大規模解析から予測した新規バクテリア clp1...

2019年度森泰吉郎記念研究振興基金成果報告書

大規模解析から予測した新規バクテリア Clp1の機能解析

慶應義塾大学政策・メディア研究科修士課程 2年先端生命科学 (BI) 齋藤元文

本研究成果は，” Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1

Family Proteins in the Three Domains of Life.”というタイトルで Genome Biology and Evolutionに 2019年 9月

にアクセプトされた (https://academic.oup.com/gbe/article/11/10/2713/5568290)．

1. 序論生命の根本的な仕組みは，地球上のあらゆる生物に共通している．例えば，遺伝情報が刻まれた DNA

分子から，messenger RNA (mRNA) に転写されて，mRNAをもとにアミノ酸 (Amino acid) が連なったタ

ンパク質に翻訳するというセントラルドグマは，全ての生物に共通したシステムである (図 1)．この DNA

分子とタンパク質に加えて，RNA分子もまた重要な役割を担っている．特に，転写された mRNAに刻ま

れているアミノ酸情報は，コドンと呼ばれる 3 文字の塩基配列ごとに暗号化されており，この暗号と対

応するアミノ酸配列を結びつける鍵となる役割は，transfer RNA (tRNA) と呼ばれる RNA分子が担ってい

る (図 2)．

図 1. DNAからタンパク質ができるまでの過程図 2. mRNAとアミノ酸を繋ぐ tRNA分子 (https://www.brh.co.jp/publication/journal/052/img/zu01b.gif, https://brainly.in/question/12818819)

本研究では，翻訳過程に必須である tRNA 分子に注目している．多くの真核生物やアーキアの前駆体

tRNA (Precursor tRNA : Pre-tRNA) 分子は，イントロン (図 3. 水色) とエキソン (図 3. 黒色) によって構

成されており，機能性の成熟 tRNA 分子 (Mature tRNA) を合成するためには，(I) スプライシング関連の

酵素によってイントロンを取り除き，(II) RNAリン酸化酵素である Clp1によって修飾を受け，(III) tRNA

ligase によってエキソン同士を連結する必要がある (図 3)．このように生命維持に重要なタンパク質は，

広範な生物種間で進化的に保存されているのではないか注目されている．本研究で対象としている Clp1

タンパク質は，ヒトやマウスの生体内において不活性化すると, tRNA断片が細胞へ蓄積し，運動ニュー

ロンの細胞死によって神経病を誘発することが報告されている (Hanada, T, et al., 2013)．しかしながら，

生体内で重要な役割を担う Clp1タンパク質がどういった生物種に保存されているのか，さらには，どの

ように遺伝子機能の多様化が起こったのか大規模な分子進化解析は行われていなかった．これまで我々

は，Clp1タンパク質の大規模な分子進化解析を行い，真核生物では 1,425種，アーキアでは 211種，新規

に 143種のバクテリアに Clp1遺伝子が存在することを明らかにした (図 4)．

図 3. Pre-tRNAからMature tRNAが合成される過程図 4. 真核生物，アーキア，バクテリア Clp1

を用いた分子進化系統樹 2. 本研究目的これまで情報学的解析によって予測された新規バクテリアの Thermus scotoductus Clp1遺伝子がリン酸

化機能を有しているのか，合成生物学的手法によって大腸菌内で組換え体 Clp1タンパク質を作成し実験

学的に検証した.

3. 研究手法 3.1. Ts-Clp1遺伝子用の発現ベクターの構築情報学的解析から予測された 723 bp の Ts-Clp1 遺伝子 (UniProt AC: E8PQM6) を GC 含量が 65%以下

で，大腸菌のコドン使用頻度に合うように eurofins (ユーロフィンジェノミクス株式会社，東京都，日本)

が提供するツール (https://www.eurofinsgenomics.jp/jp/service/gsy/orderstart.aspx?type=MyCart) を用いて，塩

基配列の最適化を行った．その後，アミノ酸配列長が 240 残基の Ts-Clp1 遺伝子を人工的に化学合成し

た (ユーロフィンジェノミクス株式会社)．次に，pET-23b発現ベクター (Novagen，Madison，WI，USA)

