aplicação de marcadores moleculares na agricultura

DOGMA CENTRAL Aplicao de marcadores moleculares na agricultura genes ambiente FENTIPO

Adriana Dantas [email protected] Florianpolis - SC

DNA armazena a informao

RNA transfere a informao

Protena executa a funo

GENOMACOMO ESTUDAR?Marcador molecular Polimorfismo Anlise de segrega o Mapa gentico Mapeamento de interesse (QRL QTL) Sequenciamento de DNA Bancos de sequencias Biblioteca genmica Genoma funcional

MARCADORES ? MARCAS ? GENES?

MARCADORES GENTICOSMorfolgicos Bioqumicos DNA RNA

Expresso gnica - RNAmMarcadores moleculares

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MARCADORES ? MARCAS ? GENES?

MARCADORES GENTICOS Identificam no indivduo as caracter sticas do fentipo, do gentipo ou de ambos; quantificvel, pode detectar variao seja na protena, ou em uma seqncia de DNA; Carter gentico pode no ter efeito observvel; Ligados a outros caracteres; Exige an lise de herana genmica.

MARCADORES GENTICOSMorfolgicosBioqumicos DNA RNA

Marcadores moleculares

At 1960 Marcadores morfolgicos - Muito esforo e planejamento;- Conhecimento prtico de cultivo; - Grande n mero de cruzamentos; - Nmero reduzido de marcadores; - Pouco cobertura genmica; - Polimorfismo limitado; -Influncia do ambiente e a o gnica; -Geralmente dominantes e recessivos.

Marcador molecular

Todo e qualquer fentipo molecular proveniente de um gene expresso, (isoenzimas, proteinas, RNAm) ou de um segmento especfico de DNA/RNA (regies expressas ou no do genoma).

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APLICA APLICAES- Organiza o da variabilidade gentica; - Escolha de genitores para a obteno de recombinantes nas prognies; - Mapeamento gentico; - Selecionar marcadores ligados a genes de interesse; - Seleo indireta de plantas em um estgio precoce e com reduo de custo e tempo; - Clonagem de genes de interesse agronmico.

MAPEAMENTO GEN TICO

- Estudos de importncia agronmica de caracter quantitativo e qualitativo; - QTLs rastreados e etiquetados, visando uma melhoria na eficincia da seleo de tipos;

Ferramentas da Biologia MolecularEnzima de restrio


Eletroforese

PCR Termociclador

Eletroforese

PCR Termociclador

DNA ligaseS CA R LA CO


CA S COLAR

CA S COLAR

3

A clivagem do DNA Cortam o DNA em s tios especficos Endonucleases de restrio ou enzimas de restrio Clivam o DNA somente em determinadas seqncias de nucleotdeos, normalmente curtas, 4 8 pares de bases Cada enzima reconhece um s tio de clivagem especfico!!!GENOMA

Enzimas de restrioENZIMA DE RESTRIO

fragmentos do genoma

Microrganismoa) Clivagem no eixo de simetria b) Clivagem simtricamente situada ao redor do eixo de simetriaEscherichia coli Bacillus amyloliquefaciens H

EnzimaEcoRI BamHI BglII Hae II HindIII

Sequncia AlvoG C A T A T T A T A C G

G C

G C

A T

T A

C G

C G

...TC GA... ...AG CT...

...GAA TTC... ...CTT AAG...

Bacillus globigii Haemophilus aegyptius Haemophilus aegyptius

A T

G C

A T

T A

C G

T A

Pu G C G C P i Py i C G C G P u

A T

A T

G C

C G

T A

T A

3

5

+5 3 3 5

+5 3

Providencia stuartii Streptococcus albus G Thermus aquaticus Brevibacterium albidium Haemophilus aegyptius

Pst I Sal I Taq I BalI Hae III

C G

T A

G C

C G

A T

G C

Molculas com extremidades abruptas

Molculas com extremidades coesivas

G C

T A

C G

G C

A T

C G

T A

C G

G C

A T

T A

G C

G C

C G

C G

A T

Figura 1. Dois tipos de clivagem feitas por enzimas de restri o. As setas indicam os s tios de clivagem. As linhas pontilhadas representam o centro de simet da sequncia. ria

A T

G C

G C

C G

C G

T A

Serratia marcescens

Sma I

C G

C G

C G

G C

G C

G C

Tabela 1. Algumas endonuclease de restrio: origem e stios de clivagem. A seta indica o local de clivagem. Pu e Pi referem-se, respectivamente, a qualquer purina e pirimidina.

