BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Turunan asam hidroksisinamik yang melimpah di tumbuhan dan sangat

menarik minat yang cukup luas untuk mereka spektrum antihiperglikemik

kegiatan seperti biologi, antitumor, bentuk antioksidan, hepatoprotective,

vasoactive, dan stimulatory effect pada alpha1 a-adrenoceptors. Hal tersebut

menunjukkan bahwa aktivitas turunan asam hidroksisinamik tersebut ditentukan

oleh posisi substitusi gugus hidroksil. Meski begitu , hampir semua anak biologis

dan analisis kimia terkini terfokus pada 4-hidroksi- atau 3,4-dihidroksisinamik

turunan asam kuat biologis karena kemampuannya. Relatif sedikit studi pada 2-

hidroksi analogues dan bahkan lebih sedikit pada turunannya glukosida

dilaporkan, terutama karena dari distribusi Linux mereka terbatas pada tanaman.

Dalam studi skrining baru-baru ini, terdapat senyawa aktif produk alami

dari tanaman obat Dendrobium (Orchidaceae), tiga asam 2-glukosiloksisinamik,

cis-melilotoside, trans-melilotoside dan dihydromelilotoside, dari D. aurantiacum

var. denneanum, yang terisolasi kuat sebagai aktifitas antioksidan. Potensi

Dendrobium sebagai obat disebabkan karena anggrek ini menghasilkan berbagai

macam senyawa metabolit penting, beberapa di antaranya adalah alkaloid.

Alkaloid utama dan paling banyak dijumpai pada Dendrobium adalah Dendrobine

(C16H25O2N). Di China, Dendrobine banyak diekstraksi dari spesies Dendrobium

nobile. Ekstraksi Dendrobine dan alkaloid lainnya sering dilakukan dari batang

atau pseudobulb. Nobilonine, Dendrine, Dendroxime dan Dendramine adalah

jenis metabolit lain yang ditemukan pada Dendrobium. Dendrobium di China

digunakan sebagai obat baik dalam bentuk segar maupun setelah dikeringkan.

Senyawa-senyawa aktif pada Dendrobium mempunyai aktivitas antikanker. Di

China Dendrobium dilaporkan telah dimanfaatkan dalam pengobatan kanker perut

dan paru-paru. Dendrobine dan alkaloid lain pada Dendrobium juga berkhasiat

untuk menurunkan kadar gula darah hingga pengobatan impotensi, menyatakan

bahwa metabolit-metabolit yang dihasilkan Dendrobium kemungkinan berpotensi

sebagai antibiotik (Smanda, 2011).

1

Kromatografi cair berperforma tinggi (HPLC) digabungkan ke diode-array

detection (DAD) dan spektrometri massa (MS) adalah alat yang ampuh untuk

analisis dan kualitas evaluasi obat-obatan dan alam products. Teknik ini sangat

memudahkan karakterisasi kimia dalam matriks kompleks dan produk alami yang

secara struktural berupa campuran. Hal ini juga memiliki selektivitas cukup dan

kepekaan analisis kuantitatif yang akurat dengan penggunaan yang tepat dari

standar internal. Dalam karya ini, dipilih HPLC-DAD/electrospray ionisasi multi-

step spektrometri massa (ESI-MSn) untuk mengembangkan metode yang akan

dicapai agar memiliki kepekaan yang lebih baik dalam identifikasi dan

kuantifikasi turunan asam 2-glukosiloksisinamik dalam ekstrak tumbuhan obat

Dendrobium.

1.2 Rumusan Masalah

Rumusan masalah yang dapat diambil dari makalah ini adalah :

1. Bagaimanakah metode analitis yang sensitif dan selektif untuk

karakterisasi dan kuantifikasi turunan asam 2-glukosiloksisinamik dalam

tanaman obat Dendrobium?

2. Bagaimanakah kelayakan menggunakan senyawa turunan asam

2-glukosiloksisinamik sebagai tanda-tanda diagnostik kimia untuk

otentikasi dan pengawasan mutu tanaman obat Dendrobium?

1.3 Tujuan Masalah

Adapun Tujuan masalah dalam penulisan makalah ini adalah :

1. Mengembangkan metode analitis sensitif dan selektif untuk karakterisasi

dan kuantifikasi turunan asam 2-glukosiloksisinamik dalam tanaman obat

Dendrobium.

2. Mengevaluasi kelayakan menggunakan senyawa turunan asam 2-

glukosiloksisinamik sebagai tanda-tanda diagnostik kimia untuk otentikasi

dan pengawasan mutu tanaman obat Dendrobium.

