BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Turunan asam hidroksisinamik yang melimpah di tumbuhan dan sangat
menarik minat yang cukup luas untuk mereka spektrum antihiperglikemik
kegiatan seperti biologi, antitumor, bentuk antioksidan, hepatoprotective,
vasoactive, dan stimulatory effect pada alpha1 a-adrenoceptors. Hal tersebut
menunjukkan bahwa aktivitas turunan asam hidroksisinamik tersebut ditentukan
oleh posisi substitusi gugus hidroksil. Meski begitu , hampir semua anak biologis
dan analisis kimia terkini terfokus pada 4-hidroksi- atau 3,4-dihidroksisinamik
turunan asam kuat biologis karena kemampuannya. Relatif sedikit studi pada 2-
hidroksi analogues dan bahkan lebih sedikit pada turunannya glukosida
dilaporkan, terutama karena dari distribusi Linux mereka terbatas pada tanaman.
Dalam studi skrining baru-baru ini, terdapat senyawa aktif produk alami
dari tanaman obat Dendrobium (Orchidaceae), tiga asam 2-glukosiloksisinamik,
cis-melilotoside, trans-melilotoside dan dihydromelilotoside, dari D. aurantiacum
var. denneanum, yang terisolasi kuat sebagai aktifitas antioksidan. Potensi
Dendrobium sebagai obat disebabkan karena anggrek ini menghasilkan berbagai
macam senyawa metabolit penting, beberapa di antaranya adalah alkaloid.
Alkaloid utama dan paling banyak dijumpai pada Dendrobium adalah Dendrobine
(C16H25O2N). Di China, Dendrobine banyak diekstraksi dari spesies Dendrobium
nobile. Ekstraksi Dendrobine dan alkaloid lainnya sering dilakukan dari batang
atau pseudobulb. Nobilonine, Dendrine, Dendroxime dan Dendramine adalah
jenis metabolit lain yang ditemukan pada Dendrobium. Dendrobium di China
digunakan sebagai obat baik dalam bentuk segar maupun setelah dikeringkan.
Senyawa-senyawa aktif pada Dendrobium mempunyai aktivitas antikanker. Di
China Dendrobium dilaporkan telah dimanfaatkan dalam pengobatan kanker perut
dan paru-paru. Dendrobine dan alkaloid lain pada Dendrobium juga berkhasiat
untuk menurunkan kadar gula darah hingga pengobatan impotensi, menyatakan
bahwa metabolit-metabolit yang dihasilkan Dendrobium kemungkinan berpotensi
sebagai antibiotik (Smanda, 2011).
1
Kromatografi cair berperforma tinggi (HPLC) digabungkan ke diode-array
detection (DAD) dan spektrometri massa (MS) adalah alat yang ampuh untuk
analisis dan kualitas evaluasi obat-obatan dan alam products. Teknik ini sangat
memudahkan karakterisasi kimia dalam matriks kompleks dan produk alami yang
secara struktural berupa campuran. Hal ini juga memiliki selektivitas cukup dan
kepekaan analisis kuantitatif yang akurat dengan penggunaan yang tepat dari
standar internal. Dalam karya ini, dipilih HPLC-DAD/electrospray ionisasi multi-
step spektrometri massa (ESI-MSn) untuk mengembangkan metode yang akan
dicapai agar memiliki kepekaan yang lebih baik dalam identifikasi dan
kuantifikasi turunan asam 2-glukosiloksisinamik dalam ekstrak tumbuhan obat
Dendrobium.
1.2 Rumusan Masalah
Rumusan masalah yang dapat diambil dari makalah ini adalah :
1. Bagaimanakah metode analitis yang sensitif dan selektif untuk
karakterisasi dan kuantifikasi turunan asam 2-glukosiloksisinamik dalam
tanaman obat Dendrobium?
2. Bagaimanakah kelayakan menggunakan senyawa turunan asam
2-glukosiloksisinamik sebagai tanda-tanda diagnostik kimia untuk
otentikasi dan pengawasan mutu tanaman obat Dendrobium?
1.3 Tujuan Masalah
Adapun Tujuan masalah dalam penulisan makalah ini adalah :
1. Mengembangkan metode analitis sensitif dan selektif untuk karakterisasi
dan kuantifikasi turunan asam 2-glukosiloksisinamik dalam tanaman obat
Dendrobium.
2. Mengevaluasi kelayakan menggunakan senyawa turunan asam 2-
glukosiloksisinamik sebagai tanda-tanda diagnostik kimia untuk otentikasi
dan pengawasan mutu tanaman obat Dendrobium.
