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8/17/2019 Pcr Marcadores Moleculares 1199233124398873 4

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Recombinación artificial – ingeniería genética :

- Marcadores Genéticos de tipo “ Moleculares “

- ADN recombinante -enimas de restricción

- Técnicas básicas deingeniería genética.- R eacción en Cadena de laPolimerasa !PCR " –


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#nima de Restricción : mecanismo de

acción corta

corta

$itio de restricción

$ecuencia palindrómo


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Visualización de productosde la restricción:

ADN de %irus & endonucleasa derestricción Psi'

M: marcador de pesomolecular !fragmentos delDNA de %irus lambda &enima

Bme'('")

*-+-,: ADN de diferentes %irus


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'mportancia :

#nima de restricción : EcoR'

ADN del organismo *

ADN del organismo +


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Mutaciones en sitios de restricción

ADN de %irus con la endonucleasa derestricción Psi'

M: marcador de pesomolecular !fragmentos delDNA de %irus lambda &enima.me'('")

*-+-,: ADN de diferentes %irus


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Mutación en el sitio derestricción : Marcador genético

Normal

#nfermo


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Mutación en el sitio de restricción : Marcador genético

Gen normal

Gen mutado


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/uellas00)

/uellitas 00)

Marcas 00

Marcadores0))


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Gen de interés agronómico

Locus “marcador”

* Marcadores

genéticos


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1oci 2eredables asociados

!ligados" a un car3cter deinterés agronómico 4 se2eredan 5untos)

6tilidad :Agronómicamente :asisten al me5orador en el

proceso de selecciónartificial temprana de un

fenotipo superior)

7 Morfológicos 7 'soenim3ticos

2- Secuencias nucleotídicas no codificantes

7 Moleculares ácidos nucleicos!

MARCADORES GENÉTICOS

1- Secuencias nucleotídicas codificantes


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"n cebada

se8* *cM ms 9

se8* *cM ms 9

# cM ms*

; cM ms*

Maí$

%ndroesterilidad"ndos&erm

a blanco

%ndroesterilidad

"ndos&erma blanco

Marcadores Morfológicos


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*Marcadores isoenzimáticos- Polimor'ismo a ni%el del producto génico!polipéptido o proteína"

MARCADORES GENÉTICOS


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R"PL(C%C()* *%T+R%L ,"L ,*%

M%RC%,R" G"*/T(C “ ML"C+L%R" “0%%, "* L% PCR Replicación “in %itro< del DNA !


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Replicación del DNA


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Replicación “in %i%o< del DNA

7 /elicasa7 =roteínas de unión a cadena sencilla !$$.="

7 >opoisomerasa ADN girasa

7 'niciación de la síntesis7 ADN polimerasa '''

7 =rimasa ARN polimerasa

7 ADN polimerasa '''7 ADN ligasa)

7 ?orrección : polimerasas ' 4 '''


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Reacción en Cadenade la PolimerasaPCR!

R eacción en Cadenade la PolimerasaPCR !

1os pasos + a @ se

repiten ,-,; %ecese incrementan m3sde *B %eces elfragmento de DNA

de interés


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#tapas para la reacción de =?R


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/ibridación de oligonucleótidos !cebadores"


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@ Reacción de PCR


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M%RC%,R" G"*/T(C “ ML"C+L%R" “0%%, "* L% PCR Replicación “in %itro< del DNA !

-Microsatélites ó $$R !$ingle $eCuenceRepeat"

-;- A> A> A> A> A> A> A> – ,

- ;- G>? G>? G>? G>? G>? – ,

- ;- ?GA> ?GA> ?GA> ?GA> – ,


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Marcadores ti&o R Microsatélites!


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Eingerprinting de la Fariedad

ArbeCuina de li%o

oli ** oli *+ oli *H oli ++

* + , @ * + , @ M * + , @ * + , @

M=M!pb"

;

@

,

+

*


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%

M=M !pb"

+

* + , @ ; B H ( 9 M

.

Eigura ,: #lectroforesisen gel de agarosa ,I

%! 'A$ oli 12

0! 'A$ oli 13

1- #mpeltre de refer)!?$'? #spaJa"K

2- #mpeltre 1=K

4- Mananilla de refer)!?$'? #spaJa"K

5-Mananilla #?K

#- Mananilla @$K

6- Mananilla gigante@$K

3- =icual de refer)7- Ne%adillo #?K

8- Ne%adillo @$K

M9 * pb) DNA ladder!$igma")

Microsatélites en li%o !Di%ersidad "


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+tilidad de losMarcadores genéticos

*- E'NG#R=R'N>'NG !2uella genética"

+- .AN?$ D# G#RM=1A$MA

,- MA=A$ G#NL>'?$@- 1?' 1'GAD$

;- D'F#R$'DAD #$>R6?>6RAG#NL>'?A

B- ERMA D# R#=RD6??'N

H- #F16?'N E'1G#N'A


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elección %sistida&or MarcadoresM%!


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Marcadores Genéticos


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Marcadores Genéticos

*- .asados en la PCR

!R eacción en Cadenade la Polimerasa" +- .asados en la digestión conendonucleasas !enimas derestricción"

a" R:LP: !Polimorfismo en la Longitud

de los Eragmentos de Restriccin"

*MARCADORES MOLECULARES: - Polimor'ismo genético directamente a ni%el del DNA

#nimas de restricción

#nimas de tipo '' :

- ?orte simétrico e8acto ensecuencias específicas palindrómicas

- rigen : diferentes organismos-Denominación : sistema alfanumérico ! EcoR' pro%iene de#sc2eric2ia coli

- Generan e8tremos co2esi%os ó

romos

>écnica


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>écnicade RE1=


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Nla(((

Rsa(

Tsp;9'

Taq(

Mse(


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Desnaturaliación del DNA


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Reacción encadena de la polimerasa

!=?R"

?iclo ,

Marcadores moleculares basados en el: Polimorfismo de Longitud de


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Marcadores moleculares basados en el: Polimorfismo de Longitud de:ragmentos de R estricción !RE1="


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Marcadores mor'ológicos:

controlados por un solo loci 4 presentan e8presión temprana

a" #n 0rassica: primera 2o5a%ellosa

b" #n maí$: raí primaria pOrpura ócoleoptilo pOrpura

Asociados a la;a&loidía


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$elección asistida pormarcadores !MA$"

Marcadores ti&o R


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Marcadores ti&o R s Microsatélites TR s >*TR s!


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e)g) ;P o%er2ang#coR' GPAA>>?

.am/'GPGA>??

,P o%er2ang =st'?>G?APG

!+" Q2en t2e ends of t2e restrictionfragments are complementar4

e)g) for #coR' ;P G‑‑‑AA>>? ,P‑‑‑

,P ?>>AA‑‑‑ G ;P‑‑‑


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Figure 3.3.

b. Blunt ends

ADN delorganismo *

ADN delorganismo +


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Marcador (soen$imático

#nima

monomérica

#nima

dimérica

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