UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Jovana M. Pavlović

Uticaj jačine mineralnih soli na indukciju aksilarnih pupoljaka

Micromeria pulegium (Benth.)

Master rad

Niš, 2016

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Uticaj jačine mineralnih soli na indukciju aksilarnih pupoljaka

Micromeria pulegium (Benth.)

Master rad

Student: Mentor:

Jovana M. Pavlović Dr Dragana D. Stojičić

Br. indeksa 116 Vanredni profesor

Niš, 2016

UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

The influence of mineral salts' strength on axillary bud induction of

Micromeria pulegium (Benth.)

Master thesis

Student: Mentor:

Jovana M. Pavlović Dr Dragana D.Stojičić

No. of index: 116 Associate professor

Niš, 2016

SAŽETAK

Endemična vrsta južnih Karpata Micromeria pulegium (Benth.) je ranije već

uvedena u kulturu in vitro. Razlog je potreba za pronalaženjem načina gajenja i

umnožavanja ove biljne vrste čije prirodne populacije imaju mali broj jedinki i nastanjuju

staništa koja su pod negativnim antropogenim faktorima. U ovom radu ispitan je uticaj

jačine mineralnih soli po Murashige and Skoog (1962) u procesu regeneracije biljaka in

vitro putem indukcije aksilarnih pupoljaka na nodalnim segmentima Micromeria pulegium.

Definisani su uslovi pri kojima se formira najveći broj aksilarnih pupoljaka na

eksplantatima i pri kojima se ostvaruje njihova najveća dužina. Osim ovih parametara

praćen je prinos sveže i suve biomase.

Ključne reči: Micromeria pulegium, indukcija aksilarnih pupoljaka, biomasa.

ABSTRAKT

The endemic species of the southern Carpathians, Micromeria pulegium (Benth.),

has already been introduced into the culture in vitro. The reason is the need for finding out

the new ways of growing and multiplying of this plant species whose natural populations

have a small number of individuals and populate habitats which are exposed to negative

anthropogenic factors. In this degree essay the influence of mineral salts' strength has been

tested on Murashige and Skoog (1962) in the process of plant regeneration in vitro by

means of induction of axillary buds into nodal segments of Micromeria pulegium. The

conditions in which are the largest number of axillary buds are formed on explants and in

which their maximum length is achieved are clearly defined. Apart from these parameters,

the yield of fresh and dry biomass has also been monitored.

Keywords: Micromeria pulegium, axillary bud induction, biomass.

SADRŽAJ

1. UVOD 1-9

1.1. Micromeria pulegium (Benth) 1-5

1.2. Asimilacija i funkcija mineralnih soli 6-7

1.3. Morfogeneza u kulturi in vitro 8-9

2. CILJ RADA 10

3. MATERIJAL I METODE 11-13

3.1. Biljni material 11

3.2. Metode sterilizacije 11

3.2.1. Sterilizacija hranljivih podloga, rastvora i pribora 11

3.3. Hranljiva podloga 11-12

3.3.1. Hranljive podloge za indukciju aksilarnih pupoljaka M. pulegium 13

4. REZULTATI 14-20

4.1. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima M. pulegium in vitro 14-20

5. DISKUSIJA 21-22

6. ZAKLJUČAK 23

7. LITERATURA 24-25

1. UVOD

1.1. Micromeria pulegium (Benth.)

Carstvo: Plantae

Razdeo: Magnoliophyta

Klasa: Magnoliopsida

Red: Lamiales

Familija: Lamiaceae (Labiatae)

Rod: Micromeria

Micromeria pulegium (Rochel) Bentham

Veliki broj biljaka iz familije usnatica (Lamiaceae) su predmet čovekovog interesovanja.

Vrste iz ove familije čine grupu jestivih, lekovitih i aromatičnih biljaka koje se koriste u

medicini, hemijskoj, prehrambenoj i kozmetičkoj industriji. Endemične vrste predstavljaju

izazov za proučavanje u cilju očuvanja diverziteta i populacija u prirodi.

Familija usnatica obuhvata višegodišnje i jednogodišnje zeljaste biljke, polužbunove, a

retko i žbunove. Familija Lamiaceae je kosmopolitskog rasprostranjenja, naseljava pretežno

suva, dobro osunčana staništa kao i stenovita mesta odnosno strme kamenjare i šipare,

krečnjačke klisure i kanjone. To je familija sa velikim značajem, velikom brojnošću i

karakteristikama samih biljaka koje je čine.

Predstavljena je sa 200 rodova koji su rasprostranjeni širom sveta. Najveće bogatstvo

rodova ove familije nalazi se u Mediteranu do male Azije (Tatić, Blečić 2002).

U flori Balkanskog poluostrva Lamiaceae su zastupljene sa 371 vrstom, a u Srbiji živi

147 vrsta ove familije koje su predstavljene u okviru trideset rodova. Od navedenog broja vrsta

iz familije Lamiaceae 84 su Balkanski endemiti.

1

Većina vrsta familije Lamiaceae ima prijatnu aromu zbog prisustva žlezda sa etarskim

uljem na listovima, granama i na cvastima biljke. Eterična ulja su različitog sastava: aromatični

alkoholi, fenoli, terpeni, ketoni i aldehidi. Zbog kvalitetnog etarskog ulja vrste ove familije se

koriste za industrijsku preradu (Ranđelović, 2005). Vrste su niskog rasta sa zbijenim busenastim

ili polužbunastim habitusom nadzemnog dela biljke. Stablo je pretežno četvorouglasto, a listovi

su naspramno raspoređeni.