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DNA ligaseS CA A R L CO

Eletroforese

PCR Termociclador


Liga o cDNA em vetores apropriados

CA S COLAR

Fragmento de DNA a ser clonado DNA vetor

CARTUCHO DE CLONAGEM - Polylinker

CA C O LS A R

Ligao catalisada pela DNA ligase

Ligao com vrias enzimas diferentes, vrios stios de clonagem

DNA recombinante Transformao

DNA recombinante Cromossomo bacteriano

5

A separao dos fragmentos da molcula de DNA em gel de eletroforese


EletroforeseCaractersticas do DNADNA ligase

PCR Termociclador

Separao por tamanho

Eletroforese (Michaelis, 1909) Gis Amido Agarose AcrilamidaSolues -tampes

CA S COLAR

S CA R LA CO

O princ p i o b sico envolvido na obteno e detec o de cada classe de marcador bioqu mico ou de DNA reside no uso de eletroforese. O termo eletroforese foi criado por Michaelis em 1909, para descrever migra o de col ides sob a influncia de um campo eltrico. Seu princ pio simples: molculas de carga negativa migram para o p lo positivo, e mol culas com carga positiva migram para o p lo negativo. A eletroforese visa separao de molculas em funo de suas cargas eltricas, de seus pesos moleculares e de suas conformaes, em suportes porosos (g is) e solu es -tampes (estabilizam o pH do meio e permitem o fluxo de corrente el trica).

+O sentido e a velocidade de migrao determinado pelo tamanho e carga das molculas

6

Carregando o gel com as amostras

AGAROSE

7

Revelando gel de agarose em U.V. brometo de etdeo

Gel acrilamida

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MARCADORES genticos? MARCAS ? GENES?

MARCADORESMorfolgicos

Bioqumicos

DNA

RNA

Marcadores moleculares

Isoenzimas Dcadas de 60 -70 Permitiram que muitas das dificuldades detectadas pelo uso dos marcadores morfolgicos fossem resolvidas. Scandalios (1975) - vantagens importantes sobre os marcadores morfolgicos convencionais. Shields e t al. (1983)- as prote nas so marcadores interessantes para o estudo gentico, porque elas so produto prim rio dos genes estruturais. Mudanas na seqncia de bases codificadoras, na maioria dos casos, resultaro em mudanas na estrutura primria da prote na correspondente. Kessel e Milchemore (1986) e Falco e Contel (1991) - abordam que as varia es proticas so de grande importncia nos estudos genticos como indicadores dos n veis de polimorfismo e relacionamento filogentico, bem como na identificao de ra as, espcies e popula es, representando, desse modo, uma valiosa ferramenta para estudos evolutivos e taxonmicos.

Eletroforese de isoenzimasIsoenzimas - diferentes formas moleculares (variantes) de uma mesma enzima, apresentando funo idntica ou similar, presente num mesmo indiv duo (Markert & Moller, 1959).

*

6PGDH -CM

Co-dominncia

Gel de Araucaria angustifolia MANTOVANI, 2003

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Natureza da variao isoenzimtica varia isoenzim As isoenzimas so diferentes firmas moleculares de uma enzima catalisando a mesma reao na clula. Quando as isoenzimas so controladas por alelos de um nico loco, elas so chamada de aloenzimas. Representam a conseqncia bioqumica da substituio, deleo ou adio de um ou mais aminocidos no polipeptdico, afetando sua carga eltrica e, conseqentemente, a sua mobilidade durante a eletroforese