1.4 Metode Penulisan

Metode yang digunakan dalam pembuatan makalah ini adalah metode

pustaka dari internet berupa jurnal ilmiah maupun artikel yang berkaitan dengan

isi makalah.

2

BAB II

ISI

2.1 Potensi Dendrobium

Sekitar 250.000 hingga 350.000 spesies tumbuhan diyakini berpotensi

sebagai tumbuhan obat (obat herbal). Namun baru sekitar 35.000 spesies yang

telah dimanfaatkan. Badan Kesehatan Dunia (WHO) memperkirakan pemanfaatan

potensi tumbuhan obat secara maksimal dapat memenuhi kebutuhan kesehatan

80% penduduk dunia terutama di negara berkembang, sementara sejak

pertengahan 1990-an diperkirakan lebih dari 200 perusahaan industri dan

organisasi besar dunia telah berusaha menemukan dan mengidentifikasi senyawa-

senyawa metabolit potensial pada tumbuhan dan hewan (Smanda, 2011).

Di benua Asia, masyarakat China, Jepang, India dan Indonesia banyak

memanfaatkan tumbuhan-tumbuhan obat untuk memenuhi kebutuhan kesehatan.

Sekitar 7300 spesies tumbuhan telah dimanfaatkan oleh masyarakat China sebagai

obat tradisional. Hal ini membuat China sebagai negara terdepan dalam

pemanfaatan tumbuhan obat. Anggrek adalah tumbuhan familia Orchidaceae

yang telah lama dimanfaatkan sebagai tumbuhan obat oleh masyarakat China.

Beberapa genus yang telah dimanfaatkan sebagai tumbuhan obat antara lain

Dendrobium, Malaxis, Gastrodia, Bletilla dan Anoectochillus. Produk obat-

obatan tradisional yang berasal dari Dendrobium bahkan telah lama

diperdagangkan di China (Smanda, 2011).

Potensi Dendrobium sebagai obat disebabkan karena anggrek ini

menghasilkan berbagai macam senyawa metabolit penting, beberapa di antaranya

adalah alkaloid. Alkaloid utama dan paling banyak dijumpai pada Dendrobium

adalah Dendrobine (C16H25O2N). Di China, Dendrobine banyak diekstraksi dari

spesies Dendrobium nobile. Ekstraksi Dendrobine dan alkaloid lainnya sering

dilakukan dari batang atau pseudobulb. Nobilonine, Dendrine, Dendroxime dan

Dendramine adalah jenis metabolit lain yang ditemukan pada Dendrobium.

Dendrobium di China digunakan sebagai obat baik dalam bentuk segar maupun

setelah dikeringkan. Senyawa-senyawa aktif pada Dendrobium mempunyai

aktivitas antikanker. Di China Dendrobium dilaporkan telah dimanfaatkan dalam

3

pengobatan kanker perut dan paru-paru. Dendrobine dan alkaloid lain pada

Dendrobium juga berkhasiat untuk menurunkan kadar gula darah hingga

pengobatan impotensi. Metabolit-metabolit yang dihasilkan Dendrobium

kemungkinan berpotensi sebagai antibiotic (Smanda, 2011).

Indonesia mempunyai kekayaan tumbuhan yang sangat besar. Kekayaan

spesies Anggrek yang ada di Indonesia salah satu yang terbesar di dunia, jauh

melebihi China. Spesies-spesies seperti Dendrobium, Malaxis dan Vanilla bahkan

banyak dijumpai. Kebiasaan masyarakat dan suku adat di Indonesia yang sejak

lama memanfaatkan tumbuhan sebagai obat membuka peluang yang sangat besar

bagi studi Etnobotani dan penelitian-penelitian untuk menggali potensi tumbuhan

obat Indonesia (Smanda, 2011).

Indonesia kaya akan spesies Anggrek salah satunya adalah Dendrobium

crumenatum (Anggrek Merpati). Di Indonesia, Anggrek merpati termasuk spesies

kosmopolit yang tumbuh secara liar namun banyak juga dijumpai sebagai

tanaman hias di rumah, kampus hingga di tepi jalan. Dendrobine tersebar luas di

genus Dendrobium, salah satunya adalah Dendrobium crumenatum (Smanda,

2011).

Gambar 1. Berbagai spesies Dendrobine yang dimanfaatkan sebagai obat.

Pengaruh Dendrobine dan alkaloid lain dalam meningkatkan viabilitas sel

neuron, menekan tingkat kematian sel neuron serta melindungi sel neuron dari

kerusakan pada tikus menunjukkan adanya pengaruh Dendrobine terhadap

aktivitas elektrik dan depolarisasi pada sel syaraf Katak. Aktivitas anti

hiperglikemia juga dari ekstrak alkaloid batang Dendrobium chrysotoxum.