の T7プロモーター下流に，人工的に合成した Ts-Clp1遺伝子を挿入した．このようにすると，C末端側

にロイシンと 6×His-tagがついた Ts-Clp1を設計できる．

3.2. Ts-Clp1組換え体タンパク質の精製大腸菌株 BL21 (DE3) のコンピテントセルに，プラスミドの pET-Ts-Clp1を導入することで形質転換を

行った．その菌を培養したプレートからシングルコロニーをとり，50 μg/ mL のアンピシリンを含む LB

培地に対して，37℃で約 4時間，30 ̊ Cで約 4時間，対数増殖期まで培養した．その後，0.4 mMの Isopropyl

β-D-1- thiogalactopyranoside (IPTG) を添加し，30 ˚Cでさらに約 16 時間培養を行い，目的の Ts-Clp1組換

え体タンパク質を過剰発現させた．細胞を遠心分離 (9,000 ×g，4 ̊ C，15 分間) により菌体ペレットを回

収し，20 mM Tris-HCl (pH 8.0)，500 mM NaCl，5 mM imidazole, 0.1 % (v/v) nonyl phenoxypolyethoxylethanol

(NP-40) を含む His-tag binding bufferで再懸濁した．その後，抽出物を T. scotoductusの生育温度である 60

Clp1_P zf-C3HC4_3Clp1 ParACLP1_N CLP1_P GIDE zf-C3HC4_3Clp1 ParACLP1_N CLP1_P GIDE

zf-C3HC4_3Clp1 ParACLP1_N CLP1_P GIDE

Clp1_eN

Clp1_eC

P. furiosus

P. horikoshii

M. jannaschii

S. bacterium

D. africanus

T. scotoductus

S. pombe

G. frondosa

B. taurus

S. pombe

G. frondosa

H. sapiens

H. sapiens

B. taurus

0.5

Grc3_G.frondosa_Eukarya

Nol9_H.sapiens_Eukarya

Clp1_S.pombe_Eukarya

Unknown_D.africanus_Bacteria

Clp1_M.jannaschii_Archaea

Clp1_P.furiosus_Archaea

Nol9_B.taurus_Eukarya

Clp1_H.sapiens_Eukarya

Clp1_B.taurus_Eukarya

Clp1_P.horikoshii_Archaea

Grc3_S.pombe_Eukarya

Clp1_G.frondosa_Eukarya

Unknown_T.scotoductus_Bacteria

Unknown_S.bacterium_Bacteria

98

67

100

73

100

100

100

100

98

100

100

97

Clp1 (Q8U4H6)

Clp1* (O57936)

Clp1 (Q58711)

Unknown (A0A0S7ZRV7)

Clp1 (F3Z1E4)

Unknown (E8PQM6)

Nol9* (Q5SY16)

Nol9 (E1BPN0)

Grc3* (Q9UU96)

Grc3 (A0A1C7LUN8)

Clp1 (Q10299)

Clp1 (A0A1C7LM88)

Clp1* (Q92989)

Clp1 (E1BPN0)





































































































































































































Archaea

Bacteria

Eukarya

Clp1_aC

Domain structureSpecies Protein�UniProt AC�

98

0.5

98

67

73

100

100

100

100

100

100

100

0 800 (aa)400200 600

97

Nol9_eC

Nol9_eN

Clp1

5’ 5’3’

5’3’

tRNA ligase

5’ 3’

Mature tRNAPre-tRNA

(I) (II)(III)

˚Cで 15 分間熱処理後，大腸菌に由来する内在性タンパク質を変性させ，4 ̊ Cで 18,000 ×g，10 分間遠心

分離をして不溶となったタンパク質を除去した．Ts-Clp1組換え体タンパク質は，Fast Protein Liquid Chro-

matography (FPLC) を用いて，HisTrap HPカラム (GE Healthcar，シカゴ，アメリカ) にトラップし，imidazole

(5-1,000 mM) の濃度を変えながら精製した．精製されたタンパク質のピークの画分は，50 mM Tris-HCl

(pH 8.0)，1 mM EDTA，0.02 % (v/v) Tween 20, 7 mM 2-mercaptoethanol, と 10 % (v/v) glycerolを含む buffer

