Mass Spectrometry

An Introductory Lecture On Mass Spectrometry Fundamentals

May, 2011

1. L. G. Wade, Jr., 2000, Organic Chemistry, 5th Edition

2. Field ,L.D, Sternhell , S., Kalman, J.R., 2008, Organic sgtructure from spectra, 4th ed., Wiley, UK.

3. Silverstein, Bassler and Morril, 1981, Spectrometric Identification of Organic Compounds, diterjemahkian oleh A.J. Hartono dkk, Pendidikan Spektrometrik Senyawa organik, Penerbit Erlangga, Jakarta

What does a mass spectrometer do?

1. It measures mass better than any other technique.

2. It can give information about chemical structures.

What are mass measurements good for?

To identify, verify, and quantitate: metabolites, recombinant proteins, proteins isolated from natural sources, oligonucleotides, drug candidates, peptides, synthetic organic chemicals, polymers

Spektrometri massa adalah alat yang digunakan untuk menentukan massa atom atau molekul, ditemukan oleh Franci William Aston pada tahun 1919.

Prinsip kerja alat ini adalah pembelokan partikel bermuatan dalam medan magnet.

Pharmaceutical analysisBioavailability studiesDrug metabolism studies, pharmacokineticsCharacterization of potential drugsDrug degradation product analysisScreening of drug candidatesIdentifying drug targets

Biomolecule characterizationProteins and peptidesOligonucleotides

Environmental analysisPesticides on foodsSoil and groundwater contamination

Forensic analysis/clinical

Applications of Mass Spectrometry

Chapter 12 6

Mass Spectrometry• Molecular weight can be obtained from a

very small sample.• It does not involve the absorption or

emission of light.• A beam of high-energy electrons breaks the

molecule apart.• The masses of the fragments and their

relative abundance reveal information about the structure of the molecule. =>

How does a mass spectrometer work?

Ion source:makes ions

Mass analyzer: separates ions

Mass spectrum:presents

information

Sample

InletIonsource

Mass Analyzer Detector

DataSystem

High Vacuum System

Mass Spectrometer Block Diagram

Inlet

Ionization

Mass Analyzer

Mass Sorting (filtering)

Ion Detector

Detection

Ion Source

• Solid• Liquid• Vapor

Detect ionsForm ions

(charged molecules)Sort Ions by Mass (m/z)

1330 1340 1350

100

75

50

25

0

Mass Spectrum

Acquiring a mass spectrum

Assigning numerical value to the intrinsic property of “mass” is based on using carbon-12, 12C, as a reference point.

One unit of mass is defined as a Dalton (Da).

One Dalton is defined as 1/12 the mass of a single carbon-12 atom.

Thus, one 12C atom has a mass of 12.0000 Da.

How is mass defined?

Isotopes

+Most elements have more than one stable isotope.

For example, most carbon atoms have a mass of 12 Da, but in nature, 1.1% of C atoms have an extra neutron, making their mass 13 Da.

+Why do we care?

Mass spectrometers can “see” isotope peaks if their resolution is high enough.

If an MS instrument has resolution high enough to resolve these isotopes, better mass accuracy is achieved.

Element Mass AbundanceH 1.0078

2.014199.985%0.015

C 12.000013.0034

98.891.11

N 14.003115.0001

99.640.36

O 15.994916.999117.9992

99.760.040.20

Stable isotopes of most abundant elements of peptides

Important performance factors

Mass accuracy: How accurate is the mass measurement?

Resolution: How well separated are the peaks from each other?

Sensitivity: How small an amount can be analyzed?

Mass measurement accuracy depends on resolution

0

2000

4000

6000

8000

Co

un

ts

2840 2845 2850 2855

Mass (m/z)

Resolution = 14200

Resolution = 4500

Resolution =18100 15 ppm error

24 ppm error

55 ppm error

High resolution means better mass accuracy

Karakteristik penganalisis

1.Mass Rosolving power Adalah ukuran kemampuan membeda-badakan dua puncak yang perbedaannya kecil ( m/z )2. Mass Accuracy Rasio kesalahan pengukuran m/z di banding dengan kebenaran m/z biasanya di ukur dalam ppm atau mili massa unit.3.Mass Range Adalah batas m/z yang dapat di terima, yang di berikan oleh analizer.4.Linear Dinamic Range Batas yang menunjukkan bahwa sinyal ion linear dengan konsentrasi analit4.Speed Menunjukkan waktu awal dan akhir, percobaan di gunakan untuk menentuksn jumlah spectra per unit waktu  yang dapat di hasilkan.

