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DIAsource ImmunoAssays S.A. - Rue du Bosquet, 2 - B-1348 Louvain-la-Neuve - Belgium

dsDNA-Ab RIA

KIPIB19011

Version : 200224/1

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Catalogue nr: KIPIB19011 Revision nr : 200224/1

dsDNA-Ab RIA en

KIPIB19011 Radio immunoassay for the in-vitro-diagnostic quantitative determination of antibodies

against dsDNA in human serum.

DIAsource ImmunoAssays SA - Rue du Bosquet 2, B-1348 Louvain-la-Neuve, Belgium - Tel: +32 10 84 99 11 - Fax : +32 10 84 99 90

INTENDED USE Radio immunoassay for the in-vitro diagnostic quantitative determination of antibodies against double-

stranded DNA (dsDNA) in human serum.

SUMMARY AND EXPLANATION The presence of antibodies to double-stranded DNA (dsDNA, native DNA) in serum is highly characteristic

for patients with SLE. It is important to quantitate the amount of antibody to dsDNA in order to differentiate

between SLE and closely related autoimmune diseases. Antibodies to dsDNA show a good correlation to the

disease activity.

Serial determinations of the amount of antibodies to dsDNA in the serum of individual patients treated for

SLE is therefore of important clinical use for the evaluation of therapy and to plan further therapeutic

measurements.

Antibodies to dsDNA normally do not appear in patient sera with drug-induced SLE. The measurement of

dsDNA antibodies in serum is helpful to decide whether the patient has a lupoid-drug reaction or real SLE.

TEST PRINCIPLE The dsDNA-Ab RIA provides a simple, accurate and precise means of estimating antibodies to dsDNA in

serum by measuring the free dsDNA binding capacity in the sample. 125I labelled dsDNA is added to the

sample. After incubation, separation is achieved by the addition of ammonium sulphate solution. Tubes are

centrifuged and supernatants carefully decanted. The tubes are then counted, the bound radioactivity being

directly proportional to the dsDNA binding capacity.

WARNINGS AND PRECAUTIONS 1. For in-vitro diagnostic use only. For professional use only.

2. Before starting the assay, read the instructions completely and carefully. Use the valid version of the

package insert provided with the kit. Be sure that everything is understood.

3. In case of severe damage of the kit package please contact DIAsource ImmunoAssays S.A. or your

supplier in written form, latest one week after receiving the kit. Do not use damaged components in test

runs, but keep safe for complaint related issues.

4. Obey lot number and expiry date. Do not mix reagents of different lots. Do not use expired reagents.

5. Follow good laboratory practice and safety guidelines. Wear lab coats, disposable latex gloves and

protective glasses where necessary.

6. Reagents of this kit containing hazardous material may cause eye and skin irritations. See MATERIALS

SUPPLIED and labels for details. Material Safety Data Sheets for this product are available on the

DIAsource ImmunoAssays S.A.-Homepage or upon request directly from DIAsource ImmunoAssays

S.A.

7. Chemicals and prepared or used reagents have to be treated as hazardous waste according to national

biohazard and safety guidelines or regulations.

8. This kit contains 125I (half-life: 60 days) , emitting ionizing X (28 keV) and γ (35.5 keV) radiations. This

kit contains radioactive material, to be received, acquired, possessed and used by physicians, laboratories

or hospitals only according to regulations and a specific license issued by the Nuclear Regulatory

Commission or issued by a state with which the Nuclear Regulatory Commission has entered into an

agreement for the exercise of regulatory authority.


9. Radioactive materials should be confined to specifically designated, regularly monitored areas in the

laboratory, restricted to authorised personnel. Use disposable labware and disposable absorbent bench

covers. Always wear film budges, lab coats and disposable gloves. Wipe up all spills immediately,

cleaning the contaminated area with a decontaminant and dispose the contaminated materials as

radioactive waste.

10. Some reagents contain thimerosal as preservative. In case of contact with eyes or skin, flush immediately

with water.

11. All reagents of this kit containing human serum or plasma have been tested and were found negative for

anti-HIV I/II, HBsAg and anti-HCV. However, a presence of these or other infectious agents cannot be

excluded absolutely and therefore reagents should be treated as potential biohazards in use and for

disposal.

12. Do not smoke, drink, eat or apply cosmetics in the working area. Do not pipette by mouth.

STORAGE AND STABILITY The kit is shipped at ambient temperature and should be stored at 2-8°C. Keep away from heat or direct sun

light. The storage and stability of specimen and prepared reagents is stated in the corresponding chapters.

SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE

Serum

The usual precautions for venipuncture should be observed. It is important to preserve the chemical integrity

of a blood specimen from the moment it is collected until it is assayed. Do not use grossly hemolytic, icteric

or grossly lipemic specimens. Samples appearing turbid should be centrifuged before testing to remove any

particulate material.

Storage: 2-8°C -20°C (Aliquots) Keep away from heat or direct sun light.

Avoid repeated freeze-thaw cycles. Stability: 48 h 6 mon

MATERIALS SUPPLIED

Quantity Symbol Component

2 x 7.5 mL

dsDNA 125I-Tracer Ready to use. Activity: < 37 kBq (1 µCi).

Contains: 125I-dsDNA, 0.01% Thimerosal.

1 x 6 x 0.25 mL

Calibrator 0-5, lyophilized Contains: dsDNA antibodies, Human serum, 0.01% Thimerosal. Exact concentrations see vial labels or QC certficate.

1 x 2 x 0.25 mL

Control 1+2, lyophilized Contains: dsDNA antibodies, Human serum.

Concentrations / acceptable ranges see QC Certificate.

1 x 2.5 mL Specimen Diluent, lyophilized Contains: Human serum, 0.01% Thimerosal.

2 x 50 mL Ammonium Sulfate Ready to use. Contains: Ammonium Sulfate, 0.01% Thimerosal.

MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED 1. Micropipettes (Multipette Eppendorf or similar devices, < 3% CV). Volume: 25; 150; 250; 1000 µL.

2. Round-bottom polystyrene test tubes (12 x 75 mm)

3. Rack to decant supernatants

4. Vortex mixer

5. Water bath, 37°C

6. Centrifuge (preferably refrigerated); 1500 x g

7. Gamma Counter

8. Bidistilled or deionised water

9. Paper towels, pipette tips and timer

125I Ag

N CAL

SPE DIL

CONTROL

AGENT PREC


PROCEDURE NOTES 1. Any improper handling of samples or modification of the test procedure may influence the results. The

indicated pipetting volumes, incubation times, temperatures and pretreatment steps have to be performed

strictly according to the instructions. Use calibrated pipettes and devices only.

2. Once the test has been started, all steps should be completed without interruption. Make sure that

required reagents, materials and devices are prepared ready at the appropriate time. Allow all reagents

and specimens to reach room temperature (18-25°C) and gently swirl each vial of liquid reagent and

sample before use. Mix reagents without foaming.

3. Avoid contamination of reagents, pipettes and wells/tubes. Use new disposable plastic pipette tips for

each component and specimen. Do not interchange caps. Always cap not used vials. Do not reuse

wells/tubes or reagents.

4. It is advised to determine samples in duplicate to be able to identify potential pipetting errors.

5. Labelling of all tubes is recommended.

6. The relative centrifugal force (g) is not equivalent to rounds per minute (rpm) but it has to be calculated

depending on the radius of the centrifuge.

PRE-TEST SETUP INSTRUCTIONS

Preparation of lyophilized or concentrated components Dilute / dissolve

Component with Diluent Remarks Storage Stability

250 µL bidist. water Cap and mix gently to dissolve.

Let stand for 10 min.

Mix without foaming.

-20°C (Aliquots)

9 w 250 µL bidist. water

2.5 mL bidist. water

Dilution of Samples Samples suspected to contain concentrations higher than the highest calibrator have to be diluted with

Specimen Diluent.

