Thrombingenerierung und
Rotationsthromboelastometrie bei
gesunden Erwachsenen
Publikationspromotion
zur Erlangung des akademischen Grades
Dr. med.
an der Medizinischen Fakultät
der Universität Leipzig
eingereicht von: Tobias Schneider
geb. 06.05.1981 in Ahlen Westf.
Angefertigt an: Universitätsklinikum Leipzig AöR
Department für Innere Medizin, Neurologie & Dermatologie
Interdisziplinäre Internistische Intensivmedizin und
Zentrum für Hämostaseologie
Leiter: PD Dr. med. Sirak Petros
Betreuer: PD Dr. med. Sirak Petros
Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom:
___________________________________________ 21.06.2016
Dissertationsschrift Tobias Schneider
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Inhaltsverzeichnis:
Liste der Abkürzungen: .......................................................................................................... 3
Bibliographische Beschreibung: ............................................................................................ 5
1. Einleitung .......................................................................................................................... 6
1.1 Ausgangslage: ........................................................................................................ 6
2. Biochemische, physiologische und verfahrenstechnische Grundlagen: ............................ 9
2.1 Das Zellbasierte Gerinnungsmodel: ............................................................................. 9
2.2 Die Rolle des Thrombin im Rahmen der Thrombozytenaktiverung/ -vernetzung .........10
2.3 Gegenregulation des prokoagulatorischen Systems ...................................................11
2.4 Grundlagen und Funktionsweisen der verwendeten Gerinnungsanalysen ..................12
Trombingenerierungsassays und deren Entwicklung .....................................................12
Calibrated Automated Thrombography (CAT) ...............................................................12
Parameter der CAT- Analyse.........................................................................................13
Plasmapräparation für PPP und PRP-Ansätze .......................................................14
Einflussfaktoren auf die Thrombingenerierung durch unterschiedliche
experimentelle Ansätze ..........................................................................................15
Weitere Einflussfaktoren auf die Thrombingenerierung ..........................................16
Einsatz von CAT in der Forschung und in der klinischen Routine ...........................16
Die Rotationsthromboelastometrie (ROTEM): ...............................................................16
Messprinzip: ...........................................................................................................16
Parameter der ROTEM Analyse: ............................................................................17
Limitationen ............................................................................................................19
Einsatz von ROTEM in Forschung und in der klinischen Routine ...........................19
3. Ableitung der Rationale für diese Studie ...........................................................................20
4. Publikation: Thrombin generation and Rotational Thromboelastometry in the healthy
adult population ....................................................................................................................21
5. Zusammenfassung der Arbeit: ..........................................................................................28
Ergebnisse: .......................................................................................................................29
Diskussion, Schlussfolgerungen und Ausblick ..................................................................30
6. Literaturverzeichnis ..........................................................................................................32
7. Quellenverzeichnis Abbildungen: ......................................................................................39
8. Supplementäre Materialien ...............................................................................................40
Darstellung der Parameter der Thrombingenerierung stratifiziert nach Altersgruppen: ......40
Fragebogen zur Ermittlung Studien Ein-/Ausschluss: ........................................................42
9. Anhang: ............................................................................................................................44
Erklärung über die Eigenständige Abfassung der Arbeit: ..................................................44
Lebenslauf ........................................................................................................................45
Danksagung:.....................................................................................................................47
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Liste der Abkürzungen:
α Alpha Winkel
α2M Alpha 2 Makroglobulin
ADP Adenosindiphosphat
APC aktiviertes Protein C
aPTT aktivierte partielle Thromboplastinzeit
AT Antithrombin
CaCl2 Calciumchlorid
CAT Calibrated Automated Thrombogram
CFT Clot formation time
CT Clotting time
CTI Corn trypsin inhibitor
ETP endogens Thrombinpotential
FII Faktor II (Prothrombin)
FIIa Faktor IIa (Thrombin)
FVII Faktor VII
FVIII Faktor VIII
FIX Faktor IX
FX Faktor X
FXI Faktor XI
FXII Faktor XII
FXIII Faktor XIII
GP-Rezeptor Glycoprotein Rezeptor
MCF Maximum clot firmness
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ML Maximum lysis
Min Minute
nM nanomolar
PAI Plasminogen activator inhibitor
PDGF Platelet derived growth factor
pM picomolar
PPP plättchenarmes Plasma
PRP plättchenreiches Plasma
PT Prothrombinzeit
ROTEG Rotationsthrombelastographie
ROTEM Rotationathrombelastometrie
TAFI Thrombin activatable fibrinolysis inhibitor
TF Tissue Factor
TFPI Tissue Factor Pathway Inhibitor
TEM Thromboelastometrie
TM Thrombomodulin
t-PA Gewebsplasminogen Aktivator
TTM-Komplex Thrombin-Thrombomodulin Komplex
TXA2 Thromboxan A2
vWF von Willebrand Faktor
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Bibliographische Beschreibung:
Thrombingenerierung und Rotationsthromboelastometrie bei gesunden Erwachsenen
Universität Leipzig, Dissertation
47 Seiten, 62 Literaturangaben, 1 Publikation, 5 Abbildungen, 3 suppl. Materialien
Referat:
Die vorliegende Arbeit untersucht in einer Population von 132 gesunden Probanden
die Hämostase mittels Calibrated Automated Thrombogram (CAT) und
Rotationsthromboelastometrie (ROTEM). CAT wurde im plätchenarmen Plasma mit
einer tissue factor (TF) von 1 und 5 pM durchgeführt. Lag time, Thrombin peak, Time
to thrombin peak und das endogene Thrombin Potential (ETP) wurden ermittelt.
ROTEM wurde ohne Aktivator durchgeführt (NATEM) und die Daten für
Gerinnungszeit (clotting time, CT), Gerinnselbildungszeit, Alpha Winkel und
maximale Gerinnselfestigkeit (MCF) mit den Daten der Thrombingenerierung
korreliert. Es zeigte sich eine positive aber nicht lineare Korrelation bezüglich Alter
versus lag time und time to peak, sowie eine annähernd lineare Korrelation bezüglich
Alter versus thrombin peak und ETP. Für ROTEM konnte eine positive Korrelation
bezüglich Alter versus MCF und Alpha Winkel, aber eine negative Korrelation
bezüglich Alter versus CT dargestellt werden. In der Gegenüberstellung beider
Assays korrelierten Thrombin peak und ETP (aktiviert mit einer TF Konzentration von
5 pM) signifikant mit dem Alpha Winkel und der MCF. Alle signifikanten Korrelationen
zeigten lediglich eine moderate Regressionssteigung.
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1. Einleitung
1.1 Ausgangslage:
Die in der klinischen Routine etablierten Tests zur Beurteilung der globalen
Hämostase sind Prothrombinzeit (PT) und die aktivierte partielle Thromboplastinzeit
(aPTT). Zudem ist die Bestimmung der Aktivität von an der Hämostase beteiligten
Einzelfaktoren möglich. Diese Messungen bilden das Modell der „klassischen“
Gerinnungskaskade ab (Abbildung 1).
Abbildung 1: Klasssische Gerinnungskaskade der plasmatischen Gerinnung. Rot
eingefärbt: Durch aPTT erfasste Faktoren. Blau eingefärbt: durch PT erfasste
Faktoren. Violett eingefärbt: überlappend durch aPTT und PT erfasste Faktoren
Abbildung 1: Klasssische Gerinnungskaskade der plasmatischen Gerinnung. Rot eingefärbt: Durch aPTT erfasste Faktoren; blau eingefärbt durch Thromboplastinzeit erfasste Faktoren.
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Abbildung 2: Phasen der Thrombingenerierung, die von den Testmethoden,
aktivierte partielle Thromboplastin Zeit (aPTT), Prothrombinzeit (PT) und
Thrombelastometrie erfasst werden.
Das „klassische“ Gerinnungsmodell kann die in vivo ablaufenden Prozesse während
der Blutstillung allerdings nur unzureichend wiedergeben. So bilden die PT und aPTT
jeweils nur Teile der Initiationsphase der Gerinnung ab (Abbildung 2).
Die globalen Gerinnungstests beschreiben das Blutungsrisiko nur unzureichend (1,
2). Zudem sind sie zum Management der Hämostase nicht ausreichend geeignet (3,
4). Durch das komplexe Zusammenspiel der einzelnen Systeme der Hämostase wird
die Verwertbarkeit der gemessenen Einzelfaktoren oder Proteine schwierig. So
zeigen Patienten mit dem gleichen Faktorenmangel unterschiedlich starke
Blutungstendenzen und Patienten mit Faktor V-Leiden Mutation unterschiedliche
Risiken für thrombotische Komplikationen (5).
Eine zielgerichtete Anamnese ist den “Standard“ Gerinnungstests in der Identifikation
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von Gerinnungsstörungen überlegen (6).