1.4 Metode Penulisan
Metode yang digunakan dalam pembuatan makalah ini adalah metode
pustaka dari internet berupa jurnal ilmiah maupun artikel yang berkaitan dengan
isi makalah.
2
BAB II
ISI
2.1 Potensi Dendrobium
Sekitar 250.000 hingga 350.000 spesies tumbuhan diyakini berpotensi
sebagai tumbuhan obat (obat herbal). Namun baru sekitar 35.000 spesies yang
telah dimanfaatkan. Badan Kesehatan Dunia (WHO) memperkirakan pemanfaatan
potensi tumbuhan obat secara maksimal dapat memenuhi kebutuhan kesehatan
80% penduduk dunia terutama di negara berkembang, sementara sejak
pertengahan 1990-an diperkirakan lebih dari 200 perusahaan industri dan
organisasi besar dunia telah berusaha menemukan dan mengidentifikasi senyawa-
senyawa metabolit potensial pada tumbuhan dan hewan (Smanda, 2011).
Di benua Asia, masyarakat China, Jepang, India dan Indonesia banyak
memanfaatkan tumbuhan-tumbuhan obat untuk memenuhi kebutuhan kesehatan.
Sekitar 7300 spesies tumbuhan telah dimanfaatkan oleh masyarakat China sebagai
obat tradisional. Hal ini membuat China sebagai negara terdepan dalam
pemanfaatan tumbuhan obat. Anggrek adalah tumbuhan familia Orchidaceae
yang telah lama dimanfaatkan sebagai tumbuhan obat oleh masyarakat China.
Beberapa genus yang telah dimanfaatkan sebagai tumbuhan obat antara lain
Dendrobium, Malaxis, Gastrodia, Bletilla dan Anoectochillus. Produk obat-
obatan tradisional yang berasal dari Dendrobium bahkan telah lama
diperdagangkan di China (Smanda, 2011).
Potensi Dendrobium sebagai obat disebabkan karena anggrek ini
menghasilkan berbagai macam senyawa metabolit penting, beberapa di antaranya
adalah alkaloid. Alkaloid utama dan paling banyak dijumpai pada Dendrobium
adalah Dendrobine (C16H25O2N). Di China, Dendrobine banyak diekstraksi dari
spesies Dendrobium nobile. Ekstraksi Dendrobine dan alkaloid lainnya sering
dilakukan dari batang atau pseudobulb. Nobilonine, Dendrine, Dendroxime dan
Dendramine adalah jenis metabolit lain yang ditemukan pada Dendrobium.
Dendrobium di China digunakan sebagai obat baik dalam bentuk segar maupun
setelah dikeringkan. Senyawa-senyawa aktif pada Dendrobium mempunyai
aktivitas antikanker. Di China Dendrobium dilaporkan telah dimanfaatkan dalam
3
pengobatan kanker perut dan paru-paru. Dendrobine dan alkaloid lain pada
Dendrobium juga berkhasiat untuk menurunkan kadar gula darah hingga
pengobatan impotensi. Metabolit-metabolit yang dihasilkan Dendrobium
kemungkinan berpotensi sebagai antibiotic (Smanda, 2011).
Indonesia mempunyai kekayaan tumbuhan yang sangat besar. Kekayaan
spesies Anggrek yang ada di Indonesia salah satu yang terbesar di dunia, jauh
melebihi China. Spesies-spesies seperti Dendrobium, Malaxis dan Vanilla bahkan
banyak dijumpai. Kebiasaan masyarakat dan suku adat di Indonesia yang sejak
lama memanfaatkan tumbuhan sebagai obat membuka peluang yang sangat besar
bagi studi Etnobotani dan penelitian-penelitian untuk menggali potensi tumbuhan
obat Indonesia (Smanda, 2011).
Indonesia kaya akan spesies Anggrek salah satunya adalah Dendrobium
crumenatum (Anggrek Merpati). Di Indonesia, Anggrek merpati termasuk spesies
kosmopolit yang tumbuh secara liar namun banyak juga dijumpai sebagai
tanaman hias di rumah, kampus hingga di tepi jalan. Dendrobine tersebar luas di
genus Dendrobium, salah satunya adalah Dendrobium crumenatum (Smanda,
2011).
Gambar 1. Berbagai spesies Dendrobine yang dimanfaatkan sebagai obat.
Pengaruh Dendrobine dan alkaloid lain dalam meningkatkan viabilitas sel
neuron, menekan tingkat kematian sel neuron serta melindungi sel neuron dari
kerusakan pada tikus menunjukkan adanya pengaruh Dendrobine terhadap
aktivitas elektrik dan depolarisasi pada sel syaraf Katak. Aktivitas anti
hiperglikemia juga dari ekstrak alkaloid batang Dendrobium chrysotoxum.