Campuran alkaloid pada ekstrak batang dan bunga D. nobile mempunyai aktivitas

anti bakteri dan anti kanker. Hal tersebut ditunjukkan dengan luas zona

penghambatan pada kultur Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella typhi,

4

Staphylococcus aureus dan Proteus. Hasil penelitian tersebut juga menunjukkan

bahwa ekstrak alkaloid dari bunga D. nobile mempunyai aktivitas antikanker

sehingga bunga dapat menjadi organ alternatif sumber Dendrobine dan alkaloid

lainnya (Smanda, 2011).

2.2 HPLC (Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi)

HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini

menjelaskan bagaimana pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang

sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom. HPLC secara

mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom.

Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung

melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.

HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk

material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang

lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya.

Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen

dalam campuran (Chetya, 2011).

Gambar 2. Instrumen HPLC

Pada prinsipnya, HPLC bekerja dengan bantuan pompa fasa gerak cair

dialirkan melalui kolom ke detektor. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa

gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-

komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut

terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam

akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi

5

dengan fasa diam maka solut-solut tersebut akan keluar kolom dideteksi oleh

detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram kromatografi gas. Seperti

pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan konsentrasi komponen dalam

campuran. Computer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan

mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC (Clark, 2007)

2.3 MS (Spektrometri Massa)

Spektrometri massa adalah alat yang digunakan untuk menentukan massa

atom atau molekul, yang ditemukan oleh Franci William Aston pada tahun 1919.

Prinsip kerja alat ini adalah pembelokan partikel bermuatan dalam medan magnet.

Sampel dalam bentuk gas mula-mula ditembaki dengan berkas elektron berenergi

tinggi. Perlakuan ini menyebabkan atom atau molekul sampel berionisasi

(melepas elektron sehingga menjadi ion positif). Ion-ion positif ini kemudian

dipercepat oleh suatu beda potensial dan diarahkan ke dalam suatu medan magnet

melalui suatu celah sempit. Di dalam medan magnet, ion-ion tersebut akan

mengalami pembelokan yang bergantung kepada:

1. Kuat medan listrik yang mempercepat aliran ion. Makin besar potensial listrik

yang digunakan, makin besar kecepatan ion dan makin kecil pembelokan.

2. Kuat medan magnet. Makin kuat magnet, makin besar pembelokan.

3. Massa partikel (ion). Makin besar massa partikel, makin kecil pembelokan.

4. Muatan partikel. Makin besar muatan, makin besar pembelokan.

(Anonim, 2012).

Gambar 3. Diagram lengkap dari spektrometer massa

6

Atom dapat dibelokkan dalam sebuah medan magnet (dengan anggapan

atom tersebut diubah menjadi ion terlebih dahulu). Karena partikel-partikel

bermuatan listrik dibelokkan dalam medan magnet dan partikel-partikel yang

tidak bermuatan (netral) tidak dibelokkan. Urutannya adalah sebagai berikut:

Tahap pertama : Ionisasi

Atom di-ionisasi dengan emengambilf satu atau lebih elektron dari atom

tersebut supaya terbentuk ion positif. Ini juga berlaku untuk unsur-unsur yang

biasanya membentuk ion-ion negatif (sebagai contoh, klor) atau unsur-unsur yang

tidak pernah membentuk ion (sebagai contoh, argon). spektrometer massa ini

selalu bekerja hanya dengan ion positif.

Tahap kedua : Percepatan

Ion-ion tersebut dipercepat supaya semuanya mempunyai energi kinetik

yang sama.

Tahap ketiga : Pembelokan

Ion-ion tersebut dibelokkan dengan menggunakan medan magnet,

pembelokan yang terjadi tergantung pada massa ion tersebut. Semakin ringan

massanya, akan semakin dibelokan. Besarnya pembelokannya juga tergantung

pada besar muatan positif ion tersebut. Dengan kata lain, semakin banyak elektron

yang ediambilf pada tahap 1, semakin besar muatan ion tersebut, pembelokan

yang terjadi akan semakin besar.

Tahap keempat : Pendeteksian

Sinar-sinar ion yang melintas dalam mesin tersebut dideteksi dengan secara

elektrik.

(Clark, 2004).

2.4 Percobaan

2.4.1 Kimia dan bahan-bahan

HPLC-grade metanol disediakan oleh Wako Pure Chemical

Industries, Ltd. (Osaka, Jepang). Air dimurnikan dengan sistem Milli-Q

(Millipore, Bedford, MA, USA). Pelarut lainnya, dibeli dari Nacalai Tesque

Inc (Kyoto, Jepang), adalah kelas analitis.

