ATIVIDADES PRTICAS SUPERVISIONADAS - APSMARCADORES MOLECULARES DE DNA

MANAUS/AMAZONAS2014

FARMCIA MANH

ATIVIDADES PRTICAS SUPERVISIONADAS - APSMARCADORES MOLECULARES DE DNA

MANAUS/AMAZONAS2014

1 INTRODUOMarcadores molecularesso sequncias de DNA que revelam polimorfismos entre indivduos geneticamente relacionados. So amplamente utilizados para estudos de gentica populacional, mapeamento e anlises de similaridade e ainda, distncia gentica. Alm disso, possvel, com estes, identificarem acessos de plantas, isolados de um microrganismo ou at completar estudos de sistemtica. Seu potencial para desvendar os segredos contidos na molcula de DNA desperta o interesse em pesquisadores, no s da rea de gentica, mas tambm de inmeros outros campos do conhecimento. A molcula de DNA a grande responsvel pela construo do indivduo, auxiliada pelo ambiente que molda sua forma final e catalisa sua constante evoluo.Esta reviso tem o objetivo de esclarecer as utilidades aplicacionais dos marcadores moleculares, e tambm as diferentes tcnicas utilizadas, no estudo dos marcadores moleculares, e suas respectivas particularidades, todas com a meta de detectar polimorfismos em uma molcula de DNA.

2 MARCADORES MOLECULARES: VANTAGENS EM SEU USO NO POLIMORFISMO GENTICOS DO DNA E SUAS APLICAESOs marcadores moleculares surgiram devido necessidade da deteco de polimorfismo gentico diretamente no DNA e representam o terceiro grupo de marcadores. Um marcador molecular definido como qualquer fentipo molecular oriundo de um gene expresso ou de um segmento especfico de DNA (Ferreira & Grattapaglia, 1998). Milach (1998a) descreve que marcadores moleculares so caractersticas de DNA que diferenciam dois ou mais indivduos e so herdados geneticamente. Existem diversas razes para que os marcadores moleculares apresentam vantagens sobre os marcadores morfolgicos convencionais. Em contrastes com caracteres morfolgicos, os marcadores moleculares exibem neutralidade fenotpica, geralmente so herdados co-dominantemente, raramente exibem interaes epistticas ou pleio trpicas, podendo ser detectados tanto em tecidos jovens como em adultos. O uso de marcadores moleculares permite que a seleo e novos cruzamentos sejam realizados em uma mesma gerao, o que aumenta consideravelmente a eficincia de um programa de melhoramento. Podem ser usados mesmo que no tenham sido mapeados, ou seja, associados a um gene, a uma regio cromossmica ou a um fentipo, desde que possam ser seguidos em geraes subsequentes, comprovando sua natureza gentica (Ferreira & Grattapaglia, 1998; Milach, 1988a).

Figura. 1. Dogma Centra da Biologia Molecular, evidenciando a influncia direta do DNA no fentipo.

