Kraftspektroskopie an einzelnen Titin-Molekülen
AFM(Atomic Force Microscop)
• Erfinder Gerd Binning
• Nobelpreis für das Rastertunnel Mikroskop
• Funktion wie RTM nur Kraft statt Tunnelstrom als Messgröße
Aufbau des AFM
• 3D Piezo Motor
• Feder mit niedriger Federkonstanten ca.0.1-1 N/m
• Scharfe Messpitze
• Feedback System zur Bestimmung und Regulierung der Feder
Messspitze
• Die Spitze im ersten AFM war ein Diamantsplitter
• Auch möglich sind Si3N4 Kristalle
• Die Feder kann mit integrierter Spitze gebaut werden
• Für elektrische oder magnetische Kräfte kann man feine geätzte Drähte als Spitze verwenden
Feder
• Lithographisch hergestellt
• Aus Silizium, SiliziumOxid oder SiliziumNitrid
• ca. 100μm lang und 1μm dick
• Ferdekonstanten 0.1-1 N/m
• Resonanzfrequenzen 10-100 kHz
Verschiedenen Typen des AFM
• Raster Kraft Mikroskop
• Es können verschiedene Kräfte gemessen werden und damit– Atomare Kräfte
– Magnetische Felder
– Elektrische Felder
– Van der Vaals
Betriebsmoden
• Contact-mode– Auflagekraft von typischerweise 10-7 bis 10-11
• Langreichweitige Kräfte– Abstand zur Probe 10-100 nm
– Feder wird nahe der Resonanz in Schwingung versetzt
– Der Kraft Gradient Fz/ z verändert die Resonanz Frequenz
Der Versuch
• Einzelmolekül Kraftspektroskopie an Titin
• Matthias Rief, Mathias Gautel, Filipp Österhelt, Julio M. Fernandez, Hermann E. Gaub
• Ziele– Untersuchung der mechanischen Eigenschaften des Muskelprotein
Titin
– und damit besseres Verständnis über die Stabilität von Muskeln
Die Probe
• Frisch aufgedampfte Gold Oberfläche
• titin Lösung 10 -100 μg/ml in Phosphat gepuffertem Salin (PBS) bei pH 7,4
• Nach 10 min abgespült mit PBS
Aufbau und Durchführung
• Die Spitze Si3N4 wird auf die Probe gepresst, und nach kurzem Warten wieder weggezogen
Konstante Geschwindigkeit
Immunoglobulin (Ig) Domänen
• Sägezahn Profil
• Zähne haben abstand 22-28 nm
• 150-300 pN je nach Geschwindigkeit
• Vermutung:– Die einzelnen Immunoglobulin Domänen entfalten sich
nacheinander
• Eine vollständig Entfaltete Domäne ist 31 nm lang
Natürliches titin und Ig4 Ig8
• Um zu beweisen, das die Ig Domänen für die schrittweise Verlängerung verantwortlich sind wurde künstliches Titin hergestellt, das nur 4 bzw. 8 Ig Domänen enthält (Ig4 Ig8)
• Bei den Versuchen mit diesem Titin wurden immer nur maximal soviele Sägezähne aufgezeichnet wie Ig Domänen vorhanden waren.
Wormlike chain model
• Beschreibt die Kraft Dehnungs Kurve
• F(x)=(kT/b)[0.25(1-x/L)-2-0.25+x/L]
• Fitten des Mesergebnis eines Ig8 mit 7 Peaks, mit Hilfe dieser Formel ergab:– Anfangslänge von 58 nm (fiten des 1. Peaks)
– Verlängerung von 28 bis 29 nm beim fiten des nächsten Peaks
Reversibel
• Nach vollständiger Entspannung falten sich die Ig Domänen wieder zusammen
• Dieser Vorgang war sehr oft wiederholbar => reversibel
Andere Methoden zur Kraftspektroskopie
• Mit Hilfe eines Force clamp AFM sind folgende Methoden möglich– Konstante Kraft
• konstante Kraft zwischen 50 und 200 pN
• Dauer zwischen 10 und 30 sec
– Kraft wächst linear mit der Zeit
• ca. 100 pN/s
Konstante Kraft
Konstante Kraft
• Man sieht einen Stufenweisen Anstieg der Länge
• Die meisten Stufen sind 22 nm
• Es gibt auch Vielfache davon, mehrere Ereignisse die nicht mehr zeitlich aufgelöst werden konnten
Zeitlich linear ansteigende Kraft
• Das entfalten spielt sich in wesentlich kürzerer Zeit ab
• aber sonst keine neuen Ergebnisse
Abhängigkeit der Kraft von zuggeschw.
• Komplexe Moleküle haben viele Konformationen
• Potentialverlauf ist Abhängig von Zuggeschwindigkeit
Montecarlo Simulation
• Simulation eines thermischen Gleichgewichts
• Annahme Ig-Domäne wird duch 6 H-Brücken gehalten
• H-Brücken können brechen und rekombinieren
• Zugkraft verteilt sich auf die bestehenden H-Brücken
• Nur möglich wenn sehr hohe Zuggeschwindigkeiten simuliert werden
Andere ähnliche Experimente
• Kraftspektroskopie an Biomolekülen
• Auch andere Domänen können sich entfalten– Immunoglobulin
– Fibronectin type III
– Cadherin
– α-Helix (DNS)
• Entfaltung lösen Nervenimpulse aus