TEST PROCEDURE

The Ammonium Sulfate solution must be kept at 2-8°C until use.

1. Pipette 25 µL of each Calibrator, Control, sample and/or diluted sample into the respective tubes.

Leave two tubes empty for Total Activity (T).

2. Pipette 150 µL of dsDNA 125I-Tracer into each tube. Vortex.

3. Incubate 60 min at 37°C in a waterbath.

4. Pipette 1000 µL of cold Ammonium Sulfate into each tube. (Except T.) Vortex.

5. Centrifuge all tubes for 15 min at 1500 x g. (Except T.)

6. Decant the tubes carefully. Drain 10 min with blotting paper. (Except T.)

7. Count the tubes in a Gamma counter for 1 min. (Including T.)

QUALITY CONTROL The test results are only valid if the test has been performed following the instructions. Moreover the user

must strictly adhere to the rules of GLP (Good Laboratory Practice) or other applicable standards/laws. All

kit controls must be found within the acceptable ranges as stated on the labels and the QC certificate. If the

criteria are not met, the run is not valid and should be repeated. Each laboratory should use known samples

as further controls. It is recommended to participate at appropriate quality assessment trials.

In case of any deviation the following technical issues should be proven: Expiration dates of (prepared)

reagents, storage conditions, pipettes, devices, incubation conditions and washing methods.

N CAL

CONTROL

SPE DIL


CALCULATION OF RESULTS Plot a curve on semi-log graph with the corrected counts of the calibrators on the y-axis (linear) against the

corresponding concentration on the x-axis (logarithmic). The concentrations of the samples can be read

directly from this calibration curve.

Alternatively the percentage value of the counts of the calibrators and samples may be compared to the

counts of the highest calibrator.

Plot a curve of % B/Bmax of the calibrators for the calibrators (y-axis, linear) against the calibrator-

concentrations (x-axis, logarithmic) on semi-log graph paper.

A good fit is provided by automated methods like cubic spline, 4 Parameter Logistics or Logit-Log.

For the calculation of the calibration curve, apply each signal of the calibrators.

In case of diluted samples the values have to be multiplied with the corresponding dilution factor.

Samples showing concentrations above the highest calibrator have to be diluted as described in PRE-TEST

SETUP INSTRUCTIONS and reassayed.

Typical Calibration Curve

(Example. Do not use for calculation!)

Calibrator dsDNA

(IU/mL)

Mean

cpm

Corrected

cpm

B/Bmax

(%)

T 17494 17494

0 0 587 0 0

1 3 786 199 1.8

2 6 1182 596 5.4

3 12 2151 1564 14.2

4 24 5110 4523 41.1

5 80 11602 11015 100

EXPECTED VALUES The results themselves should not be the only reason for

any therapeutical consequences. They have to be correlated

to other clinical observations and diagnostic tests.

Apparently healthy subjects show the following values:

< 7 IU/mL (n = 590)

It is recommended that each laboratory establishes its own

range of normal values.

LIMITATIONS OF THE PROCEDURE Specimen collection has a significant effect on the test results. See SPECIMEN COLLECTION AND

STORAGE for details.

For cross-reactivities, see PERFORMANCE.

The following blood components do not have a significant effect (+/-20% of expected) on the test results up

to the below stated concentrations:

Hemoglobin 4.0 mg/mL

Bilirubin 0.5 mg/mL

Triglyceride 30 mg/mL

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

1 10 100 1000

CP

M

IU / mL

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0

20

40

60

80

100

dsDNA-Ab RIA Antibody [IU/mL]

n

% B/B max = cpm (Sample/Calibrator) – cpm (Calibrator zero) X 100 cpm (highest Calibrator) – cpm (Calibrator zero)


PERFORMANCE

Analytical Specificity

(Cross Reactivity)

No cross-reactivities were found with the following substances tested.

Substance Source Conc.

Rheumatoid arthritis serum WHO ≤ 100 IU/mL

Anti-nuclear ribonucleoprotein (nRNO) autoantibody WHO ≤ 1:2 Dilution

IgM class anti-nuclear antibody WHO ≤ 10 mg/mL

Glycoprotein C1q Calbiochem ≤ 500 µg/mL

Analytical Sensitivity

(Limit of Detection) 2.5 IU/mL Mean signal (Calibrator Zero) - 2SD

Precision Sample No. Mean ± SD

(IU/mL) CV (%)

Intra-Assay (n = 20)

1 6.51 ± 0.57 8.83

2 10.48 ± 0.48 4.59

3 23.00 ± 0.80 3.48

4 38.99 ± 0.87 2.22

Inter-Assay (n = 20)

1 3.81 ± 0.45 11.75

2 9.81 ± 0.82 8.32

3 23.74 ± 1.91 8.03

4 38.42 ± 1.48 3.84

5 21.49 ± 2.00 9.29

Linearity

Sample No. Dilution

Meas. Conc.

(IU/mL)

Expected Conc.

(IU/mL)

Recovery

(%)

1

1:2 44.64 - 100

1:4 22.37 22.32 100

1:8 10.49 11.16 94

1:16 5.44 5.58 97

1:32 3.24 2.79 116

1.64 1.93 1.40 138

2

1:2 43.02 - 100

1:4 22.98 21.51 107

1:8 10.52 10.76 98

1:16 5.10 5.38 95

1:32 2.54 2.69 95

1.64 1.20 1.34 89

3

1:4 79.78 - 100

1:8 39.90 39.89 100

1:16 19.88 19.95 100

1:32 10.70 9.97 107

1.64 6.17 4.99 124

Recovery

Sample No. Endogenous

dsDNA (IU/mL)

Added

dsDNA (IU/mL)

Recovery

dsDNA (IU/mL)

Expected

dsDNA (IU/mL)

Recovery

(%)

1

0.9 7.5 8.2 8.4 98

0.9 15 17.5 15.9 110

0.9 30 32.7 30.9 106

0.9 60 62.6 60.9 103

2

4.41 7.5 11.8 11.6 101

4.41 15 23.4 19.1 122

4.41 30 37.3 34.1 109

4.41 60 64.1 64.1 100

3

0.72 7.5 8.2 8.2 99

0.72 15 16.9 15.7 108

0.72 30 30.7 30.7 100

0.72 60 60.8 60.7 100

Method Comparison

versus RIA DIAsource-Assay = 1.14 x AMERLEX RIA (Ortho Clinical Diagnostics) +

1.3 r = 0.951, n = 100


PRODUCT LITERATURE REFERENCES 1. Hamann D., Smeenk R.J.T. dsDNA Autoantibodies. In Autoantibodies 2nd Edition. 2007

2. Linnik M.D., Hu J.Z., Heilbrunn K. R., Strand V., Hurley F. L., Joh T., LJP 394 Investigator Consortium.

Relationship between anti-double-stranded DNA antibodies and exacerbation of renal disease in

patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis and rheumatism. 2005 Apr, 52(4): 1129-37

3. Riboldi P., Gerosa M., Moroni G., Radice A., Allegri F., Sinico A., Tincani A., Meroni PL. Anti-DNA

antibodies: a diagnostic and prognostic tool for systemic lupus erythematosus? Autoimmunity. 2005

Feb, 38(1):39-45

4. Isenberg D. Anti-dsDNA antibodies: still a useful criterion for patients with systemic lupus

erythematosus? Lupus 2004, 13: 881-885

5. Wasmuth J.-C., Grün B., Terjung B., Homrighausen A., Spengler U. ROC Analysis Comparison of Three

Assays for the Detection of Antibodies against Double-Stranded DNA in Serum for the Diagnosis of

Systemic Lupus Erythematosus. Clinical Chemistry 2004, 50:2169-2171

6. Smeenk R.J.T. Detection of antibodies to dsDNA: Current insights into its relevance. Clin Exp

Rheumatol 2002; 20: 294-300

7. Egner W. The use of laboratory tests in the diagnosis of SLE. J. Clin. Pathol. 2000; 53; 424-432

8. Takeuchi Y., Ishikawa O., Miyachi Y. The comparative Study of Anti-Double Stranded DNA Antibody

Levels Measured by Radioimmunoassay and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay in Systemic Lupus

Erythematosus. The Journal of Dermatology. 1997. Vol. 24: 297-300

9. Ter Borg E.J., Horst G., Hummel E.J., Limburg P.C., Kallenberg C.G.M. Measurement of increases in

anti-double-stranded dna antibody levels as a predictor of disease exacerbation in systemic lupus

erythematosus. Arthritis & Rheumatism. 1990 May, 33 (5): 634-643

10. Sutjita M., Hohmann A., Boey M.L., Bradley J. Microplate ELISA for Detction of Antibodies to DNA in

Patients with Systemic Lupus Erythematosus: Specificity and Correlation with Farr Radioimmunoassay.