Tiga senyawa referensi asam 2-glukosiloksisinamik, cis-

melilotosida, trans-melilotosida dan dihidromelilotosida, disolasi dari

7

batang D. aurantiacum var. dennaeanum. Struktur dikarakterisasi oleh UV,

IR, MS, 1H NMR dan 13C NMR dan kemurniannya ditentukan untuk lebih

dari 98% oleh HPLC-DAD. Internal standar, asam phthalic (>99%), didapat

dari Nacalai Tesque Inc.

Gambar 4. Struktur kimia turunan asam 2-glukosiloksisinamik.

Stok larutan standar dari cis-melilotosida pada 3 mg/mL, dan trans-

melilotosida, dihidromelilotosida dan asam phthalic pada 1 mg/mL,

disiapkan dalam metanol dan disimpan pada suhu 4oC. Larutan standar

analit (0.01-100 µg/mL) dan internal standar (20 µg/mL) yang disediakan

oleh cairan berupa solusi dari stok dengan metanol.

2.4.2 Persiapan sampel

Tiga sampel tanaman dari Dendrobium aurantiacum var. denneanum

dikumpulkan dari Nanjing (Provinsi Jiangsu), Tome dan Xishuangbanna

(provinsi Yunnan), dan dua sampel D. thyrsiflorum dan D. chrysotoxum dari

Xishuangbanna (provinsi Yunnan) di P. R. Cina. Semua tanaman sampel

yang disahkan oleh Profesor Luoshan Xu dan Dr Li Yang. Spesimen

disimpan di Herbarium dari China Pharmaceutical University, Nanjing, P.

R. China.

Sekitar 0,1 g bagian dari sampel tanaman yang sudah dilumatkan,

ditimbang secara akurat, arti dalam 50 mL 1: 1 (v/v) MeOH/air pada 50oC

8

selama 60 menit dan kemudian diekstraksi dalam ultrasonik bath selama 45

menit. Ekstrak Aliquots disentrifugasi pada 3000 rpm. Volume 5 mL

supernatan kemudian dibuang dan dicuci dengan 100 mL asam phthalic

(internal standar, 1 mg/mL) dan disaring dengan saringan PTFE 0.45 µm

sebelumnya untuk dianalisis HPLC.

2.4.3 Analisis kualitatif

Sistem HPLC digunakan untuk pemisahan Agilent seri 1100 dengan

detektor diode-array (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) dan

Bruker Esquire 3000 perangkap ion Spektrometer massa yang dilengkapi

dengan sumber ionisasi (ESI) electrospray (Bruker Daltronics, Bremen,

Jerman). Pemisahan Kromatografik dilakukan dengan kolom ODS-80Ts

(150 mm x 4,6 mm x 5 mm; Tosoh Co, Tokyo, Jepang) dipanaskan 30oC

menggunakan elusi gradien pelarut A: metanol dan pelarut B: 0.5% asam

format dalam air dengan laju aliran 0.8 mL/menit sebagai berikut: 15-35%

(30 menit), 35% (20 menit), 35-15% (10 menit). Detektor dipatok pada 210,

254, 270, 280, dan 340 nm dengan 360 nm sebagai referensi panjang

gelombang, keduanya pada 4 nm bandwidth, dengan skaning spektrum

penuh dari 150 untuk 800 nm dengan resolusi 0.5 nm.

Sumber ESI dioperasikan dengan tekanan nebuliser 50 psig,

sementara gas pengering dialirkan dengan laju aliran 10 L/min pada suhu

365oC. Tegangan kapiler diatur pada 3000V dan tegangan fragmentor pada

55 V. Dipilih analisis mode ion positif untuk MS dan MSn. Kisaran massa

untuk spektrum penuh m/z 50-1000 dan untuk produk ion spektrum m/z 50-

500. Tingkat energi benturan relatif adalah 35% dari maksimum untuk

menghasilkan hasil yang optimal dari ion produk. Data HPLC-DAD dan

HPLC/MS diakuisisi dan diproses menggunakan perangkat lunak Bruker

Esquire 5.1. Target puncak diidentifikasikan dengan membandingkan

berapa kali retensi dan spektrum UV dan MSnnya dengan standar asli.

9

2.4.4 Analisis kuantitatif

Kondisi instrumen dan kromatografik untuk analisis kuantitatif

HPLC/ESI-MS2 yang sama seperti dijelaskan dalam bagian sebelumnya.