Rod Micromeria pripada familiji Lamiaceae. Rod Micromeria (Benth.) je taksonomski

složen i vrlo kompleksan rod. Predstavljen je sa 54 vrste, 32 podvrste i 13 sorti. Naziv roda

Micromeria potiče od grčkih reči micros - malo i meris - delo predstavljajući nizak rast,

busenastu formu i sitne listove i cvetove.

Rod Micromeria deluje antimikrobno, tradicionalno se koristi kao začin i u alternativnoj

medicini kao sredstvo za lečenje prehlade, tegobe, bolova i infekcija. Rod je predstavljen

različitim životnim formama. Rod Micromeria je prvi definisao Bentham (1829). Rod

Micromeria smatra se delom nejasno definisanog “Satureja kompleksa”. Da bi se prilagodili

morfološkim raznolikostima, mnogi taksonomisti su podelili ovaj kompleks u nekoliko rodova:

Satureja L., Clinopodium L., Calamintha Mill., Acinos Mill. i Micromeria Benth (Bentham

1848; Boissier 1879; Ball i Getliffe 1972; Davis 1982).

Tokom dužeg perioda rod Micromeria predstavlja nedoumicu kada je u pitanju njegova

taksonomska struktura. Na osnovu morfoloških karakteristika i filogenetskih odnosa, vrste roda

Micromeria grupišu se u tri sektora (Boisser, 1879): Cymularia, Eumicromeria i Pseudomelissa.

Podržavajući taksonomsku individualnost Morales (1993) izdvaja 6 sekcija. Harley i sar. (2004)

predlažu koncept podele na četiri sekcije - Micromeria, Pineolentia P. Perez, Cymularia Boiss. i

Pseudomelissa. Na osnovu analize hloroplastnih DNK markera Brauchler (2005) ukazuje na

blisku povezanost sekcije Pseudomellisa sa rodom Clinopodium. Boisner je koristio termin

sektor za klasifikaciju vrsta iz roda Micromeria (Flora orientalis, 1879, str. 568 – 575).

Rod Micromeria ima relativno široko rasprostranjenje od planinskog venca Himalaja i

2

Indijskog podkontinenta do Makaronezijskog arhipelaga tj. od Evrope do Zapadne, Istočne i

Južne Afrike i Madagaskara (Harley i sar., 2004; Brauchler, 2005).

U flori Srbije i Crne Gore rod Micromeria je predstavljen są 10 vrsta, od kojih su čak 7

endemične (Šilić, 1979). Vrste roda Micromeria koje ulaze u sastav flore Srbije su klasifikovane

u 2 sekcije: Micromeria sect. Micromeria (M. croatica, M. juliana, M. cristata, M. parviflora) i

Pseudomelissa (M. thymfolia, M. albanica, M. dalmatica, M. pulegium).

Vrsta Micromeria pulegium rasprostranjena je i na teritoriji Rumunije, Srbije, Bosne i

Hercegovine (Višegrad, Međeđe). Na području Srbije nađena je na području planine Tare

(Zaovine) i u istočnoj Srbiji u klisuri Svrljiškog Timoka: Knjaževac (Orešac, EP91).

Rasprostranjenje ove vrste u Srbiji prikazano je na slici 1. Sivim kružićem predstavljeni su

podaci o rasprostranjenju na teritoriji klisure Svrljiškog Timoka, a crni kružići prikazuju

rasprostranjenje vrste na osnovu literaturnih i herbarijumskih podataka.

Slika 1. Distribucija vrste Micromeria pulegium (Rochel) Bentham u Srbiji (prema:

Bogosavljević S., Zlatković B., Ranđelović V., 2007)

3

Na preliminarnoj Crvenoj listi vaskularne flore Srbije i Crne Gore (Stevanović i sar., 2003) na

području klisure Svrljiškog Timoka nalazi se Micromeria pulegium (Tab.1).

Tabela 1. Ugroženi taksoni flore klisure Svrljiškog Timoka

Takson Kategorija ugroženosti

u Srbiji

Campanula sibirica subsp. divergentiformis (Jáv.) Domin VU-NT(DD)

Achillea grandifolia Friv. VU-NT(DD)

Achillea serbica Nyman VU-NT(DD)

Artemisia pontica L. EN-VU

Doronicum hungaricum Reichenb. fil. VU

Tragopogon pterodes Pančić ex Petrović VU

Corylus colurna L. VU Scirpus lacustris L. subsp. tabernaemontani (C. C. Gmelin) Syme

CR-VU(DD)

Scabiosa columbaria L. subsp. banatica (Waldst. & Kit.) Diklić

NT-LC(DD)

Scabiosa fumarioides Vis. & Panč. NT-LC(DD)

Micromeria pulegium (Rochel) Bentham VU-NT(DD)

Astragalus asper Jacq. EN-VU

Lathyrus pallescens (Bieb.) C. Koch VU

Vicia sparsiflora Ten. VU

Anacamptis pyramidalis (L.) L.C.M. Richard VU

Cephalanthera rubra (L.) L. C. M. Richard VU

Dactylorhiza sambucina (L.) Soo subsp. sambucina VU-LC(DD)

Epipactis helleborine (L.) Crantz NT-LC(DD)

Gymnadenia conopsea (L.) R. Br. NT-LC(DD)

Neottia nidus-avis (L.) L.C.M. Richard NT-LC(DD)

Orchis morio L. VU-NT(DD)

Orchis purpurea Hudson EN-VU(DD)

Orchis simia Lam. EN-VU(DD)

Orchis tridentata Scop. VU-NT(DD)

Platanthera chlorantha (Custer) Reichenb. EN-VU(DD)