Journal of Clinical Laboratory Analysis. 1989, 3: 34-40

Revision date : 2020-02-24

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DIAsource dsDNA Ab RIA [체외진단의료기기]

1. 제품개요

순번 항 목 내 용

1 품목명 자가면역질환검사시약

2 제품명 DIAsourc dsDNA Ab RIA

3 허가번호 수인 15-459 호

4 사용목적 사람의 혈청내 dsDNA 항체 정량측정

5 포장단위 96 테스트/키트

6 저장방법 2-8 ℃ , 제조일로부터 70일

7 사용기한 2-8 ℃ , 제조일로부터 70일

2. 측정원리

dsDNA-Ab RIA는 검체의 free dsDNA 결합력을 측정하여 dsDNA 항체를

추정하는 간편하고, 정확한 방법을 제공한다. ¹²⁵I 표지된 dsDNA가 검체에

첨가되고, 배앙 후, 황산암모늄이 첨가되어 분리가 된다. 시험관을 원심분리

한 후 상층액을 조심스럽게 따라 버린다. 그런 후 시험관을 계수하고

dsDNA의 결합력에 비례한 결합 방사능량을 측정한다.

3. 제공되는 시약

번호 명칭 구성 Colour Code

1 Tracer dsDNA-125I 2 vial, 7.5ml

2 Calibrator 0-5 6 vial, 동결건조

3 Control I, II 2 via, 0.25ml 동결건조l

4 Specimen Diluent 1 vial, 2.5ml, 동결건조

5 황산암모늄 2 vial, 50ml

4. 측정방법

1) 검체 준비

(1) 용혈되거나 황달, 지방성 검체는 사용하지 않는다. 2-8℃에 보관한다.

(2) 측정이 48시간 안에 이루어지지 않는다면 검체는 –20℃에 저장해야 한다.

(3) 빛과 열을 피하고, 냉•해동 반복을 피한다.

2) 시약 조제

(1) 표준용액 : 250ul의 증류수로 재구성한다.

(2) 정도관리 용액 : 250ul의 증류수로 재구성한다.

(3) 검체희석액 : 2.5ml의 증류수로 재구성한다.

3) 검사 방법

★ 자동화 장비 : GammaPro

(1) 각 재구성 한 표준용액, 정도관리 용액. 트레이서를 pipetting stage에

준비한다.

(2) 검체를 25ul씩 준비하여 시험관 랙에 준비한다.

(3) 25ul의 표준용액. 정도관리용액, 트레이서 150ul를 차례대로 니들이 흡입

한 후, 검체가 든 시험관에 차례대로 분주한다.

(4) 분주가 끝난 시험관은 incubation stage로 옮겨져 1시간동안 반응한다.

37℃에서 반응한다.

(5) 반응이 끝난 후 pipetting stage로 옮겨져 1000ul의 차가운 황산암모늄을

모든 시험관에 차례대로 분주한다.

(6) 분주가 끝난 시험관은 15분간 원심분리한다.

(7) rinsing stage로 옮겨져 각 시험관의 상층액을 세척 후 흡입단계까지

이루어진다.

(8) 계수단계로 넘어가 1분간 방사능량을 계수한다.

4) 결과판정

(1) 자료정리

결과 값은 수직축 상에 B/Bmax(%)값, 수평축상에 표준용액의 농도인

logarithmic 곡선에 의해 계산되어진 값이다.

(2) 참고치

정상범위를 <7 IU/ml(n=590)로 본다.

5. 완제품 시험규격

1) 외관검사

제조원의 품질관리표준지침서(문서번호 POCQ075)에 따라 시험하고,

확인양식(문서번호 FTPK004)에 기입하고 확인한다.

(1) 문서번호 ITPKKIPIB19011에 기입된 대로 구성품이 일치하는지 확인한다

(2) 제품 구성표의 lot와 키트안의 구성품이 일치하는지 확인

(3) 구성품과 키트의 유효기간을 확인

(4) 구성품의 라벨상태를 확인

(5) 구성품의 포장상태를 확인(용량, 물질 등)

(6) 서류가 맞게 있는지 확인(사용설명서, 품질서류 등)

(7) 박스에 라벨이 정확히 부착되어 있는지 확인

(8) 검사 후 담당자는 확인양식(FTPK004)에 기입하고 서명한다.

2) 성능시험 ( 제조원의 품질관리 표준지침서(문서번호 POCQ006)에 따라

시험한다.

(1) 총 계수는 허용범위 20,000 cpm을 초과하여야 한다.

(2) 표준물질 0의 결합율은 허용범위(na~4.0 %)1)내에 있어야 한다.

(3) 표준물질 1의 결합율은 허용범위(3.5-6.5 %)1)내에 있어야 한다.

(4) 표준물질 5의 결합율은 허용범위 45%1) 초과하여야 한다.

(5) 키트에 정도관리용액에서 얻어진 값이 허용범위내에 있어야 한다.

Control Ⅰ : 1.75-3.25 IU/ml Control Ⅱ : 17.5-32.5 IU/ml

(6) 키트에 표준용액에서 얻어진 값이 허용범위내에 있어야 한다.

Calibrator 1 : 3.5-6.5 IU/ml Calibrator 2 : 7.0-13.0 IU/ml

Calibrator 3 : 14.0-26.0 IU/ml Calibrator 4 : 31.5-58.5 IU/ml Calibrator 5 : 70-130 IU/ml

비고 : 각 로트의 허용범위는 방사면역측정을 위한 표준지침서(문서번호.

CACQKIPIB19011)에 기록되어 있다.

(허용범위는 평균값의 ±3SD를 기준으로 측정된다.).

6. 사용시 주의사항

1) 체외진단용으로만 사용하여야 하며, 체외진단용 이외 흡입이나 체내 투여

등을 금지한다.

2) 동 제품에 포함된 방사성동위원소 취급 시 다음 사항을 준수하여야 한다.

(1) 방사성동위원소는 지정된 장소에 보관하며, 관련 법령에 따라 자격을

갖춘자가 지정된 장소에서 사용한다.

(2) 방사성동위원소를 취급할 때 안전에 영향을 주는 불필요한 행동을 하지

않는다. (예, 음식 섭취, 흡연, 화장 등)

(3) 방사성동위원소를 포함한 시약을 분주해야 하는 경우, 입으로 파이펫팅

하지 않는다.

(4) 방사성동위원소를 취급할 때에는 장갑 및 실험복을 착용하며, 검사가

완료되면 손을 깨끗이 닦는다.

(5) 유출된 모든 물질은 즉시 닦아 낸 후 폐기 또는 취급에 관련된 소관

법령에 따라 처리하여야 하며, 방사성 물질의 오염이나 방사성 물질 등의

분실은 관련 법령에 정한 규정된 절차에 따라 처리한다.

3) 검사를 실시하기 전에 모든 제품(구성품 포함)은 해당 제품별 검사 온도

조건에 따라 실시한다.

4) 그밖에 방사성동위원소의 보관, 이동, 사용 및 폐기 등 취급에 관한 사항은

관련 법규 또는 규정에 따른다.