Die klassische Blutgerinnungskaskade wurde als Modell für die ablaufenden
Prozesse der Hämostase durch das Zellbasierte Gerinnungsmodel verdrängt (7).
Dieses berücksichtigt die hämostatischen Prozesse auf unterschiedlichen
Zelloberflächen, um so das gesamte System besser abbilden zu können.
Das Ziel neuerer Assays zur Beurteilung der Hämostase sollte daher sein, die
physiologischen Abläufe besser abzubilden, die mit dem klinischen Phänotyp des
Patienten möglichst eng korrelieren (Abbildung 2 und 3).
Abbildung 3: Das zellbasierte Gerinnungsmodel nach Hoffman
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2. Biochemische, physiologische und verfahrenstechnische Grundlagen:
2.1 Das Zellbasierte Gerinnungsmodel: Im Zellbasierten Gerinnungsmodel wird zwischen drei Phasen unterschieden:
Initiation – Amplifikation – Propagation
1. Initiation
Über einen Gewebsdefekt kommt es zum Kontakt zwischen TF- exprimierendem
Subendothel und dem in geringer Menge im Blutstrom zirkulierenden aktivierten
Faktor VII (FVIIa). Durch diesen Komplex (TF-FVIIa) werden anschließend die
Faktoren IX (FIX) und X (FX) aktiviert (FIXa; FXa). Calcium-abhängig bildet FXa
zusammen mit FVa und Phospholipiden den Prothrombinase-Komplex auf der
TF- exprimierenden Zelle. Dieser überführt Prothrombin (FII) in Thrombin (FIIa).
Die Thrombingenerierung bleibt während der Initiation weitestgehend auf die TF-
exprimierende Zelle beschränkt, da im Plasma FXa umgehend durch Tissue
Factor Pathway Inhibitor (TFPI) und Antithromin (AT) deaktiviert wird. Die Phase
der Initiierung läuft im gesunden Individuum durchgehend aber getrennt von den
weiteren für die Gerinnung nötigen Faktoren ab. Es wird also kontinuierlich eine
kleine Menge Thrombin generiert.
2. Amplifikation
Dem während der Initiation an der Läsionsstelle generierten Thrombin kommt
während der Amplifikation eine zentrale Rolle zu: Es bedingt die Lösung des von
Willlebrand Faktor (vWF)-Faktor-VIII(FVIII)-Komplexes sowie die anschließende
Aktivierung des FVIII. Zudem wird eine Konformationsänderung und Aktivierung
von Thrombozyten bewirkt. Faktor XI (FXI) und der von den aktivierten
Thrombozyten freigesetzte Faktor V (FV) werden ebenfalls durch Thrombin
aktiviert.
3. Propagation
Während der Propagation bilden FVIIIa und FIXa auf der Oberfläche aktivierter
Thrombozyten die intrinsische Tenase (FVIIIa-FIXa-Komplex). Der benötigte FIXa
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wird auf der Oberfläche der TF-exprimierenden Zelle gebildet. Von dieser kann er
zum aktivierten Thrombozyten diffundieren. Er wird durch TFPI gar nicht und
durch AT dabei nur gering inhibiert. FIXa wird zum großen Teil durch FXIa auf der
Oberfläche aktivierter Thrombozyten gebildet. Durch die intrinsische Tenase wird
wiederum FX aktiviert. Anschließend kommt es durch den Prothrombinase-
Komplex zur Aktivierung großer Mengen Prothrombin zu Thrombin („ Thrombin
burst“). Das Thrombin katalysiert nun die Aufspaltung von Fibrinogen zu Fibrin
und ermöglicht somit die Fibrinpolymerisation (8).
Zusätzlich wird der Faktor XIII (FXIII) durch das Thrombin aktiviert. Dies geschieht
durch eine hydrolytische Abspaltung vom N-terminalen Ende der A-Untereinheit.
Unter Anwesenheit von Ca2+ erfolgt die Abspaltung der B- Untereinheit mit
anschließender Bindung an die αC Region des Fibrinmoleküls. Als
Transglutaminase bewirkt der FXIIIa so die Quervernetzung des Fibrins und
stabilisiert das Gerinnsel (9).
2.2 Die Rolle des Thrombin im Rahmen der Thrombozytenaktiverung/
-vernetzung
Die durch die Endothelverletzung freigelegten Kollagenfibrillen werden durch den
vWF markiert. So wird eine Bindung zwischen dem Endothel und Glycoprotein Ib-
Rezeptor (GPIb) der Thrombozyten vermittelt. Die Aktivierung der Thrombozyten
geschieht ebenfalls durch Thrombin über Protease aktivierende Rezeptoren.
Durch Degranulation der α-Granula kommt es anschließend zur Ausschüttung
der Gerinnungsfaktoren FVIII, FV, Fibrinogen sowie von Fibronectin und dem
Platelet-derived growth factor (PDGF). Aus den δ-Granula werden zudem ADP,
Thromboxan-A2 sowie Calcium und Serotonin freigesetzt. Die Bindung von ADP
und TXA2 an thrombozytären Rezeptoren führt im Rahmen eines positiven
feedback Loops zu einer weiteren Aktivierungsverstärkung mit
Konformationsänderung des membranständigen Fibrinogen-Rezeptors (αII ß3).
Die nun hohe Affinität für Fibrin stellt die Basis für die spätere Aggregation der
Thrombozyten dar. Außerdem führt sie zu einer Orientierungsänderung der
Thrombozytenmembran („Flip-Flop-Mechanismus“). An die dadurch nach außen
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gerichteten negativ geladenen Phospholipide lagern sich Calcium-abhängig
Gerinnungsfaktoren an. Dies bildet die Grundlage für den auf der
Thrombozytenoberfläche stattfindenden Thrombin burst (10, 11).
2.3 Gegenregulation des prokoagulatorischen Systems
Das Antithrombin -Heparan System
Das AT hemmt nach der Aktivierung durch Heparansulfate (Proteoglycane) an
der Endotheloberfläche die Aktivität der Faktoren IIa, Xa, IXa, XIa, XIIa. Durch
Bindung von AT an Heparan wird eine Konformationsänderung induziert und die
Aktivität z.B. gegen Thrombin um das 750-Fache gesteigert (10, 12).
Das Protein C - Thrombomodulin-System
Trombomodulin ist ein Thrombin-bindendes Protein, welches an der Oberfläche
von Endothelzellen lokalisiert ist. Durch die Bindung an Thrombomodulin wird das
Thrombin vom prokoagulanten zum antikoagulanten Eiweiß umgewandelt. Weiter
wird über den Thrombin-Thrombomodulin Komplex (TTM-Komplex) der Thrombin
activatable fibrinolysis inhibior (TAFI) aktiviert. Dieser verhindert die Auflösung
des bereits gebildeten Gerinnsels. Der TTM-Komplex aktiviert zudem die
Serinprotease Protein C (Prot.C), welche die Gerinnungsfaktoren FVa und FVIIIa
inaktiviert. Zudem hemmt Prot. C den Plasminogen-Aktivator- Inhibitor (PAI), was
die Firbinolyse begünstigt (10, 12).
Fibrinolyse
Die Fibrinolyse beschreibt den Abbau des gebildeten Gerinnsels.
Gewebsplasminogenaktivator (t-PA) ist an Endothelzellen gebunden und wird
durch Thrombin freigesetzt. Aufgrund seiner hohen Affinität zu Fibrin wird t-PA
selektiv dort aus dem Endothel freigesetzt, wo sich Thromben gebildet haben. In
Anwesenheit von Fibrin binden t-PA und Plasminogen an den Thrombus. Durch
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die Komplexbildung kommt es zur Plasminogenaktivierung und damit zur
Fibrinolyse (10, 11).
2.4 Grundlagen und Funktionsweisen der verwendeten
Gerinnungsanalysen
Trombingenerierungsassays und deren Entwicklung
Methoden zur Bestimmung der Thrombingenerierung messen die Fähigkeit einer
Plasmaprobe, nach in vitro Aktivierung, Thrombin zu generieren. Die
Thrombingenerierungskurve reflektiert und integriert alle pro- und
antikoagulatorischen Reaktionen, welche die Thrombinformation und Hemmung
regulieren.
Da Thrombin das zentrale Enzym des Koagulationsprozesses darstellt, haben
Analysen der Thrombingenerierung grundsätzlich das Potential, die plasmatische
Gerinnung zu charakterisieren.
Der erste Thrombingenerierungstest wurde 1935 durch Harry Eagle beschrieben (13)
und durch Macfarlane und Biggs 1953 weiterentwickelt. Hier wurde die Fähigkeit der
Gerinnselbildung aus Fibrinogen in Teilproben einer zuvor aktivierten Plasmaprobe
untersucht. Daraus wurde dann die Thrombingenerierung abgeleitet (14). Dies war
zum einen eine aufwendige, zum anderen sehr ungenaue Methode.