Chapter 12 16

Mass Spectrometry• Molecular weight can be obtained from a

very small sample.• It does not involve the absorption or

emission of light.• A beam of high-energy electrons breaks the

molecule apart.• The masses of the fragments and their

relative abundance reveal information about the structure of the molecule. =>

• Sampel dalam bentuk gas mula-mula ditembaki dengan berkas elektron berenergi tinggi. • Perlakuan ini menyebabkan atom atau molekul sampel berionisasi (melepas elektron sehingga menjadi ion positif). • Ion-ion positif ini kemudian dipercepat oleh suatu beda potensial dan diarahkan ke dalam suatu medan magnet melalui suatu celah sempit.

Di dalam medan magnet, ion-ion tersebut akan mengalami pembelokan yang bergantung kepada:1.Kuat medan listrik yang mempercepat aliran ion. Makin besar potensial listrik yang digunakan, makin besar kecepatan ion dan makin kecil pembelokan.2. Kuat medan magnet. Makin kuat magnet, makin besar pembelokan.3. Massa partikel (ion). Makin besar massa partikel, makin kecil pembelokan.4. Muatan partikel. Makin besar muatan, makin besar pembelokan.

Chapter 12 19

Prinsip Dasar Spektrometri• Apabila ada sebuah benda sedang bergerak lurus dan

diberikan gaya luar ke arah samping maka benda itu tidak akan bergerak lurus, melainkan ia akan bergerak membelok ke arah samping karena adanya gaya luar tersebut.

• Misalkan anda sedang menghadapi sebuah bola meriam yang sedang melewati anda dan anda mau membelokkannya pada saat tepat lewat di depan anda. Dan alat yang anda punya hanyalah sebuah selang penyemprot air yang dihubungkan dengan sebuah pompa jet. Sejujurnya, apa yang anda lakukan .itu tidak akan berpengaruh banyak. Karena bola meriam itu sangat berat dan ia tidak akan membelok dari jalur lurusnya.

Chapter 12 20

Prinsip Dasar Spektrometri• Tapi bila kita mencoba membelokan sebuah

bola tenis yang sedang bergerak dengan kecepatan yang sama dengan bola meriam tersebut dengan menggunakan selang penyemprot air yang sama.

• Karena bola tenis ini sangat ringan, maka ia akan membelok dengan amat cepat

• Berapa besar penyimpangan yang akan terjadi karena gaya luar itu, tergantung pada massa benda tersebut (dalam hal ini bola).

Chapter 12 21

Prinsip Dasar Spektrometri• Apabila kecepatan bola dan besarnya gaya

luar itu diketahuiAanda bisa menghitung massa bola tersebut jika sudah diketahui bagaimana pola pembelokan yang terjadi pada bola tersebut.

• Semakin kecil pembelokan yang terjadi, berarti semakin berat massa bola tersebut.

• Prinsip diatas tersebut dapat juga diterapkan pada benda atau partikel seukuran atom.

Chapter 12 22

Tahapan yang terjadi didalam spektrometri

• Atom dapat dibelokkan dalam sebuah medan magnet (dengan anggapan atom tersebut diubah menjadi ion terlebih dahulu).

• Partikel-partikel bermuatan listrik dibelokkan dalam medan magnet dan partikel-partikel yang tidak bermuatan (netral) tidak dibelokkan.

Chapter 12 23

Tahapan yang terjadi didalam spektrometri

Urutannya adalah sebagai berikut:• Tahap pertama : Ionisasi• Atom di-ionisasi dengan emengambilf satu

atau lebih elektron dari atom tersebut supaya terbentuk ion positif. Ini juga berlaku untuk unsur-unsur yang biasanya membentuk ion-ion negatif (sebagai contoh, klor) atau unsur-unsur yang tidak pernah membentuk ion (sebagai contoh, argon).

• spektrometer massa ini selalu bekerja hanya dengan ion positif.