Marcadores moleculares de DNA tm sido usados para sinalizao de genes de resistncia a doenas, insetos e pragas; avaliao e caracterizao de germoplasma; melhoramento dos pais de hbridos; introgresso gnica e seleo auxiliada por marcadores o desenvolvimento de mapas genticos, determinao de grupos heterticos e associao com regies genmicas que afetam heterose, reconstituio de pedigrees, testes de pureza gentica, seleo de resistncia a patgenos exticos ainda inexistentes em determinada regio, associao com caracteres quantitativos, estudos de interao gentipo-ambiente, entre outros (Rafalski & Tingey, 1993; Ferreira & Grattapaglia, 1998; ). Federizzi (1998) enfatiza que a rea de maior impacto dos marcadores moleculares no melhoramento vegetal ser atravs do emprego da seleo assistida para identificao de gentipos superiores em populaes segregantes. Porm cita que alguns pr-requisitos devem ser levados em considerao, tais como: o marcador deve co-segregar ou estar associado ao gene de interesse; a tcnica deve ser eficiente, de baixo custo para uso rotineiro, reproduzvel e de fcil uso. A seleo assistida por marcadores moleculares realizada mediante a converso de marcadores elaborados em um tipo de marcador simples, representando uma forma de seleo indireta na qual o carter indireto apresenta herdabilidade prxima a 100 %, uma vez que a seleo poder ser conduzida independente do ambiente. O uso de marcadores moleculares na seleo de gentipos superiores poder incrementar a eficincia no melhoramento de plantas, pois menor nmero de prognies por combinao ser necessrio, bem como menor nmero de geraes para a estabilizao dos gentipos (Barbosa Neto, 1998; Federizzi, 1998). Contudo, os principais motivos para aplicao limitada de marcadores moleculares em programas de melhoramento ainda tm sido o custo e procedimentos elaborados da maioria dos marcadores disponveis. Assim, novos tipos de marcadores esto surgindo e abrindo novas perspectivas para seleo assistida. A caracterizao molecular de uma cultivar um passo fundamental no processo de proteo legal dos materiais desenvolvidos por melhoria, contribuindo para a descrio detalhada desses materiais. O uso de marcadores moleculares tem sido importante em processos legais que envolvem disputas de direito autoral (Smith, 1989). O grau de similaridade entre cultivares pode ser empregado para reconstituir o pedigree de certos materiais, com fins de testar o conhecimento bsico sobre o processo de desenvolvimento de uma cultivar e como subsdio proteo legal (Dweikat et al., 1993). O fingerprinting do DNA (caracterizao molecular de uma espcie) tem sido usado para mapeamento de ligao do genoma, teste de identidade de cultivares, determinao da relao de parentesco e da variao gentica, anlise de populaes e de pedigree, localizao de loco para doenas e epidemiologia (Landegren et al., 1980). Alm disso, o estudo da diversidade gentica de variedades e populaes encontra aplicaes diretas no melhoramento de plantas no que se refere seleo e ao agrupamento dos materiais mais promissores para formao de populaes bsicas (Phillips et al., 1993). Um dos grupos mais usados de marcadores moleculares, e que foi o primeiro a ser desenvolvidos, so os RFLPs ("Polimorfismo no Comprimento dos Fragmentos de Restrio" - Botstein et al., 1980). Quando clivados com enzimas de restrio, expressam, por eletroforese, as diferenas de comprimento de fragmentos de DNA, observadas por meio da hibridizao desses fragmentos com sequncias homlogas do DNA marcado com radioatividade ou por luminescncia. Os RFLPs podem ser causados por mudanas de pares de bases, rearranjo de DNA, insero e/ou deleo ou diversidade natural na sequncia de nucleotdeos entre ou dentro de populaes. Possibilitam a identificao de maior nmero de locos polimrficos e, por conseguinte, foram a primeira ferramenta eficaz para a seleo assistida por marcadores. A principal limitao da tcnica o uso intensivo da mo-de-obra e o tempo necessrio para a anlise genmica. Os RFLPs apresentam expresso co-dominante, e, por cobrirem todo o genoma, a probabilidade de associao de marcadores com genes de caractersticas agronmicas importantes grandemente aumentada. Mais recentemente, o advento de tcnicas baseadas em PCR ("Reao em Cadeia pela Polimerase"), apresentou uma nova opo ao uso de marcadores moleculares. A tcnica foi desenvolvida em meados da dcada de 80 e alcanou uso disseminado e extenso em diversas reas de biologia quase que imediatamente (White et al., 1989). PCR uma tcnica poderosa usada para ampliar pequenas sequncias especficas de nucleotdeos em quantidades acessveis anlise, a partir de nfima quantidade de DNA. Baseia-se na sntese enzimtica in vitro de um segmento especfico de DNA na presena da enzima DNA polimerase e de primers especficos ou no. Tais primers delimitam a sequncia de DNA de fita dupla a ser amplificada, cujos resultados so milhes de cpias idnticas (Mullis & Faloona, 1987; White et al., 1989). As tecnologias de anlise molecular da variabilidade do DNA permitem determinar pontos de referncia nos cromossomos, chamados por terminologia tcnica de marcadores moleculares. Os Marcadores Moleculares correspondem a todo e qualquer fentipo molecular oriundo de um gene expresso, como no caso de isoenzimas ou marcadores bioqumicos, ou de um segmento especfico de DNA (correspondente a regies expressas ou no do genoma). A sequncia de nucleotdeos e a funo de um marcador molecular podem ser conhecidas ou no, se o comportamento de um determinador marcador obedecer as leis de herana de Mendel, este definido adicionalmente como marcador gentico. Uma grande Observao que ressaltamos o simples fato do marcador ser DNA, ou produto da transcrio e traduo de uma sequncia de DNA, no implica que este seja um marcador gentico.Existem vrias tcnicas da biologia molecular para detectar polimorfismo gentico. Estas tcnicas possibilitam obter um nmero ilimitado de marcadores moleculares cobrindo todo o genoma do organismo. Tais marcadores podem ser usados para inmeras aplicaes, quer seja na gentica ou no melhoramento de plantas. O DNA recombinante e PCR (Reao de Polimerase em Cadeia) permitiram uma mudana no paradigma gentico bsico: da interferncia do gentipo a partir do fentipo, onde Mendel foi pioneiro, para a anlise gentica direta da variao na sequncia de DNA.Vrios marcadores se baseiam no princpio do PCR. O RAPD ("Polimorfismo do DNA Amplificado ao Acaso", Williams et al., 1990), ou AP-PCR ("Polimorfismo Amplificado pela Reao em Cadeia da Polimerase" - Welsh & McClelland, 1990), oferece a oportunidade de gerar grande quantidade de polimorfismo de fragmentos de DNA, espalhados por todo o genoma (incluindo regies de DNA repetitivo), usando primers escolhidos ao acaso, nas reaes de amplificao. Comparando com RFLPs, os marcadores RAPD no requerem primers espcie especficos, como o caso das sondas usadas nos RFLPs, necessitam cerca de 100 vezes menos DNA, no necessria digesto com enzimas de restrio, podem ser observados diretamente no gel, podendo cada primer amplificar diferentes locos do genoma (Devos & Gale, 1992; Ferreira & Grattapaglia, 1998). A grande vantagem da tcnica de marcadores RAPD est, sem dvida, na sua capacidade de detectar polimorfismo de modo simples e rpido, permitindo assim que possam ser usados como fingerprinting, distinguindo divergncias mnimas entre espcies ou clones ou dentro destes. Alm disso, os RAPDs so muito eficientes em identificar marcadores mais proximamente ligados, assim como podem mapear regies constitudas por sequncias repetitivas.