Campuran alkaloid pada ekstrak batang dan bunga D. nobile mempunyai aktivitas
anti bakteri dan anti kanker. Hal tersebut ditunjukkan dengan luas zona
penghambatan pada kultur Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella typhi,
4
Staphylococcus aureus dan Proteus. Hasil penelitian tersebut juga menunjukkan
bahwa ekstrak alkaloid dari bunga D. nobile mempunyai aktivitas antikanker
sehingga bunga dapat menjadi organ alternatif sumber Dendrobine dan alkaloid
lainnya (Smanda, 2011).
2.2 HPLC (Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi)
HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini
menjelaskan bagaimana pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang
sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom. HPLC secara
mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom.
Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung
melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.
HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk
material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang
lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya.
Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen
dalam campuran (Chetya, 2011).
Gambar 2. Instrumen HPLC
Pada prinsipnya, HPLC bekerja dengan bantuan pompa fasa gerak cair
dialirkan melalui kolom ke detektor. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa
gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-
komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut
terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam
akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi
5
dengan fasa diam maka solut-solut tersebut akan keluar kolom dideteksi oleh
detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram kromatografi gas. Seperti
pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan konsentrasi komponen dalam
campuran. Computer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan
mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC (Clark, 2007)
2.3 MS (Spektrometri Massa)
Spektrometri massa adalah alat yang digunakan untuk menentukan massa
atom atau molekul, yang ditemukan oleh Franci William Aston pada tahun 1919.
Prinsip kerja alat ini adalah pembelokan partikel bermuatan dalam medan magnet.
Sampel dalam bentuk gas mula-mula ditembaki dengan berkas elektron berenergi
tinggi. Perlakuan ini menyebabkan atom atau molekul sampel berionisasi
(melepas elektron sehingga menjadi ion positif). Ion-ion positif ini kemudian
dipercepat oleh suatu beda potensial dan diarahkan ke dalam suatu medan magnet
melalui suatu celah sempit. Di dalam medan magnet, ion-ion tersebut akan
mengalami pembelokan yang bergantung kepada:
1. Kuat medan listrik yang mempercepat aliran ion. Makin besar potensial listrik
yang digunakan, makin besar kecepatan ion dan makin kecil pembelokan.
2. Kuat medan magnet. Makin kuat magnet, makin besar pembelokan.
3. Massa partikel (ion). Makin besar massa partikel, makin kecil pembelokan.
4. Muatan partikel. Makin besar muatan, makin besar pembelokan.
(Anonim, 2012).
Gambar 3. Diagram lengkap dari spektrometer massa
6
Atom dapat dibelokkan dalam sebuah medan magnet (dengan anggapan
atom tersebut diubah menjadi ion terlebih dahulu). Karena partikel-partikel
bermuatan listrik dibelokkan dalam medan magnet dan partikel-partikel yang
tidak bermuatan (netral) tidak dibelokkan. Urutannya adalah sebagai berikut:
Tahap pertama : Ionisasi
Atom di-ionisasi dengan emengambilf satu atau lebih elektron dari atom
tersebut supaya terbentuk ion positif. Ini juga berlaku untuk unsur-unsur yang
biasanya membentuk ion-ion negatif (sebagai contoh, klor) atau unsur-unsur yang
tidak pernah membentuk ion (sebagai contoh, argon). spektrometer massa ini
selalu bekerja hanya dengan ion positif.
Tahap kedua : Percepatan
Ion-ion tersebut dipercepat supaya semuanya mempunyai energi kinetik
yang sama.
Tahap ketiga : Pembelokan
Ion-ion tersebut dibelokkan dengan menggunakan medan magnet,
pembelokan yang terjadi tergantung pada massa ion tersebut. Semakin ringan
massanya, akan semakin dibelokan. Besarnya pembelokannya juga tergantung
pada besar muatan positif ion tersebut. Dengan kata lain, semakin banyak elektron
yang ediambilf pada tahap 1, semakin besar muatan ion tersebut, pembelokan
yang terjadi akan semakin besar.
Tahap keempat : Pendeteksian
Sinar-sinar ion yang melintas dalam mesin tersebut dideteksi dengan secara
elektrik.
(Clark, 2004).
2.4 Percobaan
2.4.1 Kimia dan bahan-bahan
HPLC-grade metanol disediakan oleh Wako Pure Chemical
Industries, Ltd. (Osaka, Jepang). Air dimurnikan dengan sistem Milli-Q
(Millipore, Bedford, MA, USA). Pelarut lainnya, dibeli dari Nacalai Tesque
Inc (Kyoto, Jepang), adalah kelas analitis.