5) 본 kit 내의 혈액성분은 시험을 거쳤고 , HbsAg, 항HIV 1와 항 HIV 2에 대한

반응은 없었다. 알려져 있는 어떠한 방법으로도 간염 , AIDS, 감염성혈액

성분 같은 감염성 물질의 부재를 확신시킬 수 없다 그러므로 시약과 환자

검체의 취급은 병원내의 안전절차에 따라야 한다.

6) 시약이 피부에 접촉되지 않게 하라(요오드화나트륨 방부제). 본 kit 내의

요오드화합물 은 배관계통의 납과 구리와 반응하여 큰 폭발성을 가진

요오드화금속으로 변화할 수있다. 세척 단계에서 요오드화합물의 생성을

막기 위해 흐르는 물로 배수관을 씻어 내도록 한다.

7) 방사성물질의 취득과 저장에 대한 일지는 실험실 내에 보관되어야 한다.

방사성 물질로 오염될 수 있는 서로 다른 방사성물질에 의한 교차 오염을

예방하기 위해 실험실 기구와 유리제품은 서로 분리 되어져야 한다.

8) 방사성 물질이 쏟아진 경우에는 방사선안전 절차에 따라 즉시 제염하여야

한다. 방사성 폐기물은 특정 규정과 실험실의 관할권을 가지고 있는

신고당국의 지침에 따라 처리되어 야만 한다. 방사선안전에 대한 기본

규칙의 준수는 충분한 방호를 제공한다.

2020-02-24


dsDNA-Ab RIA es

KIPIB19011 Radio inmunoensayo para la determinación diagnóstica cuantitativa in-vitro de

anticuerpos contra DNA de cadena doble (dsDNA) en suero humano.


USO PROPUESTO Radio inmunoensayo para la determinación diagnóstica cuantitativa in-vitro de anticuerpos contra DNA de

cadena doble (dsDNA) en suero humano.

IMPLICACIONES CLÍNICAS La presencia de anticuerpos contra DNA de doble cadena (ds DNA, DNA nativo) en el suero humano es

característico de pacientes con LES (Lupus Eritematoso Sistémico). Es importante cuantificar la cantidad de

anticuerpos a DNA de doble cadena para diferenciar entre LES y otras enfermedades autoinmunes muy

realcionadas. Los anticuerpos al dsDNA muestran buena correlación a la actividad de la enfermedad.

La determinación seriada de las cantidades de anticuerpos al dsDNA en el suero de pacientes individuales

tratados por LES es por lo tanto de uso clínico importante en la evaluación de la terapia y en la planificación

de futuras medidas terapéuticas.

Los anticuerpos al dsDNA normalmente no aparecen en el suero de pacientes con LES inducido por

medicamentos. La medición de anticuerpos al dsDNA en suero ayuda a decidir cuándo el paciente sufre de

una reacción lupoide a medicamentos o un LES real.

PRINCIPIO DEL ENSAYO El dsDNA-Ab RIA proporciona métodos simples, exactos y precisos para estimar los anticuerpos al dsDNA

en suero mediante la medición de la capacidad ligante del dsDNA libre en la muestra. Se añade dsDNA

etiquetado/identificado con 125I a la muestra. Tras la incubación, se consigue la separación añadiendo la

solución de sulfato de amonio. Los tubos se centrifugan y el sobrenadante se vierte cuidadosamente.

Entonces se cuentan los tubos, siendo la radioactividad ligada directamente proporcional a la capacidad

ligante del dsDNA.

ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1. Sólo para uso en diagnóstico in-vitro. Sólo para uso profesional. 2. Antes de comenzar el ensayo lea las instrucciones completa y cuidadosamente. Use la versión válida del

prospecto que se ofrece con el juego de reactivos. Asegúrese de entenderlo todo. 3. En caso de daño severo del estuche del juego de reactivos, contacte por favor a DIAsource o a su

suministrador en forma escrita antes de transcurrida una semana de la recepción. No utilice los componentes dañados en los ensayos pero guárdelos en forma segura para la reclamación.

4. Tome en cuenta el número de lote y la fecha de caducidad. No mezcle reactivos de diferentes lotes. No use reactivos vencidos.

5. Cumpla con las buenas prácticas de laboratorio y las pautas de seguridad. Use bata de laboratorio, guantes de látex desechables y gafas de protección cuando sea necesario.

6. Los reactivos de este juego que contienen materiales peligrosos pueden causar irritación ocular y cutánea. Vea MATERIAL SUMINISTRADO y las etiquetas para los detalles. Las Hojas de Datos de Seguridad de los materiales para este producto están disponibles en la página de internet de DIAsource o mediante solicitud directa a DIAsource.

7. Los reactivos químicos y los reactivos preparados o usados deben ser tratados como desechos peligrosos de acuerdo con las regulaciones nacionales sobre bioseguridad y pautas de seguridad.

8. El personal de limpieza debe ser capacitado por profesionales para el manejo de residuos peligrosos. 9. Este kit contiene I125 (vida media : 60 días) emisor de rayos X (28 keV) y de rayos γ (35.5 keV)

ionizantes. Este juego de reactivos contiene material radiactivo, para ser recibido, adquirido, poseído y


usado por médicos, laboratorios u hospitales sólo de acuerdo con las regulaciones y la licencia específica emitida por la Autoridad Regulatoria Nuclear o emitida por un estado con el cual dicha entidad haya acordado otorgar el ejercicio de la autoridad regulatoria.

10. Los materiales radiactivos deben ser confinados en áreas específicamente diseñadas para ello, monitoreadas frecuentemente y limitadas sólo para el personal autorizado Use ropa de laboratorio desechable, cubiertas de mesa de trabajo absorbentes desechables. Emplee siempre vigilancia radiológica individual, batas de laboratorio y guantes desechables. Elimine cualquier salpicadura inmediatamente, limpiando el área contaminada con un descontaminante y elimine los materiales contaminados como desechos radiactivos.

11. Algunos reactivos contienen timerosal como preservativos. En caso de contacto con los ojos o la piel, lávese inmediatamente con agua.

12. Todos los reactivos de este juego que contienen suero o plasma humano han sido ensayados y encontrados negativos para anti-HIV I/II, HBsAg and anti-HCV. Sin embargo, la presencia de estos u otros agentes infecciosos no puede ser excluída en forma absoluta, por lo que estos reactivos deben ser tratados como potencialmente biopeligrosos a los efectos de su manipulación y eliminación.

13. No comer, beber, fumar o utilizar cosméticos donde se estén utilizando materiales radiactivos. No pipetear soluciones radiactivas con la boca

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD El juego de reactivos es enviado a temperatura ambiente y debe ser almacenado a 2-8 °C. Manteniéndose

alejado del calor o de la luz solar directa. El almacenamiento y estabilidad de muestras y reactivos

preparados se detalla en los capítulos correspondientes.

TOMA Y ALMACENAMIENTO DE LAS MUESTRAS Suero

Se deben observar las precauciones usuales para la venipuntura. Es importante preservar la integridad química de la muestra de sangre desde el momento de su toma hasta el ensayo. No emplee muestras fuertemente hemolizadas, lipémicas o ictéricas. Las muestras que presenten turbidez deben centrifugarse antes de ensayar para eliminar cualquier material particulado.

Almacenamiento: 2-8°C -20°C (Alícuotas) Manténgase alejado del calor o de la luz solar directa.

Evite congelar y descongelar repetidamente. Estabilidad: 48 h 6 meses

MATERIALES SUMINISTRADOS

Cantidad Símbolo Componente

2 x 7.5 mL dsDNA 125I-Trazador Listo para usar. Actividad: < 37 kBq (1 µCi).

Contenido: 125I-dsDNA, 0.01% Timerosal.

1 x 6 x 0.25 mL

Estándar 0-5, liofilizado Contenido: dsDNA anticuerpos, Suero humano, 0.01 % Timerosal.