Os marcadores denominados SSR ("Sequncias Simples Repetidas" - ou "Microssatlites", Hamada et al., 1982; Litt & Luty, 1989) so os mais polimrficos e consistem em pequenas sequncias com um a cinco pares de base que se repetem em srie em nmero varivel (geralmente de uma dezena a uma centena de vezes). Geralmente, os microssatlites identificam um nico loco no genoma e, por sua alta taxa de mutao, so frequentemente multiallicos, alm de segregarem de modo co-dominante. Os marcadores microssatlites tm eliminado a necessidade de cruzamentos distantes para maximizar o polimorfismo molecular, ou seja, qualquer cruzamento potencialmente informativo para o mapeamento molecular.

Contudo, esses marcadores requerem a construo de biblioteca genmica enriquecida para sequncias microssatlites, sequenciamento desses clones e desenho dos primers. Microssatlites esto sendo desenvolvidos em alguns laboratrios do mundo para diversas culturas, como milho, arroz e trigo (Roder et al., 1995; Rongwen et al., 1995; Devos et al., 1995). Os marcadores AFLPs ("Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos Amplificados" - Zabeau, 1993; Vos et al., 1995) constituem um dos mais recentes marcadores de DNA e combinam as vantagens dos RFLPs e RAPDs. Tais marcadores encontram-se distribudos por todo o genoma de procariotos e eucariotos. A tcnica dos AFLP consiste primeiramente na clivagem do DNA genmico do indivduo usando duas enzimas de restrio, seguida do emprego de adaptadores especficos, que so ligados aos terminais dos fragmentos de DNA que foram clivados. Aps, so feitas as amplificaes via PCR dos fragmentos do DNA. Por ltimo, realizada eletroforese em gel de alta resoluo para visualizao dos fragmentos gerados. A vantagem desses marcadores o grande nmero de fragmentos que so gerados e detectados em nico gel, fazendo com que, apesar de ser um marcador essencialmente dominante, sejam capazes de analisar o maior nmero de locos em um nico gel em relao aos outros marcadores, sendo, atualmente, considerados a mais eficiente entre as tecnologias de marcadores j desenvolvidas. Devido ao polimorfismo gerado por esses marcadores ser muito amplo, h maior rapidez no mapeamento gentico. Alm disso, qualquer dos marcadores citados pode ser usado para uma rpida identificao de ligao com alelos de genes que conferem importantes caractersticas para o melhoramento.

3 CONCLUSOA tendncia que as tcnicas avancem a tal ponto em que os diagnsticos no sero dados baseados num marcador deste ou daquele loco, mas da sequncia completa de DNA, ou de locos especficos. Alm disso, com tantos marcadores, qual utilizar? De acordo com os padres tcnicos de cada espcie, os recursos financeiros e o tempo disponvel sero escolhidos o melhor mtodo para cada ocasio.As tcnicas de marcadores moleculares amplificaram de forma rpida e precisa o nmero de marcadores genticos disponveis, representando uma poderosa ferramenta para ser utilizada no melhoramento de todas as formas que esto sendo evidenciadas a cada trabalho molecular. Vrios tipos de marcadores moleculares esto hoje disponveis diferenciando-se quanto sua habilidade em detectar polimorfismo, custo de aplicao, facilidade de uso e consistncia de resultados. Eles tm sido utilizados em estudos de diversidade gentica, anlises de pureza gentica, melhoramento assistido, mapeamento gentico, isolamento de genes e outros. No h mais dvidas que a tecnologia de marcadores moleculares est madura e j pode ser utilizada em vrias fases do melhoramento gentico vegetal, e entre outros. Certamente, as melhorias vo adotar rapidamente qualquer aplicao de marcadores moleculares que venha melhorar a eficincia de seleo e diminuir custos em seus programas de melhoramento. Estamos entrando na "Era Biolgica" do melhoramento vegetal, e todas as classes de estudo em pesquisas de doenas genticas mais o grande desafio ser incorporar essas novas tecnologias nos programas, cuja alta eficincia baseada em dcadas de atividades organizadas difcil de ser penetrada e modificada. inquestionvel que a tecnologia dos marcadores moleculares tem evoludo de maneira muito rpida nos ltimos anos, impactando de maneira surpreendente o conhecimento bsico da gentica molecular. Esse conhecimento bsico gerado tem que ser agora testado, visando acessar sua aplicao prtica nas diferentes etapas do melhoramento gentico convencional.

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