımı
Erciyes Üniversitesi
SEC’de ETKİLEŞİM Fiziksel etkileşimFiziksel etkileşim
Erciyes Üniversitesi
GPCKolon
Fiziksel etkileşimFiziksel etkileşimM
olek
üler
ağ
ırlık
Zaman
Exclusion Limit
Permeation Limit
SEC’de ETKİLEŞİM
Erciyes Üniversitesi
C*
H
COOHCOOHNH2
RR HOOCHOOC*C
NH2
RR
Hayn
a
(L) form (D) form
Optik izomerler: Işığı çevirme yönlerinin farklılığın dışında, tüm fiziksel ve kimyasal özellikleri aynı
*Chiral Center
CHIRAL SEPARATION
Erciyes Üniversitesi
(R)(R)
(L)
(D)
kuvvetli etkileşim
zayıf etkileşim
Optik izomer ayrımında etkileşim
CHIRAL SEPARATION
Erciyes Üniversitesi
Enjeksiyon tekniğiDetektör tipleri ve çalışma
mekanizmalarıSonuçların doğrulanması ve
güvenirliğin sağlanması
HPLC 3. Bölüm
Erciyes Üniversitesi
çözücü:Methanol
20 mL kafein
cözücü:Ethanol
20 mL kafein
ENJEKSİYON TEKNİĞİ
Çözücü etkisi Standart ve örneğin çözücüsü mobil
fazdan daha kuvvetli olmamalıdır
Erciyes ÜniversitesiZayıf solvent Kuvvetli solvent
Çözücü etkisi
ENJEKSİYON TEKNİĞİ
Erciyes Üniversitesi
DEDEKTÖRLERUltraviolet / Visible detector (UV/VIS) Photodiode Array detector (PDA) Fluorescence detector (RF) Conductivity detector (CDD) Refractive Index detector (RID) Electrochemical detector (ECD) Mass detector (MS) Evaporative Light Scattering detector
(EL)
Erciyes Üniversitesi
Ein Eout
ACl= - log (Eout / Ein)
l
C : concentration
Lambert-Beer yasası
(A : absorbance)
CellCell
UV DEDEKTÖRAbsorbans ölçümü
Erciyes Üniversitesi
UV DEDEKTÖR Çalışma prensibi
Erciyes Üniversitesi
UV DEDEKTÖR Gürültü seviyesi (Noise level)
4 2
2 1
A=-log(2/4)=0.3A=-log(2/4)=0.3
A=-log(1/2)=0.3A=-log(1/2)=0.3
A1=-log(2/(4+0.1))=0.311A2=-log(2/(4-0.1))=0.290dA=A1-A2=0.021
A1=-log(1/(2+0.1))=0.322A2=-log(1/(2-0.1))=0.278dA=A1-A2=0.044
dA=0.021AUdA=0.021AU
dA=0.044AUdA=0.044AU
Erciyes Üniversitesi
UV DEDEKTÖR UV dedektörün olanakları
İki ayrı dalga boyunda çalışabilmek Oran kromotogramı alabilmek Dalga boyunu zamana karşı
programlayabilmek Spektrum taraması yapabilmek D2 / W lamba seçeneği Değişik çalışma türleri için hücre
seçenekleri
Erciyes Üniversitesi
PHOTODIODE ARRAY DETECTOR
Çalışma prensibi
Erciyes Üniversitesi
Sample Cell
512 Elements Photodiode Array
Grating
D2 / W lampher element ayrı bir dalga boyunu ölçer
PHOTODIODE ARRAY DETECTOR
Çalışma prensibi
Erciyes Üniversitesi
Zaman
Dalgab
oyu
Abso
rban
s
kromatogramSpektrum
PHOTODIODE ARRAY DETECTOR 3 Boyutlu veri
Erciyes Üniversitesi
PHOTODIODE ARRAY DETECTOR 3 Boyutlu görüntü ve üstten
görünüş
Erciyes Üniversitesi
PHOTODIODE ARRAY DETECTOR Pik profili ve oran kromatogramı
Erciyes Üniversitesi
PHOTODIODE ARRAY DETECTOR Pik saflığı ve spektrumu