Por concentraciones exactas vea las etiquetas de las ampollas o el certificado Control

de Calidad.

1 x 2 x 0.25 mL Control 1+2, liofilizado Contenido: dsDNA anticuerpos, Suero humano.

Por concentraciones / rangos de aceptancia vea las etiquetas.

1 x 2.5 mL Dilyuente de Muestras, liofilizado Contenido: Suero humano, 0.01% Timerosal.

2 x 50 mL Ammonium Sulfate Ready to use. Contains: Ammonium Sulfate, 0.01% Thimerosal.

125I Ag

N CAL

CONTROL

SPE DIL

AGENT PREC


MATERIALES REQUIRIDOS PERO NO SUMINISTRADOS 1. Micropipetas (Multipette Eppendorf o dispositivos similares, < 3 % CV). Volúmenes: 25; 150; 250;

1000 µL. 2. Tubos de ensayo de poliestireno de fondo redondo (12 x 75 mm) 3. Colóquelos en una grilla para que el sobrenadante decante. 4. Vortex 5. Baño maría, 37 °C

6. Centrífuga (preferiblemente refrigerada); 1500 x g 7. Contador Gamma 8. Agua bidestilada o desionizada 9. Toallas de papel, puntas para las micropipetas y cronómetro

INDICACIONES PARA EL PROCEDIMIENTO 1. Cualquier manipulación inadecuada de las muestras o modificación del procedimiento de ensayo puede

alterar los resultados. Los volúmenes a pipetear, los tiempos de incubación, las temperaturas y etapas de pretratamientos tienen que ser efectuados estrictamente siguiendo las instrucciones. Use sólo pipetas u otros dispositivos calibrados.

2. Una vez comenzado el ensayo, se deben completar todas las etapas sin interrupción. Asegúrese de que los reactivos, materiales y dispositivos necesarios estén listos en el momento adecuado. Permita que todos los reactivos y muestras alcancen la temperatura ambiente (18-25 °C) y agite suavemente por rotación cada vial de reactivo líquido o muestra antes del uso. Evite la formación de espuma.

3. Evite la contaminación de los reactivos, pipetas pocillos y/o tubos. Emplee una punta desechable nueva para cada reactivo, estándar o muestra. No intercambie las tapas. Tape siempre los viales que no estén en uso. No reutilice los pocillos, tubos o reactivos.

4. Se recomienda ensayar las muestras por duplicado para poder identificar errores potenciales de pipeteo. 5. Se recomienda etiquetar todos los tubos. 6. Las fuerza centrífuga relativa (g) no es equivalente a las revoluciones por minuto (rpm) sino que tiene

que ser calculada teniendo en cuenta el radio del rotor de la centrífuga.

INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO

Preparación de componentes liofilizados o concentrados

Diluya / disuelva

Componente con Diluyente Notas Almacenamiento Estabilidad

CAL N 250 µL agua bidest. Tape y mezcle suavemente

para disolver.

Deje reposar durante 10 min.

Mezcle sin formar espuma.

-20°C (Alícuotas) 9 semanas CONRTOL N 250 µL agua bidest.

DIL SPE 2.5 mL agua bidest.

Dilución de Muestras Las muestras que se sospeche que contienen concentraciones mayores que la del estándar más alto tienen

que ser diluidas con Diluyente de Muestra.


PROCEDIMIENTO DE ENSAYO

La solución de Sulfato de Amonio debe mantenerse a 2-8°C hasta su empleo.

1. Pipetee 25 µL de cada Estándar, Control, muestra y/o muestra diluida en los tubos respectivos.

Deje dos tubos vacios para la Actividad Total (T).

2. Pipetee 150 µL de Trazador 125I-dsDNA en cada tubo. Mezclar usando un vortex.

3. Incube 60 min a 37°C en un baño de agua.

4. Pipetee 1000 µL de Sulfato de Amonio frío en cada tubo. (Excepto T.) Mezclar usando un vortex.

5. Centrifugue todos los tubos durante 15 min a 1500 x g. (Excepto T.)

6. Decante los tubos cuidadosamente. Drene 10 min con papel de secado (Excepto T).

7. Cuente los tubos en un contador Gamma durante 1 min (incluyendo T).

CONTROL DE CALIDAD Los resultados son válidos solamente si el ensayo ha sido realizado de acuerdo a las intrucciones. Además

el usuario debe atenerse a las Prácticas de Buen Laboratorio (GLP) u otras normas o leyes comparables. Para

la determinación del diagnóstico, el usuario y/o el laboratorio deben de tener un sistema validado de acuerdo

con las Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP). Los valores de los controles del ensayo deben encontrarse

dentro de los rangos de aceptación indicados en las etiquetas y el Certificado QC. Si este criterio no se

cumple, el ensayo no es válido y debe repetirse. Cada laboratorio debe emplear muestras conocidas como

controles adicionales. Se recomienda participar en los programas de aseguramiento de la calidad adecuados.

En caso de detectarse alguna desviación, se debe verificar lo siguiente: Fecha de vencimiento de los

reactivos, condiciones de almacenamiento, pipetas, dispositivos, condiciones de incubación y método de

lavado.

CÁLCULO DE RESULTADOS Plotee una curva en papel semi-logarítmico con los conteos corregidos de los estándares en el eje y (lineal)

contra las concentraciones correspondientes en el eje x (logarítmico). Las concentraciones de las muestras

pueden ser leidas directamente en esta curva estándar.

Alternativamante, el valor porcentual de los conteos de los estándares y muestras puede ser comparado a los

conteos del mayor estándar.

) Standard (highest cpm

100 x standard)-(zero cpm - andard)(Sample/St cpm = BmaxB/ %

Plotee una curva de % B/Bmax de los estándares para los estándares (eje y, lineal) contra la concentración

de los estándares (eje x, logarítmico) en papel semi-logarítmico.

Se logra un buen ajuste con métodos automáticos como cubic spline, 4 Parámetros, Logisitcs o Logit-Log.

Para el cálculo de la curva estándar, aplique cada señal de estándar (los valores de duplicados alejados debe

ser omitidos y emplear el mejor de los valores simples).

En caso de muestras diluídas los valores deberán multiplicarse por el factor de dilución correspondiente.

Las muestras que presenten una señal mayor a la del estándar mayor tienen que ser diluidas según se

describe en INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN DEL ENSAYO y analizadas nuevamente.


Curva de Calibración Típica

(Ejemplo. ¡No usar para el cálculo!)

Estándar dsDNA

(IU/mL)

Medio

cpm

Corregido

cpm

B/Bmax

(%)

T 17494 17494

0 0 587 0 0

1 3 786 199 1.8

2 6 1182 596 5.4

3 12 2151 1564 14.2

4 24 5110 4523 41.1

5 80 11602 11015 100

VALORES ESPERADOS Los resultados por si solos no deben ser la única razón para

un tratamiento terapéutico, sino que deben correlacionarse

con observaciones clínicas y ensayos de diagnóstico.

Los sujetos aparentemente sanos presentan los siguientes

valores:

< 7 IU/mL (n = 590)

Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio

rango de valores normales.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO La toma de la muestra y almcenamiento tiene un efecto importante en los resultados. Vea TOMA DE

MUESTRA Y ALMACENAMIENTO para mayores detalles.

Para reactividad cruzada, vea PRUEBAS FUNCIONALES.

Los siguientes componentes sanguíneos no tienen un efecto significativo (+/-20%) en los resultados hasta

las concentraciones declaradas:

Hemoglobina 4.0 mg/mL

Bilirrubina 0.5 mg/mL

Triglicéridos 30 mg/mL

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

1 10 100 1000

CP

M

IU / mL

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0

20

40

60

80

100


n


PRUEBAS FUNCIONALES

Especificidad Analítica

(Reactividad Cruzada)

No fue encontrada reactividad cruzada para las siguientes substancias testeadas.