Classificao das Enzimas:o As enzimas podem ser classificadas de acordo com v rios crit rios. O mais importante foi estabelecido pela Unio Internacional de Bioqumica (IUB), e estabelece 6 classes:

1. Oxidorredutases : So enzimas que catalisam rea es de transferncia de el trons, ou seja: reaes de oxi - redu o. So as Desidrogenases e as Oxidases 2. Transferases : Enzimas que catalisam rea es de transferncia de grupamentos funcionais como grupos amina, fosfato, acil, carboxil, etc. Como exemplo temos as Quinases e as Transaminases 3. Hidrolases : Catalisam reaes de hidrlise de liga o covalente. Ex: As peptidades 4. Liases Catalisam a quebra de ligaes covalentes e a remo o de mol culas de gua, amnia e gs carbnico. As Dehidratases e as Descarboxilases so bons exemplos 5. Isomerases Catalisam reaes de interconverso entre ismeros pticos ou geomtricos. As Epimerases so exemplos. 6. Ligases Catalisam rea es de formao e novas mol culas a partir da ligao entre duas j existentes, sempre s custas de energia (ATP). So as Sintetases.

Propriedades das Enzimas: As enzimas : o So catalisadores biol gicos extremamente eficientes Aceleram em mdia 109 a 1012 vezes a velocidade da reao, transformando de 100 a 1000 molculas de substrato em produto por minuto de reao. o o o o o Atuam em concentraes muito baixas Atuam em condies suaves de temperatura e pH Possuem todas as caractersticas das prote nas Podem ter sua atividade regulada Esto quase sempre dentro da clula, e compartimentalizadas.

A estrutura quaternria ativa das isoenzimas podem ser de trs tipos:1.- Monmeros: isoenzimas que possuem uma cadeia polipeptdica como estrutura quatern ria ativa.

2.- Dmeros: isoenzimas cuja estrutura quaternria ativa consiste na unio de dois polipeptdios.

3.- Tetrmeros: a estrutura quaternria ativa das isoenzimas constam de quatro polipeptdios.

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Depois de corrida a eletroforese, o gel tratado com o substrato especfico da enzima e uma substncia que reage com o produto da reao com a formao de uma substncia colorida. Com o emprego de gel de amido, para uma nica eletroforese podemos estudar diferentes enzimas pois esse tipo de gel permite seu fatiamento como abaixo:

A mobilidade da molcula atravs de um gel de eletroforese dependende seu peso molecular e da sua conformao. Aps a separao das isoenzimas por eletroforese, elas so identificadas por meio de rea es qumicas baseadas em suas atividades catalticas especificas.

Como as enzimas apresentam a propriedade de catalisar uma determinada reao qumica, isso propicia uma maneira de detectar a presena da prpria enzima. Na figura abaixo est esquematizado um mtodo de deteco de enzima que produz uma substncia colorida:

Fosfoglucomutase (PGM) monomricaalelo 1

So marcadores co-dominantes, as aloenzimas permitem identificar diretamente os gentipos heterozigotos.

alelo 2 alelo 3Resultado da presena de mais de um gene codificando cada uma das enzimas MANTOVANI, 2003 Padro isoenzim tico ou Zimograma, conjunto de bandas pertencentes ao mesmo sistema enzim tico que se observam na mesma esp cie.

Figura 1. Zimograma de PGM de couve. Incio na parte inferior, nodo no topo.1 = Ribeiro Pires 2620 com bandas na regio A e B: B, E, G, H; 2 = 1811 C, G; 3 = Roxa B, C, G, H; 4 = So Roque A, C, E, G, H; 5 = Gigante 915 C, D, F, G, H; 6 = 916 C, G, H; 7 = Cr espa Piracicaba A, E, G, H; 8 = Ribeiro Pires 2446 C, G, H; 9 = Crespa Capo Bonito C, E, G; 10 = Tupi B, G, H; 11 = Jundia C, F, I; 12 = Mococa C, E, I; 13 = So Jos C, G, H; 14 = Roxa Monte Alegre A, C, F, I; 15 = VerdeEscura A, C, E, F, -