Erciyes Üniversitesi
PHOTODIODE ARRAY DETECTOR Pik saflığı
Erciyes Üniversitesi
PHOTODIODE ARRAY DETECTOR Slit width (Sensitivity x Resolution)
Erciyes Üniversitesi
PHOTODIODE ARRAY DETECTOR PDA’nın sağladığı olanaklar
İstenilen dalga boyu aralığında çalışabilmek Analiz sonrası istenilen çok sayıda dalga boyunda
ölçüm yapabilmek Oran kromatogramı alabilmek istenilen her pikin spektrumunu görebilmek Benzerlik kıyaslaması yapabilmek Pikin saflığını tayin edebilmek D2 ve W lambayı aynı anda kullanabilmek
Erciyes Üniversitesi
+ hn1
hn2+
*
A
A*
A
hn1 hn2
Excitation Wavelength
Emission Wavelength
FluorescenceFluorescence
*
FLORESANS DEDEKTÖR Floresans oluşumu
Erciyes Üniversitesi
FLORESANS DEDEKTÖR Çalışma prensibi
Erciyes Üniversitesi
Sıcaklık kontrolü
REFRACTİVE INDEX DETECTOR Çalışma prensibi
Erciyes Üniversitesi
MASS DETECTOR Çalışma prensibi
++++++ +++++ +++++ +++ ++++ +++
+ + + ++++
++
Vacuum
Skimmer lens
Mass analyser
Rotary pump TMP1 TMP2Rotary pump TMP1 TMP2
Erciyes Üniversitesi
MASS DETECTOR Diquat’ın mass spektrumu
Erciyes Üniversitesi
Sıklıkla ortaya çıkan Sıklıkla ortaya çıkan sorunlar, muhtemel sorunlar, muhtemel nedenleri ve çözümlerinedenleri ve çözümleri
HPLC 4. Bölüm
Erciyes Üniversitesi
EddyEddy
diffusiondiffusion
AkışınAkışın
dengesizliğidengesizliği
BAND GENİŞLEMESİDoğal Neden:
Mobil faz akışının kolon içinde dengesiz akışı
Erciyes Üniversitesi
BAND GENİŞLEMESİ Genel önlemler
Daha dar ve küçük partiküllü kolon Viskozitesi daha düşük mobil faz
Kolon fırını sıcaklığını yükseltmek Yeterli ayrımı sağlamak koşulu alıkonma
süresini azaltmak akışı hızını artırmak, kısa kolon
Poroz yüzeyi daha küçük dolgu maddeli kolonlar
Küçük enjeksiyon hacmi Enjeksiyon hacmine uygun loop ve cell Daha dar bağlantı tubing’leri Silica bazlı kolon
Erciyes Üniversitesi
BAND GENİŞLEMESİ Muhtemel nedenleri ve çözümleri
Bazı piklerde genişleme varsa bir önceki enjeksiyondan kalmadır
Tüm piklerde genişleme varsa kolon etkinliğini kaybetmiş demektir. (Kolonda yaygın kirlenme, ölü hacmin büyümesi,silanol gurplarının artması)kolonu kuvvetli bir çözücü ile yıkayınEnd-cappingkolonu değiştirin
Erciyes Üniversitesi
Tailing faktörü T= W0,05 / 2f Olumlu koşullarda 0,9 > T >1,2 T<1,5 kabullenilir değerdir
FRONTİNG / TAİLİNG
ff
ww0,050,05
0,05h0,05h
tailingtailing frontigfrontig
Erciyes Üniversitesi
Muhtemel nedenleri ve çözümleri Mobil fazın çok kuvvetli olması
k’<2 olmayacak kadar kuvvetli solventi azaltın Örnek solventinin kuvvetli olması
Örneği mobil fazda çözün Kolon kapasitesinden fazla yükleme
1/10 seyrelterek enjeksiyonyapın Safsızlık
Detektörün veri alma sıklığını artırınBaşka bir dalga boyunda kontrol edin