Sustancia Origen Conc.

Suero reumatoide de la artrítis WHO ≤ 100 IU/mL

autoanticuerpo anti-ribonucleoproteína nucleica

(nRNO) WHO

≤ 1:2 Dilución

Anticuerpo anti-nucleico clase IgM WHO ≤ 10 mg/mL

Glicoproteína C1q Calbioche

m

≤ 500 µg/mL

Sensibilidad Analítica

(Límite de Detección) 2.5 IU/mL Señal media (Estándar-Cero) - 2DS

Precisión Muestra

No

Medio ± DS

(IU/mL) CV (%)

Intra-Ensayo (n = 20)

1 6.51 ± 0.57 8.83

2 10.48 ± 0.48 4.59

3 23.00 ± 0.80 3.48

4 38.99 ± 0.87 2.22

Inter-Ensayo (n = 20)

1 3.81 ± 0.45 11.75

2 9.81 ± 0.82 8.32

3 23.74 ± 1.91 8.03

4 38.42 ± 1.48 3.84

5 21.49 ± 2.00 9.29

Linearidad

Muestra

No

Dilución

Med. Conc.

(IU/mL)

Conc. Esperada

(IU/mL)

Recuperación

(%)

1

1:2 44.64 - 100

1:4 22.37 22.32 100

1:8 10.49 11.16 94

1:16 5.44 5.58 97

1:32 3.24 2.79 116

1.64 1.93 1.40 138

2

1:2 43.02 - 100

1:4 22.98 21.51 107

1:8 10.52 10.76 98

1:16 5.10 5.38 95

1:32 2.54 2.69 95

1.64 1.20 1.34 89

3

1:4 79.78 - 100

1:8 39.90 39.89 100

1:16 19.88 19.95 100

1:32 10.70 9.97 107

1.64 6.17 4.99 124

Recuperación

Muestra

No

dsDNA

Endógena

(IU/mL)

Agregado

dsDNA

(IU/mL)

Rec.

dsDNA

(IU/mL)

dsDNA

Esperada

(IU/mL)

Rec.

(%)

1

0.9 7.5 8.2 8.4 98

0.9 15 17.5 15.9 110

0.9 30 32.7 30.9 106

0.9 60 62.6 60.9 103

2

4.41 7.5 11.8 11.6 101

4.41 15 23.4 19.1 122

4.41 30 37.3 34.1 109

4.41 60 64.1 64.1 100


3

0.72 7.5 8.2 8.2 99

0.72 15 16.9 15.7 108

0.72 30 30.7 30.7 100

0.72 60 60.8 60.7 100

Comparación del Método

versus RIA

Ensayo DIAsource = 1.14 x AMERLEX RIA (Ortho Clinical

Diagnostics) + 1.3

r = 0.951,

n = 100

REFERENCIAS SOBRE EL PRODUCTO 1. Hamann D., Smeenk R.J.T. dsDNA Autoantibodies. In Autoantibodies 2nd Edition. 2007

2. Linnik M.D., Hu J.Z., Heilbrunn K. R., Strand V., Hurley F. L., Joh T., LJP 394 Investigator Consortium. Relationship between anti-double-stranded DNA antibodies and exacerbation of renal disease in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis and rheumatism. 2005 Apr, 52(4): 1129-37

3. Riboldi P., Gerosa M., Moroni G., Radice A., Allegri F., Sinico A., Tincani A., Meroni PL. Anti-DNA antibodies: a diagnostic and prognostic tool for systemic lupus erythematosus? Autoimmunity. 2005 Feb, 38(1):39-45

4. Isenberg D. Anti-dsDNA antibodies: still a useful criterion for patients with systemic lupus erythematosus? Lupus 2004, 13: 881-885

5. Wasmuth J.-C., Grün B., Terjung B., Homrighausen A., Spengler U. ROC Analysis Comparison of Three Assays for the Detection of Antibodies against Double-Stranded DNA in Serum for the Diagnosis of Systemic Lupus Erythematosus. Clinical Chemistry 2004, 50:2169-2171

6. Smeenk R.J.T. Detection of antibodies to dsDNA: Current insights into its relevance. Clin Exp Rheumatol 2002; 20: 294-300


8. Takeuchi Y., Ishikawa O., Miyachi Y. The comparative Study of Anti-Double Stranded DNA Antibody Levels Measured by Radioimmunoassay and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay in Systemic Lupus Erythematosus. The Journal of Dermatology. 1997. Vol. 24: 297-300

9. Ter Borg E.J., Horst G., Hummel E.J., Limburg P.C., Kallenberg C.G.M. Measurement of increases in anti-double-stranded dna antibody levels as a predictor of disease exacerbation in systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatism. 1990 May, 33 (5): 634-643

10. Sutjita M., Hohmann A., Boey M.L., Bradley J. Microplate ELISA for Detction of Antibodies to DNA in Patients with Systemic Lupus Erythematosus: Specificity and Correlation with Farr Radioimmunoassay. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 1989, 3: 34-40

Revision date : 2020-02-24


dsDNA-Ab RIA pt

KIPIB19011 Radioimunoensaio para a determinação quantitativa, em diagnóstico in-vitro, de

anticorpos contra DNA de dupla-hélice (dsDNA) em soro humano.


APLICAÇÕES Radioimunoensaio para a determinação quantitativa, em diagnóstico in-vitro, de anticorpos contra DNA de

dupla-hélice (dsDNA) em soro humano.

SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO A presença de anticorpos contra DNA de dupla hélice (dsDNA, DNA nativo) no soro é característico em

pacientes com LES. É importante quantificar a concentraçao de anticorpos contra dsDNA para diferenciar o

LES de outras patologias autoimunes relacionadas. Os anticorpos contra dsDNA mostram uma boa

correlação com a actividade da patologia.

A determinação da concentração de anticorpos contra dsDNA em soro de pacientes a serem medicados em

LES tem uma utilidade clínica importante para a avaliação da terapia e para prever futuras medidas

terapêuticas.

Normalmente os anticorpos contra ds DNA não são detectáveis em soro de pacientes com LES induzido por

fármacos. A quantificação de anticorpos contra dsDNA em soro é útil para diferenciar entre LES induzido

por fármacos ou verdadeiro LES.

PRINCÍPIO DO TESTE O teste de dsDNA-Ab RIA é uma técnica simples, exacta e precisa para a quantificação de anticorpos

estimados contra dsDNA em soro, através da medição da capacidade ligante do dsDNA livre na amostra.

dsDNA marcado com 125I é adicionado á amostra. Depois de incubar, adiciona-se uma solução de sulfato de

amónia para conseguir a separação. Os tubos são centrifugados e o sobrenadante é cuidadosamente

decantado. Em seguida os tubos são contados e a capacidade ligante dsDNA é directamente proporcional á

reactividade detectada.

AVISOS E PRECAUÇÕES 1. Apenas para diagnóstico in vitro. Apenas para utilização profissional.

2. Antes de iniciar o teste, leia as instruções completa e cuidadosamente. Utilize a versão válida do folheto informativo fornecido com o kit. Tenha a certeza de ter entendido tudo.

3. Em caso de danos no kit por favor contacte a DIAsource ou o seu fornecedor por escrito, até uma semana após ter recebido o kit. Não utilize componentes danificados na execução do teste, mas guarde-os para reclamação.

4. Obedeça ao número de lote e ao prazo de validade. Não misture reagentes de diferentes lotes. Não utilize reagentes expirados.

5. Siga as boas práticas de laboratório e as normas de segurança. Vista bata, luvas de látex descartáveis e óculos protectores sempre que necessário.

6. Reagentes do kit contendo material perigoso podem causar irritação da pele e dos olhos. Veja MATERIAIS FORNECIDOS e os rótulos para mais detalhes. As Fichas de Segurança do produto para este kit estão disponíveis na Homepage da DIAsource ou a pedido directamente à DIAsource:

7. Químicos e reagentes preparados ou utilizados devem ser tratados como resíduos perigosos de acordo com as normas nacionais de segurança e resíduos perigosos.