Calibrated Automated Thrombography (CAT)
Die von Hemker et. al. entwickelte Methode arbeitet mit einem fluorogenen Substrat
(Z-Gly-Gly-Arg-AMC) mit niedriger Affinität zu Thrombin. Der Test wird auf einer
Microtiterplatte durchgeführt und die Floureszenzwerte werden von einer speziellen
Software direkt in Thrombingenerierungskurven konvertiert (15, 16). Um die
Koagulation zu starten, werden der Plasmaprobe TF und synthetische Phospholipide
sowie das fluorogene Substrat mit CaCl2 gemischt zugesetzt. Im Gegensatz zu
chromogenen Methoden stört die bei der Gerinnselbildung entstehende Trübung im
Plasma das Floureszenzsignal nicht. Die Untersuchung kann daher in nicht
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defibriniertem, plättchenarmem oder plättchenreichem Plasma durchgeführt werden
(17). Zur Korrektur “innerer“ Filtereffekte (z.B.: Auslöschung des Floureszenzsignals
durch bereits umgesetzte Substratmoleküle; Ausgleich der individuell
unterschiedlichen Plasmafärbung) muss immer eine adäquate Kalibrierung erfolgen.
Jeder CAT-Test benötigt demnach zwei Floureszenz- Messungen der gleichen
Plasmaprobe. Der zur Kalibrierung benutzten Plasmaprobe wird dabei ein
Thrombinkalibrator zugesetzt, ohne die Gerinnung zu aktivieren. Der Kalibrator
besteht aus einer bekannten Menge Thrombin, gebunden an α2-Makroglobulin (α2M-
Thrombin). In dieser Form kann Thrombin nicht durch Plasma Protease-Inhibitoren
inhibiert werden. Im Kalibrationsansatz wird das Substrat konstant vom Thrombin
umgewandelt. Der Anstieg der Kurve liefert somit den Kalibrationsfaktor, welcher für
die Umrechnung von Flouroszenzeinheiten in die Thrombinkonzentration notwendig
ist (18).
Aufgrund innerer Filtereffekte und zunehmendem Substratverbrauch weicht das
Flouroszenzsignal zunehmend von einem linearen Verlauf ab. Die Abweichung von
der linearen Kurve im Kalibrationsansatz wird durch die Software erfasst und im
Messansatz dementsprechend korrigiert. Das durch α2M-Thrombin generierte
Flouroszenzsignal wird mithilfe eines mathematischen Algorithmus herausgerechnet
(16).
Die Thrombingenerierungskurve erhält man durch die 1. Ableitung des korrigiert
aufgezeichneten Floureszenzsignals (Abb. 4).
Parameter der CAT- Analyse
Lag Time (min): definiert als Zeit vom Start der Reaktion bis 1/6 der Peak Thrombin
Konzentration erreicht ist.
Time to Peak (min): Zeit vom Start der Reaktion bis zum Zeitpunkt der maximalen
Thrombingenerierung.
Thrombin Peak (nM): Maximale Thrombinkonzentration
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Endogenes Thrombin Potential (nM·min): Fläche unterhalb der Kurve. Es
repräsentiert die gesamte vom Thrombin geleistete enzymatische Arbeit, von seiner
Aktivierung bis zur kompletten Deaktivierung.
Grundsätzlich zeigen eine verlängerte lag Time sowie ein erniedrigter Thrombin Peak
und ETP einen hypokoagualtorischen Status an. Im Gegensatz dazu repräsentieren
verkürzte Lag time sowie hoher Peak und ETP einen hyperkoagulatorischen Status.
Plasmapräparation für PPP und PRP-Ansätze
PPP wird durch Zentrifugation einer Vollblutprobe hergestellt. Dabei ist das
zweimalige Zentrifugieren von entscheidender Bedeutung, da nach nur einmaliger
Zentrifugierung Plättchen und Mikropartikel zurückbleiben und die
Thrombingenerierung beeinflussen (19). Bei der Herstellung von PRP muss zur
Vergleichbarkeit die Plättchenzahl justiert werden. In der Praxis wird das PRP auf
100x103 bzw. 150x103 Plättchen pro µl eingestellt (20–22). Dies wird durch die
Abbildung 4: Typische Thrombin Generierungskurve einer Messung mit Flouroskan
Ascent
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Zugabe von autologem, Hitze-inaktiviertem PPP, welches somit ohne Aktivität von
Gerinnungsfaktoren ist, erreicht.
Einflussfaktoren auf die Thrombingenerierung durch unterschiedliche
experimentelle Ansätze
TF-Konzentration
Die Menge des zur Aktivierung zugesetzten TF bedingt z.B. den Anteil der
intrinsischen Kaskade an der Thrombingenerierung. Je niedriger die TF
Konzentration gewählt wird, desto höher ist der Einfluss der Kontaktaktivierung (5).
Die Zugabe von Corn Trypsin Inhibitor (CTI) als Inhibitor des FXIIa sollte daher die
Kontaktaktivierung inhibieren. Es konnte allerdings gezeigt werden, dass dies für TF
Konzentrationen >1pM nicht notwendig ist (23).
Des Weiteren ändern sich durch die Konzentration des TF die Determinanten der
Thrombingenerierung. So sind bei einer niedrigen TF Konzentration (1 pM) die
stärksten Determinanten des ETP Fibrinogen und der TFPI. Bei hoher Konzentration
(13 pM) sind dies jedoch Prothrombin und AT (24).
Ab TF-Konzentrationen von 10 pM kann durch eine weitere Erhöhung keine
Zunahme des ETP erreicht werden. Auch eine Differenzierung zwischen Hämophilie-
Patienten und gesunden Kontrollen ist hier nicht mehr sicher möglich (25, 26). In
Studien konnte bei TF-Konzentrationen von 5 pM eine gute Sensitivität in der
Unterscheidung zwischen Blutern und Gesunden gezeigt werden. In anderen
Untersuchungen zeigten niedrige TF-Konzentrationen unter Zusatz von
Thrombomodulin die beste Differenzierung zwischen gesunden Probanden und
Patienten nach einer Thrombose (27).
Thrombomodulin (TM) und aktiviertes Protein C
TM oder aktiviertes Protein C (APC) können dem Ansatz hinzugefügt werden, um die
Sensitivität des Verfahrens gegenüber dem physiologischen antikoagualtorischen
Protein C-System zu erhöhen. Dies ist besonders bei Zuständen mit gestörter
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physiologischer Antikoagulation, wie Sepsis, Leberinsuffizienz oder Thrombophilie
nützlich (28, 29).
Weitere Einflussfaktoren auf die Thrombingenerierung
Die Thrombingenerierung, gemessen mittels CAT, kann auch durch biologische
Variablen wie Alter (30, 31), Geschlecht (24), körperliche Konstitution (32),
genetische Faktoren (33, 34) sowie erworbene Faktoren (Schwangerschaft, orale
Antikonzeptiva) (35, 36) beeinflusst werden.
Einsatz von CAT in der Forschung und in der klinischen Routine
CAT wurde und wird in einer Reihe von Fragestellungen eingesetzt. So wurde es
beispielsweise zur Charakterisierung der Hämostase nach einer tiefen
Venenthrombose angewandt (27). Es wurde außerdem zur Detektion von
Faktorenmangel (16) und Hyperkoagulabilität (25) eingesetzt.
Thrombingenerierungsassays spielen zunehmend eine Rolle in der Diagnose,
Verlaufsbeobachtung und im Management von Hämophilie-Patienten (37). Sie
unterstützen zudem bei der Erklärung verschiedener Blutungsphänotypen bei
Hämophilie A (38). Weiter konnte gezeigt werden, dass CAT im perioperativen
Management von Patienten mit Blutungsdiathesen sowohl für das Monitoring sowie
für die Überwachung von Effekten von Blutprodukten geeignet sein kann (39).
Die Rotationsthromboelastometrie (ROTEM):
Die Grundlagen der Rotationsthromboelastometrie wurden bereits 1948 durch Hartert
gelegt (40). In den 90er Jahren wurde das System weiterentwickelt und schließlich
unter dem Namen ROTEM patentiert.