Paeonia corallina Retz. EN-VU

Paeonia mascula (L.) Miller EN-VU

Adonis vernalis L. VU

Anemone appenina L. NT-LC(DD)

Pulsatilla montana (hoppe) Reichenb. EN-VU

Frangula rupestris (Scop.) Schur NT-LC(DD)

Prunus tenella Batsch VU

Eryngium palmatum Pančić & Vis. NT-LC(DD)

Ferula heuffelii Griseb. ex Heuffel VU

Parietaria serbica Pančić VU

4

Micromeria pulegium je višegodišnja biljka visoka od 30-50 cm, izdanci biljke su brojni,

a stabljike uspravne sa korom koja se ljušti u vidu traka. Listovi stabljike su jajasti ili ređe

okruglasti, gornji listovi su sitniji, eliptični ili lancetasti, a listovi u bazi su klinasti, na licu

tamnozeleni i na naličju pepeljasto zeleni pokriveni oštrim dlakama.

Cvetovi su sakupljeni u zbijene dihazijume 9-10 mm duge, čašica je uspravna dugačka 4

- 5 mm. Pri bazi čašičnih zubaca formiran je prsten od prostih dlaka. Krunica je bela retko svetlo

ljubičasta sa pegama. Orašice su izdužene, svetlomrke, na vrhu sužene, a pri osnovi zaobljene i

papilozne.

5

1.2. Asimilacija i funkcija mineralnih soli

Biljke primaju mineralne soli iz zemljišta na kome žive. N. T. de Saussure (1804)

prilikom gajenja biljaka u vodi dodavajući različite soli je utvrdio da su neke soli neophodne za

život (npr. nitrati).

J. von Liebig (1840) došao je do zaključka da se plodnost zemljišta može poboljšati

dodavanjem mineralnih soli. Soli za koje je on rekao da su potrebne sadržale su azot, sumpor,

fosfor, kalijum, kalcijum, magnezijum, silicijum, natrijum i gvožđe. On se smatra osnivačem

nove discipline u nauci pod nazivom mineralna ishrana biljaka.

Grupa od 17 elemenata, bez kojih biljke ne mogu da žive i koje su biljkama neophodni

nazivaju se esencijalni ili bitni elementi. Elementi koji su značajni za biljku ali bez njih biljka

može da opstane nazivaju se korisni elementi. Za utvrđivanje esencijalnih elemenata

najpouzdaniji metod je metod vodene kulture koji podrazumeva gajenje biljaka sa korenom u

tečnom rastvoru mineralnih soli.

Arnon i Stout predložili su kriterijume za određivanje esencijalnih elemenata:

- bez ovih elemenata biljka ne može da obavi potpuni životni ciklus,

- oni imaju specifično dejstvo i ne mogu se zameniti drugima,

- moraju imati direktno dejstvo tj. određenu funkciju,

- ako je jedan element sastavni deo esencijalnog metabolita, onda je i on sam esencijalan.

Zemljište na kome biljke žive sadrži sve poznate mineralne elemente. Hemijska analiza

zemljišta i biljnog pepela često su korišćene za utvrđivanje potreba biljaka za mineralnim solima.

U biljnom pepelu pronađeno je 74 od 92 elementa periodnog sistema. Najobilniji sastojci

zemljišta su silicijum (33%) i aluminijum (7%).

6

Mineralna ishrana

Elementi koji su biljkama potrebni u količinama većim od 0,5 mmol/l su

makrometabolički elementi ili makroelementi – N, P, K, Ca, Mg, S. Elementi koji su biljci

potrebni u malim količinama su mikrometabolički elementi ili mikroelementi – B, Cl, Fe, Mn,

Zn, Cu, Mo, Ni i oni su neophodni u koncentraciji manjoj od 0,5 mmol/l. Gvožđe i njegov

helator Na2EDTA se smatraju prelaznom grupom soli, jer je njihova koncentracija u MS

hranljivoj podlozi (Murashige i Skoog, 1962) 0,5 mmol/l.

Funkcije mineralnih soli:

Elementi koji ulaze u sastav organskih molekula

U izgradnji kvantitativno najvažnijih organskih jedinjenja učestvuju ugljenik, vodonik i kiseonik.

U sastav proteina, nukleotida, nukleinskih kiselina ulaze azot i sumpor. Fosfor je sastavni deo

fosfolipida, fosfotnih estara i nukleinskih kiselina. Magnezijum je vezan za atome azota u jezgru

hlorofila, atom gvožđa u hemu. Cink i bakar učestvuje u sastav enzima, a kalcijum gradi veze sa

poligalakturonskom kiselinom u ćelijskom zidu.

Kofaktori u enzimskim reakcijama

Kalcijum ulazi u sastav amilaze, cink se nalazi u alkoholnoj dehidrogenazi, molibden u nitratnoj

reduktazi i bakar u plastocijaninu.

Učesnici u transportu elektrona

Elementi koji su sposobni da primanjem i otpuštanjem elektrona menjaju valencu, učestvuju u

redoks sistemima kao prenosioci elektrona koji sadrže jon gvožđa, bakra i molibdena.

Slobodni joni

Postoje elementi koji se nalaze kao slobodni joni u citosolu, oni održavaju osmotski potencijal

ćelije - kalijum i njegov prateći jon hlora, natrijum i magnezijum.

7

1.3. Morfogeneza u kulturi in vitro

Metoda kulture tkiva omogućava regeneraciju biljaka iz izolovanih biljnih organa, tkiva i

ćelija u uslovima in vitro na sterilnoj hranljivoj podlozi. Postavljanjem izolovanih biljnih delova

na odgovarajuće hranljive podloge dolazi do dediferencijacije ćelija već diferenciranih tkiva, a

zatim i regeneracije kompletnih biljaka.