8. O pessoal de limpeza deve ser orientado pelos profissionais relativamente ao manuseamento de produtos e perigos potenciais.

9. Este kit contêm 125I (meia vida: 60 dias), emitindo radiações ionizantes X (28 keV) e γ (35,5 keV). Este kit contém material radioactivo a ser recebido, obtido, possuído e usado por médicos, laboratórios ou


hospitais apenas de acordo com os regulamentos e uma licensa específica emitida pelo Instituto Tecnológico e Nuclear (Departamento de Protecção Radiológica e Segurança Nuclear).

10. Materiais radioactivos devem ser confinados a áreas do laboratório especificamente designadas para esse fim, regularmente vigiadas e com acesso restrito a pessoal autorizado. Usar material de laboratório descartável e coberturas de bancada de material absorvente e descartável. Usar sempre dosímetros de radiação, batas e luvas descartáveis. Secar imediatamente qualquer líquido derramado, limpando a área contaminada com um descontaminante, e eliminar os materiais contaminados como resíduo radioactivo.

11. Alguns reagentes contêm timerosal como conservantes. No caso de contacto com os olhos ou a pele, lavar imediatamente com água corrente.

12. Todos os componentes deste kit contendo soro ou plasma humano foram testados e foram considerados não reactivos para HIV I/II, AgHBs e HCV. No entanto, não é possível excluir em absoluto a presença destes ou outros agentes infecciosos e portanto os reagentes devem ser tratados com potencialmente perigosos quer na sua utilização quer na sua eliminação.

13. Não coma, beba, fume ou aplique cosméticos quando materiais radioativos estão sendo usados. Não pipete soluções radioativas com a boca

ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE O kit é enviado à temperatura ambiente e deve ser armazenado de 2-8 ºC. Mantenha-o longe do calor ou da

luz solar directa. A estabilidade e armazenamento das amostras e reagentes preparados são referidos nas

secções correspondentes.

RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS Soro

Devem ser observados os cuidados usuais para a punção venosa. É importante preservar a integridade

química da amostra de sangue desde o momento da colheita até ao momento de ser analisada. Não utilize

amostras muito hemolíticas, ictéricas ou lipémicas. Amostras que apresentem turvação deverão ser

centrifugadas antes do teste e devem ser removidas as partículas de matéria.

Armazenamento: 2-8°C -20°C (Alíquotas) Manter afastado do calor ou luz solar directa.

Evitar congelar-descongelar repetidamente. Estabilidade: 48 h 6 meses

MATERIAIS FORNECIDOS

Quantidade Symbol Componente

2 x 7.5 mL dsDNA 125I-Marcador Pronto a usar. Actividade: < 37 kBq (1 µCi).

Contêm: 125I-dsDNA, 0.01% Timerosal.

1 x 6 x 0.25 mL Padrão 0-5, liofilizado Contêm: dsDNA anticorpos, Soro humano, 0.01 % Timerosal.

Para concentrações exactas consultar etiquetas dos frascos ou o certificado CQ.

1 x 2 x 0.25 mL Controlo 1+2, liofilizado Contêm: dsDNA anticorpos, Soro humano.

Para concentrações / intervalos aceitáveis consultar etiquetas dos frascos.

1 x 2.5 mL Diluente de Amostra, liofilizado Contêm: Soro humano, 0.01% Timerosal.

2 x 50 mL Sulfato de Amónia Pronto a usar. Contêm: Sulfato de Amónia, 0.01% Timerosal.

125I Ag

N CAL

CONTROL

SPE DIL

AGENT PREC


MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS 1. Pipetas (Multipette Eppendorf ou aparelhos semelhantes, < 3 % CV). Volumes: 25; 150; 250; 1000 µL.

2. Tubos de ensaio de polistireno de fundo redondo (12 x 75 mm)

3. Suporte para decantação de sobrenadantes

4. Vortex

5. Banho de água, 37 °C

6. Centrífuga (de preferência refrigerada); 1500 x g

7. Contador de cintilações

8. Água bidestilada ou bi-destilada

NOTAS SOBRE O PROCEDIMENTO 1. O manuseamento incorrecto da amostra ou alterações no procedimento do teste podem influenciar os

resultados. Os volumes de pipetagem indicados bem como os tempos de incubação, a temperatura e os passos de pré-tratamento devem ser realizados estritamente de acordo com as instruções. Utilize apenas pipetas e instrumentos calibrados.

2. Uma vez iniciado o teste, todos os passos devem ser executados sem interrupção. Garanta que os reagentes necessários, os materiais e dispositivos são preparados e prontos a usar no tempo apropriado. Todos os reagentes e amostras devem estar à temperatura ambiente antes de utilizar (18-25 ºC). Agite cuidadosamente todos os frascos de reagentes líquidos e a amostra antes de utilizar. Agite os reagentes sem formar espuma.

3. Evite a contaminação dos reagentes, pipetas e poços/tubos. Utilize pontas novas descartáveis para cada reagente, padrão ou amostra. Não troque as tampas. Feche sempre os frascos não utilizados. Não reutilize poços/tubos ou reagentes.

4. Recomenda-se a determinação em duplicado das amostras de maneira a identificar potenciais erros de pipetagem.

5. Recomenda-se a rotulagem de todos os tubos.

A força centrífuga relativa (g) não é equivalente a rotações por minuto (rpm) e tem que ser calculada de acordo com o raio do rotor

INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE

Preparação de componentes liofilizados ou concentrados

Diluir / dissolver

Componente com Diluente Observações Armazenamento Estabilidade

CAL N 250 µL agua

bidest. Tapar e misturar suavemente

para dissolver.

Deixar repousar 10 min.

Misturar sem fazer espuma.

-20°C

(Alíquotas) 9 semanas CONRTOL N 250 µL

agua

bidest.

DIL SPE 2.5 mL agua

bidest.

Diluição de Amostras As amostras de que se suspeite conterem concentrações mais elevadas que o maior padrão têm que ser

diluídas com Diluente de Amostra.


PROCEDIMENTO DO ENSAIO

A solução de Sulfato de Amónia deve ser guardada a 2-8°C até ser usada.

1. Pipetar 25 µL de cada Padrão, Controlo, amostra e/ou amostra diluída para os respectivos tubos.

Deixar dois tubos vazios para a Actividade Total (T).

2. Pipetar 150 µL de Marcador-125I de dsDNA para cada tubo. Agitar no vortex.

3. Incubar 60 min a 37°C num banho de água.

4. Pipetar 1000 µL de Sulfato de Amónia frio para cada tubo. (Excepto T.) Agitar no vortex.

5. Centrifugar todos os tubos durante 15 min a 1500 x g. (Excepto T.)

6. Decantar os tubos cuidadosamente. Escoar durante 10 min em papel absorvente (Excepto T).

7. Fazer a leitura dos tubos num contador de cintilações durante 1 min (incluindo T).

CONTROLO DE QUALIDADE Os resultados do teste só são válidos se o teste tiver sido realizado de acordo com as instruções. Além disso,

o utilizador deve cumprir estritamente as regras de BPL (Boas Práticas Laboratoriais) ou normas/leis

equiparáveis. O utilizador e o laboratório devem ter um sistema validado para obter o diagnóstico, de acordo

com as boas práticas laboratoriais (GLP). Todos os padrões devem estar dentro dos intervalos de aceitação

definidos nas etiquetas e no Certificado de CQ. Se não cumprirem os critérios a série não é válida e deve ser

repetida. Cada laboratório deve usar amostras conhecidas como controlos adicionais. É recomendável

participar em ensaios de garantia da qualidade apropriados.