Messprinzip:
Die zu analysierende Probe (Plasma oder Vollblut) und das jeweilige Startreagenz
werden in eine vorgewärmte Küvette (37°C) pipettiert. Dann wird ein zylindrischer
Stempel in die Küvette eingetaucht. Es verbleibt ein Spalt von 1 mm zwischen
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Stempel und Küvette. Dieser wird durch die Probe oder das sich bildende Gerinnsel
überbrückt. Mittels einer Feder wird der Stempel abwechselnd nach rechts und links
gedreht (4,75°). Bei flüssigem Blut ist diese Bewegung ungehindert. Sobald das Blut
gerinnt, hemmt das Gerinnsel die Drehung des Stempels. Somit ist die Drehung des
Stempels umgekehrt proportional zur Gerinnselfestigkeit. Eine Lichtquelle nimmt die
Änderung der Stempelauslenkung auf und über einen an das Messsystem
angeschlossenen Computer wird das Signal digital umgewandelt. Mit Hilfe einer
entsprechenden Software wird das digitale Signal dann graphisch umgesetzt. Eine
Heizung hält die Temperatur während der Messung konstant bei 37°C (Abb. 5).
Parameter der ROTEM Analyse:
Cloting time (CT= Gerinnungszeit): Zeit vom Beginn der Messung bis die
Gerinnung einsetzt-> Gerinnungsaktivierung, Thrombinbildung, Beginn der
Gerinnselpolymerisation.
A
A
B
B
Abbildung 5: A: Prinzip der ROTEM Messung B: typische Kurve einer ROTEM
Analyse mit abgeleiteten Parametern
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Clot formation time (CFT = Gerinnselbildungszeit): Zeit ab dem Beginn der
Gerinnung bis eine Gerinnselfestigkeit von 20 mm erreicht ist. ->
Fibrinpolymerisation, Verfestigung des Gerinnsels durch Thrombozyten und FXIII.
Maximum clot firmness (MCF = Gerinnselfestigkeit): Maximale mechanische
Ausprägung des Gerinnsels -> Zunehmende Verfestigung des Gerinnsels durch
polymerisiertes Fibrin, Thrombozyten sowie durch FXIII.
Alpha angle (α): ergibt sich durch den Winkel zwischen Mittellinie und einer
Tangente an die ROTEM Kurve durch den 2 mm Amplituden Punkt. -> Beschreibt die
Kinetik der Gerinnselbildung, reflekitert die Phase der Thrombingenerierung.
Maxiumum lysis (ML = Maximale Lyse): Ausprägung der Gerinnsellyse in % vom
MCF
Unterschiedliche Testansätze der ROTEM Analyse
NATEM (Not acitvated-TEM): Zur Messung erfolgt lediglich die Recalcifizierung von
Citratblut oder Plasma. Der Aktivator ist der Kontakt der Probe mit der Küvette oder
dem Stempel. Die Probe bleibt damit gegenüber nahezu allen
Gleichgewichtsänderungen des Gerinnungssystems sensitiv. Da die Gerinnung über
Kontakt aktiviert wird ist sie etwa 10x zeitaufwendiger als z.B. die EXTEM Analyse.
EXTEM (Extrinsische Gerinnungskaskade- TEM): Die Gerinnung wird mittels TF
aktiviert. Dies führt innerhalb 70 sec. zum Beginn der Gerinnselbildung. Somit kann
innerhalb von 10 Minuten die Gerinnselbildung beurteilt werden. Erfasst werden FVII,
FX, FV, FII, FI, Thrombozyten, Fibrinolyse.
INTEM (Intrinsische Gerinnungskaskade- TEM): Die Gerinnung wird über die
Kontaktphase aktiviert. (wie aPTT und CT). Das INTEM ist damit empfindlich auf
Faktorenmängel, die dem Intrinsischen System zugeordnet werden. Zudem ist der
Testansatz sensibel auf die Heparin-Wirkung. Erfasst werden FXII, FXI, FIX, FVIII,
FX, FV, FII, FI, Thrombozyten, Fibrinolyse.
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FIBTEM: Die Aktivierung ist gleich der im EXTEM. Durch die Zugabe von
Cytochalasin D werden Thrombozyten blockiert. Das entstehende Gerinnsel ist nur
von der Fibrinbildung und Polymerisation abhängig.
APTEM: Aktivierung wie EXTEM. Durch Zugabe von Aprotinin werden fibrinolytische
Prozesse in vitro gehemmt. Ein Vergleich zum EXTEM erlaubt eine schnellere
Detektion der Fibrinolyse.
HEPTEM: Aktivierung wie INTEM. Durch Heparinase wird in der Probe vorhandenes
Heparin abgebaut und somit die ROTEM Analyse bei voll heparinisierten Patienten
ermöglicht. (41, 42)
Limitationen
Das ROTEM wird standardmäßig bei 37°C durchgeführt. Gerinnungsstörungen, die
durch Hypothermie entstehen, können daher nicht optimal erfasst werden.
Thrombozytenhemmende Medikamente werden zudem nur in supratherapeutischen
Dosen erfasst, da durch die Zugabe von Thrombin die plätchenhemmende Wirkung
überlagert wird (43). Eine ROTEM-Analyse kann, trotz vorhandener Antikoagulation
mit Vitamin K Antagonisten, oder niedermolekularen Heparinen, eine normwertige
Kurve annehmen. Zudem wird ein Mangel an vWF nicht erfasst. Für diese
Fragestellungen sind zusätzliche Tests notwendig (41).
Einsatz von ROTEM in Forschung und in der klinischen Routine
ROTEM wird bei chirurgischen Eingriffen mit zu erwartendem hohen Blutverlust oder
Gerinnungsproblemen sowie notwendiger Antikoagulation unterschiedlich eingesetzt
(43). Einige Autoren berichten über ein effektives Management von Blutprodukten (3,
44) und damit verbunden ein effektives Kostenmanagement (45, 46). Weiter wird
durch einige Arbeitsgruppen versucht, ROTEM im Management von Hämophilie-
Patienten zu implementieren (47). Als präoperativer Screening-Test findet bisher
keine routinemäßige Anwendung statt.
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3. Ableitung der Rationale für diese Studie
CAT ist ein Thrombingenerierungsassay, der das koagulatorische Potential einer
Person abbildet. Viele Arbeiten haben gezeigt, dass dieses Verfahren zur
Beurteilung von Blutungsdiathesen (26, 37, 48–50), thrombophilen Zuständen (27,
51) und zum Monitoring einer Antikoagulation (52, 53) geeignet sein kann. Eine
breite Indikation zur klinischen Anwendung erfolgte bisher jedoch noch nicht.
Die Rotationsthromboelastometrie beurteilt das koagulatorische Potential im Vollblut.
Bisher findet diese Methode vor allem in der Kardiochirurgie, Traumatologie und
Lebertransplantation ihren Einsatz. Hier konnte bereits gezeigt werden, dass durch
den Einsatz von ROTEM Blutprodukte gezielt eingesetzt werden können und so zu
einem effektiveren Gerinnungsmanagement führen (44).
Bis zum jetzigen Zeitpunkt gibt es in der Literatur keine Gegenüberstellung der
beiden oben beschriebenen Testverfahren und somit keine Information, ob ein
kombinierter Einsatz einen zusätzlichen Erkenntnisgewinn in der Beurteilung des
koagulatorischen Potentials eines Patienten liefern könnte.
Zudem liegen bis zum Zeitpunkt der Veröffentlichung kaum Daten über die
altersabhängige Entwicklung der Thrombingenerierung gemessen via CAT in
höheren Altersgruppen >65 Jahren vor. Eine Studie untersuchte vornehmlich Kinder
und junge Erwachsene (30), eine zweite untersuchte nur eine sehr kleine Zahl
gesunder erwachsener Probanden (31). Die ältere Population ist aber gerade im
klinischen Alltag die wohl am größten wachsende Patientengruppe in den
Industrienationen. Anders als bei CAT konnten für ROTEM im Rahmen einer
multizentrische Studie Referenzwerte für die in der Klinik häufig angewendeten
Testansätze (EXTEM, INTEM, APTEM, FIBTEM) festgelegt werden (54). Für den
verwendeten NATEM Ansatz liegt zum Zeitpunkt der Veröffentlichung keine Analyse
an gesunden Probanden vor. In der Literatur finden sich nur wenige, kleine,
bezüglich Alter und Geschlecht nicht homogen verteilte Patientenkollektive (55). Da
der nicht aktivierte Testansatz (NATEM) gegenüber möglichst vielen
Gleichgewichtsstörungen des Gerinnungssystems sensitiv bleibt (42), sind
Normalwerte auch für diesen Ansatz von klinischen und akademischen Interesse.
.
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Die vorliegende Arbeit ist Teil eines Projektes, in dem beide oben genannte
Testverfahren auf ihre Aussagekraft bezüglich präoperativer
Gerinnungscharakterisierung bei elektiven chirurgischen Eingriffen untersucht
werden sollen. In dieser Arbeit werden CAT und ROTEM auf ggf. gegebene
Zusammenhänge an gesunden Erwachsenen mit einer breiter Altersverteilung
untersucht, um eine erste Aussage über die Güte anschließender Vergleiche dieser
globalen Tests in Bezug auf den Gerinnungsstatus des Einzelnen zu erhalten.