Spektrometer massa dioperasikan dalam mode ion positif ESI dan transisi

dari molekul terprotonasi dimonitor untuk analisis kuantitatif dalam

beberapa reaksi pemantauan mode (MRM). Pengaturan MS2 dioptimalkan

untuk menyesuaikan pemantauan ion (ion pendahulu dan ion produk)

menggunakan gas pengering (N2) suhu 365oC, aliran gas pengerin 10

L/menit, dan tekanan gas nebuliser (N2) 50 psig. Transisi m/z 327→165,

329→167, 327→165 dan 167→149 yang dipilih untuk MRM dari cis-

melilotosida, dihidromelilotosida, trans-melilotosida dan asam phthalic

(internal standar), berturut-turut.

2.4.5 Metode validasi

Metode untuk analisis kuantitatif divalidasi untuk menentukan

linearitas, kepekaan, ketepatan dan akurasi untuk setiap analit. Enam-titik

kurva kalibrasi yang dihasilkan dengan volume sesuai dengan kerja larutan

standar. Batas-batas deteksi (LODs) dan kuantifikasi (LOQs) yang

diperkirakan oleh metode dasar kebisingan dengan sinyal tiga dan sepuluh

kali lebih tinggi daripada kebisingan dasar, berturut-turut. Presisi dan

akurasi ditentukan dengan sampel standar yang disiapkan sebanyak rangkap

tiga dalam tiga tingkat konsentrasi yang menutupi seluruh kisaran linearitas.

Ketepatan assay ditentukan oleh variasi intra-day dan inter-day dan

dilaporkan sebagai deviasi standar relatif (RSD %). Keakuratan dievaluasi

sebagai pengoreksi persentase analit yang disebut sampel terkontrol.

2.5 Hasil dan Diskusi

2.5.1 Identifikasi asam 2-glukosiloksisinamik 1, 2 dan 3

Kromatogram HPLC-DAD/MS dari ekstrak D. aurantiacum var.

denneanum memberikan tiga puncak utama (Gambar. 5) saat retensi (R t)

12.6 menit (UV: λmax 230, 265 dan 310 nm; m/z 327, [M+H]+), 20.4 min

(UV: λmax 220 dan 270 nm; m/z 329, [M+H] +) dan 24.8 min (UV: λmax 280

10

dan 320 nm; m/z 327, [M+H] +) untuk senyawa 1, 2 dan 3, berturut-turut.

Senyawa 1-3 jelas diidentifikasikan sebagai cis-melilotosida,

dihidromelilotosida, dan trans-melilotosida, berturut-turut, dengan

mencocokkan pola fragmentasi Rt, ultraviolet dan MSn sesuai dengan

standar.

Gambar 5. Kromatogram dari D. aurantiacum var. denneanum.(a) Total ion kromatogram. (b) Kromatogram HPLC/UV (270 nm) dan spektrum UV dari senyawa 1, 2 and 3. Untuk penjelasan tiap puncak, lihat Tabel 1.

11

Skema 1. Jalur fragmentasi untuk (a) senyawa 1 dan (b) senyawa 2.

Gambar 6. Spektrum ion massa produk (MS/MS) dari ion [M+H]+ (a) cis-melilotosida (m/z 327→165); (b) dihidromelilotosida (m/z 329→167); (c) trans-melilotosida (m/z 327→165); dan (d) asam phthalic (internal standar, m/z 167→149)

Seperti yang ditunjukkan pada skema 1, senyawa 1-3 mengalami

jalur fragmentasi ESI-MSn yang mirip. Molekul terprotonasi diproduksi

sesuai ion produk aglikona pada m/z 165, 167 dan 165 dalam eksperimen

MS2 (Gambar. 6) kehilangan sebuah residu glukosa, kemudian memberikan

ion-ion [M+H–162–H2O]+ pada m/z 147, 149 dan 147 pada eksperimen MS3

oleh dehidrasi dan laktonisasi untuk membentuk kumarin 1 dan 3, dan 3.4-

dihidro kumarin untuk 2. Selain itu, cis-melilotosida (1) menghasilkan ion

12

[M+H–162–C2H2O]+ pada m/z 123 dan sebuah ion [M+H–162–C2H2O–CO]+

pada m/z 95 pada eksperimen MS3 dan MS4.

Tabel 1. Karakterisasi asam 2-glukosiloksisinami turunan Dendrobium aurantiacum var. denneanum

2.5.2 Identifikasi yang tidak diketahui asam 2-glukosiloksisinamik

dalam D. aurantiacum var. denneanum

Menggunakan metode analitik HPLC-DAD/ESI-MS di atas untuk

identifikasi senyawa 1-3 dan pola fragmentasi MS2nya, enam tambahan,

struktural mirip asam 2-glukosiloksisinamik (senyawa 4-9) diidentifikasikan

dari ekstrak antioksidan D. aurantiacum var. denneanum (Gambar. 5).

