Marcadores

Moleculares

Luis De Stefano Beltrán

Departamento de Ciencias Biológicas y FisiológicasUniversidad Peruana Cayetano Heredia

Marcadores Moleculares

Un gen o secuencia de ADN que se puede usar paraidentificar a un organismo, a una especie, a una cepao a una característica fenotípica asociada con él

Un señal usada en el aislamiento de genes eucarióticos:una sonda de RFLP o un lugar de unión de partidor para amplificación

Secuencias de ADN que pueden ser identificadas mediante un simple ensayo:

tan pequeño como un SNP oo un frag. de ADN generado por ER’s.

Marcadores moleculares son segmentos o fragmentos de cromosoma que no codifican necesariamente alguna característica, que no están afectados por el ambiente. pero que son heredados de una manera Mendeliana (2006).

Marcadores Moleculares

Isozimas y Alozimas

• El “abuelo” de los marcadores moleculares

• Lewontin y Hubby, 1966 - Substituciones de amino acidos cambian la movilidad de la enzima en el gel:

-plegamiento y/o carga

• Aún en uso en estudios de Genética de

Poblaciones que necesitan identificar bajos niveles de variación genética.

Isozimas• Pros:

Protocolos bien desarrollados con moderado grado de dificultad.

No se necesita informacion genómica. Existen décadas y décadas de datos acumulados

(“mining”).

• Cons:Poca variación.Se necesita abundante tejido fresco.Loci son una muestra no aleatoria del genoma y

muchos estan bajo fuerte selección.Puede ser considerado un “arte”.Muchos reactivos químicos peligrosos.

Marcadores Moleculares

Southern blots

• Aislamiento del ADN • Digestión del ADN con enzima de

restricción • Separación de los fragmentos de

ADN de acuerdo a su tamaño• Denaturación del ADN• Transferencia de las cadenas

simples de ADN a la membrana

Metodología

• Preparación de la sonda–Marcación –Denaturación

• Hibridación de la sonda a la membrana

• Enjuague de la membrana• Autoradiografía

sonda

ubicación de los sitios de restricción

ADNAnemia

Falciforme

ADNAnemia

FalciformeADN

NormalADN

NormalA B

A + B

A + B

A

B

1. Cortar con

MstI2. Gel

1. Cortar con

MstI2. Gel

ADN β-GlobinaNormal

ADN AnemiaFalciforme

HibrididaciónSouthern

Electroforesisen geles de

Agarosa

Southern

Blot

Desventajas

• Es tediosa y trabajosa • Puede durar varios días • Costosa • Usa radioisótopos

Restriction Fragment Length Polymorphism(RFLP)

“PCR is the practice of Biology without a permit”

“RAPD allows analysis without a clue”

Random Amplified Polymorphic DNA(RAPD)

• 1990, Welsh & McCleland and Williams et al.• Usa partidores muy cortos (10 pb) para amplificar fragmentos aleatorios de ADN.• No se necesita ninguna información acerca del genoma en estudio• Marcador dominante: presente o ausente• Muy desacreditado, pero probablemente no es tan malo como algunos podrían pensar

Random Amplified Polymorphic DNA(RAPD)

Amplified Fragment Length Polymorphism

AFLPs

Pros:- Muchos loci estudiados al mismo tiempo- No se necesita ninguna información anterior- Alta variabilidad

Cons:- Homoplasia en el tamaño de los frag’s - Problemas con reproducibilidad- Protocolo es muy largo- Marcador dominante anónimo- Demasiados loci…..!!

ADN Repetitivo

Microsatélites o Secuencias Simples Repetidas(Simple Sequence Repeats, SSRs)- Mono-, di-, tri-, y tetra-nucleótidos

Minisatélites o Short Tandem Repeats (STRs)- 5-10 bp

Variable Number of Tandem Repeats- 14-100 bp

Microsatélites

Rearreglos en los tándem repetidos debido a un crossover desigual

Microsatélites

•Pros: -Altamente variable-Muchos alelos por locus-Marcador co-dominante

•Cons:-Dinámica evolutiva desconocida- “Stutter y alelos nulos complican el “scoring”-Alta inversión inicial para desarrollar loci

Single Nucleotide Polymorphism: SNPs

• Pueden representar hasta 90% de la VariaciónGenética Humana

• 1.5 millon de posiciones presentan variabilidad• Puede ser la base de la susceptibilidad a

enfermedades comunes (cáncer, diabetes, etc)• Farmacogenética: busca identificar la posible

respuesta a las terapias con drogas.• Metodos para identificar depende si es un SNP

desconocido o conocido

Marcadores No Polimórficos

• STSs (Sequence Tagged Sites) Secuencia corta de ADN (200 – 500 bp)

con una ubicación cromosómica conocida que ocurre una vez en el genoma.

• ESTs (Expressed Sequence Tags) STSs derived from ADNc’s

Conclusiones

• Todos los MM’s no son iguales.• Ninguno de ellos son ideales.• Algunos son mejores para algunos propósitos

que otros.• Sin embargo, todos son preferibles a los M’s

Morfológicos para propósitos de mapeo