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Aplicaes Aplica Cavalli-Molina (1984) destaca que numerosos estudos de locos enzimticos mostram a existncia de nveis significativos da variao gnica intra e interpopulacional em uma mesma espcie, alm de uma diferenciao considervel entre espcies no grau de heterogeneidade isoenzimtica intrapopulacional. possvel relacionar o nvel e a distribui o da variabilidade gentica com a historia natural das espcies. Influncia de caractersticas como disperso de sementes e propgulos, amplitude da distribui o geogrfica e estdio de sucesso em que a espcie se enquadra sobre a distribui o da variabilidade presente entre e dentro de populaes de plantas

Aplicaes

Anlise da variabilidade gentica

Os gis de eletroforese permite examinar vrios locos enzimaticos em uma nica corrida eletrofortica

Figura 2. Zimograma de PRX de couve. Incio na parte inferior, nodo no topo. 1 = Ribeiro Pires 2620 co m bandas na regio A: B1 Regio B com banda monom rfica ; 2 = 1811 B1; 3 = Roxa B1; 4 = So Roque A1 e B1; 5 = Gigante 915 A1; 6 = 916 B1; 7 = Crespa Piracicaba B1; 8 = Ribeiro Pires 2446 B1; 9 = Crespa Capo Bonito A1 e B1; 10 = Tupi B1; 11 = Jundia B1; 12 = Mococa B1; 13 = So Jos B1; 14 = Roxa Monte Alegre B1; 15 = Verde-Escura A1.

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Contribui Contribuio das aloenzimas :1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Sistemas de cruzamentos em plantas e seus efeitos sobre a estrutura gen tica estrutura e variabilidade em populaes popula Conseq ncias evolutivas da correla o entre alelos de diferentes locos correla (desequil (desequil brio de liga o) liga A diferencia o geogr fica de populaes dentro de esp cies diferencia popula Fatores ecol gicos que controlam o fluxo gnico dentro de populaes ecol popula Componentes da sele o natural durante o ciclo da vida da planta Rela o entre a variabilidade em aloenzimas e caracter sticas morfol gicas caracter morfol Caracteriza Caracteriza o de germoplasma Impacto da sele o e da deriva gen tica em programas de melhoramento e sele sele o Monitoramento de recursos in situ Rela es evolutivas entre esp cies, como a hibrida o, a introgresso e poliploidia Identifica o de clones e a caracteriza o de gen tipos parentais em cruzamentos

Tipos de marcadores genticos? isoenzimas - bioqumico ? RFLP ? Minissatlites ? RAPD ? MICROSSATLITES - SSR ? AFLP ? RFLP-PCR ? cDNA+AFLP ? ESTs ? SNPsEnzima de restrio

Ferramentas da Biologia Molecular

Radioatividade

Eletroforese

PCR Termociclador

Reao de polimerase em cadeia (PCR)


RNACA S COLAR

? Marcadores DNA organelas ? Marcadores especficos

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Reao de PCR

Reao de polimerase em cadeia (PCR) princ pio e aplicao da tcnicaT cnica usada para amplificar uma regio especfica de DNA em visando produzir quantidade de DNA suficiente

Como funciona MESMO?? Do que precisa???

Replicao do DNA

O que imita????