Senyawa 4 (Rt 15.6 menit) dan 7 (Rt 44.6 menit) menunjukkan spektrum

UV dan MS yang mirip untuk dihidromelilotosida (2) dan trans-

melilotosida (3), berturut-turut. Spektra massa scan penuh, 4 dan 7

menunjukkan ion [M+NH4]+ pada m/z 392 dan 390 dan ion [M+H] pada m/z

375 dan 373, menyatakan bahwa massa molekul 4 dan 7 yang 46 Da yang

lebih tinggi daripada dihidromelilotosida (2) dan trans-melilotosida (3),

berturut-turut. Spektrum MS2 yang sesuai dari 4 dan 7 memberikan dasar

puncak dari ion [M+H–162]+ pada m / z 213 dan 211 , dan spektrum

MS3nya yang dihasilkan karakteristik ion [M+H–162–H2O]+ pada m/z 195

dan 193 , yang ditugaskan untuk dihidroskopoletin dan skopoletin , berturut-

turut ; turunan kumarin yang terakhir sebelumnya telah dilaporkan pada D.

thyrsiflorum. Berdasarkan spektrum MSn di atas , senyawa 4 dan 7 secara

baik ditandai sebagai 4-hidroksi-5-metoksi-dihidromelilotosida dan 4-

hidroksi-5- metoksi-trans-melilotosida, berturut-turut (Gambar. 7).

13

Gambar 7. Identifikasi senyawa 7. (a) Spektrum massa. (b) Spektrum MS2 untuk ion [M+H]+ pada m/z 373. (c) Spektrum MS3 untuk ion pada m/z 211. (d) Pola fragmentasi senyawa 7.

Senyawa 5, 6, 8 dan 9 memberikan pola-pola fragmentasi yang

berbeda untuk spektrum MS3 mereka. Keduanya 5 (Rt 26.5 menit) dan 8 (Rt

48.8 menit) memperlihatkan UV maxima pada 230, 265 dan 310 nm,

karakteristik dari turunan asam cis-2-glukosiloksisinamik. Senyawa 5

memberikan sebuah ion [M+H]+ pada m/z 341, 14 m/z unit yang lebih tinggi

daripada cis-melilotosida (1). Spektrum MS2 dari 5 memberikan sebuah ion

[M+H–162]+ pada m/z 180, dan sebuah ion [M+H–162–CH3]+ pada m/z 165

dalam spektrum MS3, diikuti oleh pelepasan molekul H2O yang membentuk

kumarin dalam spektrum MS4. Dengan demikian, senyawa 5 itu

diidentifikasi sebagai cis-melilotoside 3'-metil ester, senyawa yang telah

teramati pada Prunus cornuta. Demikian pula, senyawa 8 memberikan

14

sebuah ion [M+H]+ pada m/z 383, 56 m/z unit yang lebih tinggi daripada 1,

dan diidentifikasi sebagai cis-melilotosida 3'-butil ester didasarkan pada

hilangnya berturut-turut residu glukosa, butena dan H2O ([M+H–162–56–

18]) dalam percobaan MSn (skema 2).

Skema 2. Tahapan jalur fragmentasi senyawa 8

Senyawa 6 (Rt 33.1 menit) dan 9 (Rt 49.4 min) menunjukkan

karakteristik UV maxima di 220 dan 270 nm, mirip dengan 2. Ion-ion

[M+H]+ pada m/z 343 dan 385 menunjukkan bahwa massa molekul 6 dan 9

14 dan 56 Da yang lebih tinggi, masing-masing, daripada 2. Spektrum MSn

6 dan 9 juga menunjukkan kerugian berturut-turut glukosa residu, metil

untuk 6 (butena 9), dan H2O menghasilkan kumarin sesuai ion produk. Oleh

karena itu, senyawa 6 dan 9 secara baik diidentifikasikan sebagai

dihidromelilotosida 3'-metil ester dan dihidromelilotosida 3'-butil ester,

berturut-turut.

Seperti yang diharapkan, perilaku retensi senyawa 4-9 ditampilkan

berurutan mirip untuk senyawa 1-3: cis-2-glukosiloksisinamik turunan

pertama asam yang terelusi, kemudian asam dihidro-2-glukosiloksisinamik,

dan akhirnya asam trans-2-glukosiloksisinamik. Karakteristik penyerapan

maxima UV dan produk yang predominan ion senyawa 1-9 tercantum dalam

tabel 1 dan semua yang terdeteksi dalam D. aurantiacum var. denneanum

dari sumber yang berbeda. Dalam rangka untuk menghilangkan

kemungkinan senyawa 5 dan 6 menjadi artefak yang diturunkan oleh

metilasi selama prosedur ekstraksi metanol, etanol digunakan untuk

ekstraksi bukan metanol. Hasil menunjukkan bahwa asam sinamik metil

ester (5 dan 6) tapi tidak etil ester yang terdeteksi yang jelas dikonfirmasi

terjadinya alami senyawa 5 dan 6 dalam ekstrak. Senyawa 5 dan 6 telah

dilaporkan di tempat lain, sedangkan senyawa 4, 7, 8 dan 9 sesuai dengan

15

produk alami yang baru, yang harus dikonfirmasi oleh future

phytochemistry work.