4. Publikation: Thrombin generation and Rotational Thromboelastometry in the
healthy adult population
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5. Zusammenfassung der Arbeit:
Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades
Dr. med.
Thrombingenerierung und Rotationsthromboelastometrie bei gesunden
Erwachsenen
Eingereicht von:
Tobias Schneider 06.05.1981 Ahlen Westf.
Angefertigt in der Abteilung für Interdisziplinäre Internistische Intensivmedizin und
Zentrum für Hämostaseologie des Universitätsklinikum Leipzig AöR
Betreut von:
PD Dr. med. Sirak Petros (Leiter Interdisziplinäre Internistische Intensivmedizin und
Zentrum für Hämostaseologie, Universitätsklinikum Leipzig)
Die beiden in der Studie untersuchten Verfahren CAT und ROTEM bieten durch die
Abbildung der Gerinnungsphasen Initiation, Amplifikation und Propagation ein
umfassendes Bild der Gerinnung. Die Tests im Einzelnen oder deren Kombination
könnten daher in der Ermittlung des koagulatorischen Phänotypen eines Patienten
ihren Beitrag leisten. Es gibt bisher allerdings nur wenige Studien zur Korrelation
zwischen den Parametern der Thrombingenerierung und der Thrombelastometrie am
Gesunden. Zudem wurde die Thrombingenerierung bisher nur in kleinen Gruppen
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untersucht, wobei gesunde ältere Probanden meist in kleiner Zahl eingeschlossen
wurden.
Ziel der Studie war es daher die Thrombingenerierung in plätchenarmen Plasma an
gesunden Erwachsenen zu untersuchen, und die Daten mit der klassischen
Rotationsthromboelastometrie zu vergleichen. Die Probanden wurden dafür mit Hilfe
eines bezüglich Vorerkrankungen, Medikamentenanamnese und Blutungsdiathese
detaillierten Fragebogens ausgewählt.
Die Thrombingenerierung wurde in plätchenarmen Plasma mittels Calibrated
Automated Thrombogram (CAT) mit 1 und 5 pM Gewebsfaktorkonzentration
durchgeführt. Die Parameter lag time, thrombin peak, time to thrombin peak und
endogenes Thrombinpotential (ETP) wurden ausgewertet. ROTEM wurde ohne
Aktivator (NATEM) durchgeführt und die Daten für Gerinnungszeit, Alpha Winkel,
Gerinnselbildungszeit und maximale Gerinnselfestigkeit dokumentiert und mit den
CAT-Werten korreliert.
Ergebnisse:
Die Ergebnisse der Studie wurden bereits veröffentlicht. Im folgenden Abschnitt
sollen diese nochmals zusammenfassend dargestellt werden.
Insgesamt wurden 132 Personen (72 Männer und 60 Frauen) mit einem medianen
Alter von 48 Jahren eingeschlossen. Eine signifikante positive nicht lineare
Korrelation für Alter versus lag time (p>0.001) und time to peak (p=0.001) und
nahezu lineare Korrelation für Alter versus thrombin peak (p=0.024) und ETP
(p=0.001) wurde beobachtet, allerdings mit einer moderaten Regressionssteigung. In
Bezug auf ROTEM gab es eine positive Korrelation zwischen Alter und maximaler
Gerinnselfestigkeit und Alpha-Winkel (p=0.001), jedoch eine negative Korrelation
zwischen Alter und Gerinnselzeit (p=0.039). Thrombin peak und ETP gemessen mit
5 pM TF-Konzentration zeigten eine signifikante Korrelation gegenüber maximaler
Gerinnselfestigkeit und Alpha-Winkel, allerdings ebenfalls mit einer moderaten
Regressionssteigung.
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Diskussion, Schlussfolgerungen und Ausblick
CAT Assays geben ein globales Bild über die Hämostase wieder. Spronk et. al
sowie Gerotziafas et al. konnten zwar eine gute intra- und interassay Variabilität von
<10% innerhalb ihres Labors nachweisen (20, 23), doch zeigt sich bis heute
zwischen einzelnen Laboren eine große Variabilität in den determinierenden
Parametern (56, 57). Diese große Variabilität verhinderte bisher auch große
multizentrische Studien. Zudem ist die Messmethode zwar benutzerfreundlich,
jedoch sehr störanfällig gegenüber Verunreinigung (z.B. Luftblasen beim Pipettieren)
sowie technischen und personellen Fehlern im Bereich der Präanalytik
(Probengewinnung und Verarbeitung). Durch Standardisierung der Präanalytik (58)
sowie der Messdurchführung, des Referenzplasmas und der verwendeten
Chemikalien (19) soll eine Vergleichbarkeit in Zukunft gegeben sein.
Die Messung im PRP geht noch immer mit einem erheblichen Arbeits- und
Zeitaufwand einher. Es ist anzunehmen, dass zwischen PRP und ROTEM eine
stärkere Korrelation zu erwarten wäre, da die Plättchenfunktion hier mit erfasst wird.
Dies legen die Ergebnisse von Johannson et al. nahe. Diese Autoren verglichen die
Thrombingenerierung gemessen mittels CAT mit ROTEG (dem ROTEM sehr
ähnliche Methode) in PRP bei einer kleinen Probenzahl. Die korrelierten Parameter
zeigten Regressionssteigungen zwischen 0.51 und 0.68 (59). Dennoch ist CAT in
PRP nach derzeitigem Stand in der Routine schwer umsetzbar.
Obwohl ein Vergleich zwischen CAT und EXTEM aufgrund des vordergründig
gleichen Aktivierungsweges und der häufigeren Verwendung von EXTEM gegenüber
NATEM in der Routine logisch erscheint, ist jedoch EXTEM ausschlich sensibel für
Störungen der extrinsischen Hämostase Komponenten (43). NATEM ist zudem
empfindlich auf Hämostasekomponenten außerhalb der extrinischen
Gerinnungskaskade (60).
Eine Korrelation zwischen Alter und Paramatern von CAT und ROTEM wurde bereits
in anderen Arbeiten beschrieben (30, 31, 54). In den bisherigen Arbeiten wurde
dieser Zusammenhang als linear dargestellt. Unsere Daten können einen solchen
linearen Verlauf jedoch nicht für alle Parameter bestätigen. Auch wenn die klinische
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Relevanz aufgrund der moderaten Entwicklung fraglich ist, hilft die neue Erkenntnis
beim Verständnis der Entwicklung der Hämostase im Alter. Die Gerinnungszeit
gemessen mit ROTEM zeigte in unseren Messungen eine leicht negative Korrelation
mit dem Alter. Eine Erklärung hierfür könnte sein, dass unsere Messungen über
Kontaktaktivierung durchgeführt wurden. So könnte ein im Alter ansteigender FVIII
(61) für die verkürzte Gerinnungszeit verantwortlich sein. Der Testansatz NATEM
wurde unseres Wissens bisher nicht bei einem derart großen Patientenkollektiv mit
entsprechender Altersverteilung untersucht. So kann durch unsere Arbeit ein Beitrag
zur Erstellung von Referenzwerten erreicht werden. Hier wären multizentrische
Studien in der Zukunft wünschenswert.
Dass eine Korrelation zwischen den CAT und ROTEM Parametern nur bei TF
Konzentration von 5 pM im CAT besteht, zeigt das die Manipulationen von Variablen
der Hämostase in vitro die Vergleichbarkeit verschiedener Testverfahren schwierig,
wenn nicht sogar unmöglich, macht.
Auch wenn signifikante Korrelationen zwischen den beiden Verfahren bestehen, ist
die Regressionssteigung sehr moderat. Dies muss bei der Interpretation von
gewonnenen Daten berücksichtigt werden. Ob sie sich gegenseitig ergänzendes
Potential besitzen, muss in weiteren Studien mit speziellen Fragestellungen
bezüglich Blutungen oder thrombotischen Ereignissen beantwortet werden.
Zwar schließt unsere Arbeit zum ersten Mal ältere Probanden höheren Alters in die
Untersuchung der Testverfahren ein, jedoch ist auch unsere Studie durch ihr
vergleichsweise kleines Patientenkollektiv in ihrer Aussagekraft limitiert.
Es benötigt weitere Forschung bezüglich der klinischen Konsequenzen, welche sich
aus von der Norm abweichenden Parametern in beiden Methoden ergeben. Dafür
wären multizentrische Studien mit entsprechend großen Patientenzahlen erforderlich.
Hier wäre eine präoperative Testung von Patienten von großem Interesse, um die
Parameter mit postoperativem Ausgang (Blutung oder Thromboembolierisiko) zu
vergleichen. Erste Arbeiten aus der Traumatologie zeigen, dass CAT hier ein
Potential haben könnte (62). Ähnliches gilt für das Gerinnungsmanagment von
Sepsispatienten. Bisherige Arbeiten zu diesem Thema sind durch ihre kleine
Probandenzahl in ihrer Aussage limitiert (29).
