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Recombinación artificial – ingeniería genética :
- Marcadores Genéticos de tipo “ Moleculares “
- ADN recombinante -enimas de restricción
- Técnicas básicas deingeniería genética.- R eacción en Cadena de laPolimerasa !PCR " –
-
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#nima de Restricción : mecanismo de
acción corta
corta
$itio de restricción
$ecuencia palindrómo
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Visualización de productosde la restricción:
ADN de %irus & endonucleasa derestricción Psi'
M: marcador de pesomolecular !fragmentos delDNA de %irus lambda &enima
Bme'('")
*-+-,: ADN de diferentes %irus
-
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'mportancia :
#nima de restricción : EcoR'
ADN del organismo *
ADN del organismo +
-
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Mutaciones en sitios de restricción
ADN de %irus con la endonucleasa derestricción Psi'
M: marcador de pesomolecular !fragmentos delDNA de %irus lambda &enima.me'('")
*-+-,: ADN de diferentes %irus
-
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Mutación en el sitio derestricción : Marcador genético
Normal
#nfermo
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Mutación en el sitio de restricción : Marcador genético
Gen normal
Gen mutado
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/uellas00)
/uellitas 00)
Marcas 00
Marcadores0))
-
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Gen de interés agronómico
Locus “marcador”
* Marcadores
genéticos
-
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1oci 2eredables asociados
!ligados" a un car3cter deinterés agronómico 4 se2eredan 5untos)
6tilidad :Agronómicamente :asisten al me5orador en el
proceso de selecciónartificial temprana de un
fenotipo superior)
7 Morfológicos 7 'soenim3ticos
2- Secuencias nucleotídicas no codificantes
7 Moleculares ácidos nucleicos!
MARCADORES GENÉTICOS
1- Secuencias nucleotídicas codificantes
-
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"n cebada
se8* *cM ms 9
se8* *cM ms 9
# cM ms*
; cM ms*
Maí$
%ndroesterilidad"ndos&erm
a blanco
%ndroesterilidad
"ndos&erma blanco
Marcadores Morfológicos
-
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*Marcadores isoenzimáticos- Polimor'ismo a ni%el del producto génico!polipéptido o proteína"
MARCADORES GENÉTICOS
-
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R"PL(C%C()* *%T+R%L ,"L ,*%
M%RC%,R" G"*/T(C “ ML"C+L%R" “0%%, "* L% PCR Replicación “in %itro< del DNA !
-
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Replicación del DNA
-
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Replicación “in %i%o< del DNA
7 /elicasa7 =roteínas de unión a cadena sencilla !$$.="
7 >opoisomerasa ADN girasa
7 'niciación de la síntesis7 ADN polimerasa '''
7 =rimasa ARN polimerasa
7 ADN polimerasa '''7 ADN ligasa)
7 ?orrección : polimerasas ' 4 '''
-
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Reacción en Cadenade la PolimerasaPCR!
R eacción en Cadenade la PolimerasaPCR !
1os pasos + a @ se
repiten ,-,; %ecese incrementan m3sde *B %eces elfragmento de DNA
de interés
-
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#tapas para la reacción de =?R
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/ibridación de oligonucleótidos !cebadores"
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@ Reacción de PCR
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M%RC%,R" G"*/T(C “ ML"C+L%R" “0%%, "* L% PCR Replicación “in %itro< del DNA !
-Microsatélites ó $$R !$ingle $eCuenceRepeat"
-;- A> A> A> A> A> A> A> – ,
- ;- G>? G>? G>? G>? G>? – ,
- ;- ?GA> ?GA> ?GA> ?GA> – ,
-
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Marcadores ti&o R Microsatélites!
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Eingerprinting de la Fariedad
ArbeCuina de li%o
oli ** oli *+ oli *H oli ++
* + , @ * + , @ M * + , @ * + , @
M=M!pb"
;
@
,
+
*
-
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%
M=M !pb"
+
* + , @ ; B H ( 9 M
.
Eigura ,: #lectroforesisen gel de agarosa ,I
%! 'A$ oli 12
0! 'A$ oli 13
1- #mpeltre de refer)!?$'? #spaJa"K
2- #mpeltre 1=K
4- Mananilla de refer)!?$'? #spaJa"K
5-Mananilla #?K
#- Mananilla @$K
6- Mananilla gigante@$K
3- =icual de refer)7- Ne%adillo #?K
8- Ne%adillo @$K
M9 * pb) DNA ladder!$igma")
Microsatélites en li%o !Di%ersidad "
-
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+tilidad de losMarcadores genéticos
*- E'NG#R=R'N>'NG !2uella genética"
+- .AN?$ D# G#RM=1A$MA
,- MA=A$ G#NL>'?$@- 1?' 1'GAD$
;- D'F#R$'DAD #$>R6?>6RAG#NL>'?A
B- ERMA D# R#=RD6??'N
H- #F16?'N E'1G#N'A
-
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elección %sistida&or MarcadoresM%!
-
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Marcadores Genéticos
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Marcadores Genéticos
*- .asados en la PCR
!R eacción en Cadenade la Polimerasa" +- .asados en la digestión conendonucleasas !enimas derestricción"
a" R:LP: !Polimorfismo en la Longitud
de los Eragmentos de Restriccin"
*MARCADORES MOLECULARES: - Polimor'ismo genético directamente a ni%el del DNA
#nimas de restricción
#nimas de tipo '' :
- ?orte simétrico e8acto ensecuencias específicas palindrómicas
- rigen : diferentes organismos-Denominación : sistema alfanumérico ! EcoR' pro%iene de#sc2eric2ia coli
- Generan e8tremos co2esi%os ó
romos
>écnica
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>écnicade RE1=
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Nla(((
Rsa(
Tsp;9'
Taq(
Mse(
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Desnaturaliación del DNA
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Reacción encadena de la polimerasa
!=?R"
?iclo ,
Marcadores moleculares basados en el: Polimorfismo de Longitud de
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Marcadores moleculares basados en el: Polimorfismo de Longitud de:ragmentos de R estricción !RE1="
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Marcadores mor'ológicos:
controlados por un solo loci 4 presentan e8presión temprana
a" #n 0rassica: primera 2o5a%ellosa
b" #n maí$: raí primaria pOrpura ócoleoptilo pOrpura
Asociados a la;a&loidía
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$elección asistida pormarcadores !MA$"
Marcadores ti&o R
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Marcadores ti&o R s Microsatélites TR s >*TR s!
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e)g) ;P o%er2ang#coR' GPAA>>?
.am/'GPGA>??
,P o%er2ang =st'?>G?APG
!+" Q2en t2e ends of t2e restrictionfragments are complementar4
e)g) for #coR' ;P G‑‑‑AA>>? ,P‑‑‑
,P ?>>AA‑‑‑ G ;P‑‑‑
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Figure 3.3.
b. Blunt ends
ADN delorganismo *
ADN delorganismo +
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Marcador (soen$imático
#nima
monomérica
#nima
dimérica