Prednosti vegetativnog razmnožavanja in vitro:

- Razmnožavanje in vitro je mnogo brže od razmnožavanja in vivo;

- Moguće je umnožiti i one biljke koje nije moguće umnožiti in vivo;

- Mikroklonirane biljke koje su oslobođene patogena i infekcija bakterijama i gljivama, pa često

rastu bolje i brže nego biljke koje rastu in vivo;

- In vitro razmnožavanje omogućava razmnožavanje samo zdravih biljaka;

- Može se započeti sa vrlo malo biljnog materijala kao početnog eksplantata;

- Zahvaljujući kontrolisanim uslovima moguće je vremenski predvideti proizvodnju kultura;

- Ovaj način razmnožavanja našao je primenu u zaštiti ugroženih i retkih biljnih vrsta ex situ.

Nedostaci vegetativnog razmnožavanja in vitro:

- U nekim kulturama koje se razmnožavaju na ovaj način genetička stabilnost je niska;

- Kod drvenastih vrsta teško je uspostaviti formiranje korenovog sistema in vitro;

- Prenos biljaka iz in vitro u in vivo uslove je težak posao;

- Regenerativna sposobnost se može izgubiti nakon nekoliko subkultura kalusnog tkiva;

- Sterilizacija eksplantata koji se uvode u kulturu in vitro je teška.

Tri hronološki najstarije in vitro tehnike kod biljaka su:

- kultura tkiva (ćelija);

- kultura embriona;

- kultura korenova.

8

Vegetativna propagacija obuhvata sledeće načine razmnožavanja:

1. Permanentna kultura pupoljaka je mikropropagacija

2. Formiranje pupoljaka de novo je organogeneza

3. Razviće embriona iz somatskih ćelija je somatska embriogeneza

4. Razviće biljaka iz haploidne ćelije muškog i ženskog gametofita bez oplođenja je

androgeneza / ginogeneza

5. Somatske ćelije mogu da se ponašaju kao polne i da fuzijom daju novi organizam –

somatska hibridizacija.

Prema vrsti eksplantata razlikuju se sledeći tipovi kultura :

- kultura embriona gde se dobijanje biljaka vrši iz oplođenih ili neoplođenih zigotskih embriona;

- kultura organa koja predstavlja skup tehnika za dobijanje biljaka iz različitih organa;

- kultura meristema: početni eksplantat je apikalni meristem sa ili bez jedne ili više lisnih

primordija i koji obično daje pojedinačne izdanke;

- vrh izdanka ili kultura izdanka se karakteriše upotrebom vrha izdanka ili pupoljka sa nekoliko

lisnih primordija;

- kultura nodija koristi bočne pupoljke na stabljikama ili deo stabljike koji nosi pojedinačne ili

višestruke članke (nodije), gde svaki pupoljak daje pojedinačni izdanak.

Prema nameni, kulture se klasifikuju kao kulture haploida, kulture korenova, kulture za

mikropropagaciju, in vitro propagacija, somatska embriogeneza i somaklonalno variranje.

Klonsko razmnožavanje biljaka metodama kulture in vitro ima značajnu primenu u rasadničkoj

proizvodnji i prilikom selekcije i oplemenjivanja.

Postupci kulture in vitro primenjuju se u smislu očuvanja i zaštite genofonda ugroženih vrsta,

razmnožavanja genetički superiornijih stabala, oblika otpornih na hemijski stres, zagađenost

atmosfere, otpornost prema pesticidima i herbicidima. Kultura in vitro predstavlja najmoćnije

sredstvo moderne genetike i molekularne biologije zbog istraživanja rasta i razvoja biljaka.

9

2. CILJ RADA

Osnovni cilj ovog rada bio je da se utvrdi da li ima i koliki je uticaj jačine mineralnih soli

MS na indukciju aksilarnih pupoljaka Micromeria pulegium, njihovu multiplikaciju i elongaciju

u kulturi in vitro. Takođe, da se utvrdi hranljiva podloga na kojoj je produkcija biomase na

podlogama sa različitom koncentracijom mineralnih soli bila najveća.

10

3. MATERIJAL I METODE

3.1. Biljni materijal Procesima vegetativnog razmnožavanja u kulturi in vitro za relativno kratko vreme mogu

se od malih fragmenata roditeljske biljke dobiti genetički uniformne jedinke. Tokom

eksperimentalnog rada osnovni biljni materijal bili su nodalni segmenti (nodus sa parom listića i

začecima pupoljaka u njihovom pazuhu) vrste Micromeria pulegium. Eksplantati su izolovani sa

biljaka gajenih in vitro. Eksplantati su bili približno iste veličine, vršni pupoljci nisu korišćeni.

Na svaku hranjivu podlogu postavljano je po 30 nodalnih eksplantata, po deset eksplantata u

jednoj tegli.

3.2. Metode sterilizacije

3.2.1. Sterilizacija hranljivih podloga, rastvora i pribora

Hranljive podloge su sterilisane u autoklavu na temperaturi od 120 °C u trajanju od 30

minuta. Instrumenti, petri kutije i potrebno posuđe i pribor su sterilisani suvom sterilizacijom u

trajanju do 2 h na temperaturi od 160-180 °C. Prostor u kome je vršeno pasažiranje kultura je

tretiran UV lampom u trajanju od najmanje 2 sata, a radna površina je pre rada prebrisana etil

alkoholom. Pincete i skalpeli su sterilisani iskuvavanjem u destilovanoj vodi 25 minuta, a nakon

uranjanja u 96%-tni etil - alkohol su opaljivani na plamenu. Tokom rada pincete i skalpeli su

stalno menjani i vodilo se računa da ne dođe do kontaminacije.