FRONTING / TAILING
Erciyes Üniversitesi
Muhtemel nedenleri ve çözümleri Kolon içinde silanol guruplarının çokluğu
End cappigMobil faza trietanolamin ilave etmekİyonlaşmayı azaltacak pH değerine sahip tampon
Kolon başında boşluk oluşmasıBoşluğu doldurun
Silica içindeki ağır metal safsızlıklarYüksek saflıkta silica bazlı kolonMobil faza EDTA ilave etmek
FRONTİNG / TAİLİNG
Erciyes Üniversitesi
PİK ŞEKİLLERİNDE BOZUKLUK İkincil alıkonma etkisi
Kaplanmış silca kolonlarda silanol guruplarının varlığı normaldir
C18
C18
C18
C18
silica coreOH
OH
Silanol group
Erciyes Üniversitesi
PİK ŞEKİLLERİNDE BOZUKLUK End capping
C18
C18
C18
silica coreOH
OH
C18
C18
C18
silica core(CH3)3Si-Cl
-HCl
C18C18
O-TMS
O-TMS
Erciyes Üniversitesi
PİK ŞEKİLLERİNDE BOZUKLUKİkincil alıkonma etkisi
Ağır metal kalıntıları
C18
C18
C18
silica coreO-TMS
O-TMSM+
M+
C18
O
O
Normal silica ağır metal kalıntısı içerir
Ağır metal içermeyen yüksek saflıkta silica’dan yapılmış kolonlar terçih edilmelidir
Erciyes Üniversitesi
Muhtemel nedenleri ve çözümleri Bağlantılarda boşluk
Enjektör ve detektör arasındaki tüm bağlantıları kontrol et
Kolon başında veya içinde boşluk Kolonu tamir et ya da değiştir
PİKLERİN ÇATALLANMASI
tüm pikler çatallıtüm pikler çatallı
kolon içindeki kolon içindeki boşlun tamiri çok boşlun tamiri çok zordurzordur
Erciyes Üniversitesi
Muhtemel nedenleri ve çözümleri Bir önceki enjeksiyondan kalma
Kendinden sonra gelen piklerden daha geniş olur Kolondaki kirlilik
Kolonu mobil fazdan daha kuvvetli bir çözücü ile yıkayın
Manuel enjektörde kirlilikSadece solvent enjekte edildiğinde de ortaya çıkar
Gradient çalışmada mobil fazlardan birinde bulunan safsızlık
Enjeksiyon yapmadan verilen START sonunda görülürKirli mobil fazı belirleyin ve değiştirin
HAYALET PİKLER (Ghost peaks)
Erciyes Üniversitesi
PİK ŞEKİLLERİNDE BOZUKLUK Kolon kirliliği
Daha önce yapılan analizlerde benzer mobil faz kullanıldığında kolonda tutulan maddeler
Kolonu kuvvetli bir çözücü ile yıkamakmobil faz:MeOH/su (30:70)mobil faz:MeOH/su (30:70)
THF ile yıkandıktan sonraTHF ile yıkandıktan sonra
Erciyes Üniversitesi
PİK ŞEKİLLERİNDE BOZUKLUK Kolon sonunda tuzaklanmış buble
Kolondan düşük akışla isopropil alkol geçirin Kolonu dik kullanmayı tercih edin
Erciyes Üniversitesi
PİK ŞEKİLLERİNDE BOZUKLUK Tampon gücü zayıf
İyonlaşma engellenemiyor
Erciyes Üniversitesi
BASELİNE PROBLEMLERİ Baseline ani,sivri iniş çıkışlar
Detektörden buble geçişi veya tuzaklanmasıMobil fazı degas edinDedektör hücresini yıkayın Resistör coil ilavesi ( basıncı kontrol
ettikten sonra)
Erciyes Üniversitesi