2.5.3 Kuantifikasi asam 2-glukosiloksisinamik dalam spesies

Dendrobium

Untuk mencapai resolusi yang cukup antara puncak, kondisi HPLC

dioptimalkan untuk kuantifikasi akurat mempertahankan analisis wajar

waktu menggunakan gradien fase gerak metanol (A) dan water/5% asam

format (B) sebagai berikut: 15-30% (10 menit), 30-15% (5 menit). Mode

MRM digunakan untuk selektivitas yang tinggi dan untuk menghindari

kemungkinan penilaian yang berlebihan atau hasil kuantitatif palsu yang

biasanya diproduksi menggunakan mode MS tunggal. Asam phthalic

digunakan sebagai standar internal. Seperti dijelaskan di atas dan

ditampilkan dalam Gambar. 3, molekul terprotonasi pada m/z 327 (1), 329

(2) dan 327 (3) memberikan sesuai terkemuka [M+H–162]+ ion produk pada

m/z 165, 167 dan 165 spektra MS2, mewakili aglikona setiap asam 2-

glukosiloksisinamik. Dengan demikian, m/z 327→165, 327→165 dan

329→167 dipilih sebagai transisi yang paling sensitif dalam modus MRM

untuk HPLC / ESI-MS2 kuantifikasi cis-melilotosida, dihidromelilotosida,

dan trans-melilotosida, berturut-tururt. Asam phthalic (internal standar),

sebuah produk ion dominan terdeteksi pada m/z 149 karena hilangnya 18 Da

(H2O) dari molekul terprotonasi pada m/z 167, dan oleh karean itu m/z

167→149 dipilih untuk deteksi kuantitatif MRM asam phthalic (Gambar.

6).

Kurva kalibrasi dibangun untuk cis-melilotosida, dihidromelilotosida,

dan trans-melilotosida. Kurva kalibrasi ini digambarkan sebagai rasio dari

daerah puncak antara analit dan standar internal versus konsentrasi analit

masing-masing. Parameter kalibrasi diringkas dalam tabel 2. Linearitas

diperoleh jarak 0.09-100, 0.01-15 dan 0.09-15 µg/mL untuk cis-

melilotosida, dihidromelilotosida, dan trans-melilotosida, berturut-turut.

Untuk setiap analitr, LOD dan LOQ dihitung sebagai tiga dan sepuluh kali

rasio sinyal-derau. cis-Melilotoside dan trans-melilotosida memiliki nilai

yang sama LOD dan LOQ 0.025 dan 0,09 µg/mL, sedangkan sensitivitas

16

tertinggi diperoleh untuk dihidromelilotosida dengan nilai-nilai LOD dan

LOQ 0,002 dan 0,01 µg/mL, berturut-turut.

Table 2. Data kurva kalibrasi referensi asam 2-glukosiloksisinamik

Presisi dan akurasi metode dinilai pada tiga konsentrasi analit kontrol

dalam rangkap tiga. Solusi sampel kontrol dengan sejumlah standar

campuran cis-melilotosida, dihidromelilotosida, trans-melilotosida dan

asam phthalic (internal standar) pada tiga tingkat konsentrasi yang berbeda

(0,5, 5 dan 10 mg/mL) meliputi berbagai linearitas untuk setiap analyte yang

berduri. Ketepatan metode dinilai dengan menghitung intra-hari dan inter-

day variasi tiga replicates, diverifikasi oleh menentukan sampel dengan

RSDs seperti yang tercantum dalam tabel 3. Keseluruhan intra - dan inter -

day variasi yang kurang dari 8% (mulai dari 0.78%-20137.92%),

menunjukkan memuaskan presisi instrumentasi dan stabilitas sampel. Selain

itu, metode analisis yang dikembangkan dalam studi ini memiliki akurasi

baik dengan keseluruhan pemulihan mulai dari 85-105% untuk analit yang

bersangkutan (Tabel 3).