Tiga senyawa referensi asam 2-glukosiloksisinamik, cis-
melilotosida, trans-melilotosida dan dihidromelilotosida, disolasi dari
7
batang D. aurantiacum var. dennaeanum. Struktur dikarakterisasi oleh UV,
IR, MS, 1H NMR dan 13C NMR dan kemurniannya ditentukan untuk lebih
dari 98% oleh HPLC-DAD. Internal standar, asam phthalic (>99%), didapat
dari Nacalai Tesque Inc.
Gambar 4. Struktur kimia turunan asam 2-glukosiloksisinamik.
Stok larutan standar dari cis-melilotosida pada 3 mg/mL, dan trans-
melilotosida, dihidromelilotosida dan asam phthalic pada 1 mg/mL,
disiapkan dalam metanol dan disimpan pada suhu 4oC. Larutan standar
analit (0.01-100 µg/mL) dan internal standar (20 µg/mL) yang disediakan
oleh cairan berupa solusi dari stok dengan metanol.
2.4.2 Persiapan sampel
Tiga sampel tanaman dari Dendrobium aurantiacum var. denneanum
dikumpulkan dari Nanjing (Provinsi Jiangsu), Tome dan Xishuangbanna
(provinsi Yunnan), dan dua sampel D. thyrsiflorum dan D. chrysotoxum dari
Xishuangbanna (provinsi Yunnan) di P. R. Cina. Semua tanaman sampel
yang disahkan oleh Profesor Luoshan Xu dan Dr Li Yang. Spesimen
disimpan di Herbarium dari China Pharmaceutical University, Nanjing, P.
R. China.
Sekitar 0,1 g bagian dari sampel tanaman yang sudah dilumatkan,
ditimbang secara akurat, arti dalam 50 mL 1: 1 (v/v) MeOH/air pada 50oC
8
selama 60 menit dan kemudian diekstraksi dalam ultrasonik bath selama 45
menit. Ekstrak Aliquots disentrifugasi pada 3000 rpm. Volume 5 mL
supernatan kemudian dibuang dan dicuci dengan 100 mL asam phthalic
(internal standar, 1 mg/mL) dan disaring dengan saringan PTFE 0.45 µm
sebelumnya untuk dianalisis HPLC.
2.4.3 Analisis kualitatif
Sistem HPLC digunakan untuk pemisahan Agilent seri 1100 dengan
detektor diode-array (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) dan
Bruker Esquire 3000 perangkap ion Spektrometer massa yang dilengkapi
dengan sumber ionisasi (ESI) electrospray (Bruker Daltronics, Bremen,
Jerman). Pemisahan Kromatografik dilakukan dengan kolom ODS-80Ts
(150 mm x 4,6 mm x 5 mm; Tosoh Co, Tokyo, Jepang) dipanaskan 30oC
menggunakan elusi gradien pelarut A: metanol dan pelarut B: 0.5% asam
format dalam air dengan laju aliran 0.8 mL/menit sebagai berikut: 15-35%
(30 menit), 35% (20 menit), 35-15% (10 menit). Detektor dipatok pada 210,
254, 270, 280, dan 340 nm dengan 360 nm sebagai referensi panjang
gelombang, keduanya pada 4 nm bandwidth, dengan skaning spektrum
penuh dari 150 untuk 800 nm dengan resolusi 0.5 nm.
Sumber ESI dioperasikan dengan tekanan nebuliser 50 psig,
sementara gas pengering dialirkan dengan laju aliran 10 L/min pada suhu
365oC. Tegangan kapiler diatur pada 3000V dan tegangan fragmentor pada
55 V. Dipilih analisis mode ion positif untuk MS dan MSn. Kisaran massa
untuk spektrum penuh m/z 50-1000 dan untuk produk ion spektrum m/z 50-
500. Tingkat energi benturan relatif adalah 35% dari maksimum untuk
menghasilkan hasil yang optimal dari ion produk. Data HPLC-DAD dan
HPLC/MS diakuisisi dan diproses menggunakan perangkat lunak Bruker
Esquire 5.1. Target puncak diidentifikasikan dengan membandingkan
berapa kali retensi dan spektrum UV dan MSnnya dengan standar asli.
9
2.4.4 Analisis kuantitatif
Kondisi instrumen dan kromatografik untuk analisis kuantitatif
HPLC/ESI-MS2 yang sama seperti dijelaskan dalam bagian sebelumnya.