3.3. Hranljiva podloga

Hranljiva podloga koja je korišćena u ovom radu bila je Murashige, T. and Skoog, F.

(1962). Podloga sadrži određeni sastav makro, mikro mineralnih soli i organskih dodataka.

11

Sastav MS hranljive podloge:

Makro mineralne soli (mg/l)

NH4NO3 1650

KNO3 1900

CaCl2 × 2H2O 440

MgSO4 × 7H2O 370

KH2PO4 170

Mikro mineralne soli (mg/l)

Mn SO4 × 4H2O 22.3

Zn SO4 × 7H2O 8.6

H3BO3 6.2

KJ 0.83

NaMoO4 × 2H2O 0.25

CuSO4 × 5 H2O 0.025

CoCl2 × 6 H2O 0.025

FeSO4 × 7H2O 27.8

Na2EDTA 37.3

Organski dodaci (mg/l)

vitamin B1 0.4 vitamin B6 0.5 nikotinska kiselina 0.5 Glicin 2.0 mioinozitol 0.1 saharoza 30.0 Agar 7.0

Neposredno pre autoklaviranja pH podloge je podešavan na 5,8 dodavanjem 0,1 NaOH.

12

3.3.1. Hranljive podloge za indukciju aksilarnih pupoljaka Micromeria pulegium

Za ispitivanje uticaja jačine mineralnih soli na indukciju aksilarnih pupoljaka korišćene

su sledeće hranljive podloge: 0 MS; 0.25 MS; 0.5 MS; 1 MS i 2 MS (Tab.2). Osnovna hranljiva

podloga po Murashige i Skoog-u je označena kao 1 MS, duplo veća koncentracija soli je

označena kao 2 MS, upola smanjena koncentracija kao 0.5 MS, četiri puta smanjena

koncentracija sa 0.25 MS, a hranljiva podloga bez mineralnih soli je označena kao 0 MS.

Tabela 2. Sadržaj mineralnih soli u hranljivim podlogama za multiplikaciju izdanaka

Hranljiva

podloga 1 2 3 4 5

MS 0 0.25 0.5 1 2

Eksplantati su postavljani u staklene teglice u kojima je razlivena hranljiva podloga. U

svaku teglicu postavljeno je po 10 eksplantata i na svaki tretman postavljeno je po 30

eksplantata.

Biljne kulture su gajene u komori za rastenje na temperaturi 21 ± 2 °C, sa fotoperiodom

od 16 sati svetlosti i 8 sati mraka, pri svetlosti fluorescentnih belih cevi „Tesla”- Pančevo i

gustinom fotonskog fluksa od 50 μmol s-1m-2.

Nakon četiri nedelje od postavljanja eksplantata na hranljive podloge različitog sastava

utvrđen je broj aksilarnih pupoljaka po eksplantatu, a merenjem je utvrđena dužina aksilarnih

pupoljaka. Tog dana je izmerena sveža masa eksplantata, a nakon 10 dana merena je i suva masa

eksplantata. Sveži eksplantati po uklanjanju sa podloge brzo venu pa je zbog toga bilo važno

meriti ih odmah. Pupoljci koji su bili manji od 1mm nisu razmatrani.

13

4. REZULTATI

4.1. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima M. pulegium in vitro

Nodalni eksplantati su postavljeni na hranljivu podlogu i na njoj su proveli 4 nedelje.

Eksplantati koji su bili zaraženi infekcijom su eliminisani, a preostali zdrav biljni materijal

korišćen je za utvrđivanje broja aksilarnih pupoljaka na nodalnim segmentima M. pulegium,

njihove dužine i prinos sveže i suve biomase.

Na eksplantatima gajenim na podlogama bez mineralnih soli nije dolazilo do formiranja

aksilarnih pupoljaka. Na podlozi MS bez mineralnih soli eksplantati nisu rasli, svi su bili braon

boje i nekrotični. Od dana kada su postavljeni pa sve dok je eksperiment trajao, odnosno 4

nedelje, eksplantati su ostali potpuno istih dimenzija i na njima nije došlo do formiranja

aksilarnih pupoljaka (Sl. 2).

Slika 2. Eksplantati M. pulegium na podlozi bez mineralnih soli

14

0 MS

Na eksplantatima gajenim na podlogama sa različitom koncentracijom korišćenih

mineralnih soli došlo je do formiranja brojnih aksilarnih pupoljaka (Tab. 3). Mineralne soli su

uticale na frekvenciju indukcije pupoljaka kao i na njihov rast.

U tabeli 3 je prikazan procenat eksplantata sa formiranim aksilarnim pupoljcima,

prosečan broj i prosečna dužina aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima, a u tabeli 4

sveža i suva biomasa izdanaka.