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Basierend auf unseren Ergebnissen ist die Implementierung der beiden Methoden in
die klinische Routine Diagnostik weiter fraglich. Unbestritten bleibt ihre Wertigkeit als
Behandlungs- und Behandlugskontrollmöglichkeit, bei der jeder Patient seine eigene
Kontrolle bildet.
6. Literaturverzeichnis
1. Chowdary P, Chowdhury P, Saayman AG, Paulus U, Findlay GP, Collins PW.
Efficacy of standard dose and 30 ml/kg fresh frozen plasma in correcting
laboratory parameters of haemostasis in critically ill patients. Br J Haematol
2004; 125(1):69–73.
2. Ewe K. Bleeding after liver biopsy does not correlate with indices of peripheral
coagulation. Dig Dis Sci 1981; 26(5):388–93.
3. Johansson PI, Stissing T, Bochsen L, Ostrowski SR. Thrombelastography and
tromboelastometry in assessing coagulopathy in trauma. Scand J Trauma
Resusc Emerg Med. 2009; 23:17–45.
4. Kozek-Langenecker SA. Perioperative coagulation monitoring. Best Pract Res
Clin Anaesthesiol. 2010; 24(1):27–40.
5. Castoldi E, Rosing J. Thrombin generation tests. Thromb Res 2011; 127 Suppl
3:21–5.
6. Koscielny J, Ziemer S, Radtke H, Schmutzler M, Pruss A, Sinha P et al. A
practical concept for preoperative identification of patients with impaired
primary hemostasis. Clin Appl Thromb Hemost 2004; 10(3):195–204.
7. Hoffman M, Monroe DM. A cell-based model of hemostasis. Thromb Haemost
2001; 85(6):958–65.
Dissertationsschrift Tobias Schneider
33
8. Hoffman M. A cell-based model of coagulation and the role of factor VIIa.
Blood Rev 2003; 17 Suppl 1:S1-5.
9. Smith KA, Pease RJ, Avery CA, Brown JM, Adamson PJ, Cooke EJ et al. The
activation peptide cleft exposed by thrombin cleavage of FXIII-A(2) contains a
recognition site for the fibrinogen α chain. Blood 2013; 121(11):2117–26.
10. Petrides PE, Heinrich PC, Löffler G, Petro W. Biochemie und Pathobiochemie.
8th ed. Berlin: Springer; 2007.
11. Pötzsch B, Müller-Berghaus G, Gawaz M, Hämostaseologie. 2nd ed. Berlin:
Springer Medizin; 2010.
12. Lehnert H, Aulitzky WE, Innere Medizin - essentials. 4th ed. Stuttgart: Thieme;
2006.
13. Eagle H. Studies on blood coagulation: II. The formation of fibrin from thrombin
and fibrinogen. J Gen Physiol 1935; 18(4):547–55.
14. Macfarlane RG, Biggs R. A thrombin generation test; the application in
haemophilia and thrombocytopenia. J Clin Pathol 1953; 6(1):3–8.
15. Hemker HC, Béguin S. Thrombin generation in plasma: its assessment via the
endogenous thrombin potential. Thromb Haemost 1995; 74(1):134–8.
16. Hemker HC, Giesen PL, Al Dieri R, Regnault V, de Smedt E, Wagenvoord R
et al. The calibrated automated thrombogram (CAT): a universal routine test
for hyper- and hypocoagulability. Pathophysiol Haemost Thromb 2002; 32(5-
6):249–53.
17. Hemker HC, Giesen PL, Ramjee M, Wagenvoord R, Béguin S. The
thrombogram: monitoring thrombin generation in platelet-rich plasma. Thromb
Haemost 2000; 83(4):589–91.
Dissertationsschrift Tobias Schneider
34
18. de Smedt E, Al Dieri R, Spronk HM, Hamulyak K, ten Cate H, Hemker HC.
The technique of measuring thrombin generation with fluorogenic substrates:
1. Necessity of adequate calibration. Thromb Haemost 2008; 100(2):343–9.
19. Dargaud Y, Wolberg AS, Luddington R, Regnault V, Spronk H, Baglin T et al.
Evaluation of a standardized protocol for thrombin generation measurement
using the calibrated automated thrombogram: an international multicentre
study. Thromb Res 2012; 130(6):929–34.
20. Gerotziafas GT, Depasse F, Busson J, Leflem L, Elalamy I, Samama MM.
Towards a standardization of thrombin generation assessment: the influence
of tissue factor, platelets and phospholipids concentration on the normal
values of Thrombogram-Thrombinoscope assay. Thromb J 2005; 3:16.
21. Pike GN, Cumming AM, Hay CR, Bolton-Maggs PH, Burthem J. Sample
conditions determine the ability of thrombin generation parameters to identify
bleeding phenotype in FXI deficiency. Blood 2015; 126(3):397–405.
22. Andreasen JB, Ravn HB, Hvas AM. Changes in thrombin generation in
children after cardiac surgery and ex-vivo response to blood products and
haemostatic agents. Blood Coagul Fibrinolysis 2015; Epub.
23. Spronk HM, Dielis AW, de Smedt E, van Oerle R, Fens D, Prins MH et al.
Assessment of thrombin generation II: Validation of the Calibrated Automated
Thrombogram in platelet-poor plasma in a clinical laboratory. Thromb
Haemost 2008; 100(2):362–4.
24. Dielis AW, Castoldi E, Spronk HM, van Oerle R, Hamulyák K, ten Cate H et al.
Coagulation factors and the protein C system as determinants of thrombin
generation in a normal population. J Thromb Haemost 2008; 6(1):125–31.
25. Chantarangkul V, Clerici M, Bressi C, Giesen PL, Tripodi A. Thrombin
generation assessed as endogenous thrombin potential in patients with hyper-
or hypo-coagulability. Haematologica 2003; 88(5):547–54.
Dissertationsschrift Tobias Schneider
35
26. Lewis SJ, Stephens E, Florou G, Macartney NJ, Hathaway LS, Knipping J et
al. Measurement of global haemostasis in severe haemophilia A following
factor VIII infusion. Br J Haematol 2007; 138(6):775–82.
27. ten Cate-Hoek, AJ, Dielis AW, Spronk HM, van Oerle R, Hamulyák K, Prins
MH et al. Thrombin generation in patients after acute deep-vein thrombosis.
Thromb Haemost 2008; 100(2):240–5.
28. Dargaud Y, Trzeciak MC, Bordet JC, Ninet J, Negrier C. Use of calibrated
automated thrombinography +/- thrombomodulin to recognise the
prothrombotic phenotype. Thromb Haemost 2006; 96(5):562–7.
29. Petros S, Kliem P, Siegemund T, Siegemund R. Thrombin generation in
severe sepsis. Thromb Res 2012; 129(6):797–800.
30. Haidl H, Cimenti C, Leschnik B, Zach D, Muntean W. Age-dependency of
thrombin generation measured by means of calibrated automated
thrombography (CAT). Thromb Haemost 2006; 95(5):772–5.
31. Filippin L, Debaugnies F, Noubouossié D, Lê PQ, Ferster A, Demulder A.
Thrombin generation Test: establishment of reference values according to age
and tissue factor concentration is essential before implementation into the
laboratory. Rev Med Brux 2011; 32(2):69–73.
32. Beijers HJ, Ferreira I, Spronk HM, Bravenboer B, Dekker JM, Nijpels G et al.
Body composition as determinant of thrombin generation in plasma: the Hoorn
study. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2010; 30(12):2639–47.
33. Lincz LF, Lonergan A, Scorgie FE, Rowlings P, Gibson R, Lawrie A et al.
Endogenous thrombin potential for predicting risk of venous thromboembolism
in carriers of factor V Leiden. Pathophysiol Haemost Thromb 2006; 35(6):435–
9.
Dissertationsschrift Tobias Schneider
36
34. Eichinger S, Hron G, Kollars M, Kyrle PA. Prediction of recurrent venous
thromboembolism by endogenous thrombin potential and D-dimer. Clin Chem
2008; 54(12):2042–8.
35. Rosenkranz A, Hiden M, Leschnik B, Weiss EC, Schlembach D, Lang U et al.
Calibrated automated thrombin generation in normal uncomplicated
pregnancy. Thromb Haemost 2008; 99(2):331–7.
36. Tchaikovski SN, van Vliet HA, Thomassen MC, Bertina RM, Rosendaal FR,
Sandset PM et al. Effect of oral contraceptives on thrombin generation
measured via calibrated automated thrombography. Thromb Haemost 2007;
98(6):1350–6.
37. Luna-Záizar H, Beltrán-Miranda CP, Esparza-Flores MA, Soto-Padilla J,
Bergés-García A, Rodríguez-Zepeda M, et al. Thrombin generation as
objective parameter of treatment response in patients with severe haemophilia
A and high-titre inhibitors. Haemophilia 2014; 20(1):7–14.