Temperatura

Amostra de DNA

100

Desnatura 94 o C

PCR

Taq DNA polimerase

50

0

Tempo95 C3 5 5 3

35 65 C

72 C

14

Temperatura

100

Desnatura 94 o C

Temperatura

PCR

100

Desnatura 94 o C

PCRAnela Primers 50 o C Extende 72 o C

Desnatura 94 o C

50

50

0

0

Tempo3 5 3

Tempo5 5

Calor5 5 3 5 3

Temperatura

100

Desnatura 94 o C

50

Anela Primers 50 o C

Extende 72 o C

Desnatura 94 o C

30x

Temperatura

PCR

100

Desnatura 94 o C


Desnatura 94 o C

30x

50

0

0

Tempo3 5 3

Tempo5 5 5

Calor5 5 5 5 5

Calor5 5 5 3 5 3

15

Temperatura

100

Desnatura 94 o C

Desnatura 94 o C

30x

Temperatura


100

Desnatura 94 o C


Desnatura 94 o C

30x

50

50

03 5 5

0

Tempo5

3

5

5

Tempo5 5 5

5 5 3 5

5 3

Calor5 5 5 5 5

Calor5 5 5

Temperatura

100

Desnatura 94 o C

PCRAnela Primers 50 o C Exteno 72 o C

Denatura 94 o C

30x

DNA dobra a cada cicloNmero de ciclos 2 4 8 16 32 64

50

03 5 5 5 3 5

Tempo5 5

Fragmento de tamanho definido

5

5

5

5

5

5

0 Ciclos

1

2

3

4

5

6

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Constataes Logo aps Kary Mullis ter descoberto a Polymerase Cadeia Reao (PCR) ele percebeu que primers curtos ligariam a v rios locais em um genoma e assim poderiam produzir fragmentos mltiplos Williams et al. (1990) desenvolveu Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) - uma tcnica que utiliza 10 primers de base muito curto para gerar fragmentos de DNAs? RFLP

Tipos de marcadores genticos? isoenzimas - bioqumico ? Minissatlites ? RAPD ? MICROSSATLITES - SSR ? AFLP ? RFLP-PCR ? cDNA+AFLP ? ESTs ? SNPs

Radioatividade

Reao de polimerase em cadeia (PCR)

Fragmentos de RAPD podem ser separados e usado como marcadores genticosou um tipo de impresso digital

RNA

? Marcadores DNA organelas ? Marcadores especficos

Extrao de DNA (Doyle e Doyle, 1987)Sol. extratora

Quantifica o de DNAQuantificao DNA (gel agarose 0,8%) 20 50 100

Adio de CIA1.51.5

1.0 0.5

Centrifugao

1.0

0.5

Amostra

0.1

Adio de etanol

RNAse

1.5

1.0 0.5 0.1

pellet

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RAPDs(Random Amplified Polymorphic DNA)

RAPD

DNA

A A B

B

?Primer se liga a muitos locais no DNA ?S quando primer locais que liga e mdireo oposta amplificao

RAPD

RAPD

DNA

DNA

> 2,000 bases

Primers encontram-se na mesma direo, amplificao NO acontecer

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RAPDDominante

DNA

100 - 1,500 bases

Primers so separados em pouca distncia, fragmento AMPLIFICADO

RAPDs5 TAGAACATAAGGCCTA ATCTTGTATTCCGGAT TAGAACATAAGGCCGG ATCTTGTATTCCGG CC GGAATGGCCATATGAT CCTTACCGGTATACTA GGAATGGCCATATGAT CCTTACCGGTATACTA

(Randomly Amplified Polymorphic DNA )5 5

5

3- CCTTACCGGTATACTA -5

5

TAGAACATAAGGCCTA5-TAGAACATAAGGCCTA-3

GGAATGGCCATATGAT

SIM

ATCTTGTATTCCGGAT

CCTTACCGGTATACTA

5

5

TAGAACATAAGGCCGG

GGAATGGCCATATGAT3- CCTTACCGGTATACTA -5

NO

ATCTTGTATTCCGG CC 5-TAGAACATAAGGCCTA- 3

CCTTACCGGTATACTA

5

Amplificao de um segmento de DNA delimitado por dois iniciadores (ou primers, ou oligonucleotdeos), comumente com 10 pares de bases, que so complementares a dois stios de nucleotdeos, um em cada fita do DNA, posicionados inversamente a uma distncia geralmente no superior a 4kb.

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Onde moram os marcadores???