Tabela 3. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima Micromeria pulegium

MS Prosečan broj pupoljaka po eksplantatu Prosečna dužina pupoljaka (mm)

1 - - -

2 0.25 4,13 ± 0,34a 5,05 ± 0,46a

3 0.5 5,79 ± 0,50bc 8,19 ± 0,45b

4 1.0 4,53 ± 0,31ab 9,38 ± 0,83b

5 2.0 6,07 ± 0,77c 9,80 ± 1,21b

Tabela 4. Uticaj različitih tretmana na masu biljaka Micromeria pulegium

MS

Prosečna sveža masa (mg) Prosečna suva masa (mg)

1 - - -

2 0.25 0,036 ± 0,0028a 0,007 ± 0,001a

3 0.5 0,073 ± 0,0087ab 0,011 ± 0,001a

4 1.0 0,108 ± 0,020b 0,012 ± 0,002a

5 2.0 0,220 ± 0,047c 0,019 ± 0,004b

15

Slika 3. M. pulegium na podlozi sa 0.25 MS mineralnih soli

Najmanji prosečan broj pupoljaka po eksplantatima dobijen je kada su eksplantati M.

pulegium gajeni na podlozi sa 0.25 MS. Prosečan broj pupoljaka po eksplantatu bio je 4.13, a

prosečna dužina pupoljaka 5.05 mm. Prosečna sveža masa bila je 0.036 mg, a prosečna suva

masa 0.007 mg (Tab. 3 i 4). Eksplantati su bili zelene boje i vitalni. Eksplantati na ovoj podlozi

imali su skraćene internodije i žbunastu formu (Slika 3). Na listovima koji dodiruju hranljivu

podlogu ili su blizu hranljive podloge uočavaju se tamne mrlje i početak nekroze tkiva.

Slika 4. Eksplantat M. pulegium na podlozi 0.25 MS

16

0.25 MS

0.25 MS

Slika 5. M. pulegium na podlozi 0.5 MS

Na eksplantatima gajenim na podlozi 0.5 MS prosečan broj pupoljaka po eksplantatu bio

je 5.79, a prosečna dužina pupoljaka 0.19 mm. Prosečna sveža masa bila je 0.073 mg, a

prosečna suva masa je 0.01 mg. U poređenju sa eksplantatima gajenim na prethodnoj podlozi,

došlo je do povećanja i broja i dužine pupoljaka. Eksplantati formirani na ovoj podlozi bili su

normalno razvijeni i prilično razgranati (Slike 5 i 6).

Slika 6. M. pulegium na podlozi 0.5 MS

17

0.5 MS

0.5 MS

Slika 7. M. pulegium na podlozi 1 MS

Prosečan broj pupoljaka na eksplantatima gajenim na podlozi 1 MS bio je 4.53, a

prosečna dužina pupoljaka je 9.38 mm. Prosečna sveža masa bila je 0.108 mg, a prosečna suva

masa je 0.012 mg. Eksplantati su bili vitalni, razgranati, zelene boje, većina je bila dugih

internodija (Slike 7 i 8).

Slika 8. M. pulegium na podlozi 1 MS

18

1 MS

1 MS

Slika 9. M. pulegium na podlozi 2 MS

Najveća prosečna dužina pupoljaka je postignuta na eksplantatima gajenim na 2 MS

podlozi, odnosno na podlozi sa dvostruko većom koncentracijom mineralnih soli (Tab. 3). Na

ovoj podlozi prosečan broj pupoljaka po eksplantatu bio je 6,07, a prosečna dužina pupoljaka

9,80 mm. Prosečna sveža masa bila je 0,220 mg, a prosečna suva masa 0,019 mg. Na ovoj

podlozi primećena je najveća raznolikost u izgledu i dužini eksplantata, pa se mogu uočiti kratke

izrazito žbunaste forme ali i one sa znatno izduženim internodijama (Slike 9 i 10).

Slika 10. M. pulegium na podlozi 2 MS

19

2 MS

2 MS

1 2 3 4

0

2

4

6

8

10

12

4.13

5.79

4.53

6.07

5.05

8.19

9.389.8

Prosečan broj pupoljaka po

eksplantatu

Prosečna dužina pupoljaka (mm)

1 2 3 4

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.04

0.07

0.11

0.22

0.01 0.01 0.010.02

Prosečna sveža masa (mg)

Prosečna suva masa (mg)

Na histogramima 1 i 2 prikazani su sumirani rezultati istraživanja. Podloga na kojoj je broj

pupoljaka bio najveći je 2 MS, na ovoj podlozi aksilarni pupoljci su bili najduži, takođe i njihova

masa bila je najveća.

Histogram 1. Prosečan broj pupoljaka i njihove prosečne dužine formirane na eksplantatima

gajenim na MS hranljivoj podlozi sa različitim koncentracijama mineralnih soli.

Histogram 2. Prosečne sveže i suve biomase izdanka merene 4 nedelja nakon postavljanja

eksperimenta.

20

5. DISKUSIJA

Danas je gajenje retkih i ugroženih biljnih vrsta metodama kulture in vitro sve

zastupljeniji način začtite ex situ. Predstavnici familije Lamiaceae gaje se zbog svojih bioloških

aktivnosti, jer predstavljaju važan izvor prirodnih farmaceutskih jedinjenja.

Uspeh regeneracije biljaka in vitro zavisi od više faktora: sastava hranljive podloge,

stadijuma razvića biljke, vrste kulture in vitro i izbora primarnog eksplantata za uspostavljanje

kulture (Cao, H. Y., i sar 1990). Na indukciju aksilarnih pupoljaka M. pulegium stimulativno su

delovali fitohormoni, pre svega citokinin BA i auksin IAA (Tošić et al., 2015). Takođe i različite

koncentracije šećera, saharoza, glukoza i fruktoza imaju pozitivne efekte u in vitro uslovima

(Kagami, H., 1999).

Mineralne soli predstavljaju važan faktor iz sastava hranljive podloge i njihova

optimalna koncentracija osigurava maksimalnu brzinu rastenja kulture. Mineralne materije

učestvuju u izgradnji organskih jedinjenja, regulišu pH vrednost, osmotski potencijal ćelije,

učestvuju u hidrataciji koloida protoplazme i katališu biohemijske procese (Vinterhalter &

Vinterhalter, 1996).