Spektrometer massa dioperasikan dalam mode ion positif ESI dan transisi
dari molekul terprotonasi dimonitor untuk analisis kuantitatif dalam
beberapa reaksi pemantauan mode (MRM). Pengaturan MS2 dioptimalkan
untuk menyesuaikan pemantauan ion (ion pendahulu dan ion produk)
menggunakan gas pengering (N2) suhu 365oC, aliran gas pengerin 10
L/menit, dan tekanan gas nebuliser (N2) 50 psig. Transisi m/z 327→165,
329→167, 327→165 dan 167→149 yang dipilih untuk MRM dari cis-
melilotosida, dihidromelilotosida, trans-melilotosida dan asam phthalic
(internal standar), berturut-turut.
2.4.5 Metode validasi
Metode untuk analisis kuantitatif divalidasi untuk menentukan
linearitas, kepekaan, ketepatan dan akurasi untuk setiap analit. Enam-titik
kurva kalibrasi yang dihasilkan dengan volume sesuai dengan kerja larutan
standar. Batas-batas deteksi (LODs) dan kuantifikasi (LOQs) yang
diperkirakan oleh metode dasar kebisingan dengan sinyal tiga dan sepuluh
kali lebih tinggi daripada kebisingan dasar, berturut-turut. Presisi dan
akurasi ditentukan dengan sampel standar yang disiapkan sebanyak rangkap
tiga dalam tiga tingkat konsentrasi yang menutupi seluruh kisaran linearitas.
Ketepatan assay ditentukan oleh variasi intra-day dan inter-day dan
dilaporkan sebagai deviasi standar relatif (RSD %). Keakuratan dievaluasi
sebagai pengoreksi persentase analit yang disebut sampel terkontrol.
2.5 Hasil dan Diskusi
2.5.1 Identifikasi asam 2-glukosiloksisinamik 1, 2 dan 3
Kromatogram HPLC-DAD/MS dari ekstrak D. aurantiacum var.
denneanum memberikan tiga puncak utama (Gambar. 5) saat retensi (R t)
12.6 menit (UV: λmax 230, 265 dan 310 nm; m/z 327, [M+H]+), 20.4 min
(UV: λmax 220 dan 270 nm; m/z 329, [M+H] +) dan 24.8 min (UV: λmax 280
10
dan 320 nm; m/z 327, [M+H] +) untuk senyawa 1, 2 dan 3, berturut-turut.
Senyawa 1-3 jelas diidentifikasikan sebagai cis-melilotosida,
dihidromelilotosida, dan trans-melilotosida, berturut-turut, dengan
mencocokkan pola fragmentasi Rt, ultraviolet dan MSn sesuai dengan
standar.
Gambar 5. Kromatogram dari D. aurantiacum var. denneanum.(a) Total ion kromatogram. (b) Kromatogram HPLC/UV (270 nm) dan spektrum UV dari senyawa 1, 2 and 3. Untuk penjelasan tiap puncak, lihat Tabel 1.
11
Skema 1. Jalur fragmentasi untuk (a) senyawa 1 dan (b) senyawa 2.
Gambar 6. Spektrum ion massa produk (MS/MS) dari ion [M+H]+ (a) cis-melilotosida (m/z 327→165); (b) dihidromelilotosida (m/z 329→167); (c) trans-melilotosida (m/z 327→165); dan (d) asam phthalic (internal standar, m/z 167→149)
Seperti yang ditunjukkan pada skema 1, senyawa 1-3 mengalami
jalur fragmentasi ESI-MSn yang mirip. Molekul terprotonasi diproduksi
sesuai ion produk aglikona pada m/z 165, 167 dan 165 dalam eksperimen
MS2 (Gambar. 6) kehilangan sebuah residu glukosa, kemudian memberikan
ion-ion [M+H–162–H2O]+ pada m/z 147, 149 dan 147 pada eksperimen MS3
oleh dehidrasi dan laktonisasi untuk membentuk kumarin 1 dan 3, dan 3.4-
dihidro kumarin untuk 2. Selain itu, cis-melilotosida (1) menghasilkan ion
12
[M+H–162–C2H2O]+ pada m/z 123 dan sebuah ion [M+H–162–C2H2O–CO]+
pada m/z 95 pada eksperimen MS3 dan MS4.
Tabel 1. Karakterisasi asam 2-glukosiloksisinami turunan Dendrobium aurantiacum var. denneanum
2.5.2 Identifikasi yang tidak diketahui asam 2-glukosiloksisinamik
dalam D. aurantiacum var. denneanum
Menggunakan metode analitik HPLC-DAD/ESI-MS di atas untuk
identifikasi senyawa 1-3 dan pola fragmentasi MS2nya, enam tambahan,
struktural mirip asam 2-glukosiloksisinamik (senyawa 4-9) diidentifikasikan
dari ekstrak antioksidan D. aurantiacum var. denneanum (Gambar. 5).