Dで透析を行った．

3.3. バクテリア Ts-Clp1のリン酸化活性の検証リン酸化アッセイは，FAMでラベル化されたオリゴヌクレオチドをプローブとして，8 M ureaを含む，

15 % polyacrylamide gelで解析した．基本的に，20 μlの反応液には，1 M Tris-HCl (pH8.0)，1 M DTT，50

mM KCl，10 mM MgCl2，1 mM ATP，25 pmol/μlの FAMでラベル化されたオリゴヌクレオチドのプロー

ブ，および精製された Ts-Clp1組換え体タンパク質 (0.5 μg/mL) を入れて反応させた．その後，サンプル

を 60 ˚C，15 分間インキュベートした後に，等量の 8 M Urea Stop Buffer [8 M urea，1 M Tris-HCl (pH8.0)

および少量のブルーデキストラン (Sigma Chemical，St Lou-is，MO，USA) を用いて反応を停止させた．

反応混合物を 70 ˚Cで 5 分間加熱し，変性剤の 8 M ureaを含有する 15 ％ (w/v) ポリアクリルアミドゲ

ルにサンプルを添加し，1,600 Vで 20 分間，1,800 Vで 90 分間電気泳動した．その後，ゲルをMolecular

Imager FX Pro (Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA) で可視化した．

4. 結果と考察まず，精製した Ts-Clp1組換え体タンパク質が目的のサイズであることを確認した (図 5. A)．次に，精

製された Ts-Clp1組換え体タンパク質を用いて，NTPs (ATP, GTP, UTP, CTP) による，一本鎖 RNA (single

-stranded RNA: ssRNA) と一本鎖 DNA (single-stranded DNA: ssDNA) に対するリン酸化活性を検証した．

その結果，60 ̊ C の条件下において，濃度が 10 ngの Ts-Clp1組換え体タンパク質は ssRNAをリン酸化す

ることが明らかとなった (図 5. B)．一方で，同条件下において，ssDNAはリン酸化されなかった (図 5.

C)．前述した結果が，Ts-Clp1組換え体タンパク質の濃度によって変化するのか調べるために，Ts-Clp1組

換え体タンパク質の濃度を 10~20倍の高濃度の条件で検証したところ，ssDNAをリン酸化することが明

らかとなった (図 5. D)．次に，ssRNAや，二本鎖 RNA (double-stranded RNA: dsRNA) や，二本鎖 RNAの

3’末端の突出型 (dsRNA 3’ o.h.) に対して検証したところ，Ts-Clp1組換え体タンパク質の濃度依存的にリ

ン酸化した (図 5. E, F)．最後に，このタンパク質は 60 ˚C ~90˚Cで活性があることから，耐熱性のタン

パク質であることが考えられた (図 5. G)．我々は，このような Ts-Clp1 タンパク質を高濃度に添加する

ことで，基質特異性が弱まることや，耐熱性タンパク質であることに関する要因は特定できていないた

め，今後の課題であると考えている．また，この Ts-Clp1遺伝子は，T. scotoductusの生体内で発現してい

ることが報告されている (Kathleen D, et al., 2016)．それ故，このバクテリアのリン酸化活性が生体内でど

のように機能しているのか今後明らかにしたい.

図 5．NTPsによる Ts-Clp1組換え体タンパク質のリン酸化活性．(A) 精製した Ts-Clp1組換え体タンパ

ク質は SDS-PAGEを行い，Coomassie Brilliant Blue (CBB) で染色した．黒矢印は，分子量が約 27 kDa

の Ts-Clp1 組換え体タンパク質の位置を指す．(B-C) NTPs による効果．数値は NTPs の濃度．基質は，

ssRNA または ssDNA を用いて，上部に記した．Ts-Clp1 組換え体タンパク質の濃度は 10 ng で行った．

(D-F) は ssDNA，dsRNA 3’ o.h.，ssRNA，dsRNAに対する，Ts-Clp1組換え体タンパク質の濃度依存性の

効果．(G) 反応温度の違いがもたらす，Ts-Clp1組換え体タンパク質のリン酸化活性の変化．

謝辞本研究は，慶應義塾大学環境情報学部金井昭夫教授には，研究全体の方針と綿密なミーティングをし

て頂いた．同大先端生命科学研究所所長冨田勝教授には研究に集中できる素晴らしい環境を提供し

て頂いた．また，本研究資金面では，GAOスカラシップに加えて，森泰吉郎記念研究振興基金，湘南藤

沢学会，科研費でサポートして頂いた．ここに深く感謝の意を表したい．

助成期間中の研究業績

国際学会（ポスター発表）

筆頭

学会名・開催場所：The 24th Annual Meeting of the RNA society, Krakow, Poland, ICE Kraków Congress Centre

