marcadores moleculares stefano
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Marcadores
Moleculares
Luis De Stefano BeltránLuis De Stefano Beltrán
Departamento de Ciencias Biológicas y FisiológicasUniversidad Peruana Cayetano Heredia
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Marcadores Moleculares
Un gen o secuencia de ADN que se puede usar paraidentificar a un organismo, a una especie, a una cepao a una característica fenotípica asociada con él
Un señal usada en el aislamiento de genes eucarióticos:una sonda de RFLP o un lugar de unión de partidor para amplificación
Secuencias de ADN que pueden ser identificadas mediante un simple ensayo:
tan pequeño como un SNP o un fragmento de ADN generado por ER’s.
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Marcadores moleculares son segmentos o fragmentos de cromosoma que no codifican necesariamente alguna característica, que no están afectados por el ambiente. pero que son heredados de una manera Mendeliana (2006).
Marcadores Moleculares
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Isozimas y Alozimas
• El “abuelo” de los marcadores moleculares
• Lewontin y Hubby, 1966 - Las substituciones de amino ácidos cambian la movilidad de la enzima en el gel: -plegamiento y/o carga
• Aún en uso en estudios de Genética de Poblaciones que necesitan identificar bajos niveles de variación genética.
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Isozimas
• Pros:Protocolos bien desarrollados con moderado
grado de dificultad. No se necesita información genómica. Existen décadas y décadas de datos acumulados
(“mining”).
•Contras:Poca variación.Se necesita abundante tejido fresco.Loci son una muestra no aleatoria del genoma y
muchos están bajo fuerte selección.Puede ser considerado un “arte”.Muchos reactivos, químicos peligrosos.
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Marcadores Moleculares
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Southern blots
• Aislamiento del ADN • Digestión del ADN con enzimas
de restricción • Separación de los fragmentos de
ADN de acuerdo a su tamaño• Desnaturalización del ADN• Transferencia de las cadenas
simples de ADN a la membrana
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Metodología
• Preparación de la sonda– Marcaje – Desnaturalización
• Hibridación de la sonda a la membrana
• Enjuague de la membrana• Autoradiografía
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sondasonda
ubicaciubicación de los sitios de restricciónón de los sitios de restricción
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ADNADNAnemiaAnemia
FalciformeFalciforme
ADNADNAnemiaAnemia
FalciformeFalciformeADNADN
NormalNormalADNADN
NormalNormalAA BB
A + BA + B
A + BA + B
AA
BB
1. Cortar 1. Cortar concon
MstIMstI2. Gel2. Gel
1. Cortar 1. Cortar concon
MstIMstI2. Gel2. Gel
ADN ADN ββ-Globina-GlobinaNormalNormal
ADN AnemiaADN AnemiaFalciformeFalciforme
HibrididaciHibrididaciónónSouthernSouthern
ElectroforesisElectroforesisen geles de en geles de
AgarosaAgarosa
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Southern
Blot
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Desventajas
•Es tediosa y trabajosa •Puede durar varios días •Costosa •Usa radioisótopos
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Restriction Fragment Length Polymorphism(RFLP)
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“PCR is the practice of Biology without a permit”
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“RAPD allows analysis without a clue”
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Random Amplified Polymorphic DNA(RAPD)
• 1990, Welsh & McCleland and Williams et al.
• Usa partidores muy cortos (10 pb) para amplificar fragmentos aleatorios de ADN.
• No se necesita ninguna información acerca del genoma en estudio
• Marcador dominante: presente o ausente
• Muy desacreditado, pero probablemente no es tan malo como algunos podrían pensar
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Random Amplified Polymorphic DNA(RAPD)
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Amplified Fragment Length Polymorphism
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AFLPs
Pros:-Muchos loci estudiados al mismo tiempo-No se necesita ninguna información anterior-Alta variabilidad
Contras:-Homoplasia en el tamaño de los fragmentos -Problemas con reproducibilidad-Protocolo es muy largo-Marcador dominante anónimo-Demasiados loci…..!!
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ADN Repetitivo
Microsatélites o Secuencias Simples Repetidas(Simple Sequence Repeats, SSRs)- Mono-, di-, tri-, y tetra-nucleótidos
Minisatélites o Short Tandem Repeats (STRs)- 5-10 bp
Variable Number of Tandem Repeats- 14-100 bp
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Microsatélites
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Rearreglos en los tándem repetidos debido a un crossover desigual
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Microsatélites
•Pros: -Altamente variable-Muchos alelos por locus-Marcador co-dominante
•Contras:-Dinámica evolutiva desconocida- “Stutter y alelos nulos complican el “scoring”-Alta inversión inicial para desarrollar loci
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Single Nucleotide Polymorphism: SNPs
• Pueden representar hasta 90% de la VariaciónGenética Humana.
• 1.5 millon de posiciones presentan variabilidad
• Puede ser la base de la susceptibilidad a enfermedades comunes (cáncer, diabetes, etc).
• Farmacogenética: busca identificar la posiblerespuesta a las terapias con drogas.
• Métodos para identificación, dependen, si es un SNPdesconocido o conocido.
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Marcadores No Polimórficos
• STSs (Sequence Tagged Sites) Secuencia corta de ADN (200 – 500 bp)
con una ubicación cromosómica conocida que ocurre una vez en el genoma.
• ESTs (Expressed Sequence Tags) STSs derived from ADNc’s
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Conclusiones
• No todos los MM’s son iguales.
• Ninguno de ellos son ideales.
• Algunos son mejores para algunos propósitos que otros.
• Sin embargo, todos son preferibles a los marcadores morfológicos para propósitos de
mapeo