Senyawa 4 (Rt 15.6 menit) dan 7 (Rt 44.6 menit) menunjukkan spektrum
UV dan MS yang mirip untuk dihidromelilotosida (2) dan trans-
melilotosida (3), berturut-turut. Spektra massa scan penuh, 4 dan 7
menunjukkan ion [M+NH4]+ pada m/z 392 dan 390 dan ion [M+H] pada m/z
375 dan 373, menyatakan bahwa massa molekul 4 dan 7 yang 46 Da yang
lebih tinggi daripada dihidromelilotosida (2) dan trans-melilotosida (3),
berturut-turut. Spektrum MS2 yang sesuai dari 4 dan 7 memberikan dasar
puncak dari ion [M+H–162]+ pada m / z 213 dan 211 , dan spektrum
MS3nya yang dihasilkan karakteristik ion [M+H–162–H2O]+ pada m/z 195
dan 193 , yang ditugaskan untuk dihidroskopoletin dan skopoletin , berturut-
turut ; turunan kumarin yang terakhir sebelumnya telah dilaporkan pada D.
thyrsiflorum. Berdasarkan spektrum MSn di atas , senyawa 4 dan 7 secara
baik ditandai sebagai 4-hidroksi-5-metoksi-dihidromelilotosida dan 4-
hidroksi-5- metoksi-trans-melilotosida, berturut-turut (Gambar. 7).
13
Gambar 7. Identifikasi senyawa 7. (a) Spektrum massa. (b) Spektrum MS2 untuk ion [M+H]+ pada m/z 373. (c) Spektrum MS3 untuk ion pada m/z 211. (d) Pola fragmentasi senyawa 7.
Senyawa 5, 6, 8 dan 9 memberikan pola-pola fragmentasi yang
berbeda untuk spektrum MS3 mereka. Keduanya 5 (Rt 26.5 menit) dan 8 (Rt
48.8 menit) memperlihatkan UV maxima pada 230, 265 dan 310 nm,
karakteristik dari turunan asam cis-2-glukosiloksisinamik. Senyawa 5
memberikan sebuah ion [M+H]+ pada m/z 341, 14 m/z unit yang lebih tinggi
daripada cis-melilotosida (1). Spektrum MS2 dari 5 memberikan sebuah ion
[M+H–162]+ pada m/z 180, dan sebuah ion [M+H–162–CH3]+ pada m/z 165
dalam spektrum MS3, diikuti oleh pelepasan molekul H2O yang membentuk
kumarin dalam spektrum MS4. Dengan demikian, senyawa 5 itu
diidentifikasi sebagai cis-melilotoside 3'-metil ester, senyawa yang telah
teramati pada Prunus cornuta. Demikian pula, senyawa 8 memberikan
14
sebuah ion [M+H]+ pada m/z 383, 56 m/z unit yang lebih tinggi daripada 1,
dan diidentifikasi sebagai cis-melilotosida 3'-butil ester didasarkan pada
hilangnya berturut-turut residu glukosa, butena dan H2O ([M+H–162–56–
18]) dalam percobaan MSn (skema 2).
Skema 2. Tahapan jalur fragmentasi senyawa 8
Senyawa 6 (Rt 33.1 menit) dan 9 (Rt 49.4 min) menunjukkan
karakteristik UV maxima di 220 dan 270 nm, mirip dengan 2. Ion-ion
[M+H]+ pada m/z 343 dan 385 menunjukkan bahwa massa molekul 6 dan 9
14 dan 56 Da yang lebih tinggi, masing-masing, daripada 2. Spektrum MSn
6 dan 9 juga menunjukkan kerugian berturut-turut glukosa residu, metil
untuk 6 (butena 9), dan H2O menghasilkan kumarin sesuai ion produk. Oleh
karena itu, senyawa 6 dan 9 secara baik diidentifikasikan sebagai
dihidromelilotosida 3'-metil ester dan dihidromelilotosida 3'-butil ester,
berturut-turut.
Seperti yang diharapkan, perilaku retensi senyawa 4-9 ditampilkan
berurutan mirip untuk senyawa 1-3: cis-2-glukosiloksisinamik turunan
pertama asam yang terelusi, kemudian asam dihidro-2-glukosiloksisinamik,
dan akhirnya asam trans-2-glukosiloksisinamik. Karakteristik penyerapan
maxima UV dan produk yang predominan ion senyawa 1-9 tercantum dalam
tabel 1 dan semua yang terdeteksi dalam D. aurantiacum var. denneanum
dari sumber yang berbeda. Dalam rangka untuk menghilangkan
kemungkinan senyawa 5 dan 6 menjadi artefak yang diturunkan oleh
metilasi selama prosedur ekstraksi metanol, etanol digunakan untuk
ekstraksi bukan metanol. Hasil menunjukkan bahwa asam sinamik metil
ester (5 dan 6) tapi tidak etil ester yang terdeteksi yang jelas dikonfirmasi
terjadinya alami senyawa 5 dan 6 dalam ekstrak. Senyawa 5 dan 6 telah
dilaporkan di tempat lain, sedangkan senyawa 4, 7, 8 dan 9 sesuai dengan
15
produk alami yang baru, yang harus dikonfirmasi oleh future
phytochemistry work.