BASELİNE PROBLEMLERİ Baseline’da dalgalanma veya kayma
Pompada basınç dalgalanması Pompa başındaki hava kabarcığını uzaklaştırın
Kolonda kirlilik Kolonun temizlenmesini bekleyin
Mobil faz kirli Mobil fazı değiştirin
Erciyes Üniversitesi
BASELİNE PROBLEMLERİ Baseline’da aşırı gürültü (noise)
Dedektör hücresi veya lensler kirli Hücreyi yıkayın
Lamba enerjisi düşük Lamba ömrünü ve enerjisini kontrol edin
Mobil fazda uygun olmayan solvent (cut off point) Mobil fazı değiştirin
Erciyes Üniversitesi
BASELİNE PROBLEMLERİ Baseline’da aşırı gürültü (noise)
Degas edilmemiş mobil faz
Degas edilmişDegas edilmiş
Havaya doymuşHavaya doymuş
0,32 Au0,32 Au
Mobil faz: MeOH, UV-210 nmMobil faz: MeOH, UV-210 nm
Erciyes Üniversitesi
ALIKONMA ZAMANI DEĞİŞİMİ Buharlaşma nedeniyle mobil fazın
yapısındaki değişim Taze mobil faz kullanın, He degas
kullanmayın, mobil fazın ağzını sıkıca kapatın
Tampon gücü zayıf Tamponun konsantrasyonu artırın veya
değiştirin Kolon kirli
Kolonu kuvvetli çözücü ile yıkayın Sıcaklık dalgalanması
Kolon fırını kullanın
Erciyes Üniversitesi
Muhtemel nedenleri Fritlerin tıkanması Akış hattında tıkanma Oto enjektörde tıkanma Kolonda tıkanma Sıcaklık azalması
BASINÇ YÜKSELMESİ
Erciyes Üniversitesi
BASINÇ YÜKSELMESİ Alınabilecek önlemler
Mobil fazı ve örnek çözeltisini süzmek0,45 veya daha da iyisi 0,20 u
Tamponla çalışmalardan hemen sonra tüm sistemi su ile yıkamak
Taze mobil faz kullanmak Kolonu en az %50 organik çözücü ile
bekletmek Mobil faza %0,01 Sodyum azid ilave
etmek
Erciyes Üniversitesi
Kolonun temizlenmesi
Kolon girişindeki frit’i çıkarın ve ulrasonik banyaoda isopropil alkolle temizleyin
Kolonu ters bağlayıp yıkama solventi ile düşük akışla uzun süre yıkayın
BASINÇ YÜKSELMESİ
Erciyes Üniversitesi
BASINÇ DÜŞMESİ Muhtemel nedenleri
Kolon öncesi hatlarda sızıntı Emme filtresinde tıkanıklık Pomba başında buble Pompa contasında sızıntı Yanlış mobil faz Kolon deformasyonu
Akış miktarını kontrol edinAkış miktarını kontrol edin
Erciyes Üniversitesi
Emme filtresinin temizlenmesi
HNO3suEDTANH3Organik solvent
BASINÇ DÜŞMESİ
Erciyes Üniversitesi
KOLON’un FİZİKSEL DEFORMASYONU
Kolonu ani şok etkilere maruz bırakmayın Mekanik darbelerden sakının Pompa çalışırken valfi açmayın, ani
basınç yükselme ve düşmelerinden sakının
8 9
4 5 6
1 2 3
・
7
0
xxxx
xxxx
xxxx
xxxx
xxxx
xxxx
xxxx
xxxx xxxx
000 0 000 0
LC-10AD :::::::
Erciyes Üniversitesi
KOLON’un KİMYASAL DEFORMASYONU
Kolona ait kullanma talimatını mutlaka okuyun Silika bazlı kolonlar
pH aralığı 2-8 Basınç genellikle 250 kg Organik solvent limitsiz
Polimer bazlı kolonlarpH aralığı çok geniş Basınç genellikle 50 - 150 kg Organik solvent limitli