38. Trossaërt M, Regnault V, Sigaud M, Boisseau P, Fressinaud E, Lecompte T.
Mild hemophilia A with factor VIII assay discrepancy: using thrombin
generation assay to assess the bleeding phenotype. J Thromb Haemost 2008;
6(3):486–93.
39. Petros S, Siegemund T, Stolzenburg J, Siegemund A, Engelmann L.
Coagulation monitoring with thrombin generation test during endoscopic
extraperitoneal radical prostatectomy for prostate cancer in a patient with
severe haemophilia B. Haemophilia 2007; 13(5):677–9.
40. Hartert H. Blutgerinnugsstudien mit der Thrombelastometrie, einem neuen
Untersuchungsverfahren. Klin Wochenschr. 1948; (16):257–60.
41. Calatzis A, Spannagl M, Vorweg M. Leitfaden ROTEM® Analyse. München:
Tem Innovations GmbH; 2013.
Dissertationsschrift Tobias Schneider
37
42. Ebinger T, de Pijper Chris. rotem.de: Tem International GmbH; 2014.
Available from: URL: http://www.rotem.de/. Download: 03.02.2015
43. Bolliger D, Seeberger MD, Tanaka KA. Principles and practice of
thromboelastography in clinical coagulation management and transfusion
practice. Transfus Med Rev 2012; 26(1):1–13.
44. Lier H, Vorweg M, Hanke A, Görlinger K. Thromboelastometry guided therapy
of severe bleeding. Hamostaseologie 2013; 33(1):51–61.
45. Spalding GJ, Hartrumpf M, Sierig T, Oesberg N, Kirschke CG, Albes JM. Cost
reduction of perioperative coagulation management in cardiac surgery: value
of "bedside" thrombelastography (ROTEM). Eur J Cardiothorac Surg 2007;
31(6):1052–7.
46. Weber CF, Görlinger K, Meininger D, Herrmann E, Bingold T, Moritz A et al.
Point-of-care testing: a prospective, randomized clinical trial of efficacy in
coagulopathic cardiac surgery patients. Anesthesiology 2012; 117(3):531–47.
47. Young G, Sørensen B, Dargaud Y, Negrier C, Brummel-Ziedins K, Key NS.
Thrombin generation and whole blood viscoelastic assays in the management
of hemophilia: current state of art and future perspectives. Blood 2013;
121(11):1944–50.
48. Al Dieri R, Peyvandi F, Santagostino E, Giansily M, Mannucci PM, Schved JF
et al. The thrombogram in rare inherited coagulation disorders: its relation to
clinical bleeding. Thromb Haemost 2002; 88(4):576–82.
49. Dargaud Y, Béguin S, Lienhart A, Al Dieri R, Trzeciak C, Bordet JC et al.
Evaluation of thrombin generating capacity in plasma from patients with
haemophilia A and B. Thromb Haemost 2005; 93(3):475–80.
50. Livnat T, Zivelin A, Tamarin I, Guetta V, Salomon O. Thrombin generation
assay as a possible tool for assessment of reduced activity of clotting factors
Dissertationsschrift Tobias Schneider
38
induced by antiphospholipid antibodies and in-vitro evaluation of treatment
options. Blood Coagul Fibrinolysis 2009; 20(8):661–6.
51. Tripodi A, Branchi A, Chantarangkul V, Clerici M, Merati G, Artoni A et al.
Hypercoagulability in patients with type 2 diabetes mellitus detected by a
thrombin generation assay. J. Thromb Thrombolysis 2011; 31(2):165–72.
52. al Dieri R, Alban S, Béguin S, Hemker HC. Thrombin generation for the control
of heparin treatment, comparison with the activated partial thromboplastin
time. J. Thromb Haemost 2004; 2(8):1395–401.
53. Gatt A, van Veen, JJ, Woolley AM, Kitchen S, Cooper P, Makris M. Thrombin
generation assays are superior to traditional tests in assessing anticoagulation
reversal in vitro. Thromb Haemost 2008; 100(2):350–5.
54. Lang T, Bauters A, Braun SL, Pötzsch B, von Pape KW, Kolde HJ et al. Multi-
centre investigation on reference ranges for ROTEM thromboelastometry.
Blood Coagul Fibrinolysis 2005; 16(4):301–10.
55. Daraktchiev AT. Evaluation eines neuen Thrombelastographie-Verfahrens-
ROTEM (Rotationsthrombelastometrie) [Univ., Diss.]. Marburg: Philipps-
Universität 2009.
56. Dargaud Y, Luddington R, Gray E, Negrier C, Lecompte T, Petros S et al.
Effect of standardization and normalization on imprecision of calibrated
automated thrombography: an international multicentre study. Br J Haematol
2007; 139(2):303–9.
57. Dargaud Y, Luddington R, Gray E, Lecompte T, Siegemund T, Baglin T et al.
Standardisation of thrombin generation test--which reference plasma for TGT?
An international multicentre study. Thromb Res 2010; 125(4):353–6.
Dissertationsschrift Tobias Schneider
39
58. Loeffen R, Kleinegris MC, Loubele ST, Pluijmen PH, Fens D, van Oerle R et
al. Preanalytic variables of thrombin generation: towards a standard procedure
and validation of the method. J. Thromb Haemost 2012; 10(12):2544–54.
59. Johansson PI, Svendsen MS, Salado J, Bochsen L, Kristensen AT.
Investigation of the thrombin-generating capacity, evaluated by thrombogram,
and clot formation evaluated by thrombelastography of platelets stored in the
blood bank for up to 7 days. Vox Sang 2008; 94(2):113–8.
60. Livnat T, Shenkman B, Martinowitz U, Zivelin A. The impact of thrombin
generation and rotation thromboelastometry on assessment of severity of
factor XI deficiency. Thromb Res 2015; 136:465–73.
61. Mari D, Coppola R, Provenzano R. Hemostasis factors and aging. Exp
Gerontol 2008; 43(2):66–73.
62. Cardenas JC, Rahbar E, Pommerening MJ, Baer LA, Matijevic N, Cotton BA
et al. Measuring thrombin generation as a tool for predicting hemostatic
potential and transfusion requirements following trauma. J Trauma Acute Care
Surg 2014; 77(6):839–45.
7. Quellenverzeichnis Abbildungen:
Abbildung 1: eigene Darstellung
Abbildung 2: Vortragsreihe Moderne Sicht der Hämostase, J. Kienast; IPS
Symposium St. Gallen 15.01. 2008
Abbildung 3: reproduziert aus INTECH open science: Infammation and acute phase
proteins in Haemostasis; 2013; Download intechopen.com: 03.04.2015; Dateiformat:
.jpg
Abbildung 4: Darstellung aus eigener Messreihe
Abbildung 5: rotem.de; Download: 01.07.2014 Dateiformat: .jpg
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8. Supplementäre Materialien
Darstellung der Parameter der Thrombingenerierung stratifiziert nach Altersgruppen:
Abbildung S1: Box plots für ETP und thrombin peak stratifiziert nach Altersgruppen (1=20-34 Jahre;
2=35-49 Jahre; 3=50-64 Jahre; 4=≥65 Jahre) und Geschlecht. A-C: ETP (gesamte Studienpopulation,
nur männliche Probanden, nur weibliche Probenden) D-F: thrombin peak (gesamte Studienpopulation,
nur männliche Probanden, nur weibliche Probenden). Signifikante Unterschiede sind durch Linien mit
den korrespondierenden p- Werten gekennzeichnet. p. Ø = kein signifikanter Unterschied
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Abbildung S2: Box plots für lag time und time to thrombin peak stratifiziert nach Altersgruppen (1=20-34 Jahre; 2=35-49
Jahre; 3=50-64 Jahre; 4=≥65 Jahre) und Geschlecht. A-C: lag time (gesamte Studienpopulation, nur männliche Probanden,
nur weibliche Probenden) D-F: time to thrombin peak (gesamte Studienpopulation, nur männliche Probanden, nur weibliche
Probenden). Signifikante Unterschiede sind durch Linien mit den korrespondierenden p- Werten gekennzeichnet. p. Ø = kein
signifikanter Unterschied
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Fragebogen zur Ermittlung Studien Ein-/Ausschluss:
Ein/Ausschluss:
1. Ist bei ihnen eine Gerinnungsstörung, Blutungsdiathese bekannt?
JA: NEIN:
2. Ist bei ihnen eine Thrombophilie diagnostiziert?
JA: NEIN:
3. Erhalten sie momentan eine Antikoagulationstherapie (blutverdünnende Medikamente), und
wenn ja, wurden diese für den bevorstehenden Eingriff abgesetzt?