Ovim radom su definisani uslovi pod kojima dolazi do razvića i izduživanja aksilarnih

pupoljaka na podlogama različitih jačina mineralnih soli. Na eksplantatima M. pulegium

gajenim na hranljivoj podlozi MS bez mineralnih soli nije došlo je do formiranja aksilarnih

pupoljaka. Kada su hranljivoj podlozi dodate mineralne soli prosečan broj pupoljaka kao i

dužina pupoljaka postepeno su se povećavali zato što su mineralne soli pozitivno delovale na

indukciju aksilarnih pupoljaka (Thorpe, A.T., 1989).

21

Rezultati ovog istraživanja pokazuju da je dvostruko jača koncentracija MS mineralnih

soli dovela do indukcije najvećeg broja pupoljaka koji su imali i najveću dužinu. Rezultati na

vrstama iz familije Lamiaceae su i nešto drugačiji. Fadel et al. (2010) su ispitivali uticaj

koncentracije nerganskih soli iz Murashige i Skoog hranljive podloge (pune jačine, pola i četvrt

jačine) na organogenezu in vitro vrste Mentha spicata L. Najveći broj izdanaka i korena

indukovanih po eksplantatu, kao i prosečna maksimalna dužina zabeležena je na hranljivoj

podlozi sa pola jačine (0,5 MS). Takođe i na eksplantatima vrste Salvia brachyodon (Mišić et al.,

2006) formiranje aksilarnih pupoljaka bilo je najintenzivnije kada su eksplantati gajeni na

podlozi 0,5 MS.

I kod vrsta iz drugih familija mineralne soli MS upola smanjene koncentracije su imale

pozitivan efekat na indukciju aksilarnih pupoljaka. Kod vrste Nephrolepis exaltata najveći broj

izdanaka ostvaren je na hranljivoj podlozi 0.5 MS sa 30 g/l saharoze i 2 mg/l BA (R. Fotohi

Gazvini et al., 2007).

Takođe i izmenjen sastav mineralnih soli može pozitivno da utiče na broj indukovanih

aksilarnih pupoljaka, kao što je to kod Rosa damascena (Nahoko Ishioka, Shizufumi Tanimoto,

1990). Broj pupoljaka značajno se povećavao dodavanjem kalcijuma u podlogu.

22

6. ZAKLJUČAK

Najveći prosečan broj aksilarnih pupoljaka 6,07 dobijen je gajenjem nodalnih eksplantata

na hranljivoj podlozi sa 2 puta povećanom koncentracijom MS mineralnih soli.

Izdanci koji su gajeni na hranljivoj podlozi bez mineralnih soli nisu uopšte rasli.

Dodavanjem mineralnih soli u koncentracijama 0,25 ; 0,5 ; 1 i 2 postepeno se povećavao broj

kao i dužina pupoljaka.

Metoda kulture in vitro uspešno se može koristiti za razmnožavanje M. pulegium

indukcijom aksilarnih pupoljaka i može biti značajna pomoć u rešavanju problema zaštite i

očuvanja ove endemične vrste.

23

7. LITERATURA

1. Bogosavljević S., Zlatković B., Ranđelović V. (2007): Flora klisure Svrljiškog Timoka.

9th Symposium on Flora of Southeastern Serbia and Neighbouring Regions, Niš,

proceeding, 41-54.

2. Boissier E (1879): Flora Orientalis. vol. 4. Basel & Geneve, 568 – 575.

3. Bräuchler, C., Ryding, O. and Heubl, G. (2008): The genus Micromeria (Lamiaceae), a

synoptical update. Willdenowia 38: 363-410.

4. Cao, H. Y., Phelep, M., and Duhoux, E., 1990: Effects of some organic compounds

(maltose, sucrose, vitamins) on the shoot biomass of Allocasuarina verticillata (Lam.) L.

Johnson (Casuarinaceae) grown in vitro. - Bulletin de la Société Botanique de France

Actualités Botaniques 137(3): 7-13.

5. Fadel, D. Kintzios, S., Economou, A., Moschopoulou, G., Constantinidou, H.I. Effect of

Different Strength of Medium on Organogenesis, Phenolic Accumulation and

Antioxidant Activity of Spearmint (Mentha spicata l.).

6. Kagami, H., 1999: Effect of Sugars on Rooting of Shoots of Japanese Persimmon

Propagated in vitro. - Plant Biotechnology 16(5): 371- 374.

7. Mišić, D.; Grubišić, D.; Konjević, R. (2006): Micropropagation of Salvia brachyodon

through nodal explants. Volume 50, Number 3, pp. 473-476 (4).

8. Nahoko Ishioka, Shizufumi Tanimoto (1990): Plant regeneration from Bulgarian rose

callus.

9. R. Fotohi Gazvini, Y. Hamidoghli, M. Shafei Hagiabad., (2007): Effects of Different

Concentrations of Mineral Salt, Sucrose and Benzyladenine on Boston Fern (Neprolepis

exaltata Schott cv. Bostoniensis) Runner Tips Initiation.

24

10. Ranđelović V., (2005) : Botanika; Biološko društvo “Dr Sava Petrović” Niš, 117-118.

11. Šilić C. (1979): Monographie der Gattungen Satureja L., Calamintha Miller, Micromeria

Benth., Acinos Miller und Clinopodium L. in der Flora Jugoslawiens, Zemaljski Muzej

BiH, Sarajevo, 172 – 262.