A large-scale molecular evolutionary analysis uncovers a variety of polynucleotide kinase Clp1 family proteins in

the three domains of life

Motofumi Saito, Asako Sato, Shohei Nagata, Masaru Tomita, Satoshi Tamaki, Haruo Suzuki, Akio Kanai

国内学会（ポスター発表）

筆頭

学会名・開催場所：第 43回日本分子生物学会，福岡

Large-scale molecular evolutionary analysis uncovers a diversity of polynucleotide kinase Clp1 family proteins in

the three domains of life

Motofumi Saito, Asako Sato, Shohei Nagata, Satoshi Tamaki, Masaru Tomita, Haruo Suzuki, Akio Kanai

ssRNA

10 100 10 100 10 100 10 100 10 100 ngTs-Clp1

on ice 22é 60é 90é 90é(pre-incu.)

-OH-P

-OH-P

Ȟ0

ATP

2 100 2 10 2 10 2 10

GTP CTP UTP

ssRNA

-OH-P

20 2010 10520 520Ts-Clp1 ng

ssRNA dsRNA

2010520Ts-Clp1

dsDNA

-OH-P

ng

2010520Ts-Clp1

dsRNA (3´ o.h.)

-OH-P

ng

-OH-P

P0

ATP

0.2 1.00 0.2 1.0 0.2 1.0 0.2 1.0

GTP CTP UTP

ssDNA

B

C

D E

F G

250 -150 -100 -75 -

50 -37 -

25 -20 -15 -

10 -

0 Ts-C

lp1kDa

A

Ts-Clp1

-OH-P

ng200100500

ssDNA

200100500Pf-Clp1

Ts-Clp1-OH

-P

ng200100500

ssDNA

参考

ssRNA

10 100 10 100 10 100 10 100 10 100 ngTs-Clp1


-OH-P

-OH-P

Ȟ0

ATP

2 100 2 10 2 10 2 10

GTP CTP UTP

ssRNA

-OH-P

20 2010 10520 520Ts-Clp1 ng

ssRNA dsRNA

2010520Ts-Clp1

dsDNA

-OH-P

ng

2010520Ts-Clp1

dsRNA (3´ o.h.)

-OH-P

ng

-OH-P

P0

ATP

0.2 1.00 0.2 1.0 0.2 1.0 0.2 1.0

GTP CTP UTP

ssDNA

B

C

D E

F G

250 -150 -100 -75 -

50 -37 -

25 -20 -15 -

10 -

0 Ts-C

lp1

kDa

A

Ts-Clp1

-OH-P

ng200100500

ssDNA

200100500Pf-Clp1

Ts-Clp1-OH

-P

ng200100500

ssDNA

参考

ssRNA

10 100 10 100 10 100 10 100 10 100 ngTs-Clp1


-OH-P

-OH-P

Ȟ0

ATP

2 100 2 10 2 10 2 10

GTP CTP UTP

ssRNA

-OH-P

20 2010 10520 520Ts-Clp1 ng

ssRNA dsRNA

2010520Ts-Clp1

dsDNA

-OH-P

ng

2010520Ts-Clp1

dsRNA (3´ o.h.)

-OH-P

ng

-OH-P

P0

ATP

0.2 1.00 0.2 1.0 0.2 1.0 0.2 1.0

GTP CTP UTP

ssDNA

B

C

D E

F G

250 -150 -100 -

75 -

50 -37 -

25 -20 -15 -

10 -

0 Ts-C

lp1

kDa

A

Ts-Clp1

-OH-P

ng200100500

ssDNA

200100500Pf-Clp1

Ts-Clp1-OH

-P

ng200100500

ssDNA

参考

大規模解析から予測した新規バクテリア clp1...

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