Recombinación artificial – ingeniería genética :

- Marcadores Genéticos de tipo “ Moleculares “

- ADN recombinante - enzimas de restricción - Técnicas básicas de

ingeniería genética.- Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) –

Enzima de Restricción : mecanismo de acción

corta

corta

Sitio de restricción

Secuencia palindrómo

Visualización de productos de la restricción:

ADN de virus / endonucleasa de restricción PsiI

M: marcador de peso molecular (fragmentos del DNA de virus lambda /enzima BmeI8I).

1-2-3: ADN de diferentes virus

Importancia :

Enzima de restricción : EcoRI

ADN del organismo 1

ADN del organismo 2

Mutaciones en sitios de restricción

ADN de virus, con la endonucleasa de restricción PsiI

M: marcador de peso molecular (fragmentos del DNA de virus lambda /enzima BmeI8I).

1-2-3: ADN de diferentes virus

Mutación en el sitio de restricción : Marcador genético

Normal

Enfermo

Mutación en el sitio de restricción : Marcador genético

Gen normal

Gen mutado

Huellas…….

Huellitas …….

Marcas ……

Marcadores…..

Gen de interés agronómico

Locus “marcador”

* Marcadores genéticos

Loci heredables asociados (ligados) a un carácter de interés agronómico y se heredan juntos.

Utilidad :

Agronómicamente : asisten al mejorador en el proceso de selección artificial temprana de un fenotipo superior.

* Morfológicos * Isoenzimáticos

2- Secuencias nucleotídicas no codificantes

* Moleculares (ácidos nucleicos)

MARCADORES GENÉTICOS

1- Secuencias nucleotídicas codificantes

En cebada

sex1 1cM ms 9

sex1 1cM ms 9

Y 5 cM ms1

Y 5 cM ms1

Maíz

AndroesterilidadEndosperma blanco

AndroesterilidadEndosperma blanco

Marcadores Morfológicos

*Marcadores isoenzimáticos

- Polimorfismo a nivel del producto génico (polipéptido o proteína)

MARCADORES GENÉTICOS

REPLICACIÓN NATURAL DEL DNA

MARCADORES GENÉTICOS “ MOLECULARES “ BASADOS EN LA PCR (Replicación “in vitro” del DNA )

Replicación del DNA

Replicación “in vivo” del DNA

* Helicasa

* Proteínas de unión a cadena sencilla (SSBP)

* Topoisomerasa ADN girasa

* Iniciación de la síntesis

* ADN polimerasa III

* Primasa, ARN polimerasa

* ADN polimerasa III

* ADN ligasa.

* Corrección : polimerasas I y III

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Los pasos 2 a 4 se repiten 30-35 veces e incrementan más de 106 veces el fragmento de DNA de interés

Etapas para la reacción de PCR

Hibridación de oligonucleótidos (cebadores)

4Reacción de PCR

MARCADORES GENÉTICOS “ MOLECULARES “ BASADOS EN LA PCR (Replicación “in vitro” del DNA )

-Microsatélites ó SSR (Single Sequence Repeat)

-5´- AT AT AT AT AT AT AT – 3´

- 5´- GTC GTC GTC GTC GTC – 3´

- 5´- CGAT CGAT CGAT CGAT – 3´

Marcadores tipo SSR (Microsatélites)

Fingerprinting de la Variedad Arbequina de Olivo

oli 11 oli 12 oli 17 oli 22

1 2 3 4 1 2 3 4 M 1 2 3 4 1 2 3 4

MPM (pb)

500

400

300

200

100

A

MPM (pb)

200

1 2 3 4 5 6 7 8 9 M

B

Figura 3: Electroforesis en gel de agarosa 3%

(A) IAS oli 12

(B) IAS oli 17

1- Empeltre de refer. (CSIC, España);

2- Empeltre LP;

3- Manzanilla de refer. (CSIC, España);

4-Manzanilla EC;

5- Manzanilla 4S;

6- Manzanilla gigante 4S;

7- Picual de refer.

8- Nevadillo EC;

9- Nevadillo 4S;

M: 100 pb. DNA ladder (Sigma).

Microsatélites en Olivo (Diversidad )

Utilidad de los Marcadores genéticos

1- FINGERPRINTING (huella genética)

2- BANCOS DE GERMOPLASMA

3- MAPAS GENÉTICOS

4- LOCI LIGADOS

5- DIVERSIDAD Y ESTRUCTURA GENÉTICA

6- FORMA DE REPRODUCCIÓN

7- EVOLUCIÓN Y FILOGENIA

Selección Asistida por Marcadores (MAS)

Marcadores Genéticos

1- Basados en la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

2- Basados en la digestión con endonucleasas (enzimas de restricción)

a) RFLP: (Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricciòn)

*MARCADORES MOLECULARES: - Polimorfismo genético directamente a nivel del DNA

Enzimas de restricción

Enzimas de tipo II :

- Corte simétrico exacto en secuencias específicas palindrómicas

- Origen : diferentes organismos

-Denominación : sistema alfa numérico, (EcoRI proviene de Escherichia coli

- Generan extremos cohesivos ó romos

Técnica de RFLP

NlaIII

RsaI

Tsp509I

TaqI

MseI

Desnaturalización del DNA

Reacción en cadena de la polimerasa

(PCR)

Ciclo 3

Marcadores moleculares basados en el: Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP)

Marcadores morfológicos: controlados por un solo loci y presentan expresión temprana

a) En Brassica: primera hoja vellosa

b) En maíz: raíz primaria púrpura ó coleoptilo púrpura

Asociados a la Haploidía

Selección asistida por marcadores (MAS)

Marcadores tipo SSR´s (Microsatélites – STR´s- VNTR´s)

e.g. 5' overhangEcoRI G'AATTC

BamHIG'GATCC

3' overhang PstICTGCA'G

(2) When the ends of the restriction fragments are complementary,

e.g. for EcoRI 5' G‑‑‑AATTC 3'‑‑‑

3' CTTAA‑‑‑ G 5'‑‑‑

Figure 3.3.

  b. Blunt ends

ADN del organismo 1

ADN del organismo 2

Marcador Isoenzimático

Enzima monomérica

Enzima dimérica