12. Stevanović V. et al. (1999): Crvena knjiga flore Srbije. 1, Isčezli i krajnje ugroženi

taksoni Ministarstvo za životnu sredinu republike Srbije, Beograd; Biološki fakultet

Univerziteta u Beogradu, Beograd; Zavod za zaštitu prirode Republike Srbije, Beograd,

380-382.

13. Tatić B., Blečić V., (1984): Sistematika i filogenija viših biljaka.- Zavod za udžbenike i

nastavna sredstva, Beograd.

14. Thorpe, A.T., (1989): In Vitro Embryogenesis in Plants. - Kluwer Academic Publishers,

pp. 1-563, Dordrecht.

15. Tošić, S. (2015): Fiziološki i biohemijski aspekti propagacije endemičnih vrsta

Micromeria pulegium (Rochel) Benth. i Micromeria croatica (Pers.) Schott in vitro,

Doktorska disertacija, - Biološki fakultet, Beograd.

16. Tošić, S., Stojičić, D., Stankov-Jovanović, V., Mitić, V., Mihajilov-Krstev, T., Zlatković,

B., (2015) Chemical Composition, Antioxidant and Antimicrobial Activites of

Micropropagated and Native Micromeria pulegium (Lamiaceae) Extracts, OXIDATION

COMMUNICATIONS vol.38 br. 1, str. 55-66.

17. Vinterhalter, D., Vinterhalter B., (1996): Kultura in vitro i mikropropagacija biljaka.

Axial, P.O., Beograd (15-54).

18. Wei Zhou, Xiaohui Liu, Pei Zhang, Pei Zhou, Xunlong Shi., (2014): Effect Analysis of

Mineral Salt Concentrations on Nosiheptide Production by Streptomyces actuosus Z-10

Using Response Surface Methodology.

25

BIOGRAFIJA KANDIDATA

Jovana Pavlović rođena je 11.03.1991. godine u Kraljevu. Završila je osnovnu školu

,,Miodrag Čajetinac - Čajka” , nakon čega upisuje gimnaziju ,,Vuk Karadžić”, prirodno –

matematički smer. Godine 2010. započinje osnovne akademske studije na Prirodno –

matematičkom fakultetu, Univerziteta u Nišu, na Departmanu za biologiju i ekologiju, koje

završava 2013. godine sa zvanjem „biolog“. Iste godine upisuje master akademske studije na

Departmanu za biologiju i ekologiju, odsek Biologija, koje završava januara 2016. godine.

Прилог 5/1

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Јована Павловић

Ментор, МН: Драгана Стојичић

Наслов рада, НР: “Утицај јачине минералних соли на индукцију аксиларних пупољака Micromeria pulegium (Benth.) ”

Језик публикације, ЈП: српски

Језик извода, ЈИ: енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2016.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)

25 стр. ; 10 слика; 4 табела; 2 xистограма.

Научна област, НО: биологија

Научна дисциплина, НД: ФиЗиологија биљака

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Micromeria pulegium, индукцијa аксиларних пупољака, биомасa.

УДК 661. 42:581. 144+582. 929. 4

Чува се, ЧУ: библиотека

Важна напомена, ВН:

Извод, ИЗ: Ендемична врста Јужних Карпата Micromeria pulegium (Benth.) je paниje већ уведена у културу in vitro. Разлог је потреба за проналажењем начина гајења и умножавања ове биљне врсте чије природне популације имају мали број јединки и настањују станишта која су под негативним антропогеним факторима. У овом раду испитиван је утицај јачине минералних соли по Мurashige and Skoog (1962) у процесу регенерације биљака in vitro путем индукције аксиларних пупољака на нодалним ceгмeнтимa M. Pulegium. Дефинисани су услови при којима се формира највећи број аксиларних пупољака на eксплaнтaтимa и при којима се остварује њихова највећа дужина. Осим ових параметара праћен је принос свеже и суве биомасе.

Датум прихватања теме, ДП: 09/09/15

Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник: Др Бojaн Злaткoвић

Члан: Др Taтjaнa Mихaилов Kpcтeв

Члан, ментор: Др Драгана Стојичић

Образац Q4.09.13 - Издање 1

Прилог 5/2

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: Master thesis

Author, AU: Jovana Pavlović

Mentor, MN: Dragana Stojičić Title, TI: The influence of mineral salts' strength on axillary bud

induction of Micromeria pulegium (Benth.)

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2016

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

25 p. ; 10 pictures; 4 tables; 2 charts.

Scientific field, SF: biology

Scientific discipline, SD: Physiology of plants

Subject/Key words, S/KW: Micromeria pulegium, axillary bud induction, biomass.

UC 661. 42:581. 144+582. 929. 4

Holding data, HD: library

Note, N:

Abstract, AB: The endemic species of the southern Carpathians, Micromeria pulegium (Benth.), has already been introduced into the culture in vitro. The reason is the need for finding out the new ways of growing and multiplying of this plant species whose natural populations have a small number of individuals and populate habitats which are exposed to negative anthropogenic factors. In this degree essay the influence of mineral salts' strength has been tested on Murashige and Skoog (MS, 1962) in the process of plant regeneration in vitro by means of induction of axillary buds into nodal segments of Micromeria pulegium. The conditions in which are the largest number of axillary buds are formed on explants and in which their maximum length is achieved are clearly defined. Apart from these parameters, the yield of fresh and dry biomass has also been monitored.

Accepted by the Scientific Board on, ASB: 09/09/15

Defended on, DE:

Defended Board, DB: President: phD Bojan Zlatković

Member: phD Tatjana Mihailov Krstev

Member, Mentor: phD Dragana Stojičić

Образац Q4.09.13 - Издање 1