JA: Nein: Abgesetzt: JA:
Nein:
Sind bei ihnen schon maligne Erkrankungen diagnostiziert worden / besteht aktuell eine maligne Erkrankung?
JA: Nein:
Blutungsrisiko:
1. Haben Sie bei sich selbst vermehrt Nasenbluten, auch ohne erkennbaren Grund, festgestellt?
JA: NEIN:
2. Treten oder traten bei Ihnen vermehrt - ohne sich anzustoßen - „blaue Flecke“ oder kleine,
punktförmige Blutungen auf ?
JA: NEIN:
Wenn „Ja“, geben Sie bitte an, ob diese Symptome
auch am Körperrumpf oder anderen, für Sie ungewöhnlichen Stellen aufgetreten sind?
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JA: NEIN:
3. Haben Sie bei sich selbst Zahnfleischbluten ohne erkennbaren Grund festgestellt?
JA: NEIN:
4. Treten Blutungen oder blaue Flecke
mehr als 1 bis 2 mal pro Woche,
JA: NEIN:
oder 1 bis 2 mal pro Woche,
JA: NEIN:
oder 1 bis 2 mal pro Monat auf?
JA: NEIN:
5. Haben Sie den Eindruck, dass es bei Schnitt- oder Schürfwunden (z.B. Rasieren)
länger nachblutet?
JA: NEIN:
6. Traten bei Ihnen bereits einmal längere und verstärkte Nachblutungen nach oder während
Operationen (z.B. Mandeloperationen, Blinddarmoperationen, Geburten) auf?
JA: NEIN:
7. Traten bei Ihnen längere und verstärkte Nachblutungen nach oder
während dem Ziehen von Zähnen auf?
JA: NEIN:
8. Wurden Ihnen bei einer Operation bereits einmal Blutkonserven oder Blutprodukte gegeben?
JA: NEIN:
Bitte geben Sie die Art der Operation(en) an: .............................................................................................
.............................................................................................
9. Gab oder gibt es in der Familie Fälle von Blutungsneigungen?
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JA: NEIN:
10. Nehmen Sie Schmerz- oder Rheumamittel ein?
JA: NEIN:
Wenn ja, bitte Namen der Medikamente eintragen:
.............................................................................................
.............................................................................................
11. Nehmen Sie weitere Medikamente oder Vitaminpräparate ein?
JA: NEIN:
Wenn ja, bitte Namen der Medikamente eintragen
.............................................................................................
.............................................................................................
12. Ist bei ihnen einmal eine Lungenembolie/Thrombose diagnostiziert worden?
JA: Nein:
Wenn ja bitte eintragen:
.............................................................................................
.............................................................................................
Folgende Frage ist nur von Frauen / Mädchen zu beantworten:
13. Haben Sie den Eindruck, dass Ihre Monatsblutungen verlängert (> 7 Tage)
und / oder verstärkt (häufiger Tampon Wechsel) sind?
JA: NEIN:
.............................................................................................
(Unterschrift, Datum)
9. Anhang:
Erklärung über die Eigenständige Abfassung der Arbeit:
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Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und ohne
unzulässige Hilfe oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel
angefertigt habe. Ich versichere, dass Dritte von mir weder unmittelbar noch mittelbar
geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten haben, die im Zusammenhang mit dem
Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen, und dass die vorgelegte Arbeit weder im
Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen
Prüfungsbehörde zum Zweck einer Promotion oder eines anderen
Prüfungsvefahrens vorgelegt wurde. Alles aus anderen Quellen und von anderen
Personen übernommene Material, das verwendet wurde, oder auf das direkt Bezug
genommen wird, wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle
Personen genannt, die direkt an der Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt
waren.
_____________ _________________
Datum Unterschrift
LEBENSLAUF
TOBIAS SCHNEIDER
Neudorferstraße 3, 79541 Lörrach | +4917975348 / +4976215104841 | [email protected] Geboren: 06.05.1981 Familienstand: verheiratet (seit 25.05.2013)
27.11.2015 T. Schneider
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BILDUNGSWEG
Paul Gerhardt Grundschule Ahlen
Qualifikation für das Gymnasium 1987 - 1991
St. Michael Gymnasium Ahlen
Abitur 1987 - 2000
Abiturfächer: Leistungskurse: Musik, Biologie
Grundkurse: Soziologie, Deutsch
St. Franziskus Hospital Ahlen 2000-2001
Zivildienst
Allgemein internistische Station
DRK Rettungsschule Münster / Berufsfeuerwehr Oelde 2001 - 2003
Ausbildung zum Rettungsassistent
Universität Leipzig 2003 -2010
Studium der Humanmedizin
BERUFLICHE TÄTIGKEITEN NEBEN DEM STUDIUM
Universität Leipzig
Studentische Hilfskraft in der Abteilung für Gastroenterologie Jan. 05 – Jan. 07
Universität Leipzig
Studentische Hilfskraft/ Wissenschaftlicher Mitarbeiter im Labor für Hämostase Jan. 07 – Jan. 09
BISHERIGE ASSISTENZÄRZLICHE TÄTIGKEIT
Kantonspital Laufen 2011 - 2012
01.01.2011- 28.02.2012 Assistenzarzt Klinik für Innere Medizin
Kantonspital Basel Land Standort Bruderholz und Liestal 2012 - 2015
01.04.2012- 31.03.2015 Assistenzarzt Klinik für Anästhesiologie
Universitätsspital Basel 2015 – offen
seit 01.05.2015 Assistenzarzt Anästhesie
FORTBILDUNGEN /FÄHIGKEITSNACHWEISE
NOTARZTKURS BERN 2013
FACHARZTPRÜFUNG ANÄSTHESIE 2015
SGNOR FACHKUNDE AUSWEISS NOTARZT 2015
Dissertationsschrift Tobias Schneider
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VERÖFFENTLICHUNGEN UND VORTRÄGE
CALIBRATED AUTOMATED THROMBOGRAPHY (CAT) IN PLATELET POOR PLASMA IN ADULTS
Poster Presentation, International Society on Thrombosis and
Hemostasis, Boston 2009
THROMBIN GENERATION AND ROTATIONAL THROMBELASTOMETRY IN
THE HEALTHY ADULT POPULATION
Original Artikel: Hämostasiologie Mai 2015 2015
SEVERE OPIOID WITHDRAWL SYNDROME AFTER A SINGLE DOSE OF NALMEFENE
Letter: European Journal of clinical pharmacology Mai 2015 2015
IT-KENTNISSE:
Microsoft Word/ Powerpoint: sicheres Arbeiten
Microsoft Excel/ Acces: sicheres Arbeiten
SPSS: selbstständiges Auswerten von Daten/ erstellen von Grafiken.
Sigma Plot: selbstständiges erstellen von Grafiken, statistischen
Auswertungen
SPRACHEN
Englisch – sprechen fließend, Lesen /Schreiben sicher
Französisch – sprechen Grundfertigkeiten
Latein – lesen (Latinum)
EHRENAMTLICHE TÄTIGKEITEN
Ehrenamtliche Arbeit als Rettungsassistent bei der Feuerwehr Oelde 2002-2005
HOBBYS / BESONDERE INTERESSEN
Musik: aktiv Gitarre und Klavier
Sport: Mountainbike, Fußball ( nicht mehr im Verein aktiv), Laufen, Fitness
Danksagung:
Mein Dank gilt denen, die mich bei dieser Arbeit betreut und unterstützt haben.
Zuerst meinem Betreuer PD Dr. Sirak Petros, der mir die Möglichkeit gegeben hat,
mich intensiv mit der spannenden Thematik der Hämostase auseinanderzusetzen.
Dissertationsschrift Tobias Schneider
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Besonderer Dank gebührt auch der Familie Siegemund (Annelie, Roland und
Thomas). Zum einen für die Unterstützung im Labor und zum anderen für ihren Input
beim Verfassen der Veröffentlichung sowie der Dissertation.
Ihnen allen sei besonders für die Geduld gedankt, die sie mit ihrem Doktoranden
aufgebracht haben. Trotz räumlicher Trennung, nach Beendigung meines Studiums
in Leipzig, wurde der Kontakt gehalten und das Projekt konnte abgeschlossen
werden.
Ich weiß, dass dies keine Selbstverständlichkeit ist.
Bedanken möchte ich mich bei allen Probanden, die an der Studie teilgenommen
haben, mir bereitwillig meinen Fragebogen beantwortet haben, mir ihr Blut geschenkt
und dabei die ein oder andere zusätzliche Punktion erduldet haben.
Großer Dank gebührt meinen Eltern, die mir ermöglicht haben ein Medizinstudium
aufzunehmen. Liebe Eltern, es war nicht ganz umsonst.
Zuletzt bedanke ich mich bei meiner lieben Frau Madeleine für ihre geduldige und
liebevolle Unterstützung.