GenomaGenes e sequncias relacionadas DNA extragnico

DNA codificante

DNA no codificante

DNA repetitivo DNA repetitivo

RAPDs AFLPs outros

Introns Repeties e m Fragmentos de tandem genes

Repeties dispersas

Transposons Satlites Sequncias de insero Microssat lites Minissat lites

GGCTATCAAAGACCTGAAGAAGCCCAGTATAACCTTAGGAAAAGCTCCTGATTTGAATAAA GCATACAAATCAATTNTATCTGGCATGAATGCAGCCAAACTCGACCCTGATGATGTATGCT CTTATCTGGCTGCCGCGATGCAGTTCTTTGAGGGATCATGTCCTGAGGACTGGACTAGCTA TGGAATCCTGATAGCTCGGAAGGGAGACAAGATCACTCCGGATTCTCTTGTGGACATAAG ACGTACTGATGTGGAAGGGAATTGGGCTCTAACAGGGGGCATGGAGTTGACAAGGGACCC TACTGTTTCAGAGCATGCA TACTGTTTCAGAGCATGCATCTCTCTCTCTTCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTC TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCGACCCTACTGTTTC CTCTCTCTCGACCCTACTGTTTC ATGTGCGCTAACTGGAGTACCATACCAAATTTCAGATTCCTGGCTGGGGCTATCAAAGACC TGAAGAAGCCCAGTATAACCTTAGGAAAAGCTCCTGATTTGAATAAAGCATACAAATCAAT TNTATCTGGCATGAATGCAGCCAAACTCGACCCTGATGATGTATGCTCTTATCTGGCTGCC CTGAGGACTG GCGATGCAGTTCTTTGAGGGATCATGTCCTGAGGACTGGACTAGCTATGGAATCCTGATA GCTCGGAAGGGAGACAAGATCACTCCGGATTCTCTTGTGGACATAAGACGTACTGATGTG CTGAGGACTG GAAGGGAATTGGGCTCTAACAGGGGGCATGGAGTTGACAAGGGACCCTACTGTTTCAGAG CATGCATCTCTGGTTGGCCTTCTCTTGAGTTTATATAGGTTGAGCAAAATCTCCGGGCAGA ATACCGGCAATTACAAGACAAACATCGCGGATACGAATAGAGCAGATTTTTGAGACAGCCC CCTTTGCAAAAATCGTAGAACATCATACTTTGATGACGACCCACAAAATGTGCGCTAACTG GAGTACCATACCAAATTTCAGATTCCTGGCTGGGGCTATCAAAGACCTGAAGAAGCCCAGT ATAACCTTAGGAAAAGCTCCTGATTTGAATAAAGCATACAAATCAATTNTATCTGGCATGA ATGCAGCCAAACTCGACCCTGATGATGTATGCTCTTATCTGGCTGCCGCGATGCAGTTCTT TGAGGGATCATGTC CTGAACTGTAGACTAGCTATGGAATCCTGATAGCTCGGAAGGGAGA CTGAGGACTG CAAGATCACTCCGGATTCTCTTGTGGACATAAGACGTACTGATGTGGAAGGGAATTGGGCT CTAACAGGGGGCATGGAGTTGACAAGGGACCCTACTGTTTCAGAGCATGCATCTCTGGTT GGCCTTCTCTTGAGTTTATATAGGTTGAGCAAAATCTCCGGGCAGAATACCGGCAATTACA AGACAAACATCGCGGATACGAATAGAGCAGATTTTTGAGACAGCCCCCTTTGCAAAAATCG TAGAACATCATACTTTGATGACGACCCACAAAATGTGCGCTAACTGGAGTACCATACCAA A

?

Consistem de pequenas seqncias (sequence motif) com 1 a 4 nucleotdeos de comprimento, repetidas em tandem.Mononucleotdeos TGCATTG AAAAAAAAAAAAAAA CTGGATC Dinucleotdeos Trinucleotdeos TGCATTGT ATAT ATATAT ATATA CTGGATC TGCATTGT GATGATGAT GAT GACTGGATC

Tetranucleotdeos TGCATTGT GA CTGACT GA CTGACCTGGATC

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Deteco de locos SSR3CACACACACA GTGTGTGTGT CACACACACA GTGTGTGTGT

Na recombina o dos alelosCACACACACA GTGT Taq GTGTGTGTGT CACACACACA GTGTGTGTGT CACACACACA GTGTGTGTGT CACACA GTGTGT 5 3 5 3 5 3 5 3