Chapter 12 24

Tahapan yang terjadi didalam spektrometri

• Tahap kedua : Percepatan• Ion-ion tersebut dipercepat supaya

semuanya mempunyai energi kinetik yang sama.

Chapter 12 25

Tahapan yang terjadi didalam spektrometriTahap ketiga : Pembelokan• Ion-ion tersebut dibelokkan dengan

menggunakan medan magnet, pembelokan yang terjadi tergantung pada massa ion tersebut.

• Semakin ringan massanya, akan semakin dibelokan. Besarnya pembelokannya juga tergantung pada besar muatan positif ion tersebut. Dengan kata lain, semakin banyak elektron yang ediambilf pada tahap 1, semakin besar muatan ion tersebut, pembelokan yang terjadi akan semakin besar.

Chapter 12 26

Tahapan yang terjadi didalam spektrometri

• Tahap keempat : Pendeteksian• Sinar-sinar ion yang melintas dalam mesin

tersebut dideteksi dengan secara elektrik.

• ‡Dalam spektrometri massa, molekul-molekul organikdalam keadaan gas (teruapkan) dibombardir dengan elektron yang berenergi cukup untuk mengalahkanpotensial ionisasi awal senyawa organik (185 ± 300kkal/mol)‡

• Tumbukan yang terjadi menyebabkan lepasnya sebuah elektron molekul membentuk ion positif radikal/kation radikal, disebut ion molekuler ‡

• Ion molekuler yang tidak stabil ini selanjutnya pecah menjadi fragmen kecil baik berbentuk radikal bebasmaupun ion lainnya yang lebih kecil

• M M+.

• M+. m1+. + m2 atau

m1+ + m2 .

Chapter 12 31

Electron Impact Ionization

A high-energy electron can dislodge an electron from a bond, creating a radical cation (a positive ion with an unpaired e-).

e- + H C

H

H

C

H

H

H

H C

H

H

C

H

H

H

H C

H

H

C

H

H

+ H

H C

H

H

C

H

H

H

+ =>

Chapter 12 32

Separation of Ions

• Only the cations are deflected by the magnetic field.

• Amount of deflection depends on m/z.• The detector signal is proportional to the

number of ions hitting it.• By varying the magnetic field, ions of all

masses are collected and counted. =>

Chapter 12 33

Mass Spectrometer

=>

Teknologi penganalisis massa

Mass Analzer memisahkan ion berdasarkan perbandingan massa dengan muatan. Dua hukum dinamika muatan partikel dalam medan magnet dan medan listrik dalam vakum

F = Q ( E+V+B ) hukum lorentzF = ma( Hukum kedua neoton pada kasus non relative vistik, kecepatan ion lebih rendah dari kecepatan cahaya )F adalah gaya yang dipilih untuk ion, m=massa iona= percepatan ionQ= muatan ionE= medan listrik

Teknologi penganalisis massa

V X B vector kecepatan ion dan medan magnetPersamaan disederhanakan( M/Q ) a = E+V x B

Dari sini kita simpulkan bahwa pengaturan pengukuran massa tergantung pada E = medan listrik V = vektor keceptan ion dan B = medan magnit

Spektra Massa

• Plot antara massa ion (m/z) (sumbu x) versus intensitas sinyal/ banyaknya ion (sumbu y)‡

• Puncak tertinggi disebut puncak dasar (basepeak)(100%)‡

• Puncak yang menunjukkan kation radikal yang tak terfragmentasi disebut puncak induk atau ion molekul (M+)

Elektron manakah yang diserang terlebih dahulu ?(skala prioritas)

I. Atom yang mempunyai pasangan elektron bebas (O,N, Cl, Br, dsb)

I. Elektron phi pada ikatan rangkap (C=C)

I. Elektron sigma pada ikatan tunggal(C-H lebih mudah dari pada C-C)

Mekanisme Fragmentasi• Homolisis

X - Y X’ + Y’

Heterolisis X – Y X+ + Y-

Hemiheterolisis X – Y X’ + Y+

Perhatikan bentuk anak panahnya

• contoh‡• Etana‡• Propana• Butana‡• Propena• 1-butena‡ metanol

Senyawa metanaMenghasilkan puncak dasar pada m/z = 16, dan fragmen-fragmen pada m/z = 15 dan 14