Tabel 3. Ringkasan akurasi dan presisi

Metode kuantitatif yang ditetapkan diaplikasikan untuk menentukan

konsentrasi cis-melilotoside, dihydromelilotoside dan trans-melilotoside di

17

tiga spesies Dendrobium, D. aurantiacum var. denneanum, D. thyrsiflorum

dan D. chrysotoxum, yang merupakan sumber utama/Tinosporae Caulis

Dendrobii (Tabel 4). Konsentrasi cis-melilotoside, D. aurantiacum var.

denneanum dari pemukiman berbeda yang berkisar dari 6.21 mg/g di Tome

ke 14.93 mg/g di Nanjing sampel. Relatif, jumlah yang lebih kecil

dihydromelilotoside dan trans-melilotoside diamati pada sampel yang

dianalisis, mulai dari 0.32%-20131.52 mg/g dan dari 1.04%-20136.44 mg/g,

masing-masing. Sehubungan dengan D. thyrsiflorum dan D. chrysotoxum,

hal yang sama juga diamati pada D. aurantiacum var. denneanum dengan

isomer cis mengumpulkan untuk tingkat yang lebih tinggi daripada derivatif

trans - dan dihidro (Tabel 4).

Tabel 4. Konsentrasi (mg/g, n¼3) asam 2-glukosiloksisinamik pada sampel Dendrobium

18

BAB III

PENUTUP

3.1. Kesimpulan

Kesimpulan yang diperoleh dari penulisan makalah ini adalah

1. Metode HPLC-DAD/ESI-MS telah dikembangkan dan berhasil diterapkan

untuk analisis simultan cis-, isomer trans dan dihidro turunan asam

2-glukosiloksisinamik dalam tiga obat spesies Dendrobium. Tiga penanda

senyawa, cis-melilotoside, trans-melilotoside dan dihydro-melilotoside, yang

diidentifikasi melalui perbandingan banyaknya retensi dan MS ultraviolet

dengan referensi standar. Menggunakan jalur fragmentasi ESI-MSn

karakteristik dari asam 2-glucosyloxycinnamic ini, struktur enam tambahan

analog urunan 2-glukosiloksisinamik hadir dalam jumlah noda yang

diidentifikasikan. Selain itu, isi dari tiga besar 2-glucosyloxycinnamic asam

pada Dendrobium sampel secara bersamaan bertekad oleh HPLC/ESI-MS2

dalam modus MRM. Metode yang dikembangkan terbukti selektif, sensitif

dan dapat diandalkan untuk analisis 2-glukosiloksisinamik dalam matriks

kompleks berdasarkan metodologi tervalidasi.

2. Metode analisis HPLC/ESI-MS2 tidak hanya memberikan informasi kimia

rinci pada analit sasaran, tetapi juga mengatasi kekurangan (a) sensitivitas

rendah, dan (b) prosedur ekstraksi rumit dan menyita waktu dibandingkan

dengan injeksi ketika menggunakan metode HPLC-DAD bertahap. Terlebih

lagi, cukup selektivitas dan kepekaan serta keakuratan analisis kuantitatif

dicapai dengan mendeteksi senyawa dalam modus MRM. Telah

dikembangkan metodologi efektif dan efisien untuk analisis kualitatif dan

kuantitatif glikosida hidroksisinamik asam pada tanaman.

3.2. Saran

Perlu adanya penelitian lebih lanjut mengenai metode analitis yang sensitif

dan selektif untuk karakterisasi dan kuantifikasi turunan asam

2-glukosiloksisinamik dalam tanaman obat Dendrobium agar lebih mudah dan

efisien serta lebih ekonomis.

19

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2012. Spektrometri Massa.<http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Istimewa:Perubahan_terbaru&feed=atom>Diakses pada tanggal 22 Mei 2012.

Chetya, T. 2011. Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi (HPLC)<http://chetyachemist.blogspot.com/2011/05/kromatografi-cairan-kinerja-tinggi-hplc.html>Diakses pada tanggal 20 Mei 2012

Clark, J. 2004. Bagaimana Spektrometer Massa Bekerja.<http:/ /Bagaimana Spektrometer massa bekerja Chem-Is-Try.Org Situs Kimia Indonesia _files/Bagaimana Spektrometer massa bekerja Chem-Is-Try.Org Situs Kimia Indonesia .html>Diakses pada tanggal 22 Mei 2012.

Clark, J. 2007. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC).<http://www.google.com/bookmarks/mark?op=edit&bkmk=http://www.chem-is-try.org/materi_kimia/instrumen_analisis/kromatografi1/kromatografi_cair_kinerja_tinggi_hplc/>Diakses pada tanggal 22 Mei 2012.

Smanda, M. 2011. Anggrek juga tanaman obathttp://melacakalam.wordpress.com/2011/12/17/anggrek-juga-tanaman-obat/diakses pada tanggal 20 Mei 2012

20