CACACA(CA)5 (CA)5

GTGTGT CACACACACA GTGTGTGTGT

(CA)3 (CA)5

CACACA GTGTGT CACACA GTGTGT

iniciador reverse iniciador forward

(CA)3 (CA)3

5 3 5 3 5 3 5

P1

Amostra 1

Amostra 2

Amostra 3F1

P1

F1

P2

P2

3 5

CACACA GTGTGT

5 3

CaractersticasM

homozigoto

Marcador co-dominante

heterozigoto

Marcador multiallico

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MICROSSATLITES SSR Simple Sequence Repeats Pequenas sequncias (sequence motif) com 1 a 4 nucleotdeos repetidos em tandem - Amplificados via PCR Classe de marcadores moleculares mais polim rficos Sinonimias SSR ( Simple Sequence Repeats); Repeats); STMS ( Sequence Tagged Microsatellites); Microsatellites); SSLP ( Single Sequence Length Polymorphisms); Polymorphisms);Onde so encontrados ?? ?Mamferos: (CA)n ( 50.000 a 100.000 vezes no genoma) Plantas: (AT)n Mitocndrias

Microsatlites

Aplicaes dos MicrossatlitesGenetic Characterization of Active Bank of Germoplasm of Pineapple Guava (Acca Sellowiana) by transfer of markers Microsatellites of Eucalyptus spp Karine Louise dos Santos1, Leocir Jos Welter1, Adriana Cibele de Mesquita Dantas1, Jean Pierre Ducroquet2 , Rubens Onofre Nodari11 Laboratrio

de Fisiologia do Desenvolvimento e Gentica Vegetal, CCA/UFSC, Florian polis, SC, Brasil Esta o Experimental de So Joaquim, Epagri, So Joaquim, SC, Brasil2

Como os microsatlites so formados ?

ReplicaoFita nascente Fita molde Slippage

Modelos para explicar os processos mutacionais envolvidos na formao das repeties Escorreges da DNA polimerase Crossing over desigual

Misalignment

+1 repeat

-1 repeat

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SEQUENCIAMENTO Se voc escolheu os microssatlites como marcador molecular para o seu estudo a primeira coisa a fazer verificar se j existem microsatlites para a sua espcie no GenBank. Se no, existem voc ter que desenvolve-los !animao

Microsatlites em sequncias

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Zabeau (1993), Vos et al. (1995) O ensaio combina a especificidade, resolu o e poder de amostragem da digesto de enzimas de restrio com a velocidade e praticidade de deteco do polimorfismo via PCR Co-amplificao especfica de um grande nmero de fragmentos de restrio Tipicamente 40-100 fragmentos so amplificados e detectados em gel de poliacrilamida Esta caracter stica tambm chamada de ndice de multiplex do ensaio AFLP

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5------GAATTC --------TTAA-----3 3------CTTAAG---------AATT -----5 EcoR I Digesto do DNA Mse I

5------GAATTC --------TTAA-----3 3------CTTAAG---------AATT -----5

AATTC --------T Liga Ligao de adaptadoresEcoR I adaptador

G---------AAT TTAA TAMse I adaptador

AATTC --------TTA TTAAG---------AAT Pr Pr - amplifica oEcoR I primer E- A

AATTCA --------GTTA TTAA GT---------CAATMse I primer M - C

Amplifica oEcoR I primer E- ACA

AATTCAACA -----------GTGGTTA TTAA GTTGT------------CACCAATMse I primer M - CAC

AFLPVantagem indiscutivel -Grande nmero de fragmentos -Nmero de marcadores simultneos analisados -Facilidade e rapidez com que realizado, -Alta resolu o e repetitivo

Desvantagem -Discriminar o heterozigoto dos homozigotos. (mas com exce o!)

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Prote nas Atributos Isoenzimas de sementes RFLPs Nvel de baixo alto baixoalto Polimorfismo Estabilidade moderada alta alta ambiental Nmero de locos moderado (

aplicação de marcadores moleculares na agricultura

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