Em caso de desvios os seguintes aspectos técnicos devem ser tidos em conta: datas de validade dos

reagentes (preparados), condições de armazenamento, pipetas, dispositivos, condições de incubação e

métodos de lavagem.

CÁLCULO DE RESULTADOS Construir um gráfico, numa escala semi-logarítmica, de contagens corrigidas dos padrões no eixo dos yy

(linear) versus a concentração correspondente no eixo dos xx (logarítmico). As concentrações das amostras

podem ser lidas directamente a partir desta curva padrão.

Alternativamente, o valor de percentagem das contagens dos padrões e amostras pode ser comparado às

contagens do padrão mais elevado.

) elevado mais (Padrão cpm

100 x zero) (Padrão cpm - adrão)(Amostra/P cpm = B/ % Bmax

Construir um gráfico de % B/Bmax dos padrões (eixo dos yy, linear) versus as concentrações dos padrões

(eixo dos xx, logarítmico) num papel semi-logarítmico.

Uma boa curva é fornecida optando por métodos computadorizados como ”cubic spline”, “4 parameter

logistics” ou “logit-log”..

Para a determinação da curva padrão, usar cada sinal dos padrões (se um dos duplicados apresentar um valor

claramente diferente do esperado pode ser omitido e o valor mais razoável pode ser usado).

No caso de amostras diluídas os valores têm que ser multiplicados pelo factor de diluição correspondente.

Amostras que apresentem concentrações acima do padrão mais elevado, têm que ser diluídas como descrito

em INSTRUÇÕES PRÉ-TESTE e testadas novamente.


Curva de Calibração Típica

(Exemplo. Não usar para cálculos!)

Padrão dsDNA

(IU/mL)

Média

cpm

Corrigido

cpm

B/Bmax

(%)

T 17494 17494

0 0 587 0 0

1 3 786 199 1.8

2 6 1182 596 5.4

3 12 2151 1564 14.2

4 24 5110 4523 41.1

5 80 11602 11015 100

VALORES ESPERADOS Os resultados por si só não devem ser a única razão para

qualquer acção terapêutica e deverão ser correlacionados

com outras observações clínicas e testes de diagnóstico.

Indivíduos aparentemente saudáveis apresentam os

seguintes valores:

< 7 IU/mL (n = 590)

Recomenda-se que cada laboratório estabeleça o seu

próprio intervalo de normalidade.

LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO A recolha e armazenamento de amostras tem um efeito significativo nos resultados dos testes. Ver

RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS para detalhes.

Para reactividade cruzadas, ver DESEMPENHO.

Os seguintes componentes sanguíneos não têm um efeito significativo (+/-20%) nos resultados do teste se

estiverem em concentrações inferiores às indicadas:

Hemoglobina 4.0 mg/mL

Bilirrubina 0.5 mg/mL

Triglicéridos 30 mg/mL

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

1 10 100 1000

CP

M

IU / mL

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0

20

40

60

80

100


n


DESEMPENHO

Especificidade Analítica

(Reactividade Cruzada)

Não foram encontradas reactividades cruzadas com as seguintes substâncias

testadas.

Substância Fonte Conc.

Soro de artrite reumatóide WHO ≤ 100 IU/mL

autoanticorpo anti-ribonucleoproteína

nuclear (nRNP) WHO

≤ 1:2 Diluição

anticorpo anti-nuclear da classe IgM WHO ≤ 10 mg/mL

Glicoproteína C1q Calbiochem ≤ 500 µg/mL

Sensibilidade Analítica

(Limite de Detecção) 2.5 IU/mL Média do Sinal (Padrão Zero) - 2SD

Precisão Amostra

No

Média ± SD

(IU/mL) CV (%)

Intra-Ensaio (n = 20)

1 6.51 ± 0.57 8.83

2 10.48 ± 0.48 4.59

3 23.00 ± 0.80 3.48

4 38.99 ± 0.87 2.22

Inter-Ensaio (n = 20)

1 3.81 ± 0.45 11.75

2 9.81 ± 0.82 8.32

3 23.74 ± 1.91 8.03

4 38.42 ± 1.48 3.84

5 21.49 ± 2.00 9.29

Linearidade

Amostra

No

Diluição

Medido Conc.

(IU/mL)

Conc. Esperada

(IU/mL)

Recuperação

(%)

1

1:2 44.64 - 100

1:4 22.37 22.32 100

1:8 10.49 11.16 94

1:16 5.44 5.58 97

1:32 3.24 2.79 116

1.64 1.93 1.40 138

2

1:2 43.02 - 100

1:4 22.98 21.51 107

1:8 10.52 10.76 98

1:16 5.10 5.38 95

1:32 2.54 2.69 95

1.64 1.20 1.34 89

3

1:4 79.78 - 100

1:8 39.90 39.89 100

1:16 19.88 19.95 100

1:32 10.70 9.97 107

1.64 6.17 4.99 124

Recuperação

Amostra

No

dsDNA

Endógena

(IU/mL)

Adicionado

dsDNA

(IU/mL)

Rec.

dsDNA

(IU/mL)

dsDNA

Esperada

(IU/mL)

Rec.

(%)

1

0.9 7.5 8.2 8.4 98

0.9 15 17.5 15.9 110

0.9 30 32.7 30.9 106

0.9 60 62.6 60.9 103

2

4.41 7.5 11.8 11.6 101

4.41 15 23.4 19.1 122

4.41 30 37.3 34.1 109


4.41 60 64.1 64.1 100

3

0.72 7.5 8.2 8.2 99

0.72 15 16.9 15.7 108

0.72 30 30.7 30.7 100

0.72 60 60.8 60.7 100

Comparação Método

Usado versus RIA

Teste DIAsource = 1.14 x AMERLEX RIA (Ortho Clinical

Diagnostics) + 1.3

r = 0.951,

n = 100

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DO PRODUTO 1. Hamann D., Smeenk R.J.T. dsDNA Autoantibodies. In Autoantibodies 2nd Edition. 2007

2. Linnik M.D., Hu J.Z., Heilbrunn K. R., Strand V., Hurley F. L., Joh T., LJP 394 Investigator Consortium. Relationship between anti-double-stranded DNA antibodies and exacerbation of renal disease in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis and rheumatism. 2005 Apr, 52(4): 1129-37

3. Riboldi P., Gerosa M., Moroni G., Radice A., Allegri F., Sinico A., Tincani A., Meroni PL. Anti-DNA antibodies: a diagnostic and prognostic tool for systemic lupus erythematosus? Autoimmunity. 2005 Feb, 38(1):39-45

4. Isenberg D. Anti-dsDNA antibodies: still a useful criterion for patients with systemic lupus erythematosus? Lupus 2004, 13: 881-885

5. Wasmuth J.-C., Grün B., Terjung B., Homrighausen A., Spengler U. ROC Analysis Comparison of Three Assays for the Detection of Antibodies against Double-Stranded DNA in Serum for the Diagnosis of Systemic Lupus Erythematosus. Clinical Chemistry 2004, 50:2169-2171

6. Smeenk R.J.T. Detection of antibodies to dsDNA: Current insights into its relevance. Clin Exp Rheumatol 2002; 20: 294-300


8. Takeuchi Y., Ishikawa O., Miyachi Y. The comparative Study of Anti-Double Stranded DNA Antibody Levels Measured by Radioimmunoassay and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay in Systemic Lupus Erythematosus. The Journal of Dermatology. 1997. Vol. 24: 297-300

9. Ter Borg E.J., Horst G., Hummel E.J., Limburg P.C., Kallenberg C.G.M. Measurement of increases in anti-double-stranded dna antibody levels as a predictor of disease exacerbation in systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatism. 1990 May, 33 (5): 634-643

10. Sutjita M., Hohmann A., Boey M.L., Bradley J. Microplate ELISA for Detction of Antibodies to DNA in Patients with Systemic Lupus Erythematosus: Specificity and Correlation with Farr Radioimmunoassay. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 1989, 3: 34-40

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