• Spektra massa propana lebih kompleks karena molekul ini dapat terpecah dengan berbagai cara

2-dimetil propana

Heksana

Fragmentasi keton dan aldehida

• AC-H that is three atoms away leads to an internal transfer of a proton to the C=O,called the McLafferty rearrangement

• Carbonyl compounds can also undergo� α cleavage

Yang mempengaruhi fragmentasi

• Efek percabangan‡• Efek suatu heteroatom atau

guguskarbonilॠPelepasan sebuah molekul kecilॠPenataan ulang McLafferty

Effek percabangan

(Sekunder)

Sangat sedikit

(Primer)+ +

Percabangan dalam suatu rantai menghasilkan fragmentasi yang terjadi terutama pada cabang, karena radikal ion sekunder dan karbokation sekunder lebihstabil daripada padanan primer nya

Efek heteroatom atau guguskarbonil

• Fragmentasi ion molekuler terjadi �pada posisi α (pemecahan α)

Spektra Massa alkohol

• Alkohol mengalami pemecahan α (pada ikatan disebelah C-OH)

• Juga dapat mengalami pelepasan molekul H-0H menghasikan C=C

Spektra massa amina

•Amina mengalami pelepasan α menghasilkan suatu radikal

Pelepasan molekul kecil

• Molekul-molekul kecil yang stabil seperti H2O, CO2, CO dan C2H4 dapat terlepas dari dalam sebuah ion molekuler

Penataan ulangMcLafferty

• � Bila terdapat sebuah atom H pada posisi γ terhadap gugus karbonil dalam ion molekuler,maka dapat terjadi penataan ulang McLafferty

• Dalam penataan ulang ini, akanterlepas suatu alkena

Kontribusi isotop

• C12 - ± 98,89% C13 - ± 1,11%‡ • H1 - ± 99,99%‡ H2 - ± 0,01%‡ • N14 - ± 99,64%‡ N15 - ± 0,36%‡ • O16 - ± 99,76%‡ O17 - ± 0,04%‡ • O18 - ± 0,20%‡ Cl35 - ± 75,53%‡ • Cl37 - ± 24,47%‡ Br79 - ± 50,52%‡ • Br81 - ± 49,48%‡ I127 - ± 100%‡

• F19 - ± 100%

Chapter 12 60

Mass Spectra of Alkanes

More stable carbocations will be more abundant.

=>

Chapter 12 61

Mass Spectra of Alkenes

Resonance-stabilized cations favored.

=>

Contoh spektra

benzilalkohol

Chapter 12 66

Mass Spectrum with Sulfur

=>

Chapter 12 67

Mass Spectrum with Chlorine

=>

Chapter 12 68

Mass Spectrum with Bromine

=>

Aturan Nitrogen

• ‡ Bila BM bernilai ganjil, maka dalammolekul terdapat atom Nitrogen berjumlah ganjil‡

• Bila BM bernilai genap, maka dalammolekul tidak terdapat atom Nitrogen, atau apabila ada atom Nitrogen maka berjumlah genap

Example : Protein Identification

1. Peptide Mass Finger Printing (PMF)from MS data

2. Database search using fragment ion masses from MS/MS data

3. Sequence Tagsfrom MS/MS data

PROBLEM

Bank President

Who robbed the bank?

Biologist

What protein was isolated?

Mass Spectrometrist

1. Interview biologist who isolated the protein

2. Cleave protein to obtain peptide mixture

3. Analyze peptide mixture by MS to obtain peptide molecular masses!

GATHER EVIDENCEPolice Officer

1. Interview witnesses

2. Dust for fingerprints

enzyme

DATABASE SEARCH

Police OfficerHeight: 5’7”

Weight: 160 lbsGender: male

Age: 35-40Fingerprints

Mass SpectrometristApprox. molecular weight: 30,000

Origin: bovine liverPeptide mass list from MS analysis:

975.4832, 1112.5368, 632.3147, 803.4134, 764.3892

DATABASE OF

KNOWN FELONS

PEPTIDE MASS DATABASEOF KNOWN PROTEINS

search search

DATABASE SEARCH RESULTS

Police Officer

Identifies the robber

Anthony J. Felon

Mass Spectrometrist

Identifies the protein

bovine carbonic anhydrase