2.5.3 Kuantifikasi asam 2-glukosiloksisinamik dalam spesies
Dendrobium
Untuk mencapai resolusi yang cukup antara puncak, kondisi HPLC
dioptimalkan untuk kuantifikasi akurat mempertahankan analisis wajar
waktu menggunakan gradien fase gerak metanol (A) dan water/5% asam
format (B) sebagai berikut: 15-30% (10 menit), 30-15% (5 menit). Mode
MRM digunakan untuk selektivitas yang tinggi dan untuk menghindari
kemungkinan penilaian yang berlebihan atau hasil kuantitatif palsu yang
biasanya diproduksi menggunakan mode MS tunggal. Asam phthalic
digunakan sebagai standar internal. Seperti dijelaskan di atas dan
ditampilkan dalam Gambar. 3, molekul terprotonasi pada m/z 327 (1), 329
(2) dan 327 (3) memberikan sesuai terkemuka [M+H–162]+ ion produk pada
m/z 165, 167 dan 165 spektra MS2, mewakili aglikona setiap asam 2-
glukosiloksisinamik. Dengan demikian, m/z 327→165, 327→165 dan
329→167 dipilih sebagai transisi yang paling sensitif dalam modus MRM
untuk HPLC / ESI-MS2 kuantifikasi cis-melilotosida, dihidromelilotosida,
dan trans-melilotosida, berturut-tururt. Asam phthalic (internal standar),
sebuah produk ion dominan terdeteksi pada m/z 149 karena hilangnya 18 Da
(H2O) dari molekul terprotonasi pada m/z 167, dan oleh karean itu m/z
167→149 dipilih untuk deteksi kuantitatif MRM asam phthalic (Gambar.
6).
Kurva kalibrasi dibangun untuk cis-melilotosida, dihidromelilotosida,
dan trans-melilotosida. Kurva kalibrasi ini digambarkan sebagai rasio dari
daerah puncak antara analit dan standar internal versus konsentrasi analit
masing-masing. Parameter kalibrasi diringkas dalam tabel 2. Linearitas
diperoleh jarak 0.09-100, 0.01-15 dan 0.09-15 µg/mL untuk cis-
melilotosida, dihidromelilotosida, dan trans-melilotosida, berturut-turut.
Untuk setiap analitr, LOD dan LOQ dihitung sebagai tiga dan sepuluh kali
rasio sinyal-derau. cis-Melilotoside dan trans-melilotosida memiliki nilai
yang sama LOD dan LOQ 0.025 dan 0,09 µg/mL, sedangkan sensitivitas
16
tertinggi diperoleh untuk dihidromelilotosida dengan nilai-nilai LOD dan
LOQ 0,002 dan 0,01 µg/mL, berturut-turut.
Table 2. Data kurva kalibrasi referensi asam 2-glukosiloksisinamik
Presisi dan akurasi metode dinilai pada tiga konsentrasi analit kontrol
dalam rangkap tiga. Solusi sampel kontrol dengan sejumlah standar
campuran cis-melilotosida, dihidromelilotosida, trans-melilotosida dan
asam phthalic (internal standar) pada tiga tingkat konsentrasi yang berbeda
(0,5, 5 dan 10 mg/mL) meliputi berbagai linearitas untuk setiap analyte yang
berduri. Ketepatan metode dinilai dengan menghitung intra-hari dan inter-
day variasi tiga replicates, diverifikasi oleh menentukan sampel dengan
RSDs seperti yang tercantum dalam tabel 3. Keseluruhan intra - dan inter -
day variasi yang kurang dari 8% (mulai dari 0.78%-20137.92%),
menunjukkan memuaskan presisi instrumentasi dan stabilitas sampel. Selain
itu, metode analisis yang dikembangkan dalam studi ini memiliki akurasi
baik dengan keseluruhan pemulihan mulai dari 85-105% untuk analit yang
bersangkutan (Tabel 3).
Tabel 3. Ringkasan akurasi dan presisi
Metode kuantitatif yang ditetapkan diaplikasikan untuk menentukan
konsentrasi cis-melilotoside, dihydromelilotoside dan trans-melilotoside di
17
tiga spesies Dendrobium, D. aurantiacum var. denneanum, D. thyrsiflorum
dan D. chrysotoxum, yang merupakan sumber utama/Tinosporae Caulis
Dendrobii (Tabel 4). Konsentrasi cis-melilotoside, D. aurantiacum var.
denneanum dari pemukiman berbeda yang berkisar dari 6.21 mg/g di Tome
ke 14.93 mg/g di Nanjing sampel. Relatif, jumlah yang lebih kecil
dihydromelilotoside dan trans-melilotoside diamati pada sampel yang
dianalisis, mulai dari 0.32%-20131.52 mg/g dan dari 1.04%-20136.44 mg/g,
masing-masing. Sehubungan dengan D. thyrsiflorum dan D. chrysotoxum,
hal yang sama juga diamati pada D. aurantiacum var. denneanum dengan
isomer cis mengumpulkan untuk tingkat yang lebih tinggi daripada derivatif
trans - dan dihidro (Tabel 4).
Tabel 4. Konsentrasi (mg/g, n¼3) asam 2-glukosiloksisinamik pada sampel Dendrobium
18
BAB III
PENUTUP
3.1. Kesimpulan
Kesimpulan yang diperoleh dari penulisan makalah ini adalah
1. Metode HPLC-DAD/ESI-MS telah dikembangkan dan berhasil diterapkan
untuk analisis simultan cis-, isomer trans dan dihidro turunan asam
2-glukosiloksisinamik dalam tiga obat spesies Dendrobium. Tiga penanda
senyawa, cis-melilotoside, trans-melilotoside dan dihydro-melilotoside, yang
diidentifikasi melalui perbandingan banyaknya retensi dan MS ultraviolet
dengan referensi standar. Menggunakan jalur fragmentasi ESI-MSn
karakteristik dari asam 2-glucosyloxycinnamic ini, struktur enam tambahan
analog urunan 2-glukosiloksisinamik hadir dalam jumlah noda yang
diidentifikasikan. Selain itu, isi dari tiga besar 2-glucosyloxycinnamic asam
pada Dendrobium sampel secara bersamaan bertekad oleh HPLC/ESI-MS2
dalam modus MRM. Metode yang dikembangkan terbukti selektif, sensitif
dan dapat diandalkan untuk analisis 2-glukosiloksisinamik dalam matriks
kompleks berdasarkan metodologi tervalidasi.
2. Metode analisis HPLC/ESI-MS2 tidak hanya memberikan informasi kimia
rinci pada analit sasaran, tetapi juga mengatasi kekurangan (a) sensitivitas
rendah, dan (b) prosedur ekstraksi rumit dan menyita waktu dibandingkan
dengan injeksi ketika menggunakan metode HPLC-DAD bertahap. Terlebih
lagi, cukup selektivitas dan kepekaan serta keakuratan analisis kuantitatif
dicapai dengan mendeteksi senyawa dalam modus MRM. Telah
dikembangkan metodologi efektif dan efisien untuk analisis kualitatif dan
kuantitatif glikosida hidroksisinamik asam pada tanaman.
3.2. Saran
Perlu adanya penelitian lebih lanjut mengenai metode analitis yang sensitif
dan selektif untuk karakterisasi dan kuantifikasi turunan asam
2-glukosiloksisinamik dalam tanaman obat Dendrobium agar lebih mudah dan
efisien serta lebih ekonomis.
19
DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2012. Spektrometri Massa.<http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Istimewa:Perubahan_terbaru&feed=atom>Diakses pada tanggal 22 Mei 2012.
Chetya, T. 2011. Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi (HPLC)<http://chetyachemist.blogspot.com/2011/05/kromatografi-cairan-kinerja-tinggi-hplc.html>Diakses pada tanggal 20 Mei 2012
Clark, J. 2004. Bagaimana Spektrometer Massa Bekerja.<http:/ /Bagaimana Spektrometer massa bekerja Chem-Is-Try.Org Situs Kimia Indonesia _files/Bagaimana Spektrometer massa bekerja Chem-Is-Try.Org Situs Kimia Indonesia .html>Diakses pada tanggal 22 Mei 2012.
Clark, J. 2007. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC).<http://www.google.com/bookmarks/mark?op=edit&bkmk=http://www.chem-is-try.org/materi_kimia/instrumen_analisis/kromatografi1/kromatografi_cair_kinerja_tinggi_hplc/>Diakses pada tanggal 22 Mei 2012.
Smanda, M. 2011. Anggrek juga tanaman obathttp://melacakalam.wordpress.com/2011/12/17/anggrek-juga-tanaman-obat/diakses pada tanggal 20 Mei 2012
20